Гіпоксичне та гіпертермічне прекондиціювання міокарду у щурів і його вікові особливості

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

УДК [612.272+616.132]:577.125/.175.5

ГІПОКСИЧНЕ ТА ГІПЕРТЕРМІЧНЕ ПРЕКОНДИЦІЮВАННЯ

МІОКАРДУ У ЩУРІВ І ЙОГО ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВАСИЛЕНКО МАРИНА ІГОРІВНА

Київ - 2010



Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця Національної Академії наук України

Науковий керівник: доктор медичних наук, академік НАН України Мойбенко Олексій Олексійович, завідувач відділом загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Ільїн Володимир Миколайович, завідувач кафедрою біології спорту Національного університету фізичної культури і спорту

доктор медичних наук, професор Ткаченко Михайло Миколайович завідувач кафедрою радіології та радіаційної медицини Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця

Захист відбудеться «9» листопада 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої Ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця,4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ, вул. Богомольця,4).

Автореферат розісланий «8» жовтня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна



АНОТАЦІЯ

Василенко М.І. Гіпоксичне та гіпертермічне прекондиціювання міокарду у щурів і його вікові особливості. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата біологічних наук за фахом 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Інститут фізіології ім.. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено дослідженню вікових особливостей процесу розвитку стану пізньої кардіопротекції, індукованого впливом гострої гіпоксичної гіпоксії та гострої гіпертермії, та визначенню можливих механізмів цих видів прекондиціювання. Розроблено нові режими гострого гіпоксичного та гострого гіпертермічного впливів, які індукують ефект пізнього прекондиціювання міокарду та описано зміни кардіодинамічних, біохімічних та морфологічних характеристик міокарда щурів в умовах запропонованих моделей відстроченого прекондиціювання. Виявлено різницю між рівнями експресії iNOS у міокарді молодих та зрілих щурів (у молодих тварин цей показник вдвічі вищий, ніж у зрілих) та між такими рівнями у різних шлуночках серця (у правому шлуночку молодих і зрілих тварин цей рівень вищий, ніж у лівому, на 80% та на 20%, відповідно). Виявлено протилежну спрямованість змін рівнів експресії iNOS у міокарді молодих та зрілих щурів після гострої гіпоксичної гіпоксії - зростання у перших та зниження у других. Показано зв'язок рівнів експресії iNOS у міокарді зі ступенем кардіопротекції при ішемії-реперфузії ізольованого серця. Обґрунтовано необхідність розділення загальної вікової групи дорослих щурів на групи „дорослих молодих” та „дорослих зрілих”, як таких, що мають істотні відмінності у низці фізіологічних характеристик (зокрема, різну реактивність міокарду).

Ключові слова: гіпоксія, гіпертермія, пізнє прекондиціювання, кардіопротекція, ішемія міокарда, вікові особливості прекондиціювання.



АННОТАЦИЯ

Василенко М.И. Гипоксическое и гипертермическое прекондиционирование миокарда у крыс и его возрастные особенности. - Рукопись. міокарда кардіопротекція гіпоксія гіпертермія

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Институт физиологии НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию возрастных особенностей процесса развития состояния отсроченной кардиопротекции, индуцированного воздействием острой гипоксической гипоксии и острой гипертермии, а также определению возможных механизмов развития этих видов прекондиционирования. Эксперименты выполнены на 150 белых крысах-самцах линии Вистар, 6-ти и 8-ми месячного возраста, весом 200-500г.

Для моделирования отсроченного прекондиционирования использовали два типа воздействия. В рамках первой модели животных подвергали воздействию острой умеренной гипоксической гипоксии - помещали в камеру, вентилируемую газовой смесью (10% О2 та 90% N2), при комнатной температуре на 1 или 3 часа. В рамках второй модели животных подвергали воздействию острой умеренной гипертермии, помещая в термостатированную камеру с температурой 40оС и нормоксической газовой средой (атмосферным воздухом), на 10 или 30 минут.

Через 24 часа после указанных воздействий у половины животных каждой группы под уретановым наркозом извлекали сердце, разделяя левый и правый желудочки. Образцы органов моментально замораживали в жидком азоте. У остальных животных извлекали сердце для определения степени кардиопротекции при ишемии-реперфузии (препарат изолированного сердца по Лангендорфу).

Обнаружено различие между уровнями экспрессии iNOS в миокарде молодых и зрелых крыс (у молодых животных этот показатель вдвое выше, чем у зрелых) и между этими уровнями в разных желудочках сердца (в правом желудочке молодых и зрелых животных этот уровень выше, чем в левом, на 80% и на 20%, соответственно). Выявлена противоположная направленность изменений уровней экспрессии iNOS в миокарде молодых и зрелых крыс после острой гипоксической гипоксии - возрастание у первых и снижение у вторых. Показана связь уровней экспрессии iNOS в миокарде со степенью кардиопротекции при ишемии-реперфузии изолированного сердца. Обоснована необходимость разделения общей возрастной группы взрослых крыс на группы «взрослых молодых» и «взрослых зрелых», как имеющих существенные различия некоторых физиологических характеристик (в частности, разную реактивность миокарда).

Ключевые слова: гипоксия, гипертермия, позднее прекондиционирование, кардиопротекция, ишемия миокарда, возрастные особенности прекондиционирования.



SUMMARY

M.I. Vasylenko. Hypoxic and hyperthermic preconditioning of the myocardium in rats: age-related peculiarities. -- A manuscript.

