Експресія 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази та ряду інших генів при дії метил-третбутилового ефіру на організм

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

УДК 577.112:616

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Експресія 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази та ряду інших генів при дії метил-третбутилового ефіру на організм

Кундієва Анастасія

Вячеславівна

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Мінченко Олександр Григорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, заступник директора інституту, завідувач відділу молекулярної біології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Шликов Сергій Георгійович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії м'язів;

доктор медичних наук, професор Маньковська Ірина Микитівна, Інститут фізіології, ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів.

Захист відбудеться “ 13 “ грудня 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “ 10 ” листопада 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к.б.н. О.В. Кірсенко

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сигнальна мережа клітин представлена численними протеїнкіназами, протеїнфосфатазами та транскрипційними факторами, які і є основною складовою частиною регуляторних каскадів клітин і відіграють надзвичайно важливу роль в динамічних механізмах регуляції біохімічних процесів як у нормі, так і при різних патологічних станах, а також при дії на організм різноманітних чинників. Дослідження молекулярних механізмів регуляції біохімічних процесів на рівні окремих факторів сигнальної мережі є надзвичайно актуальним напрямком фундаментальних досліджень у біохімії та інших медико-біологічних науках. Протягом тривалого часу досить інтенсивно вивчаються молекулярні механізми регуляції гліколізу, оскільки його активація є необхідною компонентою росту злоякісних пухлин.

Молекулярні механізми посиленої активації гліколізу як у злоякісних пухлинах, так і при гіпоксії та під впливом різних чинників, є досить складними і досліджені лише частково (Chesney, 2006; Bartrons and Caro, 2007). Прийнято вважати, що ключову роль у регуляції гліколізу відіграє 6-фосфофрукто-2-кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатаза [(PFKFB); 6-фосфофрукто-2-кіназа (EC 2.7.1.105); фруктозо-2,6-бісфосфатаза (EC 3.1.3.46)], яка контролює рівень фруктозо-2,6-бісфосфату, алостеричного регулятора 6-фосфофрукто-1-кінази (Okar et al., 2001; Rider et al., 2004). Встановлено, що PFKFB має дві ензиматичні активності: 6-фосфофрукто-2-кіназну та фруктозо-2,6-бісфосфатазну (Rider et al., 2004). Вона представлена досить великою кількістю ізоформ, синтез яких кодується чотирма різними генами, що експресують по декілька альтернативних сплайс-варіантів (Kessler and Eschrich, 2001; Atsumi et al., 2005; Minchenko and Minchenko, 2005; Мінченко та співавт., 2006, 2008).

В останні роки детально вивчаються молекулярні основи вищих рівнів регуляції найважливіших метаболічних процесів, зокрема тих, що визначають циклічний характер протікання основних процесів життєдіяльності і які генеруються циркадіальним годинником, групою взаємопов'язаних між собою циркадіальних генів (Мінченко та співавт., 2008). Більшість процесів в організмі, в тому числі і метаболізм глюкози, мають циклічний характер і контролюються циркадіальними генами, експресія яких регулюється казеїнкіназою-1? (Rudic et al., 2004). Порушення циркадіальних ритмів має сильний вплив на енергетичний обмін і є важливим чинником ожиріння та цукрового діабету [Turek et al., 2005].

SNF1/AMP-активуєма протеїнкіназа (SNARK) є молекулярним компонентом відповіді на стрес клітин; її активність змінюється за різних стресових станів клітин (Lefebvre et al., 2005). Нокаутні по SNARK миші, характеризуються ожирінням, порушенням метаболізму і мають схильність до виникнення злоякісних пухлин подібно до тварин, нокаутних по циркадіальним генам (Tsuchihara et al., 2008).

Метил-третбутиловий ефір використовується для виробництва не етильованих бензинів і є одним із найнебезпечніших глобальних хімічних забруднювачів довкілля в зв'язку з його високою стабільністю, здатністю накопичуватися в ґрунті і підземних джерелах водопостачання та вираженим негативним впливом на здоров'я людей.

