Клітинна селекція м’якої пшениці на стійкість до Gaeumannomyces graminis var. tritici

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КЛІТИННА СЕЛЕКЦІЯ М'ЯКОЇ ПШЕНИЦІ НА СТІЙКІСТЬ ДО GAEUMANNOMYCES GRAMINIS VAR. TRITICI

Спеціальність: Генетика

БАВОЛ АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

Київ, 2010 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На врожайність пшениці, важливої сільськогосподарської культури України, впливає багато чинників, у тому числі рівень стійкості до хвороб. Кореневі гнилі вважаються одними з найбільш небезпечних хвороб цієї культури. Офіобольозна коренева гниль, збудником якої є Gaeumannomyces graminis var. tritici, поширена по всій території України, за невеликим виключенням (Новохатка та ін., 1990). Слід врахувати, що збитки від неї значно вищі ніж ті, що наводяться в літературі, оскільки хвороба часто протікає в прихованій формі, коли збудник розвивається в судинах коренів рослин, закупорюючи їх, проте зовні не виявляється. Одним з найбільш екологічно безпечних та дешевих засобів боротьби є вирощування стійких сортів. Проте джерел стійкості до патогену в роді Triticum до цього часу не знайдено (Freeman, Ward, 2004). Гени стійкості до даного збудника є у вівса, проте ці види надто віддалені, щоб здійснити їх перенесення класичними методами. Враховуючи те, що використання традиційних методів селекції у даному випадку неможливе, починають використовувати нетрадиційні підходи, зокрема біотехнологічні (Анапияев и др., 2002). У зв'язку з цим, значні перспективи може мати технологія клітинної селекції, головна перевага якої полягає в можливості ведення добору нових генотипів у контрольованих умовах, зокрема на селективному фоні, створеному за участі токсичних продуктів життєдіяльності патогенних мікроорганізмів. Експериментально доведено, що стійкі до біотичних факторів генотипи можна добирати в культурі in vitro і залучати їх до селекційного процесу (Lu et al., 2000, Калашникова, 2003, Yang et al., 2006). На основі застосування методів селекції in vitro у пшениці вже одержано рослини, стійкі до фузаріозу (Волощук, 2006), септоріозу (Джос, Калашникова, 2000, Лаврова, 2002) та гельмінтоспоріозу (De Cristaldo et al., 1997). Це свідчать про можливість використання біотехнологічних підходів для розширення генетичного потенціалу та поліпшення існуючих генотипів. Застосування методів клітинної селекції потребує поглибленого вивчення низки теоретичних та методичних питань. Зокрема, недостатньо досліджені генетична активність метаболітів патогенів, а також взаємозв'язки прояву стійкості на рівні клітин, тканин і цілого організму. Важливим є вивчення особливостей індукції морфогенезу і сомаклональної мінливості в селективних умовах. На сьогодні ще недостатньо відомостей про мінливість геному пшениці in vitro та впливу умов культивування на спадковий апарат клітин.

Разом з тим, вивчення особливостей геномної мінливості культивованих клітин за дії стресових чинників та отриманих з таких культур рослин-регенерантів буде сприяти встановленню специфічних генетичних механізмів, які обумовлюють мінливість в процесі клітинної селекції та отримання стійких форм. Вирішення цих питань є основою для вдосконалення біотехнологічних прийомів розширення генетичного потенціалу пшениці і отримання стійких генотипів. Крім того, проведення таких робіт є актуальним не тільки в зв'язку із біотехнологічними аспектами застосування нових підходів у селекції, але й для розвитку фундаментальних питань мутагенезу, генетики та молекулярної біології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі генетичних основ гетерозису Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за темою НДР “Розробка біотехнологічних основ використання екологічно безпечних речовин для індукції стійкості рослин до хвороб” (№ держ. реєстрації 0107U004025, 2007-2011 рр.).

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було отримання in vitro стійких до Gaeumannomyces graminis var. tritici рослин пшениці та дослідження особливостей мінливості геному Triticum aestivum L. у процесі добору стійких форм. Відповідно до цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Оптимізувати умови калюсоутворення і регенерації в культурі різних типів експлантів та дослідити вплив біологічно активних речовин на процеси морфогенезу;

2. Розробити ефективну систему селекції in vitro м'якої пшениці на стійкість до Gaeumannomyces graminis var tritici у культурі верхівок пагонів проростків;

3. Вивчити особливості впливу метаболітів патогену на генетичну структуру клітинних популяцій калюсів пшениці у процесі добору стійких форм та рівень плоїдності рослин-регенерантів;

4. Дослідити поліморфізм ДНК калюсних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату G. graminis var. tritici, та індукованих з них рослин-регенерантів;

5. Провести комплексну оцінку стійкості отриманих рослин до збудника офіобольозної кореневої гнилі.

