Дія низьких температур та імуноізоляції на властивості тканин надниркових залоз in vitro і при ксенотрансплантації

Размещено на http://www.allbest.ru

нацІональна академІя наук украЇнИ

Інститут проблем крІобІологІЇ І крІомедицинИ

ДЕН БО

УДК 57.043:611.451.085.2

дія низьких температур та ІМУНОІЗОЛЯЦІЇ НА ВЛАСТИВОСТІ ТКАНИН НАДНИРКОВИХ ЗАЛОЗ IN VITRO І ПРИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦІЇ

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

САНДОМИРСЬКИЙ Борис Петрович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріомедицини

доктор біологічних наук

БОНДАРЕНКО Людмила Олександрівна,

Державна установа (Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України), завідувач лабораторії хроноендокринології

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професор Л.Ф. Розанов

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сучасна гормонозамісна терапія, що використовується при ряді ендокринних патологій, не може відновити весь комплекс метаболічних взаємодій гормонів. У зв'язку з цим, трансплантація ендокринних клітин є більш фізіологічним методом, що дозволяє зберегти добові та сезонні гормональні ритми, забезпечити регуляцію гормонопродукції під контролем гіпоталамо-гіпофізарної системи. Однак, серйозним обмеженням для широкого клінічного використання клітинних трансплантатів є обмежений строк їх функціонування у зв'язку з відторгненням (Lee M.K., 2000).

Різні методи обробки донорського матеріалу і реципієнтів було запропоновано для вирішення цієї проблеми, серед яких імуносупресія (Ortega J.D., 1992; Berney T., 1999), імуномодуляція шляхом культивування (Rutzky L.P., 2002), кріоконсервування з диференційованими швидкостями охолодження (Taylor M.J., 1987; Iwasa K., 1994). Ряд методів, які давали задовільні результати при трансплантації щитовидної і паращитовидних залоз (Donohoe J.A., 1983), острівцевих клітин підшлункової залози (Ricordi C., 1990), у випадку адренокортикальної трансплантації потребували додаткового використання циклоспорину А (Ricordi C., 1987).

Тривалість функціонування алогенних та ксеногенних адренокортикальних фрагментів обмежена (Бондаренко Т.П., 2002; Геращенко А.В., 2002), хоча гормони, що секретуються трансплантатами (глюкокортикоїди, дегідроепіандростерон і т.д.) володіють імуносупресивним ефектом, впливаючи на міграцію імунних клітин, продукцію багатьох цитокінів і медіаторів запалення (Elenkov I.J., 1999).

Трансплантація мікроінкапсульованих клітин з використанням біологічних матеріалів, що забезпечують імунологічну ізоляцію трансплантату та підтримують його проліферацію, регенерацію клітин трансплантату, є одним з перспективних методів в області клітинної трансплантації (Balamurugan A.N., 2003).

Small intestinal submucosa (SIS) - ксеногенний біоматеріал, отриманий з селективних шарів тонкого кишківника поросят - вже показав свої виключні ремоделюючі характеристики при трансплантації кровоносних судин (Lindberg K., 2001), шкіри (Ortega J.D., 2002). Отримані позитивні результати при трансплантації острівцевих клітин (Rutzky L.P.; Pribitkin E.A., 2004). Переваги SIS пов'язані не тільки з впливом на тип імунної відповіді, що буде переважати після трансплантації (Th-2 або Th-1), але й зі стимуляцією регенеративних процесів в трансплантаті, покращенням його трофіки внаслідок прискорення васкуляризації (Tian X.H., 2005). В екстрактах SIS було показано наявність ростових факторів (Voytik H., 1997). Крім того, продемонстровано можливість використання SIS як підложки для стимуляції клітинних культур in vitro (Woods E.J., 2004; Zhang Y., 2000; 2005). Все вищезазначене дозволяє припустити, що SIS ксеногенного або алогенного походження може представляти інтерес з точки зору імуноізолюючого матеріалу при трансплантації клітин надниркових залоз.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі фізіології людини та тварин Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна в рамках науково-дослідної теми «Фізіолого-біохімічні та структурно-функціональні закономірності клітинної адаптації до дії екзо- та ендогенних чинників» (№ державної реєстрації 0106U001584) та у відділі кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини (ІПКіК) НАН України в рамках двох науково-дослідних тем: «Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин» (№ державної реєстрації 0101U003478) та «Властивості ендокринних тканин за умов кріоконсервування та трансплантації експериментальним тваринам» (№ державної реєстрації 0106U002163).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідження впливу SIS-інкапсулювання на функціонування і структурні властивості нативних органотипових культур і кріоконсервованих та рекультивованих в умовах нормо- і гіпотермії фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят in vitro і при ксенотрансплантації.

Відповідно до встановленої мети передбачалося вирішити ряд задач:

1. Оцінити вплив органотипового культивування на базальну і дбцАМФ-стимульовану гормонопродукуючу активність та рівень ПОЛ SIS-інкапсульованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят in vitro.

2. Вивчити вплив повільного і швидкого заморожування та наступного рекультивування в умовах нормо- та гіпотермії на базальну і дбцАМФ-стимульовану гормонопродукуючу активність та рівень ПОЛ SIS-інкапсульованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят in vitro.

3. Дослідити in vivo функціональну активність SIS-інкапсульованих нативних органотипових культур і кріоконсервованих з різними швидкостями охолодження та рекультивованих в умовах нормо- та гіпотермії фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят на основі гістологічного аналізу трансплантатів, рівня кортизолу, альдостерону і холестерину в плазмі крові, рівня глюкози в крові та глікогену в печінці, фагоцитарної активності ПМ у тварин-реципієнтів.

Об'єкт дослідження - морфофункціональні властивості органотипової культури та кріоконсервованих і рекультивованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят.

Предмет дослідження - органотипова культура, кріоконсервовані та рекультивовані фрагменти надниркових залоз новонароджених поросят.