Thesis for the Candidate of Biology degree; specialty 03.00.13 -- physiology of animals and humans. -- A.A. Bogomolets Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kyiv, 2010.

The study is aimed at estimation of age-related peculiarities of development of the late cardioprotection state induced by the influences of acute hypoxic hypoxia and acute hyperthermia and at identification of possible mechanisms of these types of preconditioning. Novel modes of hypoxic and hyperthermic sessions inducing the effect of late preconditioning of the myocardium in rats have been developed. Modifications in the cardiodynamics and biochemical and morphological characteristics of the myocardium related to this state are described; special attention is paid to the role of NOS in the development of the preconditioning effect. It was found that the levels of iNOS-expression in the myocardium of young and mature adult rats are dissimilar (in young animals, this index is twofold higher than that in mature ones). The levels of expression of this enzyme in different heart ventricles also differ from each other (in the right ventricle, this index is higher than that in the left one; the difference is 80% and 20 % in young and mature animals, respectively). The iNOS expression in the myocardium of young and mature rats changes after acute hypoxic hypoxia in different directions: expression of this enzyme increases in the former animals and drops in the latter ones. It is concluded that a general age group of adult rats should be divided into the subgroups of adult young and adult mature animals. These subgroups demonstrate significant specificities of a number of physiological characteristics (dissimilar reactivity of the myocardium in particular).

Key words: hypoxia, hyperthermia, late preconditioning, cardioprotection, ischemia of the myocardium, age related peculiarities of preconditioning.



ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Захворювання серцево-судинної системи посідають головне місце серед причин смерті у розвинених країнах. В Україні цей показник становить 65% від загальної смертності. У зв'язку з цим важливим є вивчення кардіопротекторних механізмів, зокрема механізмів феномена прекондиціювання міокарду, при якому досягається захист тканин серця від важкого ішемічного ушкодження за допомогою попереднього впливу різних чинників. Murry із співробітниками у 1986 р. показали, що попередні короткочасні цикли ішемії-реперфузії в значній мірі зменшують розміри некротичної ділянки при гострому інфаркті міокарду в експерименті. Цей феномен має двофазний характер: перша (рання) фаза триває 2-3 год після впливу індуктора, а друга (пізня) фаза починається через 12-24 год і триває 3-4 доби (Kuzuya та ін., 1993, Marber та ін., 1993). Ця фаза отримала назву пізнього прекондиціювання. У зв'язку з потенційною можливістю використання цього феномена для боротьби з гострим інфарктом міокарду пізнє прекондиціювання стало об'єктом пильної уваги як вчених, так і клініцистів. Завдяки широким дослідженням були виявлені різні фармакологічні і нефармакологічні чинники, що викликають цей стан. Це тепловий стрес (Currie та ін., 1988), шлуночкова тахікардія (Kaszala та ін., 1996), фізичне навантаження (Yamashita та ін., 1999), введення ендотоксину (Brown та ін. 1989), інтерлейкіну-1 (Brown та ін., 1990), TNF-альфа (Brown та ін., 1992), TNF-бета (Nelson та ін., 1995), реактивних метаболітів кисню (Sun та ін., 1996), донорів NO (Takano та ін., 1998), агоністів аденозинових рецепторів (Baxter та ін., 1994) та інших. В той же час механізми можливого гіпоксичного та гіпертермічного прекондиціювання досі визначені недостатньо.

Особливо важливим питанням є вивчення динаміки та механізмів розвитку стану прекондиціювання у зрілому та похилому віці. Вікові зміни у структурі та функціонуванні серцево-судинної системи, а також залежне від віку зростання захворюваності на інфаркт міокарду зумовлюють високу актуальність пошуку механізмів цих змін та можливостей їх профілактики у відповідного вікового контингенту. Проте дослідження в цій області поки що носять досить розрізнений характер (Gray, 2000, Abete, 2001, Honma, 2002), що не дає можливості сформувати узагальнену картину розвитку стану прекондиціювання в онтогенезі.

Виходячи з цього, актуальним є пошук нових моделей прекондиціювання, придатних для застосування в клінічній практиці, а також дослідження механізмів їх кардіопротективної дії та вікових особливостей.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в ході виконання теми НДР відділу загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України „Дослідження ендогенних механізмів кардіопротекції при захворюваннях серця ” (№ ДР 0107U005323) та в рамках наукового проекту „Дослідження молекулярно-генетичних механізмів кардіопротекції при впливі високогірної гіпоксії ” комплексної програми НАН України „Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини ”.

Мета роботи. В експериментах на щурах встановити вікові особливості розвитку кардіопротекції при пізньому прекондиціюванні гіпоксичного та гіпертермічного генезу та дослідити можливі механізми розвитку цих видів прекондиціювання .

Завдання.

1. Розробити методи відтворення пізнього прекондиціювання при впливах гострої помірної гіпоксії та гострої гіпертермії.

2. Дослідити розвиток пізнього прекондиціювання гіпоксичного генезу у щурів молодого та зрілого віку, визначивши зміни кардіодинаміки, кардіоритмогенезу, вивільнення фермента-маркера пошкодження міокарду (лактатдегідрогенази) та ультраструктури міокарду при ішемії-реперфузії ізольованого серця.

3. Вивчити розвиток пізнього прекондиціювання гіпертермічного генезу у щурів молодого та зрілого віку, визначивши зміни кардіодинаміки, кардіоритмогенезу, вивільнення лактатдегідрогенази та ультраструктури міокарду за тих же умов.

