Вплив структурозалежного органельного і неорганельного зв’язування кальцію на внутрішньоклітинну сигналізацію: модельне дослідження

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ВПЛИВ СТРУКТУРОЗАЛЕЖНОГО ОРГАНЕЛЬНОГО І НЕОРГАНЕЛЬНОГО ЗВ'ЯЗУВАННЯ КАЛЬЦІЮ НА ВНУТРІШНЬОКЛІТИННУ СИГНАЛІЗАЦІЮ: МОДЕЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

03.00.02 - біофізика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

НОВОРОДОВСЬКА ТЕТЯНА СЕРГІЇВНА

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Дніпропетровському національному університеті імені Олеся Гончара Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент Кулагіна Ірина Борисівна доцент кафедри експериментальної фізики, старший науковий співробітник лабораторії біофізики і біоелектроніки Дніпропетровського національного університету імені Олеся Гончара

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Білан Павло Володимирович, Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник;

кандидат біологічних наук, Степанюк Андрій Русланович, Міжнародний центр молекулярної фізіології НАН України, науковий співробітник.

Захист дисертації відбудеться 14 грудня 2010 р. о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 12 листопада 2010 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

кальцій нейрон органельний регулювання

Актуальність теми. З'ясування структурно-функціональної організації нервової системи на клітинному і субклітинному рівнях є фундаментальною проблемою біофізики та суміжних галузей. Незважаючи на значний прогрес у методах дослідження фізико-хімічних процесів на різних рівнях організації нейронів, через складність об'єкту залишається дуже обмеженим, а часто й практично неможливим одночасне застосування наявних методів для експериментального дослідження взаємозв'язку між структурою, електричними і концентраційними процесами. У цьому плані істотну комплементарну роль відіграють так звані нейроморфні математичні моделі, побудовані на основі даних комп'ютеризованої реконструкції нейронів з використанням даних натурних електрофізіологічних та оптичних експериментів. Такі моделі на клітинному рівні дозволили з'ясувати, що, поряд з нелінійними електричними властивостями мембрани, складна геометрія дендритів суттєво визначає характер розряду нейронів [Mainen and Sejnowski, 1996; Krichmar et al., 2002; Korogod and Tyc-Dumont, 2009], а на субклітинному рівні - дозволили розкрити мікрогеометричні фактори модуляції ефективності синаптичної передачі [Savtchenko et al., 2000, 2004a,b; Sylantyev et al., 2008], спрогнозувати існування оптимальної в цьому аспекті ширини синаптичної щілини [Savtchenko and Rusakov, 2007], показати вплив взаємного просторового розташуванні каналів надходження Ca2+ і синаптичних везикул [Neher et al., 2001 та ін.] на перебіг фізико-хімічних процесів у синаптичних закінченнях. Проте, до останнього часу були відсутні експериментальні і модельні дослідження впливу на процеси внутрішньоклітинної сигналізації з боку мікрогеометрії таких субклітинних елементів, як тонкі дендрити, дендритні шипики та синаптичні бутони, з урахуванням наявних у цих елементах органельних депо - ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) та мітохондрій. Відомо, що у процесі нормального розвитку та в умовах патології змінюються розмір і форма нейронів та внутрішньоклітинних органел [Bertoni-Freddari et al., 1996; Anglade et al., 1996], чисельність останніх [Bertoni-Freddari et al., 2006; Fattoretti et al., 2009]. Ці обставини визначають актуальність дослідження впливу субклітинної мікрогеометрії на концентраційні кальцієві сигнали.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у науково-дослідній лабораторії біофізики і біоелектроніки Дніпропетровського національного університету ім. О. Гончара як частина робіт за держбюджетними темами "Роль просторової організації кальцієвих каналів і депо у перетворенні сигналів у нейронах" (державний реєстраційний №0105U000360) та "Роль дендритів з нелінійною мембраною у формуванні нейронного коду" (державний реєстраційний № 0108U000626).

Мета і задачі дослідження. Метою було з'ясування закономірностей регулювання концентрації Ca2+ у малорозмірних частинах нейронів у залежності від співвідношення розмірів частин внутрішньоклітинного простору, котрі зайняті цитозолем, неорганельними буферами і органельними депо та обмінюються Ca2+. Мета досягалася вирішенням наступних задач:

1. Розробити засоби і методи моделювання сполучених клітинних електричних і Ca2+-концентраційних процесів та, використовуючи ці засоби, розробити моделі окремих частин і цілих реконструйованих нейронів Пуркіньє для дослідження дендритних потенціалів і струмів, а також динаміки рівня внутрішньоклітинного Ca2+, що регулюється за участю ЕР або мітохондрій, Ca2+-буферів та екзогенного барвника.

2. На моделях дендритних ділянок нейрону Пуркіньє, що отримують локальне синаптичне збудження, дослідити як динаміка концентрації Ca2+ залежить від співвідношення геометричних розмірів відділів внутрішньоклітинного простору, що обмінюються кальцієм.

3. На зазначених моделях дослідити особливості кальцієвої динаміки, пов'язані із відмінностями кінетичних характеристик депонування Ca2+ ЕР та мітохондріями, а також із різним наповненням цитозолю органельними депо.

4. На вказаних моделях дослідити залежність динаміки Ca2+ від інтенсивності транспортних потоків Ca2+ між цитозолем і різними депо.

5. На моделях клітин Пуркіньє мозочка з реконструйованим дендритним розгалуженнями та активними електричними властивостями дендритної мембрани, дослідити вплив співвідношення розмірів ЕР і безорганельного цитозолю на локальну динаміку Са2+ у асиметричних дендритах при генерації періодичних і аперіодичних патернів розрядів на виході нейрону.

Об'єкти дослідження - побудовані у програмному середовищі NEURON математичні моделі поодиноких дендритних ділянок і реконструйованих нейронів Пуркіньє мозочка з активними електричними властивостями мембрани та наявністю таких механізмів регуляції Ca2+, як іонний обмін між цитозолем, органельними депо, ендогенними буферами та позаклітинним середовищем.

Предмет дослідження - динаміка концентрації вільного і зв'язаного Ca2+ у цитозолі та органельних депо (ЕР або мітохондріях), що займають різні частки внутрішньоклітинного простору у ділянках дендритного розгалуження нейронів під час відкликів на локальне синаптичне збудження, а також під час генерації періодичних і аперіодичних патернів розрядів на виході.