Об'єкт досліджень - стійкість м'якої пшениці до офіобольозної кореневої гнилі.

Предмет досліджень - селекція in vitro Triticum aestivum L. на стійкість до метаболітів Gaeumannomyces graminis var. tritici.

Методи досліджень. Методи культури тканин рослин, клітинної селекції, цитологічні та проточної цитометрії, ISSR-ПЛР, електрофорез ДНК в агарозних гелях, фітопатологічні та методи статистичної обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше біотехнологічним шляхом отримано рослини м'якої пшениці, стійкі до офіобольозної кореневої гнилі. Розроблено комплекс біотехнологічних прийомів, що дозволило удосконалити процес отримання рослин м'якої пшениці de novo із тканин вегетативних органів та підвищити регенераційну здатність калюсних культур, стійких до культурального фільтрату (КФ) G. graminis var. tritici.

Вперше на цитологічному рівні вивчено дію токсичних метаболітів G. graminis var. tritici на клітини калюсних культур м'якої пшениці. З'ясовано, що генотоксична дія КФ проявляється у кластогенних пошкодженнях структури хромосом та спричиняє загибель клітин шляхом некрозу. Встановлено, що стійкі до КФ лінії, характеризуються стабільно-гетерогенною структурою клітинних популяцій, постійним рівнем (5-7%) і схожим типом структурних перебудов хромосом. Показана цитологічна нестабільність рослин-регенерантів, отриманих зі стійких до КФ калюсів. Вперше показано, що стійкі до КФ G. graminis var. tritici калюсні лінії пшениці характеризуються наявністю змін у нуклеотидних послідовностях ДНК. У таких форм виявлено специфічні ISSR-амплікони довжиною 2347 пн та 1745 пн, Ці амплікони, також наявні у стійких рослин-регенерантів R0 та рослин R1, що може свідчити про потенційну можливість їх використання, як маркерів стійкості до офіобользу.

Наукова новизна підтверджена патентом на винахід.

Практичне значення одержаних результатів. Одержано рослини пшениці, стійкі до Gaeumannomyces graminis var. tritici, які можливо використовувати як джерела стійкості до офіобольозної кореневої гнилі. Розроблені методи добору in vitro та оцінки генотипів пшениці на стійкість до офіобольозу можуть застосовуватися, як елементи біотехнологічних, молекулярно-генетичних та селекційних програм.

Обґрунтовано та запропоновано до практичного використання спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних ліній м'якої пшениці, стійких до КФ Gaeumannomyces graminis var. tritici, який дозволяє прискорити процес отримання стійких до офіобольозної кореневої гнилі рослин-регенерантів та збільшити їх кількість. Одержані результати вносять вклад у розробку генетичних основ клітинної селекції пшениці. Матеріали дисертації можуть представляти інтерес для наукових закладів генетико-селекційного напряму та бути використані при викладанні генетики і біотехнології рослин у вузах.

Особистий внесок здобувача. Результати досліджень, представлені у дисертації, одержано автором роботи у відділі генетичних основ гетерозису Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.

Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Бавола А.В. Вибір об'єкту і напрямку досліджень, аналіз та інтерпретацію отриманих результатів проведено спільно з науковим керівником - д. б. н. О.В. Дубровною. Автором особисто досліджені цитологічні та молекулярно-генетичні особливості експериментального матеріалу, розроблено систему клітинної селекції, проведено добір та оцінку стійких форм. Окремі експерименти та аналізи виконано спільно із співробітниками відділів генетичних основ гетерозису та генетичної інженерії ІФРГ НАН України.

Ці дані викладено в спільних публікаціях, авторство здобувача в яких складає 60-90%.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та доповідались на VIIІ з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів (Алушта, 2007), III Іnternational young scientists conference: Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution (Odessa, 2007), Х Конференції молодих дослідників “Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології” (Київ, 2007), IV та V Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2008, 2009), III Международной научной конференции: “Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений” (Минск, 2008), IX Іnternational Conference “The Biology of plant cells in vitro and biotechnology” (Zvenigorod, 2008), V Міжнародній конференції “Геном рослин” (Одеса, 2008), І Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих учених “Фундаментальні та прикладні дослідження в біології” (Донецьк, 2009), Международной научно-практической конференции “Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениеводстве” (Минск, Люблин, 2009), IV з'їзді товариства фізіологів рослин (Київ, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць. З них: 6 статей у провідних фахових виданнях, 11 публікацій - у матеріалах та тезах конференцій і з'їздів, 1 патент України.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 173 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, п'яти розділів, узагальнення, висновків та списку посилань. Робота містить 22 таблиці та 37 рисунків.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У розділі висвітлено досягнення вітчизняних та зарубіжних учених з клітинної селекції пшениці на стійкість до біотичних та абіотичних стресових чинників довкілля. Розглянуто основні принципи, напрямки, можливості та проблеми клітинної селекції на стійкість до хвороб, зокрема кореневих гнилей. Приділено увагу методам оцінки і добору in vitro. Наведено сучасні уявлення про мінливість геному рослин в культурі тканин, детально висвітлено причини і механізми таких змін. Узагальнено відомості про сомаклональну варіабельність рослин-регенерантів і практичне значення останньої. Для введення в культуру in vitro використовували зріле та незріле насіння м'якої пшениці сортів Смуглянка, Колумбія, Солоха, Веснянка, Переяславка, Подолянка, Зимоярка та Хуторянка. Насіння пророщували на модифікованому живильному середовищі МС (Murashige, Skoog, 1962) без фітогормонів. Материнські рослини культивували в скляному посуді, об'ємом 200 мл., в який було розлито по 30 мл. середовища.