В зв'язку з цим, при вивченні впливу на організм хімічних забруднювачів довкілля надзвичайно актуальним напрямком біохімічних досліджень є аналіз експресії генів, що контролюють протікання основних метаболічних процесів, а саме генів PFKFB, циркадіальних генів, казеїнкінази-1? та SNARK, з метою виявлення чутливих генетичних маркерів дії на організм забруднювачів довкілля, зокрема метил-третбутилового ефіру.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає тематиці науково-дослідних робіт Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України і виконана у рамках держбюджетних тем „Молекулярні механізми регуляції експресії генів в нормі і при патології”, ДР № 0106U002051 (2005-2010 р.р.) та „Структурно-функціональний аналіз протеїнів за норми та деяких патологій”, ДР № 0107V007187 (2007-2011 р.р.).

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи - вивчення молекулярних основ дії на організм екологічно токсичної хімічної сполуки метил-третбутилового ефіру, механізмів його впливу на експресію мРНК циркадіальних генів, казеїнкінази-1?, SNARK, VEGF та різних генів 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази у різних органах щурів.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1) Вивчити вплив метил-третбутилового ефіру на експресію мРНК PFKFB-2, PFKFB-3 та PFKFB-4 у різних органах щурів.

2) Дослідити вплив метил-третбутилового ефіру на експресію мРНК казеїнкінази-1? та протеїнкінази SNARK.

3) Вивчити вплив метил-третбутилового ефіру на експресію циркадіальних генів групи Period у щурів.

4) Дослідити вплив метил-третбутилового ефіру на експресію циркадіальних генів Clock та BMal1b.

5) Вивчити вплив метил-третбутилового ефіру на експресію ендотеліального фактора росту судин VEGF у різних органах щурів.

Об'єкт дослідження: гени PFKFB-4, PFKFB-3, PFKFB-2, PER1, PER2, CLOCK, BMAL1B та VEGF щурів.

Предмет дослідження: зміни експресії генів PFKFB-4, PFKFB-3, PFKFB-2, PER1, PER2, CLOCK, BMAL1B та VEGF під впливом метил-третбутилового ефіру.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої у роботі мети були використані методи біохімії та молекулярної біології: виділення РНК із різних органів щурів, спектрофотометричні методи визначення кількості ДНК та РНК, електрофоретичний аналіз нуклеїнових кислот, рестрикційний аналіз ДНК та очистки рестрикційних фрагментів ДНК, лігування фрагментів ДНК, виділення плазмідних та рекомбінантних ДНК, синтез комплементарних ДНК, їх клонування у плазмідних векторах, методи полімеразної ланцюгової реакції та комп'ютерний аналіз секвенованих послідовностей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було показано, що під впливом тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру експресія генів snark, казеїнкінази-1?, циркадіальних генів, PFKFB-2, PFKFB-3, PFKFB-4 та VEGF суттєво і по-різному змінюється у печінці, легенях та серці щурів. Вперше виявлено ряд унікальних альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-4 та PFKFB-2 та зміни в їх експресії у деяких тканинах щурів при дії на організм метил-третбутилового ефіру. Вперше показано, що під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру не лише порушується експресія генів PFKFB, а і їх альтернативний сплайсинг.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів.

Результати досліджень мають важливе теоретичне значення, оскільки вони суттєво доповнюють розуміння молекулярних механізмів регуляції процесів метаболізму на рівні ключових протеїнкіназ та транскрипційних факторів, а також регуляції гліколізу на рівні експресії PFKFB та ролі альтернативного сплайсингу в системі регуляторних механізмів в нормі та при дії на організм метил-третбутилового ефіру, небезпечного глобального забруднювача довкілля. З позицій практичного значення отримані дані набувають великого інтересу, оскільки детальне вивчення механізмів дії на організм цієї токсичної хімічної сполуки може сприяти розробці способів захисту від дії метил-третбутилового ефіру, а також підготовить підґрунтя для розробки стратегій створення нових підходів до захисту довкілля та профілактики негативних впливів екотоксикантів.