Методи дослідження - комп'ютерне моделювання з використанням експериментальних даних щодо мембранних властивостей і реконструйованої геометрії дендритних розгалужень, а також даних щодо відносних розмірів Ca2+-депонуючих органел (ЕР і мітохондрій), наявних у дендритах і дендритних шипиках. Метод підгонки параметрів, котрі дають найкраще (за критерієм мінімуму середніх квадратів відхилень) наближення отриманих в результаті обчислювальних експериментів значень концентрацій до функціональних залежностей геометричних коефіцієнтів від розміру цистерни ЕР. Методи динамічної фіксації мембранного потенціалу. Всі моделі розроблені у програмному середовищі NEURON [Hines and Carnevale, 1993].

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше розроблені комп'ютерні моделі, що дозволяють одночасно досліджувати сполучені електричні і концентраційні процеси у дендритах нейронів, котрі включають в себе різні типи органельних депо (ЕР, мітохондрії), швидкі та повільні неорганельні буфери, а також буфероподібний флуорофор, як в умовах дії локальних синаптичних стимулів, так і при генерації нейроном періодичних і аперіодичних (стохастичних) патернів вихідних сигналів.

2. Уперше продемонстровано, що кінетичні характеристики депонування Са2+ різними органелами обумовлені швидкостями реакцій зв'язування з транспортними молекулами на мембрані депо; отже, вони визначаються поверхневою щільністю цих молекул та їх насиченням при певних концентраціях цитозольного Ca2+.

3. Уперше визначений вплив мікрогеометрії субклітинного елементу і депо, що в ньому міститься, на інтенсивність Са2+ сигналів. Для сигналів різного походження і часового перебігу показано, що залежність пікових концентрацій Са2+ у цитозолі визначається переважно відношенням мембранної поверхні до об'єму безорганельного цитозолю цієї ділянки, а у депо - площею поверхні обміну.

4. Вперше виявлена відмінність процесів буферизації та депонування Са2+ у ділянках різних асиметричних дендритів, котрі мають однакові розміри і однакове наповнення об'єму органельними депо. Ця відмінність особливо виражена під час генерації аперіодичних вихідних розрядів, котрі у асиметричних дендритах супроводжуються асинхронними переходами між станами високої і низької деполяризації. Тим самим вперше показано, що динаміка дендритної концентрації Са2+ має як пряму залежність від локальної мікрогеометрії дендриту, так і непряму залежність від глобальної макрогеометрії усього асиметричного дендритного розгалуження.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів.

Теоретичне значення отриманих результатів полягає у з'ясуванні певних раніше невирішених актуальних проблем, що стосуються сполучених електричних і концентраційних процесів у дендритах нервових клітин, впливу на ці процеси з боку субклітинної геометрії дендритів та наявних в них органел. Результати доповнюють уявлення про біофізичні основи структурно-функціональної організації нейронів кількісними характеристиками модулюючого впливу відносного наповнення внутрішньоклітинного об'єму органельними депо та розміру останніх на концентраційні кальцієві сигнали у цитозолі і депо.

Отримані результати мають прикладне значення для медицини, оскільки можуть сприяти більш глибокому розумінню механізмів молекулярної і клітинної патології в частині, що пов'язана із морфологічними змінами мітохондрій і ЕР при таких захворюваннях, як хвороби Альцгеймера і Паркінсона, цукровий діабет, ішемія тощо (оскільки ці зміни можуть мати несприятливі наслідки для обміну Ca2+ з цими органелами). Це, у свою чергу, може спрямувати розробки засобів фармакологічної корекції Ca2+-обмінних процесів. Розроблені моделі і протоколи модельних досліджень можуть використовуватися для навігації натурного експерименту. Обчислювальні експерименти на таких моделях, спрямовані на тестування певних положень робочих гіпотез, полегшують вирішення задач планування і здійснення натурних експериментів, сприяють скороченню часу експериментального дослідження, зменшенню кількості необхідних для цього тварин та фармакологічних препаратів, а, отже, загальних матеріальних витрат. Розроблені інструменти моделювання і отримані результати можуть бути практично упроваджені у навчальний процес вищих учбових закладів при вивченні таких дисциплін, як біофізика, фізіологія нервової системи, нейрокібернетика, та у суміжних галузях.

Особистий внесок здобувача. Розробка програмних модулів Са2+-динаміки, усі модельні дослідження та обробка результатів здійснені автором особисто. У розробці концепції роботи та обговоренні результатів приймали участь співавтори друкованих праць.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на наступних наукових форумах: Всеукраїнська наукова конференція "Сучасні питання фізіології та медицини" (Дніпропетровськ, 2007); VI та VII форуми Федерації європейських товариств нейронаук (Женева, 2008; Амстердам, 2010); Міжнародна школа “Проблеми експериментальних, клінічних та теоретичних нейронаук” (Дніпропетровськ, 2008); Розширений семінар "Кальцієві канали T-типу: від відкриття до каналопатій, 25 років дослідження" (Київ, 2008); Міжнародна конференція "Молекулярні механізми внутрішньоклітинного кальцієвого сигналювання" (Київ, 2009); 39-ті річні збори Товариства нейронаук США (Чикаго, 2009); Тренінгова школа COST-30 "Клітинна невропатологія: Моделі in vitro" (Київ, 2010).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в чотирьох наукових статтях і восьми тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису об'єктів, методів та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 177 найменувань, викладена на 147 сторінках, ілюстрована 22 рисунками та 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У розділі 1 “Огляд літератури” висвітлено відомості про регулювання рівнів Са2+ в клітинах, типи та властивості каналів надходження Са2+ у клітину, механізми його викачування у позаклітинний простір, Са2+ буфери та депо. Описано субклітинний розподіл механізмів поглинання Са2+ в нейронах різних типів, зокрема у нейронах Пуркіньє мозочка, пірамідних нейронах нової кори та гіпокампу. Описано зв'язок між динамікою внутрішньоклітинного Са2+ та електричними мембранними процесами. Розглянуті основні методи експериментальних та модельних досліджень концентрації Са2+ у цитозолі та депо. Здійснено узагальнення проблеми, окреслено невивчені актуальні аспекти та напрямки даного дослідження.

У розділі 2 “Об'єкти та методи дослідження” обґрунтовано застосування програмного середовища NEURON для розробки й дослідження моделей динаміки Са2+ у нейронах. Описано авторські моделі динаміки Са2+ у окремих ділянках (тонкі дендритні стовбури, шипики - рис.1) та реконструйованих розгалуженнях (рис.2) дендритів нейронів Пуркіньє з присутніми там мітохондріями (рис.1 А, Б) або ЕР (рис.1 В, Г; рис.2 Б) у якості Са2+ депо.