Культура калюсної тканини була отримана із різних типів екплантів (листків, верхівки пагона) рослин, попередньо вирощених в умовах in vitro, а також незрілих зародків, виділених з інтактних рослин.

Для індукції калюсу використовували середовище МС та регулятори росту - 2,4-Д і піклорам у концентраціях 0,5-2,0 мг/л.

Подальше культивування отриманих калюсних культур здійснювали на безгормональному середовищі МС. Калюс вирощували при освітленні 3-4 клк, відносній вологості повітря 70% і 16-годинному фотоперіоді.

Для отримання клітинних ліній, стійких до метаболітів G. graminis var. tritici, застосовували пряму та ступінчасту клітинну селекцію. У роботі використовували калюс, індукований з верхівок пагонів 3-добових проростків сорту Зимоярка. Для проведення клітинної селекції калюси масою 3-5 мг. висаджували в чашки Петрі (по 40 в кожній) у 10 повторностях. В якості селективного агента використовували культуральний фільтрат Gaeumannomyces graminis var. tritici, який отримували при вирощуванні високовірулентних штамів гриба на рідкому поживному середовищі Чапека. КФ стерилізували шляхом пропускання через фільтр з діаметром пор 0,22 мкм та додавали до модифікованого середовища МС.

Для індукції морфогенезу стійкі калюсні лінії переносили на модифіковане регенераційне середовище МС, доповнене КФ (50%). Після 3 тижнів культивування морфогенний калюс висаджували на свіже середовище без КФ. Калюс, що утворював пагони, переносили на середовище для укорінення, яке містило 0,2 мг/л НОК. Укорінені пагони пересаджували в стерильний пісок і поміщали у вологу камеру на 7-14 діб та по мірі розвитку переносили в ґрунт. Цитогенетичний аналіз калюсів та рослин-регенерантів здійснювали, виключаючи передфіксаційний вплив на мітоз. Готували тимчасові давлені препарати за стандартною методикою (Паушева, 1988). Частоту та типи хромосомних перебудов визначали паралельно з підрахунком числа хромосом у клітинах. Генотоксичну дію культурального фільтрату виявляли шляхом аналізу частот виникнення різних типів цитогенетичних аномалій у клітинах калюсних культур.

Для вивчення рівня плоїдності рослин-регенерантів та дослідження генетичної структури клітинних ліній використовували автоматичний аналізатор “Partec” (Німеччина).

Молекулярно-генетичний аналіз калюсних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату G. graminis var. tritici, індукованих з них регенерантів та рослин R1, здійснювали за допомогою ІSSR-методу. ДНК калюсних культур та рослин екстрагували згідно методики Деллапорта (Dellaport et al., 1983). Ампліфікацію здійснювали за описаною схемою (Roder et al., 1998). У дослідженнях застосовували 34 довільних ISSR-праймери, з ди-, три-, тетра- та пентануклеотидними мотивами, що показали свою ефективність при аналізі злакових культур (Ma et al., 1996). Продукти ампліфікації розділяли в 2%-вому агарозному гелі з додаванням бромистого етидію. Для оцінки поліморфізму та визначення рівня дивергенції між досліджуваними об'єктами дані ISSR-ПЛР були представлені у вигляді матриці бінарних ознак. Точний розмір фрагментів ДНК визначали за допомогою пакету прикладних програм TotalLab v2.01 (Nonlinear Dynamics), відносно маркера молекулярної маси.

Поліморфізм спектрів ПЛР оцінювали методом попарного незваженого кластерування з арифметичним усередненням (UPGMA) за допомогою пакету прикледних програм POPGENE v1.32 (Yeh et al., 1999).

Дендрограму генетичних відстаней за Жаккардом (Sneath, Socal, 1973) між досліджуваними об'єктами будували з використанням програми MEGA v3.1 (Kumar et al., 2005). Для виявлення ступеня фрагментації ДНК здійснювали електрофорез сумарної ДНК в 1,5%-вому агарозному гелі, що містив 0,5 мкг/мл бромистого етидію, в 1хТВЕ буфері за напруги 3-4 В/см протягом 4-6 год.

