Особливості експресії ядерних і toll-подібних рецепторів та їх функціональних зв’язків у пухлинних клітинах різного походження

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК: 576.385.5 + 577.218 + 576(367 + 535)

Особливості експресії ядерних і toll-подібних рецепторів та їх функціональних зв'язків у пухлинних клітинах різного походження

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Білько Денис Іванович

Київ 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Центрі молекулярних і клітинних досліджень Національного університету «Києво-Могилянська академія»

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Національний університет біоресурсів і природокористування України,

професор кафедри молекулярної генетики і біобезпеки

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Островська Галина Віталіївна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри цитології, гістології та біології розвитку

доктор медичних наук, професор

Савцова Зоя Дмитрівна,

Національний університет «Києво-Могилянська академія»,

професор кафедри біології

Захист відбудеться «15» грудня 2010 року о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет), ауд. 215)

Поштова адреса: 01601, Київ, вул. Володимирська, 64, ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01601, Київ, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий «____» ___________ 2010 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Цимбалюк О. В.

експресія пухлинний менінгіома

АНОТАЦІЯ

Білько Д. І. Особливості експресії ядерних і Toll-подібних рецепторів та їх функціональних зв'язків у пухлинних клітинах різного походження. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2010.

Дослідження рецепторів у злоякісних клітинах є насьогодні актуальною темою, адже розвиток сучасних технологій та поява новітніх інструментальних методів обумовлює багатовимірне вивчення процесів, що відбуваються у нормі та під час неопластичної трансформації. У роботі було проведено аналіз експресії генів надродини ядерних рецепторів та Toll-подібних рецепторів у пухлинних клітинах різного походження для визначення особливостей їх фенотипових характеристик та ролі цих рецепторів у індукції клітинної загибелі.

Встановлено, що найбільш загальною фенотиповою ознакою пухлинних клітин різного ґенезу є експресія ядерних рецепторів: рецепторів глюкокортикоїдів і рецепторів-активаторів проліферації пероксисом. Виявлено особливості експресії надродини ядерних рецепторів та Toll-подібних рецепторів у клітинах менінгіом. Доведена здатність бактеріальних ендотоксинів активувати експресію власних (TLR4) і функціональних (TLR9) Toll-подібних рецепторів у пухлинних клітинах, що може знижувати чутливість останніх до апоптотичних сигналів. Досліджено особливості дії принципово нової катіонної сполуки, гексадецилтрифеніл-фосфоніум-броміду, яка у достатньо низькій концентрації здатна викликати апоптоз у більшості культивованих клітин шляхом спрямованого впливу на мітохондрії. Виявлений ефект блокування глюкокортикоїдом Dex процесу передислокації цитохрому С з мітохондрій до цитоплазми, викликаного проапоптичними агентами, розширює уявлення про процес індукції апоптозу і є підґрунтям для розробки протоколів лікування злоякісних пухлин із застосуванням кортикостероїдних гормонів.

Ключові слова: надродина ядерних рецепторів, Toll-подібні рецептори, кількісна ПЛР, дексаметазон, пухлинні клітинні лінії, солі фосфоніуму, апоптоз, некроз, мітохондрії.

АННОТАЦИЯ

Билько Д. И. Особенности экспрессии ядерных и Toll-подобных рецепторов и их функциональных связей в опухолевых клетках разного происхождения. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Актуальность темы, посвященной исследованию рецепторов в злокачественных клетках, связана с бурным развитием современных технологий и внедрением новейших инструментальных методов, которые позволяют осуществлять всестороннее изучение процессов, происходящих в норме и в процессе неопластической трансформации. К сожалению, связь рецепторных систем с процессами злокачественной трансформации клеток разного гистогенеза недостаточно изучена (особенно это касается Toll-подобных рецепторов), несмотря на то, что вопросы взаимодействия опухолевых клеток с их микроокружением, паренхимой и стромой опухолей, роли воспаления (особенно хронического) в опухолевой прогрессии в последние годы привлекают все большее внимание исследователей.

В диссертации проведен анализ экспрессии рецепторов опухолевых клеток человека разного происхождения для выяснения особенностей их фенотипических характеристик и роли этих рецепторов в индукции клеточной гибели. Исследовали следующие клеточные линии: MCF-7 и Т-47D (карцинома молочной железы), CACO, COLO, LOVO (колоректальный рак), U89MG (глиобластома), Corl23 (рак легких), EAhy 926 (эндотелиальные клетки вены пуповины), K562 (эритролейкемия) и менингиомы.

Показано, что наиболее характерной для опухолей разного гистогенеза является экспрессия рецепторов глюкокортикоидов (GR) и рецепторов-активаторов пролиферации пероксисом (PPAR). Эти фенотипические признаки определялись как в клеточных линиях, так и в первичных материалах (биоптаты менингиом), но в первых чаще определяли экспрессию PPARб, во вторых - PPARв. Исходя из особенностей экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов (AR, PR, ERб, ERв), а также рецепторов ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, опухолевые клетки четко отличались в зависимости от происхождения опухоли. Так, типичной для клеток менингиом была экспрессия рецепторов прогестерона (PR) - 71 %, что указывает на потерю контроля экспрессии гена рецептора прогестерона альфа-рецептором эстрогена. Оказалось, что рецепторы TLR1-6 та TLR9-10 экспрессируют во всех исследуемых клеточных линиях и первичных культурах менингиом, в то время как экспрессия TLR8 в этих клетках не выявлена.

Определена способность бактериальных эндотоксинов активизировать экспрессию собственных (TLR4) и функциональных (TLR9) Toll-подобных рецепторов в опухолевых клетках, что может вызывать падение чувствительности последних к апоптотическим сигналам. Для оценки характеристики роста опухоли и ее ответа на воздействие противоопухолевых препаратов определены критерии анализа экспрессии генов суперсемейства лиганд-активированных ядерных рецепторов и TLR в опухолевых клетках. Показано, что определение уровня экспрессии функционирующего GRб является одним из показателей чувствительности клеток к действию противоопухолевых препаратов, а активация данного рецептора приводит к падению чувствительности клеток к апоптозу. В связи с этим, предлагается проводить молекулярное ПЦР-исследование биоптатов на наличие GR в опухоли в связи с тем, что в случае системного применения кортикостероидных гормонов может снизиться эффективность действия химиотерапевтических препаратов за счет снижения чувствительности клеток к апоптозу и торможения редукции клеточной массы опухоли. Описанный эффект блокирования глюкокортикоидом Dex передислокации цитохрома С с митохондрий в цитоплазму, вызванной проапоптотическими агентами, расширяет представления о процессе индукции апоптоза и является научным обоснованием, которое может быть использовано при разработке протоколов лечения злокачественных опухолей с применением кортикостероидных гормонов.