Рис. 1. Основні механізми регулювання електричних та Ca2+ концентраційних процесів у дендритних ділянках нейронів Пуркіньє з мітохондріями (А, Б) або ЕР (В, Г) у якості депо

Дендритна мембрана модельних нейронів (pис. 1, А, В, товсті стрілки) містила канали вхідного кальцієвого струму Р-типу (ICa(Р)), вихідного калієвого струму затриманого випрямлення (IK(DR)), А-типу (IK(А)), Ca2+-залежного калієвого струму(IK(Са)), неспецифічного струму витоку (Ileak), а також Ca2+-насос - Са2+-АТФазу (ICa(АТР)). У якості стимулу використовували активацію потенціалнезалежного збуджуючого синаптичного струму IS = GS(t)(E - ES) шляхом внесення змінної у часі t синаптичної електропровідності: GS(t) = GSmaxf(t), де GSmax - пікове значення, ES=0 мВ -потенціал рівноваги (реверсії) струму, що відповідало дії глутаматергічного синапсу AMPA-типу. У випадку тонічної синаптичної активації провідність GS була постійною у часі й однорідною по дендритній мембрані. Для відповідної ділянки дендриту розраховувалися наступні потоки обміну Ca2+: дифузія в сусідні ділянки (dif), зв'язування з повільним (парвальбуміном) та швидким (кальмодулін) буферами й флуоресцентним барвником типа Fura-4 (buf), обмін з мітохондріями (mit) або ЕР (ER). Обмін з мітохондріями (рис. 1, А) відбувався через уніпортер (Фuni) і Са2+-Na+ обмінник (ФNaCa), а з ЕР (рис. 1, Б) - через насоси та канали: поглинання (up), пасивного витоку (ER leak), індукованого кальцієм вивільнення Са2+ (CICR) та вивільнення Са2+ через канали, чутливі до інозитол-3-фосфату [IP3] (IP3). Обчислювали також продукцію/розпад IP3 (зсуви [IP3]). Кожна органела мала форму циліндра тієї ж протяжності l, що й ділянка дендриту (Рис.1, Б, Г). Заповнення дендритного об'єму органельними депо варіювали, змінюючи кількість мітохондрій (при незмінному діаметрі 0,1 мкм) або діаметр цистерни ЕР, dER.

Зазначені вище електричні струми та потоки Ca2+ визначали зміни трансмембранного потенціалу E дендритної ділянки

dE/dt = (ICaР + IK(DR) + IKА + IK(Са) + Іleak + ICa(АТР) + IS)/Cm

(тут IS - синаптичний струм, Cm - ємність мембрани), а також зміни цитозольної концентрації [Ca2+]i

d[Ca2+]i /dt = ?kФk

де Фk - парціальні потоки обміну між цитозолем та позаклітинним середовищем (Фe), буферами (Фbuf), депо (Фmit або ФER) та потік дифузії (Фdif) до сусідніх безорганельних ділянок. Ці потоки визначалися рівняннями:

Фe = -(S/Vcyt)(ICaР + ICa(АТР))/(zCaF),

Фdif = ([Ca2+]i - [Ca2+]bulk)/?dif

де zCa=2 - валентність, F - стала Фарадея, ?dif - стала часу дифузійної релаксації концентрації до базального рівня [Ca2+]bulk.

Геометричними параметрами рівняння (3) є площа мембранної поверхні S та вільний від органел об'єм цитозолю Vcyt дендритної ділянки:

Vcyt = V - VmitN

Або Vcyt = V - VER

де V, Vmit та VER - об'єми ділянки, мітохондрії та ЕР, відповідно, N - кількість мітохондрій всередині ділянки.

Потоки обміну Са2+ з мітохондріями або ЕР визначалися як

Фmit = (VmitN/ Vcyt) d[Ca2+]mit /dt

Або ФER = (VER/ Vcyt) d[Ca2+]ER /dt

Зміни концентрації Са2+ всередині мітохондрій або ЕР, відповідно:

d[Ca2+]mit/dt = Фuni-ФNaCa

d[Ca2+]ER/dt = SER(Фup-ФERleak-ФCICR-ФIP3)

Рівняння зв'язування Са2+ з буферами [B] або барвником [D] мали вигляд:

d[B]/dt = K2B[CaB] - K1B[Ca2+]i[B]

де К1* - константи швидкостей зв'язування (мМмс)-1; К2* - константи швидкостей дисоціації комплексів (мс-1).

[CaD] = [D]tot - [D]

де [D]tot - повна концентрація зв'язаного з Са2+ та вільного барвника. Розв'язок (інтеграл) диференціального рівняння (2):

[Ca2+]i(t) = ? d[Ca2+]i = ?t ?k Фk dt = ?k ?t Фk dt

дозволив виділити внески потоків або їх комбінацій до загального сигналу:

[Ca2+]i(t)¦k = ?t Фk dt

Описані вище механізми динаміки Са2+ включали до моделі нейрону Пуркіньє з реконструйованим дендритним розгалуженням (рис.2, А). Ця модель у відповідь на розподілене по дендритах тонічне синаптичне збудження меншої або більшої інтенсивності генерувала періодичні (А, 1) або аперіодичні (А, 2) пачки потенціалів дії, що забезпечувалося додатковим включенням до дендритної мембрани описаних у цих нейронах іонних каналів (pис. 2, Б, товсті стрілки), котрі відповідають за швидкі регенеративні електричні процеси, але мають незначний вплив на перебіг постсинаптичних процесів. Це - канали Ca2+ струмів Е- і Т-типів (ICa(Е), ICa(Т)), калієвих струмів D-, і М-типів (IK(D) і IK(М)), Ca2+-залежних низько- та високопорогового струмів (IK(Са)l та IK(Са)h).

Рис. 2. Нейрон Пуркіньє з реконструйованим дендритним розгалуженням (А) та склад мембранних каналів та насосів і внутрішньоклітинних механізмів регулювання концентрації Ca2+ за участю ЕР у якості депо (Б), включених до дендритних ділянок. D1, D2 і D3 - схожі за розмірами ділянки асиметричних дендритів, використані для співставлення електричних і концентраційних процесів під час генерації періодичних (А, 1) і аперіодичних (А, 2) пачок потенціалів дії на виході модельного нейрону в умовах тонічної активації синаптичної провідності однорідно розподіленої по дендритах

Відповідність структурозалежності Са2+-сигналів певним функціям геометричних розмірів депо й дендритних ділянок з'ясовували методом параметризованих наближуючих функцій. Визначали, яка функція геометричних параметрів, що входять до рівнянь концентраційних процесів, є найкращим наближенням до цільової функції, котрою завжди була отримана у модельних експериментах залежність інтенсивності концентраційного сигналу від розміру депо (наприклад, діаметру цистерни ЕР). Прикладом наближуючої функції є залежність від dER значень геометричного коефіцієнту у рівнянні (3), тобто відношення площі дендритної ділянки до частки її об'єму, вільної від депо, S/Vcyt = (?dl)/(?d2l/4 - ?dER2l/4)=(4/d)/(1-(dER/d)2) (f1 на рис.5, А, Б, Г). Приклади інших використаних функцій dER - площа мембрани депо (f3 на рис.5, Б), відношення об'ємів депо і цитозолю (f2). Найкращою вважалася та наближуюча функція, яка давала найменшу похибку при досягненні мінімуму середнього квадрату її відхилень від цільової.