4. Визначити рівні експресії маркерного фермента прекондиціювання iNOS у міокарді правого та лівого шлуночка щурів при гіпоксичному та гіпертермічному прекондиціюванні.

5. Визначити роль iNOS у формуванні кардіопротективних ефектів прекондиціювання гіпоксичного і гіпертермічного ґенезу за допомогою застосування специфічного блокування iNOS під час ішемії-реперфузії ізольованого серця.

Об'єктдослідження - феномен пізнього прекондиціювання міокарду у щурів.

Предмет дослідження - механізми розвитку пізнього прекондиціювання міокарду гіпоксичного та гіпертермічного генезу та їх вікові особливості.

Методи дослідження. В роботі використані наступні методичні підходи: фізіологічний (індукція ефекту прекондиціювання під впливом контрольованих епізодів гіпоксії та гіпертермії різної тривалості, реєстрація характеристик скоротливої функції препарату ізольованого серця в умовах ішемії-реперфузії), біохімічний (визначення активності лактатдегідрогенази в перфузатах ізольованого серця), молекулярно-біологічний (визначення експресії iNOS у зразках тканин міокарда за методом імуноблотингу) та морфологічний (електронна мікроскопія зразків тканини міокарда).

Наукова новизна одержаних результатів. В експериментах на тваринах розроблено нові режими гострого гіпоксичного та гіпертермічного впливів, які індукують ефект пізнього прекондиціювання міокарду. Вперше описано зміни кардіодинамічних, біохімічних та морфологічних характеристик міокарда щурів в умовах запропонованих моделей відстроченого прекондиціювання.

Вперше виявлено різницю між рівнями експресії iNOS у міокарді молодих та зрілих щурів (у молодих тварин цей показник майже вдвічі вищий, ніж у зрілих) та між такими рівнями у різних шлуночках серця (у правому шлуночку молодих і зрілих тварин цей рівень вищий, ніж у лівому).

Виявлено протилежну спрямованість змін рівнів експресії iNOS у міокарді молодих та зрілих щурів після гострої гіпоксичної гіпоксії - значне зростання у перших та зниження у других.

Обґрунтовано необхідність розділення загальної вікової групи дорослих щурів на групи „дорослих молодих” та „дорослих зрілих”, як таких, що мають істотні відмінності у низці фізіологічних характеристик (зокрема, різну реактивність міокарду).

Практичне значення одержаних результатів. Показано специфіку формування феноменів пізнього прекондиціювання, спричинених дією гострої гіпоксичної гіпоксії та гострої гіпертермії. Виявлено різницю у формуванні пізнього прекондиціювання у молодих і зрілих щурів та з'ясовано деякі механізми, що пояснюють цю різницю. Ці дані можуть бути використані при викладанні фізіології та патофізіології у навчальних закладах медико-біологічного профілю.

Розроблено методики гіпоксичного і гіпертермічного прекондиціювання міокарда, які дозволяють підвищити коректність виконання досліджень у даній галузі; відповідні розробки у майбутньому можуть бути адаптовані для використання у клініці.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено пошук та наукове обґрунтування області досліджень, здійснено аналіз наукової літератури та систематизацію літературних даних. Самостійно проведено весь обсяг експериментальних досліджень, виконано статистичну обробку. У взаємодії з науковим керівником проаналізовано отримані дані, сформульовані основні висновки роботи. Самостійно підготовлені до публікації матеріали за основними результатами експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені та обговорювалися на 20 наукових з'їздах, конференціях та симпозіумах, з яких 13 - міжнародних, в тому числі на IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004 р.), ISHR European Section Meeting (Dresden, Germany, June 2-6, 2004), 26^th ISHR European section Meeting (Manchester, Great Britain, June 14-17, 2006), VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (Moscow, Russia, June 21-24, 2006) та на засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (10 червня 2009 р.).

Наукові публікації. Матеріали дисертації викладено в 7 статтях у наукових фахових виданнях та у 20 тезах доповідей на наукових конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 120 сторінках та ілюстровано 33-ма рисунками. Текст дисертації вміщує вступ, огляд літератури, опис методики, 4-и глави результатів, обговорення та аналіз цих результатів, висновки та список літератури, в якому наведено 9 джерел кирилицею та 148 - латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експерименти було проведено на 150 щурах-самцях лінії Вістар, віком 6 та 12 місяців.

Індукція відстроченого прекондиціювання

Для створення відстроченого прекондиціювання використовували два види впливів. У рамках першої моделі тварин піддавали впливу гострої помірної гіпоксичної гіпоксії. Щурів вміщували у вентильовану камеру з гіпоксичною газовою сумішшю (10% О₂ та 90% N₂) при кімнатній температурі. Сеанси гіпоксії тривали 1 або 3 год. У рамках другої моделі індукції прекондиціювання тварин піддавали впливу помірної гіпертермії, вміщуючи у термостатовану камеру з температурою 40^оС та нормоксичним газовим середовищем (атмосферним повітрям). Сеанси гіпертермії тривали 10 або 30 хв.

Через 24 год після вказаних впливів у половини тварин кожної групи під уретановим наркозом (1500 мг/кг) вилучали серце, розділяючи правий та лівий шлуночки, та препарували аорту і легені. Зразки органів миттєво заморожували у рідкому азоті. У решти тварин усіх груп вилучали серце для визначення ступеню кардіопротекції в умовах ішемії-реперфузії.