В работе исследованы особенности действия принципиально нового катионного соединения, гексадецилтрифенил-фосфониум-бромида (ГДТФФБ), которое в малых концентрациях способно снижать негативный электрохимический потенциал митохондрий и вызывать апоптоз у большинства культивируемых клеток путем прямого воздействия непосредственно на митохондрии. Оказалось, что молекулы ТФФБ, модифицированные длинными полинасыщенными поликарбоновыми цепями, обладают большей афинностью к митохондриям и вызывают апоптотическую смерть культивируемых клеток in vitro в гораздо меньших концентрациях, чем молекулы с более короткими цепями. Так, ГДТФФБ вызывал индукцию апоптоза во всех первичных культурах менингиом и опухолевых клеточных линиях разного происхождения. Полученные результаты являются базисом для разработки нового класса целевых противоопухолевых химиотерапевтических препаратов, поражающее действие которых направлено непосредственно на митохондрии.

Ключевые слова: семейство ядерных рецепторов, Toll-подобные рецепторы, количественная ПЦР, дексаметазон, опухолевые клеточные линии, соли фосфониума, апоптоз, некроз, митохондрии.

SUMMARY

Bilko D.I. Expression of the nuclear and Toll-like receptors and their functional activity in the tumor cells of different origin. - Manuscript.

Thesis for obtaining of scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.11 - cytology, cell biology, histology. Taras Shevchenko National University of Kyiv, 2010.

Investigation of the receptors in the tumor cells is very current in modern scientific research; development of novel instrumental technologies allows for multidimensional studies of the processes in norm and during neoplastic transformation. We determined expression levels of nuclear receptor superfamily members and Toll-like receptors in tumor cells of different origin for determination of their association patterns and their roles in the processes of induction of cell death.

It was determined that most commonly found coexpression association of the nuclear receptor superfamily members was glucocorticoid receptor with peroxisome proliferator activated receptor Beta. Expression levels of nuclear receptor superfamily members and Toll-like receptors were also determined in meningioma tumors. It was shown that bacterial endotoxins are able to induce expression of the Toll-4 and Toll-9 receptors that via NF-kappa B pathways might lower sensitivity of cells to proapoptotic signals. Action of the novel cationic compound, hexadecyl-triphenyle-phosphonium bromide, on the tumor cells was determined, that was able to induce apoptosis of the tumor cells at very low doses by directly causing damage to the mitochondria. It was also shown that glucocorticoid dexamethasone was able to block apoptosis in the cells treated with the phosphonium compounds and that this blockage was at the stage of the cytochrome C release prevention. These results broaden our understanding of the apoptotic process and may allow for development of new mitochondrial targeted chemotherapeutic strategies that take into account molecular action of the corticosteroid hormones on the tumor cells.

Key words: nuclear receptor superfamily, Toll-like receptors, quantitative PCR, dexamethasone, tumor cell lines, compounds of phosphonium, apoptosis, necrosis, mitochondria.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток сучасних технологій та поява новітніх інструментальних методів обумовлює багатовимірне вивчення процесів, що відбуваються в клітинах. Зокрема, актуальним є дослідження експресії і функціонування різноманітних клітинних рецепторів у нормі та при розвитку патологічних станів, пов'язаних зі стресом, запальним процесом, імунологічними конфліктами, злоякісною трансформацією (Глузман Д.Ф., 2005; Чехун В.Ф., 2007; Aderem A., 2000; Newton C. et al., 2002; Olivier S. et al., 2006). Рецепторні молекули, які експресуються будь-якою клітиною, забезпечують її реакцію на мітогенні, мотогенні, диференціювальні, функціонально-активуючі, апоптогенні та інші чинники, а також відіграють важливу роль у забезпеченні клітинного гомеостазу.

Серед різних надродин рецепторів найменшою мірою досліджені ядерні (NRS) та Toll-подібні (TLR) рецептори (Latz E., 2004; Bain D.L. et al., 2007). До недавнього часу багато представників NRS відносили до так званих orphan-рецепторів, тобто рецепторів з певно визначеною генетичною детермінацією, відомою структурою, але без відомої функції. Розкодування механізмів взаємодії orphan-рецепторів дозволило певною мірою перенести їх із невідомих до визначених, які однак потребують детального вивчення. Досить розповсюджена експресія NRS у різних типах тканин відкриває широкі можливості для досліджень і вирішення наукових і практичних питань. Експресія і функціонування TLR досліджені переважно в клітинах імунної системи. Розповсюдженість цих рецепторів в клітинах інших типів, зокрема, епітеліальних, їх роль у розпізнаванні агоністів (стимулюючих чинників), клітинній реактивності, зв'язок із розвитком патологічних станів потребують подальших досліджень (Маянский А.Н., 2004; Дранник Г.Н., 2006).

Щодо зв'язку згаданих рецепторних родин із процесами злоякісної трансформації клітин різного гістогенезу, інформації вкрай недостатньо (особливо щодо TLR), хоча питання взаємодії пухлинних клітин з їх мікрооточенням, паренхіми і строми пухлини, ролі запалення (особливо хронічного) у пухлинній прогресії привертають в останні роки все більшу увагу (Бережная Н.М., 2009; Balkwill F. et al., 2001; 2005; Mantovani A. et al., 2008).

Виходячи з викладеного, ми вважали за доцільне провести аналіз особливостей експресії і функціонування NRS та TLR у пухлинних клітинах різного походження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у межах тем «Експресія генів надродини ядерних стероїдних рецепторів та Toll-рецепторів у менінгіомах та у пухлинах раку молочної залози» (№ держреєстрації 0108U010512) та «Розробка методу культурального аналізу та контролю якості трансплантаційного матеріалу в онкогематології» (№ держреєстрації 0107U009272).

Мета дослідження. Визначити особливості експресії NRS і TLR та їх функціональних зв'язків у пухлинних клітинах різного ґенезу та дослідити регуляцію клітинної загибелі катіонними мітохондріально-націленими сполуками.

Задачі дослідження.

Оцінити експресію генів NRS у пухлинних клітинних лініях різного походження і у первинних культурах менінгіом.

Провести оцінку експресії TLR у менінгіомах і у пухлинних клітинних лініях різного походження та дослідити вплив бактеріальних ендотоксинів на експресію цих рецепторів і чутливість пухлинних клітин до апоптотичного сигналу.

Вивчити вплив синтетичного глюкокортикоїду дексаметазону на проліферативну та метаболічну активність культур пухлинних клітин.