Методи дослідження - органотипове культивування, кріоконсервування з різними швидкостями охолодження, спектрофотометричний метод визначення ПОЛ та активностей антиокислювальних ферментів глутатіонредуктази і глутатіонпероксидази, хірургічний метод моделювання надниркової недостатності (адреналектомія), радіоімунологічний метод визначення гормонів, метод оцінки фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів, біохімічні методи дослідження, світлова мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше проведено дослідження морфофункціональних властивостей органотипової культури і кріоконсервованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят, інкапсульованих в SIS. Показано, що в процесі культивування знижується гормонопродукуюча активність органотипової культури, що найбільш виражено для SIS-інкапсульованих зразків. Однак, здатність до дбцАМФ-стимульованої секреції як кортизолу, так і альдостерону, виявлено у випадку 2-добової органотипової культури. Вперше було показано, що за рівнем базальної секреції кортизолу і альдостерону та здатності до стимульованого стероїдогенезу найбільш високу гормонопродукуючу активність мали повільно заморожені фрагменти надниркових залоз, рекультивовані в SIS при 26 єС, в той час як для швидко заморожених зразків рівень даних показників був значно вищим у випадку рекультивування в SIS при 37 єС. Вперше було проведено ксенотрансплантацію SIS-інкапсульованої органотипової культури і фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят, кріоконсервованих з різними швидкостями охолодження. Зафіксовано компенсаторний ефект SIS-інкапсульованого матеріалу в достатньо віддалені посттрансплантаційні строки. Серед органотипових культур найбільша ефективність in vivo притаманна 2-добовій органотиповій культурі, інкапсульованій в SIS. У випадку кріоконсервованих фрагментів вірогідна компенсація надниркової недостатності спостерігалась після трансплантації як повільно, так і швидко заморожених зразків, рекультивованих за умов гіпотермії в SIS.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в даній роботі, розширюють фундаментальні знання про функціонування трансплантаційного матеріалу в організмі реципієнта після впливу факторів, що сприяють зниженню імуногенності донорського матеріалу, таких як органотипове культивування, кріоконсервування та рекультивування. Запропоновано спосіб підвищення ефективності адренокортикальних трансплантатів шляхом їх інкапсуляції в SIS.

Особистий внесок здобувача. Висунуті на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, які мають відношення до теми дисертації, опубліковані у співавторстві з науковим керівником д.б.н., проф. Бондаренко Т.П., співробітниками відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, відображають результати сумісного планування і проведення експериментів у відділі, обговорення результатів і підготовки матеріалів до друку.

Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки в роботі. В опублікованих зі співавторами роботах, особистий вклад здобувача полягає:

- в роботі [1] в дослідженні гормональної активності органотипових культур надниркових залоз при трансплантації та участі в обговоренні результатів;

- в роботах [2, 6, 7] в проведенні адреналектомії та трансплантації SIS-інкапсульованих надниркових залоз, визначенні рівня холестерину в плазмі крові тварин, обробці та аналізі експериментальних даних;

- в роботах [3, 4] в отриманні фрагментів SIS, проведенні адреналектомії, трансплантації SIS-інкапсульованих надниркових залоз, вимірюванні рівню глюкози в крові тварин-реципієнтів, проведенні гістологічного аналізу та участі в обговоренні результатів;

- в роботі [5] в отриманні органотипової культури надниркових залоз новонароджених поросят, визначенні рівня її гормональної активності, аналізі отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи представлені на симпозіумі «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007 р.); IX з'їзді трансплантологів України (Київ, 2007 р.); 18 European Students Conference «Promising Medical Scientists Willing to Look Beyond» (Berlin, 2007 р.), конференції молодих вчених ІПКіК (Харків 2008 р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті, 3 з яких - в наукових фахових виданнях, 3 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 152 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 2 таблицями, 74 рисунками і мікрофотографіями. Дисертаційна робота містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати досліджень і їх обговорення, підсумок і список літератури на 24 сторінках, який включає 184 джерела, в тому числі 147 - іншомовних.

наднирковий залоза порося інкапсулювання ксенотрансплантація

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження

В роботі використовувались нативні і кріоконсервовані фрагменти та органотипові культури надниркових залоз новонароджених поросят. В якості реципієнтів для трансплантації використовували щурів лінії Вістар (самки) віком 3 місяці (220 шт). Експерименти на лабораторних тваринах проводились з дотриманням загальних Національних норм біоетики (Перший національний конгрес з біоетики, Київ, 2001) і положень «Європейської концепції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних або інших наукових цілей» (Страсбург, 1986).

Новонароджених поросят (300 шт.) забивали з використанням ефірного наркозу, надниркові залози негайно вилучали в стерильних умовах, відмивали середовищем 199, що містило 100 од/мл пеніциліну і 200 мкг/мл стрептоміцину, подрібнювали на фрагменти розміром 1-3 мм³ та приміщували в охолоджене середовище RPMI.

Органотипову культуру надниркових залоз отримували за стандартною методикою (Грищенко В. І. та ін., 2000) при температурі 37 С або 26 єС.

Заморожування фрагментів надниркових залоз здійснювали в пластикових контейнерах фірми “Nunс” (V=2 мл) з використанням наступних швидкостей охолодження: 1 С/хв (Бондаренко Т. П., 2001) та 85-100 С/хв (Гуріна Т.М., 2004). Відігрів здійснювали на водяній лазні (37 С) до зникнення твердої фази. Фрагменти надниркових залоз після заморожування-відігріву рекультивували при 26 С або 37 С протягом 2 діб (Алабедалькарім Н. М., 2005).

Фрагменти SIS було отримано з інтестіни новонароджених поросят за методом Badylak S. F. (Suckow M. A., 1999).

Для вивчення базальної секреції кортизола нативні, кріоконсервовані і рекультивовані зразки інкубували 24 години в середовищі RPMI з 10 % сироваткою великої рогатої худоби за стандартних умов культивування. Вивчення стимульованого стероїдогенезу проводили при додаванні до стандартного середовища культивування дбцАМФ до кінцевої концентрації 2 ммоль/л.