Оцінку стійкості рослин-регенерантів до збудника офіобольозної кореневої гнилі здійснювали, поміщаючи їх на середовище МС з 50% КФ. Стійкість рослин R1 оцінювали шляхом пророщування насіння на фільтрувальному папері, змоченому культуральним фільтратом (100%), за допомогою методу агарових дисків (Bateman, 1988, Крючкова, 2005), а також на штучному інфекційному фоні в умовах вегетаційних дослідів.

Експериментально отримані дані обробляли за допомогою методів статистичного аналізу (Доспехов, 1985, Лакин, 1990).

Для проведення робіт з отримання стійких до стресових чинників рослин біотехнологічним шляхом потрібно мати ефективну систему in vitro, яка ґрунтується на використанні певного типу екпланта.

Незрілі зародки є традиційним експлантом у пшениці, проте їх застосування має ряд обмежень, оскільки вони доступні тільки короткий проміжок часу протягом вегетаційного періоду, а калюсні культури, отримані з них, швидко втрачають регенераційний потенціал (Ozgen et al., 1996, Machii et al., 1998). Останнім часом значно зріс інтерес до листкових сегментів та верхівок пагонів проростків, як найбільш перспективних експлантів для злакових культур (Sharma et al., 2005, Haliloglu, 2006, Bu et al.,2007). Перевагою даних типів експлантів є можливість подолання генотипічних особливостей форм, що характеризуються низьким регенераційним потенціалом, а також отримання значної кількості вихідного матеріалу за короткий час.

Враховуючи це, у наших дослідженнях ми використовували різні типи експлантів, зокрема незрілі зародків інтактних польових рослин, ізольованих на 12-15 добу після запилення, базальні сегменти листків стерильних 2-6-добових проростків, розміром 1-2 мм. (листкові експланти), а також верхівки пагонів стерильних 1-3-добових проростків, розміром 1,2-2 мм.

Введення пшениці в культуру in vitro. Для введення в культуру in vitro застосовували як експланти, отримані з інтактних рослин, що вирощувалися в умовах відкритого ґрунту, так і відокремлені з проростків, попередньо отриманих у стерильних умовах. Незрілі зернівки та зріле насіння поверхнево стерилізували відповідно до розроблених нами способів (Бавол та ін., 2008). За такого підходу ефективність стерилізації складала 90-98%. Життєздатність насіння (співвідношення кількості пророслих насінин до загальної кількості висаджених) за такого способу стерилізації складала 90-100% і не відрізнялася у різних сортів.

Дослідження впливу типу та віку експланта на частоту калюсогенезу та регенерації пагонів. Нами показано, що досліджувані сорти м'якої пшениці в культурі незрілих зародків характеризуються низькою здатністю як до індукції морфогенного калюсу, так і до регенерації пагонів.

Найбільша частота утворення морфогенного калюсу виявлена у озимих сортів Смуглянка та Веснянка, і складала 35,0 ± 1,4% та 31,4 ± 1,3% - відповідно. У вищезгаданих сортів виявилося досить ефективним застосування низькотемпературної обробки (+4 С) незрілого насіння протягом двох діб, що дозволило підвищити частоту утворення морфогенного калюсу у них до 51-55%. Найбільшу частоту регенерації серед досліджених форм мали озимі сорти Смуглянка та Веснянка - 22,1 ± 1,2% і 20,3 ± 1,1% відповідно, а також сорти-дворучки Зимоярка і Хуторянка - по 17,2 ± 1,0%. Експерименти по вивченню чинників, які впливають на процеси дедиференціації та диференціації клітин листкового експланта, підтвердили, що ембріогенний потенціал культури тканин листка злаків, визначається віком листка, його положенням на пагоні, а також розміром експланта. Частота утворення морфогенного калюсу була найбільшою у експлантів сорту Веснянка (17,2 ± 1,0%) та у сортів-дворучок Зимоярка і Хуторянка - 12,5 ± 0,9%, отриманих з проростків тридобового віку, та поступово знижувалася із збільшенням віку проростків - частота калюсогенезу з листкових сегментів шестидобових проростків була найменшою (2-5%).

Отримані дані показали, що найбільша регенераційна здатність також була притаманна калюсам, індукованим з листкових експлантів, відокремлених з тридобових проростків, зокрема для сорту Зимоярка ця величина складала 7,3 ± 0,4%, а для сортів Смуглянка та Хуторянка 6,2 ± 0,3%. Проте така частота регенерації пагонів є недостатньою для проведення робіт із клітинної селекції.