Результати досліджень входять до програм спецкурсів „Сучасні біотехнології” та „Конструювання генів” біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно проведено аналіз даних літератури по темі роботи, виконано експериментальні дослідження по вивченню експресії генів PFKFB і VEGF та обробку отриманих результатів. Робота з експериментальними тваринами проводилась за участі к.мед.н. Ю.О. Паустовського, дослідження по вивченню експресії циркадіальних генів та генів протеїнкіназ, а також клонування та секвенування PFKFB-2 проводились за участі к.мед.н. Д.О. Мінченка, розробка методології за участі проф. О.П. Яворовського та наукового керівника д.б.н. Мінченка О. Г., аналіз та обговорення результатів проведені за участі наукового керівника д.б.н. Мінченка О. Г.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було представлено на конференціях: The VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, 2009; VIII міжнародна міждисциплінарна науково-практична конференція молодих вчених. Шевченківська весна, Київ, 2010.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, з них 6 статей, опублікованих у фахових наукових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України, 3 статті у GenBank і 3 тез доповідей у матеріалах міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 133 сторінках друкованого тексту та складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, результатів досліджень, їх обговорення, висновків, списку використаних джерел, що включає 184 посилань (11 кирилицею та 173 латиницею). Робота ілюстрована 35 рисунками.

Перелік умовних скорочень. PFKFB - 6-фосфофрукто-2-кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатаза; PFKFB-1-4 - ізоформи 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-1-4; Per1 - циркадіальний фактор 1 групи Period; Per2 - циркадіальний фактор 2 групи Period; Clock - циркадіальний фактор Clock; BMal1b - циркадіальний фактор BMal1b; VEGF - ендотеліальний фактор росту судин

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури детально висвітлено сучасні відомості про молекулярні механізми регуляції експресії генів, зокрема у злоякісних пухлинах та при гіпоксії, HIFHHHмолекулярні механізми активації гліколізу при гіпоксії та у злоякісних пухлинах, а також про PFKFB, її роль у регуляції гліколізу. Проаналізовано дані стосовно ізоформ PFKFB, їх властивостей, молекулярних механізмів регуляції експресії їх генів, а також про альтернативний сплайсинг PFKFB, циркадіальні гени, казеїнкіназу-1??та SNARK, про метил-третбутиловий ефір, систему стресу ендоплазматичного ретикулуму та його значення в механізмі дії токсичних речовин, а також за різних патологічних процесів. Метил-третбутиловий ефір (2-метокси-2-метил-пропан) є екологічно небезпечною хімічною сполукою, що використовується для виробництва не етильованих бензинів і є одним із найнебезпечніших глобальних хімічних забруднювачів довкілля в зв'язку з його високою стабільністю, здатністю накопичуватися в ґрунті і підземних джерелах водопостачання та вираженим негативним впливом на здоров'я людей, може ініціювати розвиток ряду патологічних станів: хронічні нефропатії, гіпертрофія печінки, алергічні та респіраторні захворювання, нейротоксичні прояви, в тому числі і виникнення злоякісних новоутворень в нирках, печінці, сім'яниках та лімфовузлах, ініціювати розвиток лейкемій. Одним із можливих механізмів дії метил-третбутилового ефіру може бути виникнення порушень у функціонуванні сигнальних каскадів у клітинах.

У даній роботі ми вивчили дію метил-третбутилового ефіру, глобального хімічного забруднювача довкілля, що має виражену негативну дію на організм, в тому числі і онкогенну, на експресію генів, що мають безпосереднє відношення до росту злоякісних пухлин: PFKFB та їх альтернативний сплайсинг, циркадіальних факторів, протеїнкінази SNARK і казеїнкінази-1?, а також VEGF у різних органах щурів з метою виявлення можливих молекулярно-генетичних маркерів дії на організм екологічно небезпечних хімічних сполук.

Матеріали та методи дослідження

Досліди проводили на щурах-самцях лінії Wistar, вагою 180 - 220 г. Для виділення РНК у щурів брали печінку, легені та серце. Метил-третбутиловий ефір вводили щурам внутрішньошлунково у дозі 500 мг/кг щоденно в умовах холодового стресу (після введення метил-третбутилового ефіру щурів витримували шість годин при +4оС) протягом 1 місяця або у кількості 0,5; 5; та 50 мг/кг маси тіла один раз на день, п'ять разів на тиждень протягом двох місяців.