Вимірювання інтенсивності перекисного окислення ліпідів у гомогенатах надниркових залоз новонароджених поросят проводили за методом (Владимиров Ю.А., 1972). Рівень глутатіонпероксидази визначали за методом (Герасимов А.М., 1976), глутатіонредуктази - за методом (Paglia D.E., 1967).

Трансплантацію фрагментів та органотипових культур в дозі 35 мг здійснювали під капсулу нирки двостороннє адреналектомованих щурів (А/е) під комбінованим наркозом (кетамін - 2,5 мг, ксилазін - 0,5 мг/100 г маси тіла тварин).

Рівень кортизолу в плазмі крові тварин-реципієнтів і середовищі культивування визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів СТЕРОН-К-¹²⁵І-М (Бєларусь). Для оцінки імунологічного стану реципієнтів визначали фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів (Александров М. Т., 1988).

Вимірювання рівня глюкози в плазмі крові тварин після трансплантації здійснювали за методом в модифікації Н.В. Клімкіної (Пушкина Н.Н., 1963).

Вміст глікогену у печінці вимірювали за методом (Меньшиков В.В., 1999) та нормували на 100 мг маси тканини.

Для проведення гістологічних досліджень трансплантаційний матеріал або нирку з трансплантатом фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну, зневоджували етанолом і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 5-7 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином. Препарати досліджували під світловим мікроскопом при збільшеннях об'єктиву х10, х20 і х40. Мікрофотозйомку здійснювали на мікроскопі «Olimpus ІХ 71».

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою пакету аналізу програми “Excel” з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) для непараметричних даних.

Результати досліджень та їх обговорення

Морфофункціональні властивості органотипової культури надниркових залоз новонароджених поросят при SIS-інкапсуляції. Обмежений термін функціонування органотипових культур ендокринних залоз в організмі реципієнта перешкоджає широкому застосуванню неваскуляризованого матеріалу в клінічній практиці. Відсутність функціональної активності ендокринного трансплантату пов'язана з рядом причин: відторгнення донорського матеріалу імунною системою хазяїна, нестатність трансплантата у зв'язку з погіршенням трофіки гормонопродукуючих клітин і некрозом значної частки трансплантованої тканини. Для зниження імуногенності трансплантованої ендокринної тканини застосовують метод культивування (Зубкова Г.А, 2005). Але культивування органотипових культур надниркових залоз на протязі 2-6 діб призводило до зниження базального гормонопоеза, пригнічення або відміни дбцАМФ-стимульованої секреції кортизолу адренокортикоцитами новонароджених поросят (Алабедалькарім Н.М., 2007). Ефективна регенерація та репарація пошкодженої тканини потребує відновлення кровотоку для метаболічної підтримки клітин. Одним із способів вирішення цієї проблеми є застосування біологічно сумісної оболонки, що буде сприяти васкуляризації трансплантата, регенерації і репарації клітин. Одним з таких матеріалів є SIS. З одного боку, SIS імуноізолює трансплантаційний матеріал, сприяючи інгібуванню або відстрочці імунної відповіді (Metzger D.W., 2002). З іншого боку, інкапсуляція гормонопродукуючої тканини в SIS позитивно впливає на її морфофункціональні характеристики (Lakey J.R., 2001; Tian X.H., 2005), що, ймовірно, забезпечується присутністю в складі SIS ростових факторів (Voytik-Harbin S.L., 1997; McDevitt C.A., 2003). У зв'язку з цим ми припустили, що культивування SIS-інкапсульованого матеріалу забезпечить більш високу гормональну активність органотипової культури надниркових залоз.

Як показано на рис. 1а, гормонопродукуюча активність органотипової культури через 24 години культивування характеризувалась високим рівнем базальної секреції кортизолу (393,05±16,54 нмоль/г білку), однак не спостерігалось підвищення рівня кортизолу в середовищі інкубації за присутності стимулятора дбцАМФ. Через 48 годин культивування органотипова культура була здатна реагувати на дію стимулятора на фоні зниження базальної кортизол-секретуючої активності до 71,47±5,47 нмоль/г білку. Культивування органотипової культури протягом 72 годин сприяло підвищенню рівня базальної секреції кортизолу при відсутності здатності відповідати на дію стимулятора.

Інкапсуляція органотипової культури в SIS також приводила до зниження базальної кортизол-секретуючої активності протягом 72 годин культивування. Зниження даного показника мало більш виражений характер в порівнянні зі стандартними органотиповими культурами, однак відповідь на дію дбцАМФ зберігалась у SIS-інкапсульованих органотипових культур всіх строків культивування.

Вивчення альдостерон-секретуючої активності органотипової культури показало (рис. 1б), що в процесі культивування також відбувається зниження базальної секреторної активності, в тому числі і для SIS-інкапсульованих зразків. При цьому 2 і 3 доба культивування характеризувались здатністю органотипової культури до стимульованого стероїдогенезу. Крім того, зі збільшенням строка культивування стандартної і SIS-інкапсульованої культури спостерігалось зниження активності глутатіонредуктази і глутатіопероксидази в порівнянні з рівнем даного показника в гомогенатах нативних фрагментів надниркових залоз, що корелює з динамікою зниження гормонопродукуючої активності даних зразків. Вивчення інтенсивності аскорбат-індукованого ПОЛ показало, що даний показник корелює з рівнем гормонопродукуючої активності органотипової культури та має зворотну залежність. Таким чином, за сукупністю досліджених параметрів найбільш оптимальним було 2-добове культивування органотипової культури, інкапсульованої в SIS.

Морфофункціональні властивості кріоконсервованих SIS-інкапсульованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят

Одним із способів, що дозволяють модулювати функціональну активність та імунологічні властивості ендокринних тканин, є кріоконсервування. Припущення про імуномоделюючий вплив кріоконсервування з'явились на підставі даних про пошкодження антигенпредставляючих клітин після заморожування з високою швидкістю охолодження (> 70 єС/хв) (Taylor M. J., 1988). Крім того, відомо про позитивний вплив рекультивування, в тому числі за умов пониженої температури, на гормонопродукуючу активність кріоконсервованих клітин надниркових залоз (Алабедалькарім Н.М., 2005; Устиченко В.Д., 2008). У зв'язку з цим в нашій роботі ми використовували два температурних режими рекультивування (26 єС і 37 єС) фрагментів надниркових залоз, кріоконсервованих зі швидкостями охолодження 1 і 100 єС/хв та інкапсульованих в SIS. Отримані дані порівнювали з показниками для нативних фрагментів, визначення функціональної активності яких також проводили при температурі 26 або 37 єС (Н-26 і Н-37 відповідно).