В якості експлантів ми також використовували верхівку пагона 1-3 добових проростків. Найбільша частота утворення морфогенного калюсу спостерігалась у озимих сортів Смуглянка (31,2 ± 1,3%), Веснянка (30,2 ± 1,3%) та сортів-дворучок Зимоярка (24,3 ± 1,2%) і Хуторянка (22,1 ± 1,1%). Подібно до листкових сегментів, максимальною регенераційною здатністю характеризувались калюси, отримані з верхівок пагонів тридобових проростків. Найбільша частота їх регенерації відмічена у сортів Зимоярка та Хуторянка - 14,4 ± 0,9% і 13,9 ± 0,9% відповідно.

Оптимізація складу живильного середовища для підвищення частоти калюсогенезу та регенерації пагонів.

Для підвищення частоти калюсоутворення ми використовували модифіковане середовище МС-2/3, яке додатково містило аспарагінову кислоту (150 мг/л), азотнокисле срібло (10 мг/л) та піклорам (4-аміно-3,5,6-трихлорпіколінова кислота) (2 мг/л). Калюси, отримані на цьому середовищі з верхівки пагона проростка зберігають життєздатність та морфогенну активність довше (в середньому на 3 пасажі) порівняно з культурами іншого походження. Для індукції регенерації пагонів нами було використано модифіковане середовище МС-3/7, яке додатково містило аспарагінову кислоту (150 мг/л), азотнокисле срібло (10 мг/л), гліцин (3 мг/л), аденін (20 мг/л), піклорам (0,5 мг/л) та БАП (1 мг/л), що дозволило підвищити частоту регенерації з калюсних культур, отриманих з верхівки пагона на 39,4-96,5%, що достовірно не поступається частоті регенерації з калюсу, індукованому з незрілих зародків. Зокрема, частота регенерації пагонів у культурі верхівок пагонів проростків сорту Зимоярка досягала 28,3 ± 1,3%.

Дослідження впливу хітозану на калюсоутворення з експлантів верхівки пагона проростка, ріст калюсних культур та процеси регенерації пагонів показало, що процеси морфогенезу залежать від концентрації полісахариду в середовищі і його молекулярної маси. Відповідно до отриманих результатів, хітозан з молекулярною масою 10 кДа має здатність стимулювати ріст калюсних культур пшениці та регенерацію пагонів у концентрації 25 мкг/мл.

Таким чином, у результаті проведеної роботи нами розроблена система in vitro, яка включає: схему стерилізації вихідного матеріалу, використання як ексланта верхівки пагона тридобових проростків, модифіковані живильні середовища для калюсогенезу і регенерації пагонів, що була використана для проведенні робіт з клітинної селекції пшениці на стійкість до Gaeumannomyces graminis var. tritici.

На першому етапі досліджень була визначена токсичність культурального фільтрату, залежно від часу культивування гриба G. graminis var. tritici. Виявлено, що найбільша його токсичність спостерігається на 55-60 добу культивування, тому у подальшій роботі використовували КФ саме цього строку вирощування. Також була визначена чутливість калюсної тканини м'якої пшениці до різних концентрацій селективного агента в живильному середовищі. Відмічено, що наявність навіть мінімальної концентрації 10% КФ у живильному середовищі пригнічувало ріст калюсів, зменшувало приріст їх маси, викликало появу некротичних плям брунатного або чорного забарвлення. Концентрація 70% селективного чинника виявилася летальною. Найбільш оптимальною для подальшої роботи була доза 50% КФ. За такої концентрації залишались життєздатними 10% калюсів. Для отримання форм, стійких до метаболітів G. graminis var. tritici, застосовували пряму та ступінчасту клітинну селекцію.

Пряму клітинну селекцію проводили за наступною схемою: 1 пасаж на середовищі з сублетальною концентрацією КФ (50%) - 1 пасаж на контрольному середовищі (без КФ). Таким чином проведено чотири цикли добору і відібрано 7 штамів, які зберігали здатність рости на селективному середовищі. З них було отримано 4 стійкі лінії (№2, 7, 19 та 24), які не тільки мали приріст маси на селективному середовищі (табл.), а й зберігали морфогенетичний потенціал.

Табл. - Відносний приріст сирої маси у стійких до культурального фільтрату G. graminis var. tritici калюсних ліній пшениці:

Поряд з експериментами по прямому перенесенню на селективні середовища, проводили ступінчасту селекцію за схемою: 1 пасаж на селективному середовищі з КФ (30%) це 1 пасаж на контрольному середовищі (без КФ) це 1 пасаж на селективному середовищі з КФ (40%) це 1 пасаж на контрольному середовищі (без КФ) це 1 пасаж на селективному середовищі з КФ (50%) це 1 пасаж на контрольному середовищі (без КФ) це 1 пасаж на селективному середовищі з КФ (50%) це 1 пасаж на контрольному середовищі (без КФ). У результаті послідовного добору виділено варіанти, які характеризувались здатністю до росту на селективному середовищі з. КФ (50%) та стабільно зберігали ознаку стійкості протягом 4 пасажів.