Порівняльні дослідження різних механізмів органельного депонування в умовах генерації певних електричних патернів у різних дендритних ділянках здійснювали методом динамічної фіксації потенціалу. При цьому значення мембранного потенціалу (МП) певної ділянки реконструйованого розгалуження під час періодичної або аперіодичної активності реєструвалися і далі подавалися у якості командної напруги на ділянку, яка відрізнялася включеними до неї механізмами депонування та буферизації Са2+.

Розділ 3 "Результати досліджень" складається з чотирьох підрозділів.

3.1. Вплив геометричних характеристик органельного депо і безорганельного цитозолю на динаміку внутрішньоклітинного Са2+ у дендриті.

Низькоінтенсивні синаптичні стимули викликали підпороговий електричний процес (Рис.3, А, 1), а більш інтенсивні - регенеративні градуальні відклики, так звані кальцієві потенціали дії (ПД), із ранньою та пізньою компонентами (2-4). Відповідно зростали величина і тривалість Са2+ сигналу у цитозолі (Б, 1-4).



Рис. 3. Зміни МП (А) і цитозольної концентрації Са2+ (Б) у ділянці дендриту, викликані поодиноким синаптичним збудженням, інтенсивність якого визначалася внесеною провідністю (0.7, 0.8, 1 та 50 нС, криві 1-4 відповідно)

У дендритних ділянках, по-різному заповнених ЕР, ідентичне синаптичне збудження викликало однакові електричні мембранні процеси (Рис.4, А, Д), але різні концентраційні відповіді в цитозолі (Б, Е) та ЕР (В, Ж).

Кальцієві сигнали зростали із збільшенням об'ємної частки ЕР. Додавання барвника зменшувало Са2+-сигнали у цитозолі (пор. Б і Е) з виникненням характерної слідової "полички" (вставка на Б) й уповільнювало приріст і спад концентрації Са2+ в ЕР. Це відповідало поведінці комплексу Са2+-барвник (Г), концентрація якого спочатку збільшувалась, після чого комплекс розпадався, звільнюючи Са2+, котрий надалі депонувався ЕР. Отже, розмір депо та, відповідно, наповненість ним внутрішньоклітинного простору є структурними факторами, які істотно модулюють Са2+ сигнали у цитозолі і депо, і ця структурозалежність адекватно відображується Са2+-чутливим барвником. Відношення поверхня/безорганельний об'єм ділянки (функція f1= S/Vcyt = S/(V - VER), відношення об'ємів ЕР і цитозолю (f2=VER/ Vcyt), площа поверхні ЕР (f3= SER) та інтенсивність Са2+-сигналів у цитозолі й депо викликаних ідентичними синаптичними стимулами, змінювались залежно від діаметру ЕР (kER= dER/d) (рис.5).



Рис. 4. Вплив відносного розміру Са2+-депо дендритної ділянки на динаміку Са2+ при ідентичному синаптичному збудженні (50 нС) за наявності (А-Г) та відсутності (Д-Е) Са2+-чутливого барвника. Частка ЕР у об'ємі ділянки складала 1, 4, 9, 16, 25 та 36% (криві 1-6, відповідно)

Рис. 5. Кількісні зв'язки інтенсивності Са2+-сигналів та субклітинної геометрії. Цитозольна пікова (А) і слідова (Б) концентрації Са2+, зміни концентрації Са2+ у ЕР (В) та комплексу Са2+-барвник (Г) у порівнянні з різними функціональними залежностями (f1 та f3) геометричних коефіцієнтів модельних рівнянь від відносного діаметру ЕР (kER= dER/d)

Порівнюючи ці залежності, методом найменших квадратів відхилень визначали, до якої з вказаних функцій є найбільш наближеною залежність інтенсивності Са2+-транзієнтів від dER (kER). З'ясувалося, що пікова (А) і слідова (Б) цитозольні концентрації Ca2+, а також концентрація комплексу Са2+-барвник (Г) найбільш наближені до f1, а зміни концентрації Са2+ у ЕР (В) - до f3. Отже, відношення площі мембрани до безорганельного об'єму ділянки є геометричним “коефіцієнтом модуляції” інтенсивності кальцієвих сигналів у цитозолі, а площа мембрани ЕР модулює інтенсивність цих сигналів у депо.

Рис. 6. Викликані поодинокою синаптичною активацією зміни концентрації Са2+, зв'язаного з повільним (А, Б) та швидким (В, Г) буферами, віднесеної до концентрації вільного Са2+ при різних загальних концентраціях буферів і частках ЕР в об'ємі компартменту

Загальна концентрація повільного буферу 50 мкМ (А, В) і 150 мкМ (Б, Г), швидкого буферу 5 мкМ і 30 мкМ (криві 1 і 2, відповідно). Діаметр цистерни ЕР складав 0.1 і 0.6 діаметру компартмента (тонка й товста лінії, відповідно).

Рис. 6 ілюструє реакції ендогенних буферів, індуковані поодиноким синаптичним стимулом, який був прикладений на 10 мс. Зв'язувальні здатності буферів і барвника характеризували відношенням концентрації комплексу "кальцій-буфер" або "кальцій-барвник" до концентрації вільного кальцію - так званими коефіцієнтами зв'язування [CaB1]/[Ca2+]i, [CaB2]/[Ca2+]i або [CaD]/[Ca2+]i, а також відношенням приростів зазначених вище концентрацій - диференціальними коефіцієнтами зв'язування d[CaB1]/d[Ca2+]i, d[CaB2]/d[Ca2+]i або d[CaD]/d[Ca2+]. Базальні (передстимульні) значення зв'язувальної здатності кожного з буферів визначалися його загальною концентрацією і не залежали від концентрації буфера-конкурента. Так, для компартменту з 36%-вою об'ємною часткою ЕР при [B1]= 50 і 150 мкМ базальне відношення [CaB1]/[Ca2+]i складало близько 260 та 770, відповідно (А, Б), а таке у [CaB2]/[Ca2+]i при [B2]= 5 і 30 мкМ складало близько 4.8 і 28.7, відповідно (В, Г). Під час піку [Ca2+]i відношення [CaB1]/[Ca2+]i і [CaB2]/[Ca2+]i падали відповідно до 2-6.2 (А, Б) і 0.38-2.3 (В, Г), вказуючи на те, що по відношенню до пікових концентрацій вільного Ca2+ зв'язувальні здатності обох буферів низькі. Спостережувані після скінчення масованого входу Ca2+ слідові процеси зв'язування швидкого і повільного буферів характерним чином відрізнялися. Так, відношення [CaB2]/[Ca2+]i швидко досягало значень, що на порядки перевищували базальні -при будь-якій загальній концентрації швидкого буфера [B2], не залежно від [B1], після чого протягом приблизно 100 мс поверталося до базальних значень (В, Г). В цей же час, відношення [CaB1]/[Ca2+]i зростало спочатку різко до рівня вище або нижче базального в залежності від меншої або більшої концентрації [B1], а потім, протягом близько 100 мс (час повернення до базального рівня швидкої буферизації), - повільно, до рівня, котрий суттєво перевищував базальний, залежав від загальної концентрації повільного буфера та не залежав від концентрації швидкого буфера (А, Б). Описані закономірності якісно зберігалися при різному заповненні компартменту ЕР (пор. тонкі та товсті лінії на А-Г), а кількісно відносні концентрації обох комплексів кальцій-буфер були більшими при більшій частці ЕР.