Повільне заморожування фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят. Як показано на рис. 2а, у випадку повільно заморожених фрагментів рекультивування як при 26 єС, так і при 37 єС (П-26 і П-37 відповідно), призводило до вірогідного зниження базальної секреції кортизолу. Рекультивовані при 26 єС фрагменти (П-26) мали більш високу секреторну активність. Однак здатність до стимульованої секреції кортизолу була характерна тільки для повільно заморожених фрагментів, рекультивованих при 37 єС (П-37), що виражалось в 3-кратному підвищенні рівня кортизолу в середовищі інкубації за присутності дбцАМФ.

Інкапсуляція матеріалу в SIS не дозволила підвищити гормональну активність фрагментів надниркових залоз після рекультивування при 37 єС (П-SIS37) і сприяла втраті здатності клітин до дбцАМФ-стимульованого стероїдогенезу. Сумісне використання гіпотермічного рекультивування та інкапсуляції повільно заморожених фрагментів в SIS (П-SIS26) призводило до зниження базальної кортизол-секретуючої активності в порівнянні з відповідними зразками без SIS (П-26).

Абсолютні значення даного показника були вірогідно вищими відносно SIS-інкапсульованих зразків, рекультивованих при 37 єС (П-SIS37). Крім того, в даному випадку ми спостерігали вірогідне підвищення рівня кортизолу в середовищі інкубації за присутністю стимулятору стероїдогенеза дбцАМФ до 300,28±17,38 нмоль/г білку в порівнянні з базальним рівнем секреції (91,38 ± 9,72 нмоль/г білку).

Подальші дослідження гормональної активності фрагментів, кріоконсервованих зі швидкістю охолодження 1 єС/хв, показало, що рекультивування при 37 єС, яке забезпечувало здатність адренокортикальних клітин до дбцАМФ-стимульованої секреції кортизолу, не дозволило отримати відповідь на введення в середовище інкубації дбцАМФ підвищенням рівня секреції альдостерону. В той же час, як нативні фрагменти (Н-26), так і фрагменти, рекультивовані при 26 єС в SIS (П-SIS26) були здатні до вірогідного підвищення альдостерон-продукуючої функції в присутності стимулятора дбцАМФ.

Для повільно заморожених фрагментів не було зафіксовано вірогідних змін активності глутатіонредуктази в нестимульованих зразках. При цьому присутність дбцАМФ в середовищі інкубації забезпечила підвищення активності даного ферменту у випадку фрагментів, рекультивованих при 37 єС (П-37) і при 26 єС в SIS (П-SIS26). Однак, вірогідним підвищення даного показника було тільки у випадку П-SIS26, для яких була встановлена здатність до збільшення секреції і кортизолу, і альдостерону в присутності дбцАМФ. При цьому як зниження температури рекультивування до 26 єС, так і інкапсуляція повільно заморожених фрагментів надниркових залоз в SIS, не відображались на активності глутатіонпероксидази. Необхідно зазначити також відсутність дбцАМФ-залежної зміни даного показника. Однак кріоконсервування зі швидкістю охолодження 1 єС/хв та наступне рекультивування незалежно від температурного режиму не приводили до підвищення ПОЛ в порівнянні з даними, отриманими для контрольних зразків (Н). При цьому інгібуючий вплив дбцАМФ на рівень даного показника проявлявся тільки у випадку П-SIS26, що супроводжувалось вірогідним підвищенням секреторної активності кортизолу та альдостерону.

Швидке заморожування фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят. Дослідження гормональної активності швидко заморожених фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят показало, що кріоконсервування та рекультивування при 37 єС призводили до вірогідного зниження гормон-секретуючої активності матеріалу (Ш-37) в порівнянні з нативними зразками (Н-37), в тому числі і у випадку інкапсуляції в SIS (Ш-SIS37) (рис. 3а). Однак на відміну від повільно заморожених фрагментів, більш високий рівень кортизолу було зафіксовано для SIS-інкапсульованих зразків, що також супроводжувалось підвищенням рівня кортизолу в присутності дбцАМФ. Гіпотермічне рекультивування приводило до підвищення базальної секреції кортизолу (Ш-26) в порівнянні з нативним матеріалом (Н-26).

При цьому для SIS-інкапсульованих фрагментів, рекультивованих при 26 єС, спостерігався найбільш низький рівень кортизол-секретуючої активності. Слід зазначити, що у всіх випадках гіпотермічної обробки була відсутня здатність до дбцАМФ-стимульованого стероїдогенезу. В той же час, за даними рівня альдостерону (рис. 3б) видно, що комбінація швидкого заморожування та SIS-інкапсуляції забезпечує більш високий рівень гормональної активності фрагментів, як при гіпотермічному рекультивуванні, так і при рекультивуванні в умовах 37 єС. Вивчення активності глутатіонредуктази показало, що швидке заморожування та наступне рекультивування призводить до вірогідного зниження активності ферменту в нестимульованому стані. Вірогідне підвищення даного показника спостерігалось тільки у випадку Ш-26, де відбувалось підвищення базальної секреції кортизолу. При цьому не спостерігалось зміни активності ферменту глутатіонпероксидази в порівнянні з нативними фрагментами у всіх випадках, за виключенням фрагментів, кріоконсервованих зі швидкістю охолодження 100 єС/хв, рекультивованих при 37 єС (Ш-37), для яких також було зафіксовано найбільш високий рівень інтенсивності утворення ТБК-активних продуктів.

Таким чином, важливу роль в здійсненні гормонопродукуючої функції кріоконсервованими зразками грає комбінація швидкості охолодження при кріоконсервуванні та температури наступного рекультивування. Збереженню більш високої гормональної активності повільно заморожених фрагментів надниркових залоз in vitro сприяє гіпотермічне рекультивування, тоді як для швидко заморожених фрагментів більш переважним є рекультивування при фізіологічній температурі.