Методом ступінчастої селекції було відібрано 32 стійкі калюсні варіанти, проте в подальшому з них не вдалося отримати рослини-регенеранти, оскільки у таких форм спостерігався ризогенез, або ж утворювалися пагони, які поступово припиняли свій ріст, і не утворювалося повноцінне коріння.

Для диференціації стійких та нестійких клітинних ліній також був використаний один із показників наявності незворотних змін в ядрі клітин - фрагментація ДНК. Показано, що під впливом КФ G. graminis var. tritici, на відміну від стійких ліній, у ДНК нестійких форм спостерігалась інтенсивна деградація з утворенням неперервного спектра фрагментів широкого діапазону молекулярних мас.

Зазначимо, що олігонуклеосомної фрагментації ДНК, що характерна для програмованої загибелі клітин, не спостерігалось. Це свідчить про те, що культуральний фільтрат G. graminis var. tritici викликає загибель клітин пшениці шляхом некрозу. Крім того ступінь фрагментації ДНК може бути використана як критерій добору стійких клітинних форм.

Проблема отримання рослин із стійких клітинних ліній є однією із найбільш важливих та складних у клітинній селекції. Регенерація з таких форм значно ускладнена, а частота індукції рослин дуже низька (Калашникова, 2003).

У наших дослідженнях частота регенерації рослин на середовищі МС-3 зі стійких до КФ клітинних ліній була на рівні 2-5%, що достовірно нижче ніж у контролі, де цей показник складав 28%.

Для підвищення регенераційної здатності стійких калюсних культур м'якої пшениці та збільшення кількості рослин-регенерантів, нами було модифіковано середовище МС-3/7 (Патент України №42324), що дозволило підвищити частоту регенерації до 10-22%.

Для масового укорінення пагонів найкращим виявилося середовище МС з половинним вмістом макроелементів та НОК у концентрації 1 мг/л. Через 15-20 діб на такому середовищі отримували 60% рослин-регенерантів з повноцінною кореневою системою.

Оцінка стійкості рослин до офіобольозної кореневої гнилі. Для аналізу отриманих форм була проведена комплексна оцінка стійкості рослин до збудника офіобольозу та його метаболітів. Із 56 отриманих ліній R1 - 4 виявились стійкими (середній бал ураження кореневої системи збудником офіобольозу складав 0-0,5), 17 - мали середній бал ураження 0,6-1,5, а інші за цим показником достовірно не відрізнялися від рослин вихідного сорту (середній бал ураження кореневої системи рослин сорту Зимоярка збудником офіобольозу складав 2,5).

Аналіз насіння R2 методом агарових дисків підтвердив стійкість рослин до збудника офіобольозу та показав, що середній бал ураження кореневої системи рослин R2 не перевищує значення, отримані для рослин R1. Таким чином, вперше біотехнологічним шляхом отримано рослини пшениці, стійкі до G. graminis var. tritici.

Цитогенетичний та цитометричний аналіз калюсних культур. Цитогенетичний аналіз калюсних культур показав високий ступінь гетерогенності і наявність значних розходжень у характері протікання цитологічних процесів між калюсами, що вирощувалися на контрольному та селективному середовищах. Вже у першому пасажі відмічено достовірне збільшення числа поліплоїдних клітин (6x) до 26,1 ± 4,1%, в той час, як в контролі цей показник складав 12,6 ± 3,3%.

Поряд з поліплоїдизацією спостерігалось достовірне збільшення кількості анеуплоїдних клітин до 15,2 ± 3,9%, порівняно з 5,8 ± 2,4% у контролі. Це явище пов'язане із втратою хромосом у мітозі й часто супроводжувалося наявністю мікроядер поблизу інтерфазних ядер. У цілому, популяції клітин калюсу як контрольного, так і того, що вирощувався на селективному середовищі, є досить гетерогенними за числом хромосом, кількість яких у клітинах складала від 7 до понад 84. На селективному середовищі у калюсів визначається значна кількість клітин з відхиленнями від нормального процесу мітозу. Виявлено як хромосомні аберації, так і порушення веретена поділу у вигляді багатополюсних мітозів. Відмічено клітини з двома та більше ядрами, а також клітини з фрагментованими ядрами. Кількість клітин з аномаліями поділу у калюсів на селективних середовищах коливалась від 15 до 18 відсотків, у той час як у контролі їх число не перевищувало 6%, хоча спектр аномалій мітозу був приблизно однаковим. В анафазах відмічено хроматидні й хромосомні мости, одиничні та парні фрагменти, а також множинні порушення, що свідчить про наявність мутаційного процесу, який викликає порушення цілісності хромосом. У першому пасажі кількість клітин з абераціями у контрольному калюсі була на рівні 2,9 ± 1,7%, в той час, як у калюсах, що культивувалися на селективному середовищі, відмічено достовірне збільшення їхнього числа до 13,7 ± 3,4%. Слід зазначити, що сумарна кількість аберантних анафаз з фрагментами становить понад 66%, тобто у спектрі клітинних пошкоджень переважають “свіжі” розриви. Достовірне збільшення їхньої кількості свідчить про значний генотоксичний вплив культурального фільтрату на хромосомний апарат клітин і його кластогенний ефект у сублетальній концентрації.