Визначити особливості дії синтетичного глюкокортикоїду дексаметазону на апоптоз клітин, викликаний катіонною сполукою гексадецил-трифеніл-фосфоніум-бромідом та оксидативним стресом.

Об'єкт дослідження - первинні культури менінгіоми і пухлинні клітинні лінії, а також отримана з них мРНК.

Предмет дослідження - експресія генів NRS, експресія TLR; вплив активації цих рецепторів відповідними лігандами на процеси апоптозу і некрозу пухлинних клітин.

Методи дослідження - культуральні методи; методи полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), Вестерн-блоттингу; світлової, флуоресцентної та трансмісійної електронної мікроскопії; біохімічні, статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше встановлено, що найбільш типовою для пухлин різного гістогенезу є експресія ядерних рецепторів - рецепторів глюкокортикоїдів (GR) та активаторів проліферації пероксисом (PPAR), а також TLR1-6. Одержано пріоритетні дані щодо особливостей експресії NRS та TLR у клітинах менінгіом. Доведена здатність бактеріальних ендотоксинів активувати експресію власних (TLR4) і функціональних (TLR9) Toll-подібних рецепторів у пухлинних клітинах, що може знижувати чутливість останніх до апоптотичних сигналів.

Вперше визначено і досліджено особливості дії принципово нової катіонної сполуки, гексадецилтрифеніл-фосфоніум-броміду, яка у достатньо низькій концентрації здатна викликати апоптоз клітин шляхом спрямованого впливу на мітохондрії. Виявлено ефект блокування дексаметазоном процесу викликаної апоптогенними агентами передислокації цитохрому С з мітохондрій до цитоплазми, що розширює уявлення про участь кортикостероїдних гормонів в механізмах регуляції апоптозу.

Практичне значення одержаних результатів.

- визначено критерії аналізу експресії генів NRS та TLR у пухлинних клітинах для оцінки характеристики росту пухлини та її відповіді на дію протипухлинних препаратів;

з'ясовано, що виявлення рівня експресії альфа-рецептора глюкокортикоїдів може бути одним з показників чутливості клітин до дії індукторів мітохондріального апоптозу, а активація даного рецептора призводить до блокування останнього;

показано, що досліджена сполука гексадецилтрифеніл-фосфоніум-бромід є потужним індуктором апоптозу завдяки накопиченню у мітохондріях, що призводить до їх осмотичного руйнування; ці дані можуть стати у нагоді при розробці протипухлинного препарату з підвищеною афінністю до клітин з високим електронегативним потенціалом, тобто з високим рівнем аеробного метаболізму;

пропонується проводити молекулярне ПЛР-дослідження біоптатів на наявність рецептора глюкокортикоїдів у пухлині і приймати цей факт до уваги для вибору оптимальних схем медикаментозної редукції клітинної маси пухлини.

Результати розробок автора використовуються при читанні лекцій студентам на факультеті природничих наук Національного університету «Києво-Могилянська академія», на факультеті біотехнології Національного технічного університету «Київський політехнічний інститут», курсантам Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора полягає у отриманні наукових результатів, викладених у дисертації, та у проведенні патентно-інформаційного пошуку, підборі і обробці даних літератури, проведенні експериментальних досліджень, аналізі результатів та їх статистичній обробці, написанні і оформленні дисертації.

У наукових працях, що опубліковані у співавторстві, відбито результати спільного планування, проведення експериментів та обговорення результатів. Разом із науковим керівником, проф. М.Ф. Стародубом, інтерпретовано результати і сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи було представлено і обговорено на І установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології, Львів, 2004; XVI міжнародній конференції «Modern Trends in Human Leukemia», Вілседе, Німеччина, 2005; III Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології», Львів, 2007; VІІІ науковій конференції молодих онкологів з міжнародною участю «Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології», Київ, 2007; Міжнародному міждисциплінарному симпозіумі «Від експериментальної біології до превентивної та інтегративної медицини», Судак, 2007; на конференціях, присвячених «Дням науки НаУКМА» у 2008, 2009 роках, XVIII міжнародній конференції «Modern Trends in Human Leukemia and Cancer», Вілседе, Німеччина, 2010.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, з них 3 статті в спеціалізованих виданнях, рекомендованих ВАК України, 5 статей в іноземних журналах, 6 тез доповідей в матеріалах міжнародних і національних конгресів і конференцій, 2 патенти.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 170 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел (277 найменувань, з них 234 - латиницею). Робота ілюстрована 48 рисунками і 10 таблицями.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Дослідження проведені на клітинних лініях пухлин людини, зокрема, колоректального раку (COLO, CACO, LOVO), раку молочної залози (MCF-7, T-47D), еритролейкемії (K562), раку легені (Corl23), гліобластоми (U-87MG), а також імморталізованих ендотеліальних клітин вени пуповини людини (EAhy926). Крім того, у роботі використано первинні культури менінгіом людини, надані клінікою Grossharden та клінікою Villingen-Schenningen департаменту нейрофізіології Інституту психіатрії ім. Макса Планка (м. Мюнхен, Німеччина) співробітниками відділу молекулярної ендокринології проф. Г. Сталла.

Виділення РНК та ПЛР. Екстракцію РНК проводили за протоколом фірми «Quiagen RNeasy»; після чого здійснювали електрофорез РНК (200 нг на пробу) в 1 % агарозному гелі на ТВЕ буфері за стандартною методикою у режимі 5-6 В/см. Візуалізацію проводили з допомогою трансілюмінатора. кДНК одержували із використанням набору для зворотної транскрипції фірми «MWG Biotech» (за протоколом виробника), і проводили оптимізовану ПЛР зі специфічними праймерами для рецепторів естрогенів (ERб, ERв), прогестерону (PR), андрогенів (AR), глюкокортикоїдів (GR), активації проліферації пероксисом (PPARб, PPARв, PPARг), а також TLR1-10 і поверхневого маркера CD45. Гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогеназа (GAPDH) та в-актин, як гени домашнього господарства, були використані в якості позитивного контролю виділеної та обернено транскрибованої РНК (Mullis K.B., 1983).

Кількість та якість ізольованої РНК, а також ефективність зворотної транскрипції, перевіряли за допомогою ампліфікації з в-актин-специфічними праймерами. ПЛР здійснювали на ампліфікаторі «Biometra Quattro» або на «Thechnе gene». Усі праймери були перевірені програмою BLAST-пошук для впевненості у відсутності перехресних реакцій. Оптимізацію ПЛР здійснювали за допомогою ампліфікатора «Biometra Quattro» із золотим градієнтним блоком при температурі від 52 до 62°C (ідентичні реакційні суміші для кожного набору праймерів були піддані 35 циклам ПЛР). Були відібрані умови реакції з максимальною ефективністю - 56 °C для усіх пар праймерів. Продукти ПЛР забарвлювали бромистим етидієм і візуалізували під УФ.