Виділення РНК, плазмід, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) та клонування проводили як описано Minchenko et al. (2003, 2004). Експресію генів PFKFB, Per1, Per2, BMal1, Clock, казеїнкінази-1?, SNARK та VEGF вивчали за допомогою зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції (Minchenko et al. 2008). Експресія мРНК ?-актину була контролем кількості аналізуємої РНК. Кількісну ПЛР у реальному часі проводили на апараті „Stratagene Mx 3000P cycler”, використовуючи SYBRGreen Mix. Для аналізу результатів кількісної ПЛР та їх статистичної обробки використовували спеціальну комп'ютерну програму „Differential expression calculator”.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив метил-третбутилового ефіру на експресію мРНК PFKFB та VEGF

Дію метил-третбутилового ефіру на інтенсивність експресії мРНК PFKFB-4 у печінці та легенях щурів, яким вводили цю хімічну сполуку протягом місяця в дозі 500 мг/кг маси тіла, вивчали методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції. Спочатку синтезували комплементарні ДНК за допомогою зворотної транскриптази, використовуючи для цього РНК із печінки та легень щурів. Ці органи були вибрані у зв'язку з тим, що печінка і легені в найбільшій мірі вражаються метил-третбутиловим ефіром, але різняться особливостями його метаболізму.

Встановлено, що за довготривалої дії метил-третбутилового ефіру суттєво посилювалась експресія мРНК PFKFB-4 у печінці щурів, але знижувалась у легенях (Рис. 1), що свідчать про чутливість експресії даного гена до дії цієї сполуки як у печінці, так і в легенях.

Вплив довготривалого введення щурам метил-третбутилового ефіру на інтенсивність експресії мРНК PFKFB-4 у печінці та легенях досліджували також методом полімеразної ланцюгової реакції, використовуючи іншу пару праймерів, яка охоплювала більшу ділянку фруктозо-2,6-бісфосфатазної частини PFKFB-4. На рисунку 2 представлені результати цих досліджень. Вони узгоджуються з попередніми даними аналізу експресії мРНК PFKFB-4 методом полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі: посилення експресії мРНК PFKFB-4 у печінці та зниження експресії даної мРНК у легенях щурів, що отримували метил-третбутиловий ефір, але у продуктах полімеразної ланцюгової реакції з печінки щурів, яким вводили протягом місяця дану хімічну сполуку, з'являється більша за розміром додаткова смужка.

Для ідентифікації можливого додаткового варіанту мРНК PFKFB-4, що з'являється у печінці щурів за дії метил-третбутилового ефіру, ми клонували різні за розміром фрагменти комплементарних ДНК PFKFB-4 щура, в тому числі і фрагмент, що індукується метил-третбутиловим ефіром.

Була отримана велика кількість клонів у pCRII-TOPO та pBluescript II SK+. і проведено їх секвенування, серед яких було виявлено також два додаткових, один із яких мав вставку (11-й інтрон), розміром 94 пари нуклеотидних залишків (н.з.). Інший варіант мРНК PFKFB-4 виявився коротшим за основну форму і мав делецію розміром 22 н.з. в каталітичній ділянці фруктозо-2,6-бісфосфатазної частини PFKFB-4. Отримані дані вказують на порушення вирізання 11-го інтрона з пре-мРНК PFKFB-4 у печінці щурів за умов дії метил-третбутилового ефіру. Комп'ютерний аналіз амінокислотної послідовності нового альтернативного сплайс-варіанту мРНК PFKFB-4 показав, що включення 11-го інтрона в структуру мРНК PFKFB-4 створює новий сплайс-варіант, в якому суттєво змінена послідовність амінокислот і що призводить до передчасної появи стоп-кодону невдовзі після останнього каталітичного домену, домену „K”, фруктозо-2,6-бісфосфатазної частини PFKFB-4. Цей сплайс-варіант мРНК PFKFB-4 практично не має С-кінцевої частини, яка є дуже важливою в регуляції активності PFKFB і зокрема її фруктозо-2,6-бісфосфатазної активності. Є дані про те, що відсутність залишків серину в С-кінцевій частині PFKFB виключає можливість регуляції її активності шляхом фосфорилювання С-кінця даного ензиму (Rider et al., 2004). Таким чином, даний альтернативний сплайс-варіант мРНК PFKFB-4 повинен мати знижену фруктозо-2,6-бісфосфатазну активність і працювати на посилення гліколізу. Ймовірно, що індукція експресії такого варіанту PFKFB-4 за дії метил-третбутилового ефіру представляє собою адаптаційну реакцію на токсичну дію даної хімічної сполуки шляхом посилення гліколізу.