Визначення фізіологічних, біохімічних та морфологічних показників

Ізольоване серце ретроградно перфузували за Лангендорфом оксигенованим розчином Кребса через аорту протягом 20 хв. Після цього ізольоване серце піддавали 30-хвилинній тотальній нормотермічній ішемізації з наступною 40-хвилинною реперфузією. Реєстрували коронарний перфузійний тиск та тиск у лівому шлуночку (за допомогою латексного балончика та тензодатчиків). Визначали тривалість збереження скорочень після початку ішемії та затримку їх відновлення після початку реперфузії. Протягом реперфузії вимірювали коронарний потік та відбирали зразки перфузату для визначення активності лактатдегідрогенази (ЛДГ).

Активність ЛДГ у перфузатах визначали з використанням набору реактивів та протоколу LDH 500 (Sigma, США).

Зразки тканини верхівкової ділянки міокарда фіксували у глутаральдегіді та OsO₄, зневоднювали та заливали в епоксидну смолу (Епон). Ультратонкі зрізи (40-60 нм завтовшки) контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю та вивчали за допомогою електронного мікроскопа.

Визначення експресії iNOS

Експресію iNOS у заморожених зразках тканин визначали методом імуноблотингу (Western blotting) згідно з протоколами BIO-RAD Labs (США). Зразки супернатанту після гомогенізації тканин, лізису, центрифугування та денатурації розділяли за допомогою вертикального гель-електрофорезу у 7,5%-му поліакриламідному гелі у системі SDS-PAGE з використанням установки Mini Protean 3 (BIO-RAD, США). Трансфер (1 год при 100 V і 0,35 А) проводили з використанням установки Mini Transblot Cell (BIO-RAD, США). Якість розділення та трансферу перевіряли за допомогою забарвлення відповідними барвниками.

Мембрану після трансферу білків блокували та інкубували 2 год з поліклональними антитілами до iNOS щура та, після відмивання, з антитілами до кролячого IgG (Sigma, США) протягом 1 год. iNOS виявляли за допомогою набору ExtrAvidin Peroxidase Staining Kit (Sigma, США). Забарвлену мембрану піддавали скануванню та комп'ютерній денситометрії. Результати представляли в умовних одиницях (у.о.) інтенсивності забарвлення.

Результати досліджень та їх обговорення

Гіпоксичний вплив протягом 1 год. не чинив значного впливу на тривалість періоду збереження ефективних скорочень після початку ішемії у порівнянні з контролем в обох вікових групах (Рис. 1). Щодо гіпоксичного прекондиціювання протягом 3 год., то у групі молодих тварин спостерігалася збільшення згаданого періоду в середньому на 24%, а у групі зрілих тварин - на 46% (р<0,05) у порівнянні з контролем (Рис. 1). Інтервал до початку відновлення скорочень з моменту початку реперфузії в обох групах тварин вірогідно не змінювався.

Кількість випадків фатальних аритмій після годинної гіпоксії в обох вікових групах була майже у два рази більшою, ніж у контрольних тварин. В той же час тригодинна гіпоксія викликала зменшення цього показника у молодих тварин більше, ніж удвічі, а у зрілих - взагалі запобігала появі аритмій.

Скоротливу активність міокарду оцінювали за динамікою тиску у лівому шлуночку протягом реперфузії.

У молодих тварин одногодинна гіпоксія не викликала істотних змін даного показника, а тригодинна зумовлювала його зростання та стабілізацію у порівнянні з контролем. У зрілих щурів такого ефекту не спостерігалося.

Як кореляти ступеню пошкодження міокарда визначали зміни активності ЛДГ у перфузаті, що відтікає, та морфологічні прояви деструкції тканин міокарду (за допомогою електронної мікроскопії).

У молодих тварин гіпоксичне прекондиціювання зумовлювало істотне зменшення активності ЛДГ (на 57%, р<0,05). У зрілих подібний ефект був слабким і спостерігався лише протягом останнього періоду реперфузії.

Дані морфологічних досліджень свідчили, що гіпоксичне прекондиціювання забезпечує істотне зменшення морфологічних проявів ішемічно-реперфузійного ушкодження міокарда в обох вікових групах. У зразках від тварин, підданих перед ішемією гіпоксії тривалістю 3 год були відсутні пошкодження, характерні для ішемії-реперфузії. Тканина міокарда практично відповідала інтактній, в ній були повністю збережені як м'язові волокна, так і мітохондріальний апарат.

Отримані в цій частині роботи дані свідчать про те, що помірна гіпоксична гіпоксія тривалістю 3, але не 1 год. викликає виражений ефект пізнього прекондиціювання міокарда, що узгоджується з даними, отриманими в одночасних експериментах на мишах (Хі та ін. 2002). При цьому у молодих тварин цей ефект проявлявся майже за усіма визначеними показниками: покращувалися параметри скоротливої активності міокарда, спостерігався виразний протиаритмічний ефект, зменшувалися структурні прояви пошкодження тканини міокарда. В той же час у зрілих щурів прояви збереження тканин міокарда були лише частковими, а ступінь порушення скоротливої активності взагалі не змінювався. Наявність у однієї вікової групи ознак пізнього прекондиціювання, які відсутні у іншої, свідчить про те, що ці прояви забезпечуються різними механізмами, які є у однієї групи тварин і відсутні або послаблені у іншої. Це підтверджує припущення R. Bolli (2001) про наявність багатьох механізмів реалізації ефектів пізнього прекондиціювання.

Ефекти гіпертермічного прекондиціювання досліджувалися за тією самою схемою, що і прояви гіпоксичного прекондиціювання.