Кількісні зміни у експресії генів визначали за допомогою real-time ПЛР (ампліфікатор I-Cycler «Biorad», програмне забезпечення I.Q5). Відбір праймеру та наборів проб здійснювали з використанням принципу TAQman (пакет програмного забезпечення Primer Express «Applied Biosystems»). Всі пари праймерів попередньо перевіряли конвенційною ПЛР на відповідність до передбачуваного розміру продукту і температури плавлення. ПЛР SYBR Green була адаптована до скринінгу пухлин як економічно вигідна альтернатива для ПЛР TAQman. Виведено стандартну криву залежності концентрації матриці від накопичення флуоресцуючого SYBR Green; нахил стандартної кривої наближений до 1. Оптимізацію здійснювали з використанням концентрацій зразка 10, 5, 2,5, 1,25 і 0,625 нг ДНК, приготованих з одної концентрованої аліквоти кДНК. Оптимальною для усіх генів була концентрація 2,5 нг.

Визначення морфофункціональних характеристик досліджених клітин. Редукційний потенціал клітин, як показник мітохондріального метаболізму, визначали в МТТ-тесті, а також в тесті з барвником WST-1 «Roche Molecular Biochemicals» (Berridge M.V., 2005). Результати тестів вимірювали у відносних одиницях поглинання (relative absorbance units, ABS) при довжині хвилі, відповідно, 550 нм і 450 нм з референтним фільтром 630 нм у планшетному сканері «Biorad». Для визначення клітинної загибелі було використано тестову систему ELISA «Roche Molecular Biochemicals», що вимірює фрагментацію ДНК, пов'язану виключно з апоптозом (Engval E., Perlman P., 1971).

Морфологічне дослідження і прямий підрахунок кількості клітин проводили за стандартними методиками світлової і флуоресцентної мікроскопії з модулюючою контрастною оптикою мікроскопа «Leica DMIL» (IMC - Image modulation contrast). Відповідно до конкретної задачі дослідження використовували барвники акридин оранжевий (мічення нуклеїнових кислот та визначення форми клітинної загибелі) і Hoechst 33342 в суміші з пропідій-йодидом для підтвердження цілісності клітинних мембран (Hawley T.S., 2004).

Вплив солей трифеніл-фосфоніум-броміду (ТФФБ) «Sigma», а саме, гекса- (ГТФФБ), дека- (ДТФФБ) та гексадецил-ТФФБ (ГДТФФБ) на культури клітин оцінювали шляхом прямого обліку кількості клітин в контрольних і дослідних зразках на приладі «ZM Coulter» та визначення життєздатності і рівня їхнього окислювально-відновного потенціалу клітин в МТТ-тесті. Для вивчення впливу солей ТФФБ на мітохондрії було використано метод трансмісійної електронної мікроскопії. Зразки для дослідження готували за стандартною методикою, аналізували на електронному мікроскопі «Jeol 100C» при 80 кV, мікрофотографії знімали при збільшенні від 10 000 до 56 000 разів.

Вміст цитохрому С в очищених мітохондріальних і цитоплазматичних фракціях визначали методом Вестерн-блоттингу, який проводили у 4 етапи (Burnette W.N., 1981): електрофоретичне розділення денатурованих протеїнів мітохондріальної та цитоплазматичної фракцій клітин на вертикальному поліакриламідному SDS-гелі; перенесення розділених протеїнів (на трансферній установці Mini Protean III «BioRad», 4 год при 50 мА/см) на нітроцелюлозну мембрану; інкубація мембран з первинними анти-цитохром С МкАТ (goat anti-Cytochrome-C human, «Santa Cruz») та вторинними антитілами, маркованими хемілюмінесцентною пероксидазою хрону (mouse HRP anti-goat). Хемілюмінесцентні сигнали отримували після експозиції зразків до фотоплівки за умов зменшеного доступу світла. Розмір продуктів визначався у порівнянні зі стандартними маркерами розміру протеїнів («Gentau»).

Внутрішньоклітинну концентрацію АТФ визначали люмінесцентним методом із застосуванням ферменту люциферази «Sigma» за допомогою люмінометра. Для здійснення реєстрації даних були використані SPPS та програмне забезпечення Microsoft Excel, для статистичного аналізу даних були застосовані критерії Стьюдента та ч2 Пірсона.

Результати досліджень та їх обговорення

Вивчення експресії NRS і TLR у клітинах пухлин різного гістогенезу та різного ступеня гормонозалежності було проведено з використанням ПЛР-праймерів для 8 представників надродини NRS (AR, PR, ERб, ERв, GRб, PPARб, PPARв, PPARг), TLR1-10, а також кількох цитокінів (ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-8).

Аналіз даних щодо експресії NRS (табл. 1) свідчить, що у найбільшій кількості досліджених клітинних ліній експресуються рецептори активаторів проліферації пероксисом PPARб (у 6 із 7 ліній - 85,7 %) і PPARв (у 5 із 7 ліній - 71,4 %), а також рецептори глюкокортикоїдів GRб (у 6 із 7 ліній - 85,7 %). Рецептори естрогенів (ERб, але не ERв) та прогестерону (PR) експресовані в культурах раку молочної залози. Рецептори андрогенів (AR) не виявлено в жодному з дослідів, що, найвірогідніше, пов'язано з гістогенезом досліджених пухлинних ліній. За індивідуальними профілями експресії ліганд-активованих ядерних рецепторів досліджені культури, залежно від гістогенезу, чітко відрізняються між собою. Найбільш широкий спектр NRS експресували клітини раку молочної залози (MCF-7, T-47D): рецептори естрогенів, прогестерону, глюкокортикоїдів, а також PPARб і PPARв. Клітинам колоректального раку притаманна експресія GRб і різних ізоформ PPAR (CACO - PPAR/GRб; LOVO - PPAR/PPAR/PPAR/GRб); клітинам гліобластоми (U-87MG) - GRб і PPAR; клітинам раку легені (Corl23) - PPAR та PPAR, а також ER (треба зазначити, що в жодній іншій з досліджених ліній цей рецептор не визначався). Культура ендотеліальних клітин (EAhy926) характеризувалася експресією рецепторів PPAR, PPAR, PPAR, ER та GRб.