Другий альтернативний сплайс-варіант мРНК PFKFB-4 має делецію 3'-кінцевої частини 10-го екзону. Він був виявлений секвенуванням клонованих кДНК PFKFB-4. Встановлено, що даний варіант мРНК PFKFB-4 має всі каталітичні домени 6-фосфофрукто-2-кінази, але не має двох важливих каталітичних доменів фруктозо-2,6-бісфосфатази („J” та „K”), що виключає можливість функціонування фруктозо-2,6-бісфосфатазної частини цього варіанту PFKFB-4. Більше того, даний сплайс-варіант має видозмінену і вкорочену С-кінцеву частину PFKFB-4, яка є дуже важливою в регуляції активності PFKFB, кількість залишків серину на С-кінці значно більша порівняно з основним варіантом PFKFB-4, що може мати важливе значення у регуляції активності PFKFB (Rider et al., 2004). Для вивчення експресії іншого альтернативного сплайс-варіанту мРНК PFKFB-4, що має делецію в ділянці J-домена розміром 22 нуклеотидних залишки, були використані праймери М8 та М9. Встановлено, що його експресія суттєво змінюється у печінці та легенях під впливом метил-третбутилового ефіру: посилюється у печінці і знижується у легенях (рис. 3).

Таким чином, основним результатом цього етапу проведеної нами роботи можна вважати дані про те, що метил-третбутиловий ефір змінює експресію та сплайсинг PFKFB-4 у легенях та печінці щурів, порушуючи надзвичайно важливу ланку регуляції гліколізу. Все це дає підставу вважати, що експресія та сплайсинг мРНК PFKFB-4 можуть бути чутливим тестом для визначення токсичної дії на організм не лише метил-третбутилового ефіру, а і ряду інших екологічно небезпечних сполук.

Дослідження рівня експресії мРНК PFKFB-3 показало суттєве його збільшення як у печінці, так і у легенях щурів під впливом метил-третбутилового ефіру (500 мг/кг протягом місяця) (Рис. 4). Оскільки пре-мРНК PFKFB-3 може утворювати декілька альтернативних сплайс-варіантів, що різняться своїм 3'-кінцем (Мінченко та співав., 2008), то ми вивчили експресію цих варіантів мРНК PFKFB-3. Встановлено, що метил-третбутиловий ефір посилює експресію альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-3, але по-різному у печінці і легенях: у печінці більші за розміром, а у легенях менші (Рис. 5). Ці дані узгоджуються з даними інших авторів про різне функціональне значення окремих ізоформ PFKFB-3 у різних типах клітин (Atsumi et al., 2005; Bando et al, 2005).

Подібні результати були отримані при дослідженні експресії мРНК PFKFB-3 з допомогою іншої пари праймерів (M4 та M5), але в цих експериментах нами було виявлено дві додаткові смужки альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-3 (Рис. 6). Альтернативні сплайс-варіанти PFKFB-3 різняться між собою не лише по кількості основних та додаткових екзонів у структурі С-кінцевої ділянки, а і по положенню стоп-кодона, що обумовлено зміною рамки зчитування (Рис. 7). У зв'язку з цим, є 4 більших і 3 менших сплайс-варіанта, що ми і бачимо на Рис. 5, але нижня смужка містить лише два.

У той же час, на рисунку 6 ми бачимо чотири смужки, де верхня смужка (1) представлена найбільшим сплайс-варіантом мРНК PFKFB-3, який має повний набір основних та додаткових екзонів C-кінцевої регуляторної ділянки; друга - містить 3 більших варіанти, а у третій - знаходяться 2 менших сплайс-варіанти, які не мають додаткових екзонів. І четверта смужка мРНК PFKFB-3 містить лише один, найменший, сплайс-варіант, який не має як 2 основних, так і 2 додаткових екзонів. Рівень експресії найменшого сплайс-варіанту мРНК PFKFB-3 суттєво знижується у печінці і посилюється у легенях щурів під впливом метил-третбутилового ефіру.