Ксенотрансплантація нативних SIS-інкапсульованих органотипових культур надниркових залоз новонароджених поросят

Для оцінки компенсаторної активності того чи іншого виду трансплантата ми оцінювали функціональні показники тварин і морфологічні характеристики трансплантатів на 31 добу після двосторонньої адреналектомії, яку проводили хірургічним шляхом. Інкапсуляцію трансплантаційного матеріалу в даному дослідженні здійснювали як перед культивуванням (SIS…), так і безпосередньо перед трансплантацією (…SIS).

Нами було показано, що середня тривалість життя щурів після адреналектомії складала 20,83,96 діб. Трансплантація органотипової культури, культивованої протягом 1 доби, вірогідно збільшувала тривалість життя реципієнтів до 31,00±0,00 діб. Зі збільшенням строку культивування трансплантаційного матеріалу відмічено зниження середньої тривалості життя реципієнтів до значень, що вірогідно не відрізнялись від даних для адреналектомованих щурів. У випадку органотипових культур надниркових залоз всіх строків культивування, трансплантованих або культивованих і трансплантованих в SIS, спостерігалось вірогідне підвищення даного показника в порівнянні з адреналектомованими тваринами. Однак, незважаючи на вірогідно більш високу тривалість життя реципієнтів 3-добової органотипової культури, культивованої в SIS (3дSIS), відсоток тварин, що вижили, складав 33 %, що свідчить про загибель більшості тварин в пізні післяопераційні строки і може бути пов'язано з виснаженням трансплантату. Найбільш високі показники виживання тварин спостерігались при трансплантації 1-добової органотипової культури (1д) і культури, культивованої 2 доби в SIS (SIS2д).

Відомо, що в надниркових залозах щурів основним глюкокортикоїдом, який продукується адренокортикоцитами, є кортикостерон у зв'язку з неактивністю ферменту СYP21в, що відповідає за синтез кортизолу (Payne A.H., 2004). Тому ефективність трансплантату ми оцінювали за рівнем в плазмі крові тварин-реципієнтів кортизолу, що секретується клітинами надниркових залоз новонароджених поросят.

Згідно наших даних та даних літератури (Illera J.C., 1998), в плазмі крові контрольних і адреналектомованих щурів визначається незначний рівень кортизолу, що продукується неадреналовими клітинами, який складає близько 10 нмоль/л. Трансплантація 1-добової органотипової культури (1д) призводила до вірогідного підвищення рівня кортизолу в плазмі крові адреналектомованих щурів (рис. 4а). При цьому заключення 1-добової культури в SIS не дозволило підвищити її компенсаторну активність. Збільшення тривалості передтрансплантаційного культивування до 2 діб також не сприяло підвищенню ефективності трансплантатів, в тому числі і при інкапсуляції в SIS (2д і 2дSIS). Найбільш високі значення кортизолу в плазмі крові реципієнтів було виявлено у випадку трансплантації 3-добової органотипової культури. При цьому культивування в SIS вірогідно знижувало компенсаторну активність трансплантату.

Дослідження здатності органотипових культур компенсувати недостатність альдостерону показало, що трансплантація як стандартної 1-добової органотипової культури (1д), так і інкапсульованої в SIS (1дSIS), не дозволила вірогідно підвищити рівень даного показника в плазмі крові експериментальних тварин (рис. 4б). Серед 2-добових культур, як і за рівнем кортизолу, найбільш ефективною була культура, трансплантована після культивування в SIS (SIS2д). Для 3-добової органотипової культури зниження компенсаторної активності спостерігалось в ряду 3д > 3дSIS > SIS3д. Дана залежність від способу використання SIS зберігалась і у випадку кортизол-секретуючої активності клітин трансплантату.

Сумарний вплив глюкокортикоїдів після видалення надниркових залоз проявляється у зменшенні маси тіла тварин. Нами було визначена маса тіла експериментальних тварин по закінченню терміну спостереження в порівнянні з початковим рівнем. Було показано, що адреналектомовані тварини не набирали масу протягом експерименту. Реципієнти всіх експериментальних груп характеризувались вірогідним підвищенням даного показника в порівнянні з адреналектомованими тваринами, однак не досягали маси, характерної для тварин контрольної групи. При цьому найбільш вираженою корекція маси була у випадку трансплантації стандартних органотипових культур всіх строків культивування в порівнянні з трансплантацією SIS-інкапсульованих зразків. Виключенням в цьому плані була 2-добова культура, культивована в SIS.

Одним з наслідків адреналектомії був виражений гіпоглікемічний статус тварин. Підвищення рівня глюкози в периферичній крові було виявлено при трансплантації всіх видів органотипових культур 2 діб культивування, а також у випадку 3-добової культури, культивованої в SIS (SIS3д). Культивування протягом 1 доби позитивно не впливало на стан вуглеводного обміну при трансплантації, в тому числі і при використанні SIS. Стан нормоглікемії за рівнем глікогену в печінці було досягнуто при трансплантації 1-3-добових культур, в тому числі і SIS-інкапсульованих. Більш того, у всіх випадках, крім 1дSIS, рівень глікогену в печінці досягав рівня контрольних значень.

Трансплантація всіх видів органотипових культур сприяла підвищенню концентрації холестерину в плазмі крові тварин відносно рівня, характерного для адреналектомованих тварин. При цьому трансплантація всіх варіантів 3-добової органотипової культури сприяла вірогідному підвищенню даного показника вище за контрольні значення.

Відомо, що недостатність надниркових залоз призводить до активації фагоцитарної функції перитонеальних макрофагів (Bishay B., 2003). Тому для виявлення ефектів передтрансплантаційної обробки на функціонування трансплантатів надниркових залоз ми досліджували деякі ефекторні функції перитонеальних макрофагів експериментальних тварин. Нами було встановлено, що адреналектомія призводить до вірогідного підвищення фагоцитарної активності ПМ в порівнянні з контролем, а нормалізація даного показника спостерігалась при транспланатції 2-добової і 3-добової органотипової культури після культивування в SIS (SIS2д і SIS3д відповідно).