Гіпертермічні впливи тривалістю 10 або 30 хв. зумовлювали у зрілих щурів збільшення тривалості ефективних скорочень міокарда в умовах ішемії у 1,5 рази у порівнянні з контролем (р<0,05). У молодих тварин подібний ефект був відсутнім.

Кількість випадків фатальних аритмій у молодих тварин після 10-хвилинної гіпертермії була майже на 50% більшою, ніж у контролі. В той же час 30-хвилинні епізоди викликали зменшення цього показника в даній групі на третину. У зрілих тварин як 10-, так і 30- хвилинні гіпертермічні впливи зумовлювали збільшення відносної кількості фатальних аритмій у порівнянні з контролем більш, ніж у 1,5 рази.

Що ж до скоротливої активності міокарду, гіпертермічні впливи тривалістю як 10, так і 30 хв забезпечували помірне зростання та стабілізацію тиску у лівому шлуночку протягом реперфузії у порівнянні з контролем, але тільки у зрілих щурів. У молодих тварин такий ефект був практично відсутнім.

В обох вікових групах гіпертермічне прекондиціювання не зменшувало активності ЛДГ у міокарді щурів, підданому ішемізації.

Морфологічні дослідження показали, що в обох вікових групах тварин попередня гіпертермія протягом 10 хв. призводила до помітного зменшення пошкоджень міокарда під час ішемії-реперфузії у порівнянні з контролем. Після 30-хвилинної гіпертермії у молодих тварин спостерігалася практична відсутність набряку структур міокарду. Тканина, проте, дещо ущільнювалась, мало місце порушення поперечної посмугованості міоцитів. В останніх були наявні вакуолі з рештками зруйнованих мітохондрій; кількість цих органел зменшувалась. Вцілілі мітохондрії мали везикулярні кристи.

У зрілих тварин при збільшенні тривалості гіпертермії до 30 хв. постішемічні гістологічні зміни мали мозаїчний характер. Поруч з неушкодженими ділянками міокарду спостерігалися регіони з сильними порушеннями структури, аж до повного руйнування мембран клітин з виходом у міжклітинні простори білків та фрагментів клітинних структур.

Отримані в цій частині роботи дані свідчать про те, що ефекти помірної гіпертермії значно відрізняються від ефектів гіпоксії. Викликане гіпертермією пізнє прекондиціювання проявлялося у деякому зниженні кількості фатальних аритмій у молодих тварин та кращому збереженні скорочень міокарду з моменту початку ішемії у зрілих. Ступінь пошкодження тканини міокарду при 10-хвилинному гіпертермічному впливі зменшувався в обох групах. Але при 30-хвилинному впливі в обох групах спостерігалися і негативні ефекти - зростання кількості фатальних аритмій у зрілих тварин та значні структурні мозаїчні зміни тканини міокарда.

Зважаючи на існуючі дані про значну роль iNOS у формуванні феномену пізнього прекондиціювання різного генезу, ми вважали цікавим з'ясувати роль цього ензиму у запропонованих моделях прекондиціювання. Для цього було застосовано специфічний блокатор активності iNOS - РВІТ (кінцева концентрація у розчині - 50 нмоль/л). Було встановлено, що блокування активності iNOS повністю усуває ефект прекондиціювання щодо тривалості збереження скорочень з початку ішемії як після гіпоксичного, так і після гіпертермічного впливів, причому в обох вікових групах (Рис. 1 та 4)). Аналогічна картина спостерігалася і щодо кількості фатальних аритмій: блокування активності iNOS повністю усувало ефект прекондиціювання в обох вікових групах тварин.

Блокування iNOS також повністю відміняло ефект гіпоксичного прекондиціювання щодо скоротливої активності міокарду, але цей ефект проявлявся лише у молодих тварин. Для гіпертермічного прекондиціювання картина була зворотньою: вплив блокування iNOS на ефект прекондиціювання у молодих тварин був істотно меншим, ніж у зрілих.

Що ж до морфологічних змін у тканинах міокарду, то при гіпоксичному прекондиціюванні блокування активності iNOS лише частково відміняло протективний ефект в обох групах тварин.

Одержані дані свідчать, що і гіпоксичне, і гіпертермічне прекондиціювання базується на множинних механізмах, причому деякі ефекти є залежними від iNOS, а деякі - ні. Наявність відчутної різниці таких ефектів у вікових групах досліджених тварин говорить про те, що механізми індукції та розвитку прекондиціювання у цих групах відрізняються кількісною, а у деяких випадках навіть якісною специфікою.

Для з'ясування ролі iNOS у феномені прекондиціювання визначали рівень експресії цього білку в тканинах міокарда щурів обох вікових груп за допомогою імуноблотингу та оцінювали зв'язок цих показників із ефектами запропонованих режимів прекондиціювання. Виявилося, що існує значна різниця між рівнями експресії iNOS в згаданих умовах як у тварин вивчених вікових груп, так і в одних і тих самих групах, але в різних ділянках міокарду. Так, у молодих тварин експресія iндуцибельної NO-синтази у правому і лівому шлуночках серця значно розрізнялася. Вихідний рівень такої експресії в правому шлуночку був у середньому на 117% вищим, ніж у лівому (Р<0,001, Рис.6). Зміни даного показника після дії гострої гіпоксії варіювали в межах 10-15% у правому шлуночку та 50-60% - у лівому. При цьому вірогідне зростання експресії iндуцибельної NO-синтази у тканинах міокарда викликала лише 3-годинна гіпоксія.