3.2 Порівняльний аналіз обміну Са2+ між цитозолем та мітохондріями або ЕР. Для виділення особливостей вкладу потоків обміну з кожним депо, які обумовлені відмінностями мембранних механізмів у мітохондрій та ЕР, потрібно було забезпечити надходження однакових вхідних кальцієвих сигналів у депо обох типів.

Рис. 7. Вплив відносного наповнення дендритної ділянки мітохондріями (А-В) або ЕР (Г-Е) на динаміку Са2+ при ідентичному синаптичному збудженні (2 нС). Частка депо у об'ємі ділянки складала 1, 4, 9, 16, 25 та 36% (криві 1-6, відповідно)



Рис. 8. Динаміка Са2+ в ділянках, однаково наповнених мітохондріями (А-В) або ЕР (Г-Е), при різних інтенсивності й тривалості цитозольних транзієнтів, викликаних ідентичним синаптичним збудженням. Відповіді (2, 4) - при 5-кратно зменшеній (порівняно з 1, 3) інтенсивності дифузії Са2+ в сусідні ділянки, (3, 4) - при температурі 15 °С, (1, 2) - при 22 °С

Це реалізовувалося в умовах превалювання загальних для обох моделей потоків (Фe, Фbuf и Фdif) у порівнянні з потоком обміну з тим або іншим депо (Фmit чи ФER). У ділянках, що однаково заповненні мітохондріями або ЕР, ідентичне синаптичне збудження викликало ідентичні зрушення МП (Рис.7, А, Г) та концентраційні відклики у цитозолі (Б, Д). Із збільшенням частки депо збільшувалися Са2+ сигнали як у цитозолі, так і у депо, причому відповідні прирости концентрації у ЕР були більш значними (пор. В і Е).

Зменшення інтенсивності дифузії, не позначаючись на електричних відповідях (Рис.8, А, Г, 1, 2), призводило до відповідного збільшення цитозольної концентрації Са2+. Зменшення температури призводило до збільшення тривалості та інтенсивності електричної відповіді (А, Г, 3, 4) за рахунок уповільнення активації та інактивації потенціалзалежних каналів плазматичної мембрани. Відповідно збільшувалася й тривалість Са2+-транзієнту в цитозолі (Б, Д, 3). При цьому інтенсивність Са2+-сигналу в ЕР (Е) у декілька разів перевищувала таку в мітохондріях (В). Приріст концентрації Са2+ в ЕР був майже лінійним та приблизно в два рази більшим, ніж у мітохондрії. Отже, ЕР ефективніше депонує Са2+, ніж мітохондрії, однак наповнення об'єму будь-яким з цих органельних депо має однакові функціональні наслідки для Са2+-транзієнтів.

3.3 Особливості кальцієвої динаміки, обумовлені відмінностями у щільності транспортних систем різних депо. Збільшення швидкостей обміну Са2+ між цитозолем і депо призводило до зниження пікової концентрації Са2+ у цитозолі (рис. 9, А, Д; у разі ЕР - більш значного, з появою слідового компоненту, Д), до її збільшення у депо (пропорційного у мітохондріях, Б, та непропорційного - у ЕР, Е).

Рис. 9. Характеристики обміну Са2+ між цитозолем та мітохондріями (А-Г) або ЕР (Д-З) в залежності від максимальної швидкості обміну (щільності транспортних молекул) при ідентичному синаптичному збудженні. Криві 1 відповідають початковому значенню, а 2-6 - збільшеним у 20, 40, 60, 80 і 100 разів максимальним швидкостям (частка депо - 36%)



Рис. 10. Кальцієві транзієнти при збільшенні максимальної швидкості потоку захвату Са2+ органельними депо (щільності транспортних молекул захвату) в 10 і 100 разів (криві 2, 3) у порівнянні з початковою (1)

При цьому збільшувався потік Са2+ як у цитозоль (В, Ж), так і у депо (Г, З). У випадку ЕР всі зміни були більш виражені; швидкості спаду всіх потоків прогресивно збільшувалися (Ж, З). Збільшення максимальної швидкості депонування Са2+ мітохондріями незначно змінювало цитозольний транзієнт (рис.10, А), тоді як у разі депонування ЕР спостерігалися виражені зменшення кількості цитозольного (Д) та збільшення кількості депонованого (Е) Са2+. У випадку мітохондрій істотно збільшувалася інтенсивність сумарного потоку Са2+ (трансмембранного та дифузійного) (В), який визначав зміни цитозольної концентрації (А), тоді як тривалість цього потоку збільшувалася при 10-кратній швидкості (2) і скорочувалася при 100-кратній (3). У випадку ЕР збільшувалися як інтенсивність, так і тривалість вказаного сумарного потоку (Ж). Аналогічних змін зазнавали потоки обміну з відповідними депо (Г, З). Концентрація Са2+ у мітохондрії (Б) досягала максимуму після закінчення цитозольного транзієнту при початковій (1) та 10-кратній швидкості (2), а при 100-кратній (3) максимум досягався істотно раніше піку транзієнта, що свідчить про швидке насичення транспортних молекул при таких рівнях концентрації. Отже, при будь-якій наповненості внутрішньоклітинного простору різними депо, кінетичні характеристики депонування ними Са2+ визначаються швидкостями реакцій зв'язування з транспортними молекулами на мембрані депо, тобто визначаються поверхневою щільністю останніх та обмежуються насиченням транспортної системи при певних рівнях цитозольної концентрації Са2+.