Принципово подібні дані одержані і при дослідженні менінгіом людини. Аналіз відсоткового розподілу експресії NRS у 125 зразках останніх показав, що найчастіше були експресовані GRб і PPAR (кожний у 91 % випадків), а також PPAR (у 42 %). Достатньо типовою для менінгіом виявилася експресія PR (у 71 %), що узгоджується із даними, отриманими раніше (Blankenstein, 2000). Експресію AR спостерігали у 19 % випадків, ERб - у 8 %. Експресія ER була відсутньою (подібно до результатів дослідження пухлинних клітинних ліній). Експресія асоційованих із запаленням цитокінів була характерна, насамперед, для клітинних ліній колоректального раку (ІЛ-1 та ІЛ-6 у клітинах LOVO, ІЛ-8 у клітинах CACO, LOVO) та раку легені Corl23 (ІЛ-8). В клітинах гліобластоми експресувався ІЛ-1, в клітинах ендотелію EAhy926 - ІЛ-1 та ІЛ-6 (див. табл. 1).

Таблиця 1 Експресія NRS та деяких інтерлейкінів у клітинних лініях пухлин та ендотелію людини

№

Лінія клітин

P

P

P

ER

ER

PR

GRб

ІЛ-1

ІЛ-6

ІЛ-8

актин

GAPDH

1.

MCF-7

+

+

-

+

-

+

+

-

-

-

+

+

2.

T-47D

+

+

-

+

-

+

+

-

-

-

+

+

3.

CACO

+

-

-

-

-

-

+

-

-

+

+

+

4.

LOVO

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

5.

U-87MG

-

+

-

-

-

-

+

+

-

-

+

+

6.

Corl23

+

-

+

-

+

-

-

-

-

+

+

+

7.

EAhy926

+

+

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

Примітка. Pб - PPARб; Pв - PPARв; Pг - PPARг.

Визначення експресії Toll-подібних рецепторів в досліджуваних клітинних лініях (табл. 2) показало, що типовою для всіх ліній була експресія TLR1-6. Відмінності, пов'язані із гістогенезом клітинних ліній, торкались експресії TLR9 і меншою мірою TLR10. Експресію TLR7 спостерігали лише в клітинах еритролейкозу (лінія К562), експресію TLR8 не було виявлено в жодній лінії.

Таблиця 2 Експресія TLR у клітинних лініях пухлин різного походження та ендотелію людини

№

Лінія клітин

Походження

TLR

CD45

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1.

COLO

Колоректальний рак

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

2.

CACO

Колоректальний рак

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

-

3.

LOVO

Колоректальний рак

+

+

+

+

+

+

-

-

-

+

-

4.

U87MG

Гліобластома

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

-

5.

MCF-7

Рак молочної залози

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

-

6.

EAhy 962

Ендотелій

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

-

7.

K562

Еритролейкемія

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

Скринінг зразків менінгіом показав, що типовою для цих пухлин є експресія TLR1-4 (100 % випадків); експресія TLR10 визначалась у 90 %, TLR5, TLR6 і TLR9 - у 80 % випадків. Характерною для проаналізованого матеріалу була відсутність експресії TLR7 та TLR8 у всіх зразках. Таким чином, результати вивчення експресії TLR у первинному пухлинному матеріалі менінгіоми людини узгоджуються з даними, отриманими при дослідженні пухлинних клітинних ліній, і обґрунтовують точку зору, що експресія TLR (зокрема, TLR1-6, TLR9, TLR10) є звичним явищем у пухлинних клітинах людини. Виходячи з сучасних уявлень щодо патогенетичного зв'язку процесів хронічного запалення і злоякісної трансформації епітеліоцитів (зокрема, у слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту та органів дихання), треба зазначити, що описана вище експресія прозапальних цитокінів у культурах клітин колоректального раку і раку легенів співпадала з експресією TLR1-6, до ефектів зв'язування яких лігандами належить активація транскрипційного фактора NF-кB, що, як вважають, займає одне з центральних місць у впливі процесу запалення на канцерогенез (Karin M., 2006; Maeda S., Omata M., 2008).

Беручи до уваги найбільш часте визначення значного рівня експресії GRб, PPARб та PPARв у всіх досліджених матеріалах, було проведено подальше вивчення впливу активації цих представників NRS на функціональний стан пухлинних клітин (проліферацію, редукційний потенціал, чутливість до апоптогенних факторів різного механізму дії) із особливою увагою до GRб. У зазначеній серії дослідів були використані первинні культури менінгіом та клітинна лінія гліобластоми U-87MG. Зокрема, було вивчено динаміку впливу 1 мкМ синтетичного глюкокортикоїду дексаметазону «Sigma» (Dex) на проліферативну активність, морфологію і редукційний потенціал клітин менінгіоми у первинній культурі. Показано, що протягом 3 діб після обробки Dex суттєві відмінності між показниками редукційного потенціалу (визначення з використанням WST-1) в контрольних і дослідних культурах відсутні (рис. 1). Починаючи з 4-ї доби, зареєстровано 2 типи відповіді клітин менінгіоми на Dex. Перший тип відповіді (серія експериментів А) характеризувався тенденцією до зниження редукційного потенціалу на 4-ту добу дії Dex (0,192 ± 0,010 проти 0,220 ± 0,010 ABS в контролі, р>0,05) і статистично значимим зниженням потенціалу на 6-ту добу дослідження (відповідно, 0,263 ± 0,015 і 0,340 ± 0,020 ABS, р<0,05; зниження на 23 %). При другому типі відповіді (серія експериментів Б) показники редукційного потенціалу клітин, оброблених Dex, достовірно знижувались вже на 4-ту добу і становили 0,476 ± 0,021 порівняно із 0,548 ± 0,026 ABS в контролі (р<0,05). На 6-ту добу ця різниця ставала ще більш виразною (0,179 ± 0,006 проти 0,932 ± 0,041 ABS, р<0,001; зниження на 81 %). Вивчення клітин під інвертованим мікроскопом при збільшенні 100Ч та 200Ч засвідчило, що ефект падіння результатів WST-1-тесту є наслідком зниження кількості клітин в дослідних культурах, але прямого зв'язку між ступенем зниження редукційного потенціалу і зменшенням кількості клітин не встановлено.

Особливістю описаних серій експериментів виявилось те, що у культурах серії А була відсутня експресія GR, тоді як у культурах серії Б її було визначено. Виходячи з викладених результатів, можливо припустити, що ефект Dex спостерігається не внаслідок індукції клітинної загибелі, а імовірніше, є проявом падіння рівня редукційного потенціалу під впливом механізмів, індукованих через GRб. Метаболізм WST-1 у клітинах серії експериментів А був приблизно удвічі нижчий, ніж у клітинах серії експериментів Б. Це може свідчити, що у останніх рівні NADH та NAD(P)H значно знижені; у цих умовах Dex, очевидно, здійснює більш значний вплив на редукційний потенціал.