Були також проведені дослідження експресії мРНК PFKFB-3 та її альтернативних сплайс-варіантів у печінці, легенях та серці щурів, яким вводили менші кількості метил-третбутилового ефіру (0,5; 5 та 50 мг/кг) щоденно протягом 2 місяців. Показано, що рівень експресії мРНК PFKFB-3 дозо-залежно змінювався у печінці, легенях та серці щурів під впливом метил-третбутилового ефіру.

Так, експресія мРНК PFKFB-3 у легенях та серці щурів, яким вводили метил-третбутиловий ефір у найменшій дозі, суттєво не змінювалась, а у печінці знижувалась. Під впливом більшої дози метил-третбутилового ефіру (5 мг/кг) експресія мРНК PFKFB-3 суттєво змінювалась у всіх органах, але у печінці та серці збільшувалась, а у легенях, навпаки, знижувалась, а при збільшенні дози до 50 мг/кг спостерігалися більш виражені зміни лише у печінці. Результати цих досліджень свідчать про високу чутливість експресії мРНК PFKFB-3 до дії метил-третбутилового ефіру, особливо у легенях та серці. Протилежно направлені зміни в експресії PFKFB-3 у печінці і серці, з одного боку, та легенях, з іншого, під впливом метил-третбутилового ефіру можливо обумовлені особливостями механізмів регуляції гліколізу, різною чутливістю цих тканин до його токсичної дії, а можливо і особливостями метаболізму метил-третбутилового ефіру у печінці, серці та легенях чи рівнем оксигенації цих тканин [150, 151, 158]. Добре відомо також, що гепатоцити відіграють центральну роль в метаболізмі глюкози та в процесах детоксикації і що порушення сигнальних шляхів може змінювати їх чутливість як до метаболітів, так і до токсинів. Відомо, що реакція різних генів PFKFB і на гіпоксію в різних органах може бути різнонаправленою (Михальченко та співав., 2008).

Як видно із даних, представлених на Рис. 9, у печінці, серці та легенях виявляється дві основні смужки кДНК PFKFB-3 як у контрольних щурів, так і у тварин, яким вводили різні дози метил-третбутилового ефіру протягом двох місяців, коли використовували для ампліфікації праймери M3 (прямий) та M5 (зворотний). Кожна із цих смужок представляють собою набір альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-3, про що вказувалося вище. Встановлено, що рівень експресії мРНК PFKFB-3 у печінці та серці суттєво збільшувався, а в легенях знижувався під впливом метил-третбутилового ефіру в дозі 5 та 50 мг/кг, причому у печінці посилювалась експресія менших за розміром ізоформ, а у серці - більших, в той же час у легенях знижувалась експресія всіх ізоформ мРНК PFKFB-3.

Таким чином, отримані нами дані свідчать про суттєвий вплив тривалої дії відносно малих доз метил-третбутилового ефіру на експресію PFKFB-3 у різних життєво важливих органах - печінці, легенях та серці.

При дослідженні експресії ізоформ мРНК PFKFB-2 було встановлено, що у печінці та легенях щурів під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру за умов холодового стресу змінюється експресія як основної, так і додаткової ізоформи.

Встановлено, що експресія основної ізоформи мРНК PFKFB-2 посилюється у печінці щурів під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру на 58 % і у легенях - на 23 % , а додаткової ізоформи - на 33 %. мРНК PFKFB-2 виявилась гетерогенною. У зв'язку з цим ми провели детальний аналіз продуктів ампліфікації шляхом їх клонування та секвенування. Було проведено клонування та секвенування додаткової ізоформи і виявлено три нових альтернативних сплайс-варіанти мРНК PFKFB-2. Один із них мав вставку між 3-м і 4-м екзонами розміром 55 нуклеотидних залишків, що вносила стоп-кодон у кодуючу послідовність, другий - делецію 8-го екзону і третій - делецію 8-го екзону і вставку між 9-м і 10-м екзонами, розміром 20 нуклеотидних залишків. Комп'ютерний аналіз перших двох послідовностей показав, що їх білкові продукти не мають багатьох доменів 6-фосфофрукто-2-кінази, у зв'язку з чим можуть проявляти лише фруктозо-2,6-бісфосфатазну активність. Встановлено, що рівень експресії першого варіанту мРНК PFKFB-2 посилюється на 124 %, другого - на 87 % і третього - на 63 % у легенях щурів за дії метил-третбутилового ефіру (Рис. 11).