3.4 Структурозалежність динаміки Са2+ у реконструйованих дендритах нейронів Пуркіньє під час генерації періодичних і аперіодичних патернів розряду на виході. Нейрон Пуркіньє з реконструйованим дендритним розгалуженням при низькій інтенсивності тонічної розподіленої синаптичної активації дендритів (внесена провідність GS=50 мкС/см2) генерував періодичні пачки з чотирьох потенціалів дії (ПД) (рис. 2, А, 1), а при більш високій (GS=68 мкС/см2) - аперіодичні пачки різної складності та поодинокі ПД (рис. 2, А, 2). Як видно на прикладі ділянки D2, періодичні пачки ПД аксона супроводжувалися у дендритах періодичними збільшеннями деполяризації мембрани (А), кальцієвого струму (Б), концентрації Са2+ у примембранному цитозолі (В) та змінами потенціалу рівноваги для Са2+(Г). Методом динамічної фіксації потенціалу отримували ідентичні зміни МП (Рис. 11, А, Д) й порцій надходження Са2+ у відповідних ізольованих дендритних компартментах (пор. Б, Е), що свідчить про адекватність використаного методу для порівняння впливу типу і просторової організації механізмів депонування Са2+. Так, приклад того ж дендритного компартменту D2 показує, що після заміни спрощеного механізму 1 регуляції Са2+ на механізм 2, який ураховував буферизацію та депонування Са2+, при ідентичних періодичних деполяризаційних зсувах спостерігалися дещо більші кальцієві струми (пор. К з Б, Е). Це було пов'язано із збільшенням рівноважних потенціалів для Са2+ (пор. М з Г, З), залежних від цитозольної (зменшеної) концентрації Са2+ (пор. Л і В, Ж). У тому ж компартменті рівні прирости діаметру ЕР обумовлювали різні значення приростів пікової концентрації Са2+ у цитозолі (Рис.12, А, В) і депо (Б, Г). Наявність буферів і барвника позначалося на цих змінах неістотно (В, Г).

Побудовані за результатами рис. 12 залежності пікових концентрацій Са2+ від відношення діаметрів ЕР і дендриту (рис.13, криві 2-5), будучи зсунутими в область більших концентрацій, були подібними одна одній та представленій на рис.5, А, отже апроксимувалися однотипною функцією - відношенням мембранної поверхні до безорганельного об'єму цитозолю компартменту (див.п.3.1).

Рис. 11. Електричні і концентраційні сигнали на ділянці D2 реконструйованого дендритного розгалуження підчас власної періодичної активності (А-Г) та при динамічній фіксації потенціалу на ізольованій ділянці (Д-М) з такими ж геометрією і мембранними властивостями, але різними механізмами регуляції рівня Са2+. Концентрація Са2+ у примембранному цитозолі за відсутності буферів та депо (механізм 1, Д-З) та у безорганельному цитозолі за наявності буферів та обміну з ЕР (механізм 2, И-М)



Рис. 12. Вплив відносного розміру ЕР на динаміку концентрації Са2+ у цитозолі (А, В) та ЕР (Б, Г) при наявності (В, Г) та за відсутності (А-Б) буферів і барвника на дендритній ділянці D2 при динамічній фіксації потенціалу, що відповідав періодичному патерну. Частка ЕР у об'ємі ділянки складала 4, 16 та 36 % (криві 1-3)

Рис. 13. Залежності пікових концентрацій Са2+ від відношення діаметрів ЕР і дендриту. Крива 1 відповідає графіку на рис. 5, А, криві 2-5 - змінам пікового (2-3) та слідового (4-5) компонентів цитозольного транзієнту за наявності (2, 4) та відсутності (3, 5) Ca2+ буферу

При динамічній фіксації потенціалу на ділянках, які належали трьом різним асиметричним піддеревам реконструйованого розгалуження нейрону, що генерував аперіодичний вихідний патерн (рис.14), асинхронні сплески деполяризації різної інтенсивності (А, Д і И) супроводжувалися вхідними Са2+ струмами (Б, Е і К), у котрих співвідношення амплітуд швидких і повільних компонентів істотно варіювали за рахунок більшої варіації швидкого компонента. Найбільше накопичення Са2+ спостерігалося в депо ділянки D2, а найменше - у D3. Ці відмінності у рівнях Са2+, депонованого у різних ділянках, очевидно, пов'язані з відповідно тривалішим або коротшим, у середньому, перебуванням дендритів у стані високої деполяризації (пор. З, Г і М), що зумовлювало надходження більшої або меншої кількості Са2+ в цитозоль (В, Ж, Л). Отже, макрогеометрія цілого розгалуження визначає асинхронність і різну інтенсивність електричних транзієнтів в асиметричних частинах дендритного галуження при генерації аперіодичної активності на виході клітини.

Рис. 14. Електричні й концентраційні сигнали на ділянках D1 (А-Г), D2 (Д-З ) и D3 (И-М) реконструйованого дендритного розгалуження нейрону Пуркіньє в умовах динамічної фіксації потенціалу, що відповідає аперіодичному патерну розрядів на виході

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі, відповідно до її мети та завдань, з'ясовані біофізичні закономірності динаміки Са2+ у нейронах та субклітинних елементах у залежності від мікрогеометричних співвідношень між частинами внутрішньоклітинного простору, які обмінюються Са2+, а саме між органельними депо (ЕР, мітохондрії) та цитозолем, ендогенними неорганельними буферами і Са2+-чутливими барвниками. Знайдені закономірності видаються важливими для розуміння як загальних біофізичних механізмів регулювання клітинного Са2+ у нормі, так і особливостей функціонування цих механізмів в умовах структурних змін на субклітинному рівні, що мають місце при різних видах патології.

1.Розроблений і всебічно протестований оригінальний інструмент комп'ютерного моделювання динаміки внутрішньоклітинного кальцію за участю різних органельних депо, ендогенних та екзогенних буферів, що відрізняються кінетиками зв'язування, у дендритах нейронів з різними наборами іонних каналів і насосів плазматичної мембрани.

2.Відносне наповнення внутрішньоклітинного об'єму субклітинних елементів (таких, як ділянки тонких дендритів, дендритні шипики) органельними депо та розмір останніх є структурними мікрогеометричними факторами, котрі здатні суттєво модулювати як інтенсивність, так і часові характеристики Са2+-сигналів у цитозолі і депо. Ця структурозалежність може адекватно відображуватися Са2+-чутливими барвниками.

3. Зазначений вплив мікрогеометрії субклітинного елементу і депо на інтенсивність цитозольних Са2+-сигналів різного походження і часового перебігу кількісно визначається головним чином відношенням площі мембранної поверхні до вільного від депо об'єму цього елементу. Це відношення є свого роду геометричним “коефіцієнтом модуляції” інтенсивності Са2+-сигналів у цитозолі. Інтенсивність Са2+-сигналів у депо також суттєво модулюється структурними факторами і кількісно визначається головним чином площею мембранної поверхні депо, через яку здійснюється обмін Са2+ з цитозолем.