Рис. 1 Вплив Dex на редукційний потенціал первинних культур менінгіоми

У подальших експериментах визначали вплив Dex у культурах менінгіом на дію пероксиду водню протягом 6-денного інкубаційного періоду. Було показано, що тоді як пероксид водню у концентрації 50 мкM не діє на метаболізм WST-1 через 24 год. після обробки, додавання Dex пригнічує редукційний потенціал клітин. При дії пероксиду водню у концентрації 100 мкM на 1-шу добу після обробки метаболізм WST-1 навіть дещо підвищується; у присутності Dex, навпаки, в цей термін спостерігається зниження редукційного потенціалу досліджуваних клітин. Це свідчить про швидкий вплив Dex на реакцію первинних культур менінгіоми (рис. 2).



Рис. 2 Відповідь пухлинних клітин менінгіоми на дію 100 мкM пероксиду водню за відсутності та у присутності Dex (1 мкM). Визначення методом WST-1

При подальшому дослідженні спостерігали поступове достовірне зростання редукційного потенціалу контрольних культур. При дії пероксиду водню (незалежно від додаткового впливу Dex) протягом 5 діб показники редукційного потенціалу змінювалися мало, а на 6-ту добу - знижувалися. В усіх точках визначення редукційний потенціал культур, оброблених перекисом водню і Dex, був дещо меншим, ніж культур, що зазнали впливу лише перекису водню (див. рис. 3). Вплив пероксиду водню на зниження редукційного потенціалу у клітинах менінгіоми може бути пояснений тим, що оксидативний стрес різко виснажує клітинні запаси NADH та NAD(P)H. Ці кофактори використовуються антиоксидантними ферментними системами, і ці ж кофактори задіяні у відновленні WST-1.

Слід зазначити, що мікроскопічні дослідження культур менінгіом при дії пероксиду водню у концентрації 100 мкM показали ознаки клітинної загибелі із характеристиками апоптозу. Водночас, за присутності Dex, морфологія оброблених пероксидом водню клітин була більш подібною до морфології контрольних клітин, хоча загальна кількість клітин та їх редукційний потенціал знижувалися. Тобто, в первинних культурах менінгіом зафіксовано різноспрямований вплив Dex на ефекти перекису водню, що реєструються у WST-1-тесті та при мікроскопічному дослідженні.

Експерименти з використанням клітинної лінії U87-MG, яка, як було показано раніше, експресує GR (див. табл. 1), показали, що відповідь цієї лінії на вплив лише Dex подібна до відповіді менінгіом у серії експериментів Б. Водночас, було виявлено певні відмінності у відповіді клітин цієї лінії на сукупний вплив Dex і перекису водню порівняно з описаною вище відповіддю первинних культур менінгіом. Клітини лінії U-87MG обробляли пероксидом водню у концентраціях 10-250 мкM (щоб уникнути гострих цитотоксичних ефектів, пов'язаних із індукцією некрозу) за відсутності та з попередньою обробкою Dex. Було виявлено, що 10 мкM пероксиду водню знижували редукційний потенціал на 52 % у порівнянні із контролем, в той час як спільна дія із Dex знижувала редукційний потенціал на 81 %. Дія 50 мкM пероксиду водню пригнічувала метаболізм WST-1 на 71 % у порівнянні з контрольними показниками, а спільна дія з Dex - на 88 %. Слід також зазначити, що при сукупній дії Dex і пероксиду водню у концентраціях 10 та 50 мкM в клітинах лінії U87-MG не спостерігалася жодна з характеристик апоптозу (на відміну від культур, оброблених лише пероксидом водню), що вказує на важливу роль GRб у регуляції клітинного поділу та клітинної загибелі. У цьому експерименті будь-яке подальше збільшення концентрації пероксиду водню було гостро цитотоксичним, більшість клітин проходили некроз. Однак, навіть при високих концентраціях оксиданту при візуальному спостереженні клітин під мікроскопом Dex все ще був здатен захистити частину клітин від загибелі.

На наступному етапі було проведено дослідження загибелі клітин лінії U87-MG, оброблених 100 та 250 мкM пероксиду водню за відсутності та у присутності Dex (1 мкM), методом ELISA (рис. 3). Dex суттєво знижував апоптотичну фрагментацію ДНК при дії пероксиду водню у концентрації 100 мкM, що співпадає з даними візуальних спостережень контрольних і дослідних культур. При дії пероксиду водню у концентрації 250 мкM кількість фрагментованої ДНК була значно меншою (це вказує на те, що некроз стає переважаючою формою клітинної загибелі). Але і за таких умов дія Dex проявлялась у зниженні апоптотичної фрагментації ДНК. Таким чином, в дослідах з клітинною лінією гліобластоми U-87MG встановлено однотипний вплив Dex на метаболічні і морфологічні ефекти, а також цитотоксичну дію (шляхом апоптозу і некрозу) пероксиду водню.

Рис. 3 Вплив Dex (1 мкM) на наслідки оксидативного стресу, зумовленого пероксидом водню, у клітинах гліобластоми лінії U-87MG

Дослідження впливу лігандів NRS (естрогену, Dex, прогестерону) на експресію TLR (зокрема, TLR2 і TLR4) в клітинах раку молочної залози лінії MCF-7 показало, що в той час, як ER не пов'язаний із регуляцією експресії TLR, дія Dex і прогестерону підвищує експресію TLR2 у 1,8 і 6,0 разів, TLR4 - у 3,5 і 3,0 рази, відповідно, що узгоджується з опублікованими раніше результатами досліджень експресії генів TLR в клітинах імунної системи під дією глюкокортикоїдів і прогестерону (Rozkova D., 2006). На цій же лінії клітин було показано, що ліганд TLR (LPS E.coli) індукує експресію TLR (TLR4, TLR9), знижує чутливість пухлинних клітин до апоптогенного впливу H2O2, але підвищує здатність останнього індукувати некроз.