У зрілих тварин вихідні рівні експресії iNOS у правому та лівому шлуночках були практично рівними; ці значення були співставними з рівнем експресії iNOS у лівому шлуночку молодих тварин. Вірогідну зміну цих показників викликала також лише 3-годинна гіпоксія, причому, на відміну від молодих, вона призводила до зменшення, а не збільшення експресії iNOS. Гіпертермічне прекондиціювання у молодих тварин призводило до невеликого, але вірогідного (Р<0,05) збільшення рівня iNOS у правому шлуночку та істотного різкого збільшення в лівому. У зрілих же тварин в цих умовах зміни рівнів iNOS були дуже значними, причому напрямок змін у правому та лівому шлуночках виявився протилежним - в правому спостерігалося шестиразове зменшення, а у лівому даний показник зростав на 50-100%.

Слід підкреслити, що ці дані добре співвідносяться з показниками ефектів прекондиціювання. Зростання експресії iNOS відповідає виразності проявів пізнього прекондиціювання, які відміняються в результаті блокування активності цього ензиму. Одержані результати узгоджуються з даними літератури, які свідчать про зростання pівнів експресії iNOS у міокарді щурів після впливу хронічної (Rouet-Benzineb, 1999) та інтервальної (Ding 2005, Chien 2006) гіпоксії а також у різних клітинних лініях після гіпоксичного культивування (Jiang, 2002, 2008; Lu, 2006). Подібні результати одночасно з нами були отримані у дослідах на мишах, де через 24 год після 4-годинного епізоду гіпоксії (10% О₂) спостерігалося зростання pівнів експресії iNOS у міокарді у два-три рази (Хі, 2002). На жаль, наразі в літературі даних щодо змін рівнів експресії iNOS, пов'язаних з гіпертермією, дуже мало і вони значною мірою суперечливі. Є повідомлення як про зростання цих рівнів після гіпертермії, так і про відсутність впливу гіпертермії на експресію iNOS у міокарді щурів (Yang, 2005) та у кардіоміоцитах (Ilangovan, 2004), що може бути наслідком різних умов експериментів. Таким чином, результати нашої роботи показали принципову можливість використання нефармакологічних факторів - гіпоксичної гіпоксії та гіпертермії помірної інтенсивності та тривалості - для індукції феномену пізнього прекондиціювання, в якому стійкість міокарда по відношенню до ішемії-реперфузії суттєво підвищується. Ці протективні зміни значною мірою пов'язані з відповідними змінами у системі iNOS. Також ми виявили помітну різницю у процесах розвитку феномана пізньої прекондиції у тварин 6-ти та 12-ти місячного віку, що свідчить про різну чутливість до позитивних прекондиціюючих та негативних ушкоджуючих впливів. Ці дані вказують на доцільність більш детальної диференціації вікових груп експериментальних тварин, які, вочевидь, характеризуються різною стійкістю серцево-судинної системи (а, можливо, й інших систем організму) до пошкоджуючих впливів різноманітної природи.



ВИСНОВКИ

Дисертаційну роботу присвячено розробленню нових режимів пізнього прекондиціювання міокарда - гіпоксичного та гіпертермічного - та дослідженню вікових особливостей цього прекондиціювання. Показано різницю кардіопротективних ефектів та механізмів їх розвитку у молодих та зрілих тварин.

1. Розроблено нові режими пізнього прекондиціювання у щурів - за допомогою впливу помірної гіпоксичної гіпоксії протягом 3 год (гіпоксичне прекондиціювання) та помірної гіпертермії протягом 10 хв (гіпертермічне прекондиціювання).

2. Гіпоксичне прекондиціювання молодих щурів характеризується кардіопротективним впливом, що призводить до зростання на 21% та стабілізації тиску у лівому шлуночку протягом реперфузії, зниження частоти виникнення фатальних аритмій на 12%, зменшення активності лактатдегідрогенази на 30% та зменшення морфологічних проявів ішемічно-реперфузійного ушкодження міокарда у порівнянні з контролем. Гіпоксичне прекондиціювання у зрілих щурів має більш виразний протиаритмічний вплив, але меншою мірою впливає на вивільнення лактатдегідрогенази та скоротливу функцію серця.

3. Кардіопротективний ефект гіпертермічного прекондиціювання у молодих тварин проявляється у зменшенні морфологічних проявів ішемічно-реперфузійного ушкодження міокарда та тенденції до зростання тривалості ефективних скорочень після початку ішемії. Гіпертермічний вплив у зрілих щурів викликає зростання тривалості ефективних скорочень після початку ішемії на 50%, зростання на 40% та стабілізацію тиску у лівому шлуночку протягом реперфузії, зменшення морфологічних проявів ішемічно-реперфузійного ушкодження міокарда. Збільшення тривалості гіпертермічного впливу до 30 хв поряд з кардіопротективним впливом викликає пошкодження тканин міокарду.

4. Вихідні рівні експресії iNOS у міокарді суттєво відрізняються у досліджених вікових групах (у молодих у 2 раиз вищий, ніж у зрілих) і є різними у правому та лівому шлуночках. Гіпоксичне прекондиціювання призводить до зростання рівня iNOS у молодих щурів (у 2 рази) та до зниження його у зрілих. Гіпертермічне прекондиціювання у молодих тварин призводить до різкого збільшення рівня експресії iNOS лише у лівому шлуночку.