Подальше культивування калюсів, що вирощувалися на різних середовищах, супроводжувалося поліплоїдизацією культур. Протягом перших пасажів цей процес інтенсивніше відбувався у калюсів, що перебували в селективних умовах.

Починаючи з 5 пасажу, кількість поліплоїдних клітин у калюсах, що вирощувалися на контрольному та селективному середовищах, достовірно не відрізнялась, частота хромосомних аберацій практично не змінювалася. Певна стабілізація калюсних культур за рівнем хромосомних перебудов може свідчити про те, що пройшов добір клітинної популяції, пристосованої до росту на селективному середовищі. Гетерогенність стійких калюсних ліній за рівнем плоїдності клітин була підтверджена методом проточної цитометрії. Аналіз рівня плоїдності рослин-регенерантів, отриманих із стійких клітинних ліній. При цитологічному дослідженні регенерантів, отриманих із стійких калюсних ліній, виявлені рослини різного рівня плоїдності.

7 з 33 проаналізованих рослин-регенерантів, мали відмінний від гексаплоїного набір хромосом. Отримані дані були підтверджені нами за допомогою методу проточної цитометрії, який засвідчив, що більшість рослин-регенерантів, індукованих із стійких до КФ калюсних ліній є гексаплоїдами, однак було виявлено і міксоплоїдні рослини.

Молекулярно-генетичний поліморфізм клітинних ліній пшениці, стійких до КФ Gaeumannomyces graminis var. tritici, та регенерантів з них. При дослідженні отриманих калюсних ліній, стійких до КФ G. graminis var. tritici, було виявлено та проаналізовано 227 чітких ISSR-фрагмента. Із них 65 (28,6%) були поліморфними.

Залежно від праймера число поліморфних ампліконів варіювало від 1 до 13. Розмір таких фрагментів складав від 261 до 2846 пн. Для порівнянні калюсів, що не зазнавали селективного тиску та стійких калюсних ліній, розраховували значення генетичних відстаней (DJ) за Жаккардом по 227 ISSR-локусам. Відповідно до отриманих даних була складена дендрограма, на якій можна виділити два чітко відокремлені кластера.

Перший з виявлених кластерів повністю відповідав групі ліній, отриманих шляхом клітинної селекції (L1-L7), а другий - групі калюсів, які не зазнавали селективного тиску (C1-C9).

Одержані результати свідчать, що за клітинної селекції зміни геному м'якої пшениці, які виникають в культурі in vitro носять спрямований характер. У стійких калюсів виявлено специфічні зміни у нуклеотидних послідовностях ДНК. Встановлено, що всі стійкі клітинні лінії відрізнялись від вихідного калюсу та калюсу, який не зазнавав дії селективного чинника, наявністю специфічних ампліконів довжиною 2347 пн - праймер ISSR 7 та 1745 пн - праймер ISSR 12, а також відсутністю амплікону довжиною 1108 пн - праймер ISSR 15.

Для кількісної оцінки ступеня поліморфізму та визначення рівня дивергенції між стійкими регенерантами та рослинами вихідного сорту, була розрахована матриця значень DJ по 227 локусах. Виявилось, що всі стійкі регенеранти формували один кластер, а рослини вихідного сорту утворювали окрему гілку. Генетична відстань між вихідними рослинами та регенерантами складає 0,4907-0,5388. В той же час, максимальне значення цієї величини всередині кластеру (між рослинами-регенерантами) було 0,2168 а мінімальне - 0,0693.

Слід зазначити, що в спектрах продуктів ампліфікації стійких рослин-регенерантів, також були виявлені амплікони довжиною 2347 пн (праймер ISSR 7) та 1745 пн (праймер ISSR 12). Наявність цих фрагментів була встановлена і в ISSR-спектрах рослин R1.

Наявність певних ампліконів у всіх стійких форм - як клітинних ліній, так і рослин може свідчити про їхній безпосередній зв'язок з ознакою стійкості. Ці амплікони потенційно можуть бути використані як маркери стійкості до офіобользу.