4. При будь-якому наповненні внутрішньоклітинного простору мітохондріями або ЕР їх кінетичні характеристики депонування Са2+ обумовлені головним чином швидкостями реакцій зв'язування з транспортними молекулами мембрани, а, отже, визначаються біохімічними властивостями і поверхневою щільністю цих молекул. При цьому насичення транспортної системи обмежує швидкість депонування при певних рівнях цитозольної концентрації Са2+.

5. Наявність швидкого неорганельного буфера і/або барвника з подібними кінетичними властивостями уповільнювало фазу зростання і зменшувало інтенсивність раннього компоненту, а також збільшувало інтенсивність пізнього компоненту цитозольного транзієнту, що відповідно позначалося на транзієнтах у депо, особливо ЕР. Динаміка зв'язування Са2+ повільним ендогенним буфером подібна до динаміки депонування даного іону ЕР.

6. У нейронах з активними (нелінійними) електричними властивостями дендритної мембрани, поряд з прямим впливом локальної мікрогеометрії дендритних ділянок і депо, органельне депонування Са2+ і неорганельна буферизація зазнають також опосередкованого, але суттєвого впливу з боку макрогеометрії (особливо метричної асиметрії дендритного розгалуження в цілому).

7. Зазначений вплив асиметрії галуження особливо виражений під час генерації просторово неоднорідних дендритних патернів власної електричної активності, які супроводжують генерацію складних аперіодичних пачкових потенціалів дії на виході нейрону, оскільки саме асиметрія спричиняє асинхронні переходи між станами високої і низької деполяризації мембрани, а, отже, різну тривалість станів високої деполяризації і надходження Са2+ у асиметричних гілках.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

1. Корогод С. М. Влияние геометрических характеристик органельного депо и безорганельного цитозоля на динамику уровней внутриклеточного кальция в дендрите: модельное исследование /С. М. Корогод, Т. С. Новородовская // Нейрофизиология. - 2009. - Т. 41, № 1. - С. 19-31. (особисто здобувачем у програмному середовищі NEURON розроблені моделі механізмів кальцієвої динаміки з участю ЕР як органельного депо у дендритних ділянках нейрону Пуркіньє мозочка, здійснені усі модельні дослідження та обробка отриманих результатів).

2. Новородовская Т. С. Сравнительный модельный анализ кальциевого обмена между цитозолем и депо митохондрий или эндоплазматического ретикулума /Т. С. Новородовская, С. М. Корогод // Нейрофизиология. - 2009. Т. 41, № 5. - C. 367-380. (особисто здобувачем розроблені моделі механізмів кальцієвої динаміки з участю мітохондрій як органельних депо у дендритних ділянках нейронів Пуркіньє, здійснені усі модельні дослідження та обробка отриманих результатів).

3. Новородовская Т. С. Модельное исследование особенностей кальциевой динамики, обусловленных обменом между цитозолем и органельными депо / Нейрофизиология. - 2009. - Т. 41, № 5. - С. 450-459.

4. Новородовская Т. С. Структурозависимая Cа2+ динамика в содержащих депо дендритах нейрона Пуркинье при генерации пачечных разрядов. Модельное исследование / Т. С. Новородовская, И. Б. Кулагина // Нейрофизиология. - 2010. - Т. 42, № 1. - C. 67-81. (особисто здобувачем розроблені і досліджені моделі механізмів кальцієвої динаміки з органельними депо у ділянках реконструйованих складних дендритних розгалуженнях нейронів Пуркіньє з використанням динамічної фіксації потенціалів, зареєстрованих під час власної пачкової активності).

Тези доповідей:

1. Новородовська Т. С. Модельні дослідження кальцієвої динаміки у синаптичних бутонах в залежності від розміру мітохондрій, граючих роль кальцієвих депо / Т. С. Новородовська, С. М. Корогод // Сучасні питання фізіології та медицини: всеукр. наук. конф., 26-29 вересня 2007 р.: матеріали конф. - Дніпропетр., 2007. - С. 73.

2. Novorodovska T. S. Simulation studies of calcium signals in synaptic boutons with different types of organellar stores / T. S. Novorodovska, S. M. Korogod // 6th FENS forum, 12-16 July 2008: abstacts, vol.4. - Geneva (Switzerland), 2008. - abstract № 114.19.

3. Novorodovska T. S. Comparative simulation study of calcium dynamics in synapses with different ogranellar stores / Problems of experimental, clinical and theoretical neurosciences: internat. neuroscience school, 2-4 May 2008. - Dnipropetrovsk, 2008.

4. Novorodovska T. S. Comparative analysis of calcium dynamics in synapses with endoplasmic reticulum or mitochondria as the stores / T. S. Novorodovska, S. M. Korogod // T-type calcium channels: from discovery to channelopathies, 25 Years of Research: advanced workshop, 5-7 June 2008: program and abstract book. - Kyiv, 2008. - P. 39.

5. Novorodovska T. S. Comparative analysis of calcium exchange between cytosole and endoplasmic reticulum or mitochondria as the stores / T. S. Novorodovska, S. M. Korogod // Molecular mechanisms of intracellular calcium signalling: internat. Conference, 11-13 October 2009: program and abstract book. - Kiev, 2009. - P. 29-30.

6. Novorodovska T. S. Impact of organellar store and organelle-free cytosole volumes on intracellular calcium dynamics: A simulation study / T. S. Novorodovska, S. M. Korogod //Society for Neuroscience's 39th annual meeting, 17-21 October 2009: abstracts. - Chicago (USA), 2009. - abstract № 619.13.

7. Novorodovska T. S. Structure-dependent Са2+ dynamics in the store-containing active dendrites of simulated Purkinje neuron during generation of complex bursting patterns / T. S. Novorodovska, I. B. Kulagina, S. M. Korogod // 7th FENS forum 3-7 July 2010: abstracts, vol.5. - Amsterdam (The Nietherlands), 2010. - abstract № 141.5.

8. Novorodovska T. S. Structure-dependent Cа2+ dynamics in the active dendrites of simulated Purkinje neuron containing endoplasmic reticulum as Ca2+ store / T. S. Novorodovska // Cellular neuropathology- in vitro models: COST B30 training school, 3-7 June 2010: program and abstract book. - Kiev, 2010. - P. 39.

АНОТАЦІЯ

Новородовська Т. С. Вплив структурозалежного органельного і неорганельного зв'язування кальцію на внутрішньоклітинну сигналізацію. Модельне дослідження. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 біофізика. - Дніпропетровський національний університет ім. О. Гончара, Дніпропетровськ, 2010 р.