На завершальному етапі роботи ми дослідили вплив трьох модифікацій солей трифеніл-фосфоніум-броміду ТФФБ (гекса-, дека- та гаксадека-ТФФБ), на морфофункціональні характеристики клітин раку молочної залози людини (MCF-7) та імморталізованих ендотеліальних клітин (EАhy926). За допомогою МТТ-тесту було показано, що інкубація клітин обох ліній з модифікаціями ТФФБ (концентрація від 1 до 5 мкM) протягом 24-72 год. супроводжується прогресуючим, залежно від концентрації, зниженням редукційного потенціалу клітин (рис. 4). Зокрема, редукційний потенціал контрольних клітин лінії EАhy926 становив 1,510 0,030 ABS; при впливі 5 мкМ ГТФФБ він достовірно знижувався до 0,430 0,010, ДТФФБ - до 0,200 0,008, ГДТФФБ - до 0,160 0,005 ABS. Щодо лінії клітин MCF-7 встановлено, що редукційний потенціал різко знижувався при дії усіх 3 модифікацій ТФФБ вже у концентрації 1 мкM (при дії ГТФФБ - 0,253 0,012, ДТФФБ - 0,204 0,010, ГДТФФБ - 0,084 0,002 ABS проти 0,765-0,667 ABS у контрольних культурах; в усіх випадках р<0,05). При збільшенні концентрації солей до 5 та 10 мкM, ефект всіх модифікацій ТФФБ у лінії MCF-7 був ідентичний.

Результати цих експериментів свідчать, що найефективнішою модифікацією базової молекули виявився n-ГДТФФБ, тобто базова молекула, модифікована полінасиченим полікарбоновим ланцюгом з 16 атомами вуглецю.



Рис. 4 Редукційний потенціал клітин ліній EAhy926 (А) і MCF-7 (Б) під впливом різних модифікацій ТФФБ у різних концентраціях

Проліферативну активність клітин визначали за допомогою приладу Z3 Coulter Counter (Beckman, USA) (рис. 5).

Рис. 5 Проліферативна активність клітинної лінії MCF-7 під впливом низьких концентрацій ГДТФФБ (усереднені значення 3 експериментів)

Початкова кількість культивованих клітин становила 1Ч103 на комірку. Інгібуючий вплив солей ТФФБ визначався, починаючи з концентрації 100 нМ. Так, на 3-тю добу у контролі кількість клітин збільшувалася удвічі; внаслідок дії 100 нМ ГДТФФБ становила (1,3 0,02)Ч103 і продовжувала зменшуватися при подальшому збільшенні концентрацій (для концентрації 250 нМ - (1,1 0,01)Ч103, 500 нМ - (1,05 0,01)Ч103). На 5-ту добу у контролі кількість клітин дорівнювала (6,63 0,05)Ч103; при дії 100 нМ ГДТФФБ досягала тільки (2,2 0,03)Ч103; 250 нМ - (1,57 0,02)Ч103; 500 нМ - (1,14 0,03)Ч103 клітин на комірку. Особливо переконливі результати отримані на 6-ту добу, коли в контролі налічували (9,52 0,07)Ч103 клітин на комірку, а при дії 100 нМ ГДТФФБ втричі менше - (3,82 0,05)Ч103. Збільшення концентрації до 250 нМ призводило до падіння кількості клітин і дорівнювало (1,25 0,02)Ч103, до 500 нМ - (0,98 0,01)Ч103 клітин на комірку. Використання ГДТФФБ у концентраціях менше 100 нМ, а саме 50 та 75 нМ, не впливало на проліферацію клітин лінії MCF-7.

Таким чином, у межах концентрацій від 100 до 500 нМ ГДТФФБ справляє дозозалежний статистично достовірний (p<0,05) інгібуючий ефект на проліферацію клітин, а у діапазоні від 1 мкM до 10 мкM призводить до достовірного зниження редукційного потенціалу і апоптозу переважної більшості досліджених культивованих клітин.

За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії, із використанням кількісного методу ELISA та WST-1-методу показано, що солі ТФФБ (зокрема, катіонічна сполука ГДТФФБ) потужно індукують апоптоз шляхом руйнування мітохондрій. Для вивчення впливу активації GRб на ефективність цих мітохондріально-націлених сполук було проведено дослідження редукційного потенціалу (із використанням WST-1-тесту), фрагментації ДНК (із використанням методу ELISA) та формування апоптотичних тілець (із використанням забарвлення Hoechst 33342) у первинних культурах менінгіом, які піддавали обробці ГДТФФБ за відсутності та у присутності (протягом 5 год.) Dex.

Було виявлено, що дія ГДТФФБ проявляється у дозозалежному зниженні показника редукційного потенціалу клітин менінгіоми (рис. 6 А) у WST-1-тесті; у присутності Dex (1 мкМ) спостерігається подальше його зниження. Обсяг апоптотичної фрагментації ДНК, визначений методом ELISA, майже у 5 разів зростає порівняно з контролем під дією 1 мкМ ГДТФФБ і достовірно знижується під дією 10 мкМ ГДТФФБ. Це вказує, що остання концентрація ГДТФФБ індукує переважно некроз клітин. Зниження показника фрагментації ДНК при сумісній дії обох концентрацій ГДТФФБ і Dex відповідає пригніченню апоптотичної загибелі клітин у культурах (рис. 6 Б).

Рис. 6 Рівень редукційного потенціалу клітин з первинних культур менінгіоми в разі дії ГДТФФБ протягом 24 год. безпосередньо та із додаванням Dex; дослідження методом WST-1 (А) та методом ELISA (Б)

Під дією ГДТФФБ (1 мкМ) вже через 5-8 год. спостерігали морфологічну відповідь клітин, яка характеризувалася усіма ознаками класичного апоптозу. У клітинах, на які не подіяв ГДТФФБ, виявляли велике інтактне ядро, що забарвлювалося Hoechst 33342 у блідий блакитно-білий колір. Апоптотичні клітини містили фрагменти інтенсивного синього забарвлення, які свідчили про високий ступінь конденсації хроматину. Хоча за даними методів WST-1 і ELISA Dex ефективно блокує апоптоз, клітини, оброблені ГДТФФБ і Dex, морфологічно характеризувалися вакуолізованою цитоплазмою і повною відсутністю проліферації. Інформація, отримана в результаті електронно-мікроскопічних досліджень і досліджень рівня внутрішньоклітинної АТФ, підтвердила факт набрякання мітохондрій у разі дії солей ТФФБ. Таким чином, Dex не захищає мітохондрії від набрякання, яке викликається пошкоджуючою дією солей ТФФБ.