5. Механізми розвитку досліджених ефектів пізнього прекондиціювання є iNOS-залежними, але різною мірою. Введення специфічного блокатора iNOS практично повністю нівелює ефекти гіпоксичного прекондиціювання за всіма показниками у молодих щурів, тоді як у зрілих щурів блокада iNOS не впливає на скоротливу функцію міокарда та активність лактатдегідрогенази. Ефекти гіпертермічного прекондиціювання в обох вікових групах лише частково залежать від блокування iNOS. Це вказує на відмінності механізмів кардіопротекції при прекондиціюванні різного ґенезу та їх модифікацію з віком.

6. Зміни у міокарді молодих і зрілих щурів в умовах гіпоксичного і гіпертермічного прекондиціювання демонструють істотні кількісні, а в деяких випадках і якісні відмінності. Це вимагає визнання даних вікових груп щурів як принципово різних за своїми фізіологічними властивостями.



ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

1. Василенко М.І. Ультраструктурні зміни міокарда при гіпертермічному прекондиціюванні та ішемії-реперфузії ізольованого серця щурів: роль iNOS / Портниченко А.Г., Розова К.В., Василенко М.І., Мойбенко О.О. // Здобутки клін. і експерим. медицини. - 2007. - №2.- С.127-131. (Здобувачем частково виконано експериментальну частину та підготовлено матеріал до друку)

2. Василенко М.І. Ультраструктурні зміни міокарду при гіпоксичному прекондиціюванні та ішемії-реперфузії ізольованого серця щурів: вікові особливості / Портниченко А.Г., Розова К.В., Василенко М.І., Мойбенко О.О. // Фізіол. журн.- 2007.- 53, №4.- С. 27-34. (Здобувачем частково виконано експериментальну частину та підготовлено матеріал до друку)

3. Василенко М.І. Механізми пізньої кардіопротекції при гіпертермії / Портниченко А.Г., Василенко М.І., Мойбенко O.O. // Матер. ІІ Міжнар. наук. конф. „Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка”. - Одеса, 2005. - С. 200-202. (Здобувачем частково виконано експериментальну частину та повністю підготовлено матеріал до друку)

4. Василенко М.И. Острая гипоксическая гипоксия как индуктор отсроченной кардиопротекции у крыс / Портниченко А.Г., Василенко М.И., Портниченко В.И., Мойбенко А.А. // Гипоксия, автоматизированный анализ гипоксических состояний. Сб. трудов под ред. А.З.Колчинской. - Москва-Нальчик, 2005. - Т.1.- С.185-190. (Здобувачем частково виконано експериментальну частину та підготовлено матеріал до друку)

5. Василенко М.І. Гіпертермічне прекондиціювання серця та аритмогенез / Василенко М.І., Портниченко А.Г., Мойбенко O.O. // Клін. та експерим. патол.- 2004.- 3, № 2.- С.55-57. (Здобувачем самостійно виконано експериментальну частину та підготовлено матеріал до друку)

6. Василенко М.И. О роли системы оксида азота в патогенезе нарушений сердечно-сосудистой системы при ишемии-реперфузии и гипоксии миокарда / Мойбенко А.А., Портниченко А.Г., Гарматина О.Ю., Юзькив М.Я., Василенко М.И., Коцюруба А.В. // Автоматизированный анализ гипоксических состояний: Сб.трудов.- Нальчик-Москва, 2003.- С.180-184. (Здобувачем частково виконано експериментальну частину та підготовлено матеріал до друку)

7. Василенко М.І. Вплив гострої гіпоксичної гіпоксії на індукцію синтази оксиду азоту у щурів / Портниченко А.Г., Василенко М.І., Мойбенко O.O. // Фізіол. журн.- 2003.- 49, №3.- С.47-49. (Здобувачем частково виконано експериментальну частину та підготовлено матеріал до друку)

Тези доповідей:

1. Портниченко А.Г., Василенко М.И., Мойбенко А.А. Феномен позднего прекондиционирования миокарда: медиаторные и эффекторные механизмы // IV Всероссийская с международным участием школа-конф. по физиологии кровообращения, Москва, 29 янв.-1 февр. 2008. Тез.докл. - Москва, 2008.- С.78.

2. Василенко М.І., Портниченко А.Г., Мойбенко О.О. Взаємозв'язок експресії HSP70 та iNOS у міокарді щурів різного віку при дії гострої гіпоксії // Наук. конф. з міжн. участю «Високогірна гіпоксія і геном», Терскол, Росія, 14-17 серпня 2008. Тези доп. - Фізіол. журн., 2008.- 54, №4.- С. 62.

3. Портниченко А.Г., Василенко М.І., Мойбенко О.О. Фенотиповий репрограмінг міокарду при гіпоксичному прекондиціюванні // VI читання ім. В.В.Підвисоцького: Бюлетень матер. наук. конф., Одеса, 31 травня-1 червня 2007. - Одеса: Одеський держ. мед. університет, 2007. - С.100-101.

4. Портниченко А.Г., Розова К.В., Василенко М.І., Мойбенко О.О. Ультраструктурні зміни міокарду при гіпертермічному прекондиціюванні та ішемії-реперфузії ізольованого серця щурів: роль iNOS // Матер. наук.-практ. конф. «Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів досліджень органів і тканин у нормі та при діагностиці патологічних процесів», Тернопіль, 24-25 травня 2007. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2007. - С. 117.

5. Портниченко А.Г., М.І.Василенко, О.О.Мойбенко. Молекулярно-генетичні механізми кардіопротекції при гіпоксичному прекондиціюванні //Матер. наук.-практ. конф. «Актуальні питання патофізіології», Сімферополь-Ялта, 5-6 жовтня 2006. - Труды Крымского ГМУ им.С.И.Георгиевского.- 2006.- 142, ч.III.- C.244.