З використанням розроблених автором комп'ютерних моделей досліджені закономірності структурозалежної динаміки Са2+ у малорозмірних частинах нейрону, які зайняті цитозолем, неорганельними буферами і органельними депо (ендоплазматичний ретикулум або мітохондрії) та обмінюються Са2+.

Встановлені кількісні характеристики модулюючого впливу відношення мембранної поверхні та безорганельного об'єму цитозолю на цитозольні Са2+ сигнали у дендритній ділянці, які адекватно відображуються Са2+-чутливим флуорофором. Інтенсивність Са2+-сигналів у депо визначається площею поверхні його мембрани. Виявлено, що при будь-якому заповненні клітини ендоплазматичним ретикулумом або мітохондріями їх кінетичні характеристики депонування Са2+ визначаються швидкостями реакцій зв'язування з транспортними молекулами мембрани депо (їх поверхневою щільністю) та обмежуються насиченням транспортної системи при певних рівнях Са2+. За своїми кінетичними характеристиками зв'язування Са2+ повільним ендогенним буфером та депонування ендоплазматичним ретикулумом подібні.

Встановлено, що локальне депонування Са2+ залежить не тільки від зовнішньої синаптичної дії, але й від просторового патерну власної електричної активності нейрону через істотно відмінні умови функціонування депо у ділянках асиметричних дендритів, де суттєво відрізняються власні електричні процеси, а отже й надходження Са2+.

Таким чином, має місце не тільки пряма залежність динаміки Са2+ від локальної мікрогеометрії дендриту, але і непряма - від глобальної макрогеометрії розгалуження.

Ключові слова: динаміка Са2+, ендоплазматичний ретикулум, мітохондрії, субклітинна мікрогеометрія, кальцієві буфери, флуорофор, нейрон Пуркіньє, динамічна фіксація потенціалу

АННОТАЦИЯ

Новородовская Т. С. Влияние структурозависимого органельного і неорганельного связывания кальция на внутриклеточную сигнализацию. Модельное исследование. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 биофизика. - Днепропетровский национальный университет им. О. Гончара, Днепропетровск, 2010 г.

С использованием разработанных автором компьютерных моделей отдельных фрагментов и реконструированного разветвления дендритов мозжечковых нейронов Пуркинье исследованы закономерности структурозависимой динамики Са2+ в обменивающихся этим ионом малоразмерных частях, занятых цитозолем, неорганельными буферами и органельными депо - эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или митохондриями. Дендритная мембрана содержала характерные для упомянутых нейронов ионные каналы (в том числе каналы синаптического тока) и кальциевый насос. Уравнения модели учитывали обмен Ca2+ между цитозолем, буферами, депо и внеклеточной средой, а также процессы диффузии. Мембрана ЭР обладала кальциевым насосом, каналами утечки и каналами Са2+-индуцированного и инозитол-3-фосфатзависимого высвобождения Са2+. Митохондрии и цитозоль обменивались Са2+ через унипортер и Na+-Ca2+ обменник. Депо занимали от 1 до 36 % внутриклеточного объема. Связывающую способность буферов и флуорофора характеризовали отношением концентраций связанного и свободного кальция или приращений этих концентраций.

Установлены количественные характеристики модулирующего влияния отношения мембранной поверхности и безорганельного объема цитозоля на Са2+ сигналы в дендритном участке, адекватно отображаемые Са2+-чувствительным флуорофором. Интенсивность Са2+ сигналов в депо модулируется площадью поверхности его мембраны.

Выявлено, что при любом заполнении клетки эндоплазматическим ретикулумом или митохондриями их кинетические характеристики депонирования Са2+ определяются скоростями реакций связывания с транспортными молекулами мембраны депо (их поверхностной плотностью) и ограничиваются насыщением транспортной системы при определенных уровнях Са2+. При разном заполнении дендрита органельным депо увеличение концентрации медленного буфера несколько уменьшало вызванные приложением синаптического стимула цитозольные транзиенты Са2+, не сказываясь на их форме, тогда как быстрый буфер и кинетически подобный ему краситель замедляли фазу нарастания транзиента, уменьшали ранний и увеличивали поздний компоненты последнего.

Установлено, что локальное депонирование и буферизация Са2+ зависят не только от внешнего синаптического действия, но и от пространственного паттерна собственной электрической активности нейрона из-за существенно отличных условий функционирования депо и буферов на участках асимметричных дендритов, где существенно отличаются собственные электрические процессы, а следовательно и поступление Са2+. При этом по своим кинетическим характеристикам связывание Са2+ медленным эндогенным буфером подобно депонированию ЭР. Таким образом, имеет место не только прямая зависимость динамики Са2+ от локальной микрогеометрии дендрита, но опосредованная - от глобальной макрогеометрии ветвления.

Ключевые слова: динамика Са2+, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, субклеточная микрогаометрия, кальциевые буферы, флуорофор, нейрон Пуркинье, динамическая фиксация потенциала.

SUMMARY

Novorodovska T. S. Impact of structure-dependent organellar and non-organellar calcium binding on intracellular signalization. Model study. - Manuscript.

Thesis for a сandidate's degree by specialty 03.00.02 - Biophysics. -Dniepropetovsk Oles Gonchar National University, Dniepropetovsk, 2010.

Features of structure-dependent Ca2+ dynamics in the small-size parts of neurons occupied by the cytosol, non-organellar buffers and organellar stores (endoplasmic reticulum or mitochondria) and exchanging Ca2+ were investigated using computer models developed by the author.

Quantitative characteristics of modulatory impact of ratio of the membrane area to organelle-free volume on Са2+ signals in a dendritic compartment, which are adequately displayed by Ca2+-sensitive fluorophore, were obtained. Ca2+ signal intensity in the store was determined by the membrane area of the latter. It was revealed that for any intracellular space occupancy by the stores their Ca2+ storing kinetic characteristics were determined by the rates of Ca2+ binding to transport molecules in the store membrane (their surface density) and were limited by the saturation of the transport system at certain levels of Ca2+. Са2+ binding by slow endogenous buffer and storing by endoplasmic reticulum are similar in their kinetic characteristics.

It was established that local Са2+ storing depends not only on external synaptic action, but also on spatial pattern of intrinsic electrical activity because of essentially different condition of the store functioning is the compartments of asymmetrical dendrites, where intrinsic electrical processes and therefore Са2+ entry significantly differ.

Hence, there is not only direct dependence of Са2+ dynamics on local microgeometry of a dendrite, but also indirect one on the global arborization macrogeometry.

Keywords: Ca2+ dynamics, endoplasmic reticulum, mitochondria, sub-cellular microgeometry, calcium buffers, fluorophore, Purkinje neuron, dynamic voltage clamp

...