У подальшому було поставлено задачу вивчити на якому етапі відбувається блокування ГДТФФБ-індукованого апоптозу Dex. У зв'язку з тим, що передислокація цитохрому С є ключовим моментом в індукції мітохондріального апоптозу, було вирішено проаналізувати процес переходу цитохрому С в цитоплазму під впливом ТФФБ і показати, як змінюється цей процес при додатковому впливі Dex. Цитохром С визначали методом Вестерн-блоттингу в очищених мітохондріальних і цитоплазматичних фракціях. Було показано, що ГДТФФБ викликає передислокацію цитохрому С з мітохондрій в цитоплазму клітини; ефект цілковито блокується Dex, при цьому апоптотична загибель клітин не відбувається (рис. 7). Для подальшого аналізу механізму блокування апоптозу Dex проведені кількісні дослідження експресії апоптоз-інгібуючого протеїну (AIП) сурвівіну методом Вестерн-блоттингу. На рис. 8 показані результати експозиції клітини до імуноглобулінового “сендвічу”, первинне антитіло якого було специфічне до сурвівіну. Наведені дані свідчать, що Dex не впливає на рівень експресії сурвівіну, тоді як обробка клітин ГДТФФБ викликає виразну індукцію експресії сурвівіну, яка не змінюється під додатковим впливом Dex.

Контроль	ГДТФФБ	ГДТФФБ+Dex
Мітохондрії	Цито-плазма	Міто-хондрії	Цито-плазма	Цито-плазма	Міто-хондрії

Рис. 7 Результати Вестерн-блоттингу на розділених мітохондріях і цитоплазмі клітин після дії ГДТФФБ і впливу Dex; процес передислокації цитохрому С (14 кДа) з матриці мітохондрій у цитоплазму клітин

Контроль	Dex	ГДТФФБ	ГДТФФБ + Dex

Рис. 8 Результати Вестерн-блоттингу для сурвівіну (18,5 кДа)

Таким чином, у результаті проведених досліджень встановлено, що катіонні сполуки на основі ТФФБ зумовлюють зниження негативного електрохімічного потенціалу мітохондрій клітин. Молекули ТФФБ, модифіковані довшими полінасиченими полікарбоновими ланцюгами, мають більшу афінність до мітохондрій та викликають апоптотичну загибель культивованих клітин in vitro у значно менших концентраціях, ніж молекули із коротшими ланцюгами. ГДТФФБ індукує апоптоз у всіх первинних культурах менінгіом і клітинних лініях MCF-7 і EAhy926. Dex призводив до блокування апоптозу, зумовленого ГДТФФБ, перешкоджаючи транслокації цитохрому С з матриці мітохондрій у цитоплазму, таким чином запобігаючи активації каспазного каскаду. Механізм блокування Dex апоптозу потребує подальшого вивчення.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі викладені теоретичні узагальнення результатів аналізу рівнів експресії генів надродини ядерних рецепторів і Toll-подібних рецепторів та ефекти їх лігандів у пухлинних клітинних лініях та у первинному матеріалі менінгіом.

Встановлено, що найбільш типовою для пухлин різного гістогенезу є експресія рецепторів глюкокортикоїдів (GR) та рецепторів-активаторів проліферації пероксисом (PPAR). Ці фенотипові ознаки виявлено як у клітинних лініях, так і в первинному матеріалі (біоптати менінгіом), але в перших найчастіше визначали експресію PPARб, в других - PPARв.

За профілем експресії рецепторів статевих стероїдних гормонів (AR, PR, ERб, ERв), а також рецепторів ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-8 досліджені пухлинні клітини чітко відрізняються залежно від походження пухлини. Зокрема, типовою для клітин менінгіом була експресія рецепторів прогестерону (PR) - 71 %, тоді як б-рецептор естрогенів (ERб) виявлено лише у 8 % зразків, що вказує на втрату контролю експресії гену рецептора прогестерону б-рецептором естрогенів.

Встановлено експресію Toll-подібних рецепторів TLR1-6 та TLR9-10 у пухлинних клітинних лініях різного походження та у первинних культурах менінгіом; експресію TLR8 не було виявлено в жодному випадку. Показано, що бактеріальні ендотоксини здатні модулювати (активувати) експресію власних (TLR4) і функціональних (TLR9) Toll-подібних рецепторів у пухлинних клітинах, що може знижувати чутливість останніх до апоптотичних сигналів.

Синтетичний глюкокортикоїд Dex пригнічує проліферацію первинних культур менінгіоми і клітинної лінії гліобластоми U-87MG та зумовлює їх виражений захист від клітинної смерті, індукованої оксидативним стресом.

Катіонна сполука гексадецилтрифеніл-фосфоніум-бромід індукує апоптоз у всіх первинних культурах менінгіоми і пухлинних клітинних лініях різного походження, у той час як Dex блокує цей процес, запобігаючи проникненню цитохрому С в цитоплазму клітин.

Отримані результати є підґрунтям для розробки нового класу цільових протипухлинних хіміотерапевтичних препаратів, уражувальна дія яких спрямована безпосередньо на мітохондрії.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Bilko D. Glucocorticoids block oxidant-induced endothelial cell death // Наукові записки НаУКМА, 2007. - Т.67. - с. 15-18. Внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, аналіз і формулювання висновків, написання статті.

2. Білько Д.І. Аналіз експресії надродини ліганд-активованих рецепторів у злоякісних клітинних лініях різного походження / Д.І. Білько, К. Ньютон, М.Ф. Стародуб // Науковий вісник Національного університету біоресурсів і природокористування України, 2009. - Вип. 134, т. 3. - с. 228-233. Внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, аналіз і формулювання висновків, написання статті.

3. Bilko D. Toll-like receptor expression in cell lines and primary tumour material // Наукові записки НаУКМА, 2008. - том 80, с. 15-17. Внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, аналіз і формулювання висновків, написання статті.

4. Білько Д.І. Модифікований дельта/дельта-СТ метод обчислення результатів SYBR GREEN кількісної ПЛР / Д.І. Білько, М.Ф. Стародуб // Науковий вісник Національного університету біоресурсів і природокористування України, 2009. - Вип. 134, т. 3. - с. 224-228. Внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, аналіз і формулювання висновків, написання статті.

5. Jacklin A. The sesame seed oil constituent, sesamol, induces growth arrest and apoptosis of cancer and cardiovascular cells / A. Jacklin, C. Ratledge, K. Welham, D. Bilko, C.J. Newton. // Annals of the New York Academy of Sciences, 2003. - Vol. 1010. - P. 374-380. Внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, аналіз і формулювання висновків, написання статті.

6. Newton C.J. Dexamethasone blocks antioestrogen- and oxidant-induced death of pituitary tumour cells / C.J. Newton, D. Bilko, S. Pappa, S.L. Atkin // The Journal of Endocrinology, 2001. - Vol. 169(2). - P. 249-261. Внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, аналіз і формулювання висновків, написання статті.

...