Відомо, що порушення досить складних механізмів альтернативного сплайсингу може призводити до складних патологічних станів в зв'язку з тим, що альтернативний сплайсинг має надзвичайно велике значення у регуляції функцій клітини і близько 15% спадкових хвороб пов'язані з порушенням регуляції сплайсингу (Wang and Cooper, 2007; Ghigna et al., 2008; Nilsen and Graveley, 2010). рибонуклеїновий кислота ген судина

Отримані нами результати експресії альтернативних сплайс-варіантів мРНК PFKFB-2 вказують на те, що метил-третбутиловий ефір значно порушує регуляцію гліколізу в клітинах легень шляхом змін у альтернативному сплайсингу мРНК PFKFB-2.

Проведено також дослідження експресії ендотеліального фактора росту судин VEGF, який відіграє важливу роль у регуляції ангіогенезу. Виявлено посилення рівня його експресії у печінці на 26% та зниження у легенях на 28 % у щурів під впливом метил-третбутилового ефіру (500 мг/кг).

У зв'язку з тим, що серед продуктів ампліфікації були додаткові смужки, ми провели дослідження експресії недавно виявленого альтернативного сплайс-варіанту мРНК VEGF (GenBank accession номер AY702972). Встановлено, що його експресія збільшується під впливом метил-третбутилового ефіру у печінці в три рази, а у легенях в значно меншій мірі (Рис. 12).

Результати досліджень VEGF показали вплив метил-третбутилового ефіру на альтернативний сплайсинг і цей вплив є більшим порівняно з експресією основної ізоформи VEGF. Даний альтернативний сплайс-варіант мРНК VEGF по даним комп'ютерного аналізу кодує вкорочену ізоформу.

В наступних експериментах ми досліджували експресію мРНК VEGF у печінці, легенях та серці щурів, яким вводили менші дози метил-третбутилового ефіру (0,5; 5 та 50 мг/кг протягом 2 місяців. Встановлено, що рівень експресії мРНК VEGF та його сплайс-варіанта суттєво дозо-залежно збільшується у печінці, знижується у легенях та істотно не змінюється у серці під впливом метил-третбутилового ефіру (Рис.13).

Таким чином, порушення експресії VEGF і різних ізоформ PFKFB, як і їх альтернативного сплайсингу, може привести до патологічних процесів.

Протікання як фізіологічних, так і біохімічних процесів у організмі має циркадіальний характер і контролюється генами Per2, BMal1b, Clock та казеїнкінази-1?, а порушення механізмів їх регуляції може приводити до виникнення патологічних процесів. Було встановлено, що під впливом навіть мінімальної дози метил-третбутилового ефіру (0,5 мг/кг) суттєво змінюється експресія циркадіальних генів Per2, BMal1b та Clock у всіх досліджуваних органах, але більш виражено у печінці та легенях щурів, але при збільшенні дози до 5 мг/кг маси тіла у легенях спостерігається суттєве зниження експресії мРНК Per2 (Рис. 14). Збільшення дози метил-третбутилового ефіру до 50 мг/кг маси тіла призводить до різкого збільшення (майже втричі) експресії мРНК Per2 у печінці і зниження у легенях (майже у 4 рази) та в міокарді (2,5 рази).

В той же час експресія мРНК BMal1b під впливом метил-третбутилового ефіру у легенях збільшується, а у печінці та міокарді, навпаки, - знижується (Рис. 15). Збільшення дози метил-третбутилового ефіру до 5 мг/кг призводить до ще більш вираженого збільшення експресії мРНК BMal1b у легенях і зниження у міокарді.

Відомо, що експресія гена BMal1b тісно пов'язана з експресією іншого циркадіального гена, CLOCK. Встановлено, що під впливом метил-третбутилового ефіру у дозі 0,5 мг/кг маси тіла протягом двох місяців збільшує експресію мРНК у печінці на 27 %, а у легенях та міокарді ефект був вдвічі більшим. Більші дози метил-третбутилового ефіру посилюють експресію мРНК CLOCK у міокарді в 2,5 рази і знижують майже у 2,5 рази у легенях. Ще більші дози метил-третбутилового ефіру (50 мг/кг) вдвічі посилюють експресії мРНК CLOCK у печінці.