Таким чином, за сукупністю досліджених параметрів найбільш ефективною в компенсації надниркової недостатності, викликаної двосторонньою адреналектомією, була трансплантація 2-добової органотипової культури надниркових залоз новонароджених поросят, культивованої в SIS.

Ксенотрансплантація SIS-інкапсульованих повільно заморожених фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят

При трансплантації фрагментів надниркових залоз, кріоконсервованих зі швидкістю охолодження 1 °С/хв і рекультивованих при 26 °С або 37 °С, нами було встановлено, що дані види трансплантатів не дозволяють вірогідно подовжити середню тривалість життя тварин-реципієнтів. При цьому загибель тварин відбувалась в основному в ранні післяопераційні строки. Тільки трансплантація SIS-інкапсульованих повільно заморожених (П-SIS) і рекультивованих в умовах гіпотермії (П-26SIS) фрагментів надниркових залоз забезпечувала загибель тварин в більш пізні посттрансплантаційні строки.

При дослідженні гормонального фону тварин-реципієнтів було встановлено (рис. 5а), що вірогідному підвищенню рівня кортизолу на 31 добу після адреналектомії сприяла трансплантація повільно заморожених фрагментів, рекультивованих в SIS при 37 єС (П-SIS37), та фрагментів, рекультивованих при 26 єС і трансплантованих в SIS (П-SIS26). Крім того, високий рівень кортизолу в плазмі крові тварин з П-26SIS супроводжувався вірогідним підвищенням альдостерону в порівнянні з адреналектомованими тваринами (рис. 5б). Вірогідно вищим в порівнянні з А/е був також рівень альдостерону в плазмі крові тварин з трансплантатами повільно заморожених фрагментів, трансплантованих безпосередньо після розморожування (П та П-SIS).

При цьому відновлення маси тварин до рівня контрольних значень на 31 добу після операції спостерігалось тільки для реципієнтів з трансплантатами, інкапсульованими в SIS до або після рекультивування при 26 єС (П-26SIS і П-SIS26).

Нормалізація вуглеводного обміну з точки зору відновлення рівня глюкози в периферичній крові забезпечувалась зразками, що сприяли компенсації гіпокортицизму (П-26SIS і П-SIS37). Однак, вірогідне підвищення даного показника спостерігалось і при трансплантації фрагментів, культивованих в SIS при 26 єС (П-SIS26).

Відновлення запасів глікогену в печінці після А/е нами було встановлено у тварин всіх експериментальних груп. При цьому два варіанти трансплантатів забезпечували підвищення рівня даного показника вище за контрольні значення: це фрагменти надниркових залоз, інкапсульовані в SIS до або після гіпотермічного рекультивування (П-26SIS и П-SIS26).

Вивчення впливу ксенотрансплантації повільно заморожених фрагментів на рівень холестерину в плазмі крові тварин-реципієнтів не дозволило виявити перевагу того чи іншого виду трансплантата. Однак всі варіанти трансплантатів сприяли підвищенню даного показника відносно адреналектомованих тварин.

При дослідженні імунологічного статусу тварин нами було встановлено вірогідне зниження фагоцитарної активності ПМ при трансплантації фрагментів, рекультивованих в умовах гіпотермії (П-26SIS і П-SIS26), як в порівнянні з адреналектомованими тваринами, так і відносно реципієнтів нерекультивованих повільно заморожених зразків (П).

За сукупністю досліджених параметрів, найбільш високий рівень компенсаторної активності забезпечували фрагменти, кріоконсервовані зі швидкістю охолодження 1 єС/хв і рекультивовані при 26 єС та трансплантовані в SIS.

Ксенотрансплантація SIS-інкапсульованих швидко заморожених фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят

Нами було встановлено 100 % виживання тварин у випадку трансплантації швидко заморожених SIS- інкапсульованих фрагментів безпосередньо після відігріву (Ш-SIS) та після рекультивування в умовах гіпотермії (Ш-SIS26). Крім того, кріоконсервування з високими швидкостями охолодження дозволило подовжити строк функціонування трансплантатів в організмі реципієнта, що відображалось на загибелі тварин лише в пізні післяопераційні строки.

Трансплантація Ш-SIS не дозволила підвищити рівень кортизолу в плазмі крові реципієнтів на 31 добу після трансплантації і не перевищувала фонового рівня гормону, характерного для адреналектомованих тварин (рис. 6а). При цьому у випадку трансплантації нерекультивованих зразків без SIS (Ш), ми спостерігали вірогідне підвищення кортизолу в плазмі крові цих тварин в порівнянні з адреналектомованими, однак на момент закінчення строку спостереження вижило лише 33 % експериментальних тварин, що, ймовірно, обумовлено виснаженням трансплантату в пізні строки спостереження. На фоні високого виживання експериментальних тварин з трансплантатами в SIS, рекультивованими в умовах гіпотермії після інкапсуляції (Ш-SIS26) кортизол-продукуюча функція адренокортикоцитів трансплантату також була вищою в порівнянні з адреналектомованими тваринами.

Як і у випадку рівня кортизолу, вірогідне підвищення альдостерон-продукуючої функції також спостерігалась у випадку трансплантації швидко заморожених нерекультивованих фрагментів (Ш) (рис. 6б). Однак, при трансплантації рекультивованих SIS-інкапсульованих трансплантатів вірогідне підвищення даного показника спостерігалось тільки у випадку гіпотермічно рекультивованих фрагментів, трансплантованих в SIS (Ш-26SIS).

Маса тіла тварин до 31 доби після трансплантації у всіх випадках перевищувла дані для адреналектомованих тварин. Однак, до нормалізації даного показника відносно контрольних значень приводила тільки трансплантація швидко заморожених фрагментів, рекультивованих при 26 єС до або після інкапсуляції в SIS.