6. Portnychenko A., M.Vasylenko, O.Moybenko. Agеing and expression of iNOS in preconditioned hearts //26thEuropean section Meeting of ISHR, 14-17 June 2006, Manchester. Abstracts. J Mol Cell Cardiol, 2006; 40:991.

7. Portnychenko A.G., Portnichenko V.I., Dosenko V.E., Vasylenko M.I., Mankovskaya I.N., Moybenko O.O. Peculiarities of transcription factor and protein expression in rat tissues at high altitude and after hypoxic hypoxia exposure // VIII World Congress of International Society for Adaptive Medicine. Moscow, Russia, June 21-24, 2006. Abstracts. II-10.05. P. 161.

8. Портниченко А.Г., О.О.Мойбенко, М.І.Василенко, О.Ю.Гарматіна. Фенотиповий репрограмінг міокарда: нові методи кардіопротекції //Матер. VII з'їзду Укр. фізіол. тов-ва з міжнар. участю, присв. 125-річчю О.О.Богомольця. Чернівці, 18-20 травня 2006 р. - Фізіол. журн., 2006.- 52, №2.- С. 96-97.

9. Портниченко А.Г., Василенко М.И., Мойбенко А.А. Феномен позднего прекондиционирования миокарда при экстремальных воздействиях // IV Всеросс.конф. с междунар. участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посв. 80-л. Ин-та физиологии им. И.П.Павлова РАН, С.-Петербург, Россия, 4-6 окт 2005. Тез.докл. - CПб, 2005.- С.195-196.

10. Портниченко А.Г., Василенко М.И., Мойбенко А.А. iNOS-зависимые механизмы повреждения миокарда при гипоксическом прекондиционировании // Матер. 4-й Всеросс. конф. (с междунар. участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, Россия, 12-14 окт 2005. - М., 2005.- С. 92.

11. Кукоба Т.В., Портниченко А.Г., Василенко М.І., Мойбенко О.О. Протекторний ефект посилення експресії гемоксигенази-1 у міокарді // ІV читання ім. В.В.Підвисоцького: Бюлетень матер. наук. конф., Одеса, 26-27 травня 2005. - Одеса: Одеський держ. мед. університет, 2005. - С.63-64.

12. MI Vasylenko, AG Portnychenko, OO Moybenko. Acute hyperthermia elicits iNOS-dependent delaeyd cardioprotection from myocardial infarction. 2004 ISHR European Section Meeting. Dresden, Germany, 2-6 June, 2004. Abstracts. J Mol Cell Cardiol 2004; 36: 751, N 112.

AG Portnychenko, OYu Harmatina, MI Vasylenko, OO Moybenko, AV Kotsiuruba. Regulation of iNOS induction in left and right ventricles of heart during delayed cardioprotection from infarction. 2004 ISHR European Section Meeting. Dresden, Germany, 2-6 June, 2004. Abstracts. J Mol Cell Cardiol 2004; 36: 751, N 113.

13. Василенко М.И., Портниченко А.Г., Мойбенко А.А. Отсроченная кардиопротекция после действия острой гипоксии и острой гипертермии у крыс // III Всероссийская с международным участием школа-конф. по физиологии кровообращения, посв. 250-летию МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, 27-30 янв. 2004. Тез.докл. - Москва, 2004.- С.11-12.

14. Портниченко А.Г., Василенко М.И., Мойбенко А.А. Возрастные аспекты прекондиционирования миокарда при гипоксическом воздействии // Механизмы функционирования висцеральных систем: III Всероссийская конф. с международным участием, посв. 175-летию со дня рожд. Ф.В.Овсянникова, Санкт-Петербург, 29 сент.- 1 окт. 2003. Тез.докл. - С.-Петербург, 2003.- С.261.

15. Портниченко А.Г., Василенко М.І., Мойбенко О.О. Вікові особливості міокардіального репрограмінгу при впливі екстремальних факторів// Особливості формування та становлення психофізіологічних функцій в онтогенезі. Матер. Всеукр. наук. симп., Черкаси, 2003. - Київ;Черкаси: Вид-во ЧДУ, 2003.- С.82.

16. Портниченко А.Г., Василенко М.І., Мойбенко О.О. Гомеостатична регуляція індуцибельної синтази оксиду азоту при ішемії-реперфузії міокарда // Гомеостаз: фізіологія, патофізіологія, фармакологія, клініка. Тези доп. Міжнар. наук. конф., Одеса, 18-19 вересня 2003.- С.28-29.

17. А.Г. Портниченко, М.І. Василенко, О.О.Мойбенко. Механізми пізньої кардіопротекції при гіпертермії. // Гомеостаз: фізіологія, патофізіологія, фармакологія, клініка. Тези доп. Міжнар. наук. конф., Одеса, 18-19 вересня 2003.

18. Портниченко А.Г., Василенко М.И., Мойбенко А.А. Влияние острой гипоксической гипоксии на индукцию синтазы оксида азота у крыс // AstroEco-2002. Abstracts. Hypoxia. Ecology. Terskol, Russia, August 12-16, 2002. - Kyiv, 2002.- С. 74.

19. Marina I Vasylenko. Expression of iNOS protein in rat tissues after different extreme actions. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. September 25-27, 2003, Kyiv, Abstracts, p. 138.

Размещено на Allbest.ru

...