ВИСНОВКИ

Експериментально доведено можливість отримання біотехнологічним шляхом стійких до Gaeumannomyces graminis var. tritici рослин м'якої пшениці. На цитологічному та молекулярно-генетичному рівні досліджено особливості структурно-функціональної мінливості геному Triticum aestivum L., яка виникає у процесі культивування in vitro за дії біотичного стресового чинника:

1. Розроблено комплекс біотехнологічних прийомів, що дозволило удосконалити процес отримання рослин м'якої пшениці de novo із тканин вегетативних органів;

2. Вперше одержано рослини пшениці, стійкі до G. graminis var. tritici, які можливо використовувати як джерела стійкості до офіобольозної кореневої гнилі;

3. З'ясовано, що генотоксична дія КФ G. graminis var. tritici на калюсні культури виявляється у кластогенних пошкодженнях структури хромосом та спричиняє загибель клітин шляхом некрозу;

4. Встановлено, що стійкі калюсні лінії, характеризуються стабільно-гетерогенною структурою клітинних популяцій, постійним рівнем (5-7%) і схожим типом структурних перебудов хромосом. Для таких ліній властивий подібний тип розвитку - збільшення ступеня поліплоїдизації, порівняно з контролем на перших етапах культивування;

5. Сомаклональна мінливість регенерантів, отриманих із стійких до КФ G. graminis var. tritici калюсів виявляється, зокрема, різним рівнем плоїдності рослин;

6. Вперше показано, що стійкі до культурального фільтрату G. graminis var. tritici калюсні лінії пшениці характеризуються наявністю специфічних ампліконів довжиною 2347 та 1745 пн. Ці амплікони також виявлено у стійких регенерантів R0 та рослин R1, що може свідчити про потенційну можливість їх використання як маркерів стійкості до офіобольозу;

7. За допомогою ISSR-аналізу встановлено поліморфізм ДНК стійких та нестійких калюсних ліній. Згідно генетичних відстаней по Жаккарду, використовуючи метод попарного незваженого кластерування з арифметичним усередненням, стійкі форми виділено в окремий кластер, що дозволяє зробити припущення, що зміни геному м'якої пшениці за клітинної селекції носять спрямований характер;

8. Запропоновано до практичного використання спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних ліній м'якої пшениці, стійких до КФ G. graminis var. tritici, який дає змогу прискорити процес отримання стійких до офіобольозної кореневої гнилі рослин-регенерантів та збільшити їх кількість.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ біотехнологічний метаболіт морфогенез

1. Бавол А.В. Регенерація рослин із експлантів верхівки пагона проростків пшениці / А.В. Бавол, О.В. Дубровна, І.І. Лялько // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2007, - Т. 5, №1-2. - С. 3-10.

2. Бавол А.В. Добір та цитологічний аналіз стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici клітинних ліній пшениці та регенерантів з них / А.В. Бавол, О.В. Дубровна, І.І. Лялько // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів -2008. - Т. 6, №2 -С. 191-200.

3. Бавол А.В. Регенерація рослин із різних типів експлантів м'якої пшениці / А.В. Бавол, О.В. Дубровна, І.І. Лялько // Физиология и биохимия культурных растений. - 2008. - т. 40, №2. - С. 150-156.

4. Бавол А.В. Поліморфізм ДНК клітинних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici, за використання ІSSR-методу / А.В. Бавол, А.В. Злацька // Физиология и биохимия культурных растений. - 2009. - т. 41, №1. - С. 69-74.

5. Бавол А.В. Селекція in vitro м'якої пшениці на стійкість до Gaeumannomyces graminis var. tritici / А.В. Бавол, О.В. Дубровна, І.І. Лялько // Физиология и биохимия культурных растений. - 2009. - Т.41, №4. - С. 314-320.

6. Бавол А.В. Молекулярно-генетичний поліморфізм клітинних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici, та регенерантів з них / А.В. Бавол, О.В. Дубровна // Цитологія і генетика. - 2009. - т. 43, №5. - С. 28-34.

7. Пат. 42311 України МПК (2009) А01Н4/00 Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici / Бавол А.В., Дубровна О.В., Лялько І.І., заявник і патентовласник Інститут фізіології рослин і генетики НАН України. - №200901624, заявка 11.03.2008, опубл. 25.06.2009, Бюл. №12.

8. Бавол А.В. Особливості процесів морфогенезу в культурі листкових експлантів озимої пшениці/ А.В. Бавол, О.В. Дубровна, І.І. Лялько // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Збірник наук. праць. - Київ: Логос. - 2007. - Т.2. - С. 444-448.

9. Бавол А.В. Вплив хітозану на ріст і розвиток калюсних культур м'якої пшениці / А.В. Бавол, О.В. Дубровна, І.І. Лялько // Фактори експериментальної еволюції організмів: Збірник наукових праць. - Київ: Логос. - 2008. - т. 5. - С. 249-253.

Размещено на Allbest.ru