Дослідження рівня активності вуглеводного обміну тварин-реципієнтів показало вірогідне зниження концентрації глюкози в плазмі крові на 31 добу після адреналектомії. Трансплантація швидко заморожених фрагментів безпосередньо після відігріву (Ш) дозволяла вірогідно підвищити рівень даного показника. При цьому використання SIS-інкапсуляції (Ш-SIS) або рекультивування при 37 єС (Ш-37) забезпечувало збереження рівня глюкози в крові реципієнтів на рівні, характерному для адреналектомованих тварин. В той же час трансплантація матеріалу, рекультивованого в SIS при 37 єС (Ш-SIS37), не тільки не дозволила компенсувати гіпоглікемічний стан реципієнтів, але й забезпечила вірогідно більш низький рівень глюкози в крові в порівнянні з адреналектомованими тваринами. Однак, тільки трансплантація фрагментів, рекультивованих при 37 єС (Ш-37SIS) і трансплантованих в SIS, а також гіпотермічно рекультивованих в SIS (Ш-SIS26), дозволила підвищити концентрацію глюкози в крові до рівня контрольних значень.

Глікоген-запасаюча функція печінки тварин-реципієнтів після трансплантації швидко заморожених фрагментів у всіх випадках компенсувала відповідну недостатність внаслідок адреналектомії. Причому трансплантація нерекультивованих зразків без SIS (Ш) та фрагментів, рекультивованих при 26 єС і трансплантованих в SIS (Ш-26SIS) дозволила підвищити вміст глікогену в печінці до рівня контрольних значень.

В той же час, нормалізація рівня холестерину в плазмі крові реципієнтів відмічена для всіх варіантів гіпотермічно рекультивованих фрагментів, в тому числі і для інкапсульованих в SIS, як перед рекультивуванням, так і перед трансплантацією (Ш-26, Ш-26SIS, Ш-SIS26).

Дослідження фагоцитарної активності ПМ показало, що зниження високого рівня даного показника, викликаного недостатністю глюкокортикоїдних гормонів внаслідок білатеральної адреналектомії, до рівня контрольних значень спостерігалось на 31 добу після трансплантації швидко заморожених фрагментів, рекультивованих при 26 єС до або після SIS-інкапсуляції (Ш-26SIS і Ш-SIS26).

Таким чином, за сукупністю отриманих даних серед швидко заморожених фрагментів надниркових залоз найбільш успішні в компенсації надниркової недостатності були зразки, рекультивовані при 26 єС до або після SIS-інкапсуляції.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової задачі щодо пошуку імуноізолюючих матеріалів природного походження і запропоновано нове вирішення наукового завдання, що виявляється в експериментальному дослідженні впливу SIS на функціонування органотипових культур і кріоконсервованих та рекультивованих фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят in vitro та in vivo, і встановлено, що використання комбінації дії низьких температур, гіпотермічного рекультивування та інкапсуляції в SIS дозволяють подовжити життя трансплантатів в організмі реципієнтів та підсилити їх компенсаторну роль відносно гормональної недостатності, нормалізації обміну речовин та макрофагальної активності у експериментальних тварин.

1. Інкапсуляція органотипових культур надниркових залоз в SIS призводить до зниження базальної секреторної активності in vitro, однак в порівнянні зі стандартними культурами сприяє збереженню гістоструктури, здатності до дбцАМФ-стимульованого стероїдогенезу та менш вираженим змінам активності глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази, що забезпечує збереження рівня ТБК-активних продуктів на початковому рівні.

2. Для повільно заморожених SIS-інкапсульованих (1 єС/хв) фрагментів надниркових залоз in vitro було виявлено перевагу гіпотермічного рекультивування (26 °С), що сприяє збереженню здатності до базальної і дбцАМФ-стимульованої гормонопродукуючої активності, зниженню активності процесів перекисного окиснення ліпідів і високим ступенем збереженості гістоструктури, характерним для зразків нативної адренокортикальної тканини.

3. Інкапсуляція швидко заморожених фрагментів (100 єС/хв) в SIS більш ефективна in vitro при рекультивуванні в умовах нормотермії (37 °С), що виражалось в більш високому рівні їх гормональної активності, збереженості гістоструктури, здатності до дбцАМФ-стимульованого стеоїдогенезу і зниженні рівня ТБК-активних продуктів.

4. При трансплантації органотипових культур надниркових залоз за сукупністю досліджених параметрів (тривалість життя, маса тіла реципієнтів, рівень кортизолу, альдостерону і холестерину в плазмі крові, глікогену в печінці, фагоцитарна активність перитонеальних макрофагів реципієнтів, гістологічний аналіз трансплантатів) найбільш ефективною в компенсації надниркової недостатності на 31 постопераційну добу була 2-добова культура, культивована в SIS.

5. В умовах in vivo встановлено можливість компенсації надниркової недостатності на 31 добу після трансплантації як повільно, так і швидко заморожених фрагментів надниркових залоз, інкапсульованих в SIS перед рекультивуванням при 26 °С або безпосередньо перед трансплантацією (тривалість життя, маса тіла реципієнтів, рівень кортизолу, альдостерону і холестерину в плазмі крові, глікогену в печінці, фагоцитарна активність перитонеальних макрофагів реципієнтів, гістологічний аналіз трансплантатів).

Перелік ПРАЦЬ, опублікованих за темою дисертації

1. Дудецкая Г.В. Селективне збереження зонально диференційованих клітин надниркових залоз новонароджених поросят при SIS-інкапсульованій трансплантації щурам / Г. В. Дудецька, Н. М. Алабедалькарім, Ден Бо, Н. Ф. Губіна, Т. П. Бондаренко // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. - 2007. - Т. 9. - №2 (33). - Ч. 2. - С. 39-43.

2. Алабедалькарим Н.М. Гормонопродуцирующая активность криоконсервированных и SIS-инкапсулированных фрагментов надпочечников новорожденных поросят in vitro и при ксенотрансплантации / Н. М. Алабедалькарим, Ден Бо, В. Д. Устиченко, Т. П. Бондаренко // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія: Біологія. - 2008. - Випуск 8 (№ 828). - С. 119-125.

3. Алабедалькарим Н.М. Ксенотрансплантація фрагментів і органотипових культур надниркових залоз новонароджених поросят / Н. М. Алабедалькарім, Ден Бо, В. Д. Устиченко, Т. П. Бондаренко // Вісник проблем біології і медицини. - 2009. - В. 1. - С. 20-23.

4. Дудецкая Г.В. Иммуноизоляция криоконсервированных органотипических культур надпочечников при ксенотрансплантации / Г. В. Дудецька, Ден Бо, Н. М. Алабедалькарим // Трансплантология. - 2007. - Т. 9. - № 1. - С. 91-93.

5. Deng B. Immunoisolation, culture and cryopreservation as methods for improvement of adrenal gland xenograft functioning / B. Deng, G. V. Dudetskaya, N. M. Alabedalkarim // Eur J. of Med Res. - 2007. - V. 12 (Suppl IV). - Р. 46.

6. Дудецкая Г. В. Ксенотрансплантация инкапсулированных органотипических культур надпочечных желез новорожденных поросят / Г. В. Дудецкая, Н. М. Алабедалькарим, Ден Бо, Т. П. Бондаренко // Материалы симпозиума «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». - Москва, ЦИТО. - 2007. - C. 67.

7. Дудецкая Г.В. Эффективность криоконсервированных ксенографтов надпочечников новорожденных поросят при компенсации экспериментального гипокортицизма и гипоальдостеронизма / Г. В. Дудецкая, Ден Бо, Н. М. Алабедалькарим, Т. П. Бондаренко // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18. - № 1. - С. 127-129.

АНОТАЦІЇ

Ден Бо. «Дія низьких температур та імуноізоляції на властивості тканин надниркових залоз in vitro і при ксенотрансплантації». - Рукопис.

Дисертаційна робота на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2010.

В роботі досліджено рівень гормональної активності інкапсульованих в SIS (small intestinal submucosa) органотипових культур та фрагментів надниркових залоз новонароджених поросят при кріоконсервування та наступному рекультивуванні при 26 і 37 єС in vitro і при ксенотрансплантації. Показано, що in vitro кріоконсервовані SIS-інкапсульовані фрагменти здатні до базальної і стимульованої секреції кортизолу та альдостерону у випадку повільного заморожування і гіпотермічного рекультивування та швидкого заморожування з наступним рекультивуванням при 37 єС. При цьому на 31 добу після трансплантації найбільш успішними в компенсації надниркової недостатності були, як швидко, так і повільно заморожені фрагменти надниркових залоз, рекультивовані в умовах гіпотермії та трансплантовані в SIS.

Ключові слова: надниркові залози, фрагменти, органотипова культура, кріоконсервування, кортизол, альдостерон, ксенотрансплантація.

Ден Бо. «Действие низких температур и иммуноизоляции на свойства тканей надпочечников in vitro и при ксенотрансплантации». - Рукопись.

Диссертационная работа на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2010.

В работе исследован уровень гормональной активности инкапсулированных в SIS (small intestinal submucosa) фрагментов и органотипических культур надпочечников новорожденных поросят при криоконсервировании и последующем рекультивировании при 26 и 37 єС in vitro и при ксенотрансплантации.

Установлено, что гормонопродуцирующая активность органотипической культуры через 24 часа культивирования характеризовалась высоким уровнем базальной секреции кортизола. Следует отметить, что для стандартных культур наблюдалось отсутствие повышения уровня содержания кортизола в среде инкубации в присутствии стимулятора стероидогенеза дбцАМФ. Культивирование в течение 48 часов приводило к восстановлению способности органотипической культуры реагировать на действие стимулятора на фоне снижения базальной кортизол-секретирующей активности. Через 72 часа культивирования наблюдалось повышение базальной секреции кортизола органотипической культурой на фоне отсутствия способности отвечать на действие стимулятора. Инкапсуляция органотипической культуры в SIS также приводила к снижению базальной кортизол-секретирующей активности в течение 72 часов культивирования. Причем снижение данного показателя имело более выраженный характер по сравнению с культивированием без SIS.

Изучение альдостерон-секретирующей активности органотипической культуры показало, что в процессе культивирования происходит снижение базальной секреторной активности, в том числе и для SIS-инкапсулированных образцов. При этом, несмотря на то, что дбцАМФ является неспецифическим стимулятором стероидогенеза для клеток клубочковой зоны надпочечников, 2 и 3 сутки культивирования характеризовались способностью органотипической культуры к стимулированному стероидогенезу.

Показано, что в случае медленно замороженных фрагментов рекультивирование, как при 26 єС, так и при 37єС, приводило к достоверному снижению базальной секреции кортизола. Рекультивированные при 26 єС фрагменты надпочечников, обладали более высокой секреторной активностью. Однако, способность к стимулированной секреции кортизола была характерна только для медленно замороженных фрагментов, рекультивированных при 37 єС. Инкапсуляция материала в SIS не позволила повысить гормональную активность фрагментов надпочечников после рекультивирования при 37 єС и способствовала утрате способности клеток к дбцАМФ-стимулированному стероидогенезу. Однако совместное использование гипотермического рекультивирования и инкапсуляции медленно замороженных фрагментов в SIS приводило к снижению базальной кортизол-секретирующей активности по сравнению с соответствующими образцами без SIS. Дальнейшее исследование гормональной активности фрагментов, криоконсервированных со скоростью охлаждения 1 єС/мин, показало, что последующее рекультивирование при 37 єС, обеспечивающее способность адренокортикальных клеток к дбцАМФ-стимулированной секреции кортизола, не отвечали на введение в среду инкубации дбцАМФ повышением секреции альдостерона. В то же время, как нативные фрагменты, так и фрагменты, рекультивированные при 26 єС в SIS, были способны к достоверному повышению альдостерон-секретирующей функции.

Исследование гормональной активности быстро замороженных фрагментов надпочечников новорожденных поросят показало, что как и в случае медленно замороженных фрагментов, криоконсервирование и рекультивирование при 37 єС, приводило к достоверному снижению гормоносекретирующей активности материала, в том числе и инкапсулированного в SIS.

...