Експресія мРНК казеїнкінази-1? виражено збільшується у печінці та серці, причому максимальні зміни у печінці виявляються при введенні щурам метил-третбутилового ефіру в дозі 50 мг/кг маси тіла, а у серці та легенях - при дозі 5 мг/кг.

Встановлено також, що метил-третбутиловий ефір викликає дозо-залежні зміни в експресії мРНК SNARK у печінці, легенях та серці, причому у печінці мінімальні його дози посилюють, а більші - пригнічують, а у легенях та серці - посилюють, але максимальний ефект виявляється при введенні тваринам метил-третбутилового ефіру у дозі 5 та 50 мг/кг маси тіла, відповідно.

Крім того, було встановлено, що базальний рівень експресії мРНК казеїнкінази-1? та SNARK є різним у різних органах: в легенях рівень обох мРНК є найвищим, у міокарді, порівняно з печінкою, переважає казеїнкінази-1?, а у печінці - переважає SNARK (дані не приведені).

Таким чином, результати даної роботи свідчать про виражену дію метил-третбутилового ефіру на експресію казеїнкінази-1?, SNARK, VEGF, ряду циркадіальних генів та різних PFKFB і їх альтернативний сплайсинг у таких життєво важливих органах, як печінка, легені та серце, що може порушувати інтенсивність протікання більшості циркадіальних процесів внаслідок дисрегуляції сигнальних каскадів і вносити свій вклад у розвиток патологічних станів, у тому числі і злоякісних пухлин. Причому ці зміни виявляються при тривалому, протягом двох місяців, введенні щурам цієї токсичної, екологічно небезпечної хімічної сполуки навіть в дуже малих дозах: 0,5 або 5 мг/кг маси тіла, що еквівалентно одній десятитисячній або одній тисячній долі LD50 і що свідчить про високу чутливість цих ланок регуляції метаболізму до дії метил-третбутилового ефіру. Механізм дії метил-третбутилового ефіру ще не з'ясований остаточно, він може бути комплексним, включаючи дію продуктів його метаболізму, і опосередкований системою стресу ендоплазматичного ретикулуму, що включає IRE-1, XBP-1, Per2, PFKFB і SNARK та індукується у відповідь на дію різних чинників, в тому числі і ряду хімічних речовин (Aragon et al., 2009; Hollien et al., 2009). Протилежно направлені зміни в експресії ряду генів у печінці та легенях за дії метил-третбутилового ефіру можуть бути обумовлені різною чутливість цих тканин до його токсичної дії, особливостями його метаболізму чи рівнем оксигенації цих тканин (McGregor, 2007).

Оскільки метил-третбутиловий ефір проявляє виражену дію на важливі ключові механізми регуляції метаболічних процесів у клітинах на рівні експресії PFKFB, Per2, BMal1, Clock, SNARK та казеїнкінази-1?, то їх дослідження може слугувати важливим чутливим показником дії метил-третбутилового ефіру на організм і бути корисним в пошуках чутливих маркерів біонебезпеки.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, що виражається у виявленні зміненої експресії мРНК різних 6-фосфофрукто-2-кіназ/фруктозо-2,6-бісфосфатаз (PFKFB), циркадіальних генів Per2, BMal1 і Clock, VEGF, казеїнкінази-1? та SNARK, а також змін в альтернативному сплайсингу в печінці, легенях та серці за тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру. Наукове завдання вирішено шляхом експериментального вивчення експресії генів у різних органах щурів.

1. Встановлено, що метил-третбутиловий ефір (500 мг/кг протягом місяця) посилює експресію мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-4 у печінці та знижує в легенях щурів і порушує вирізання інтрону з пре-мРНК PFKFB-4 у печінці, в результаті чого з'являється новий альтернативний сплайс-варіант мРНК, який кодує ізоензим з видозміненим та вкороченим С-кінцем.

2. Показано, що експресія альтернативного сплайс-варіанту мРНК PFKFB-4, що має делецію 22 н.з. у каталітичній частині фруктозо-2,6-бісфосфатази, суттєво змінюється під впливом метил-третбутилового ефіру як у печінці, так і у легенях, але в протилежному до основного варіанту мРНК напрямку.

3. Встановлено, що під впливом метил-третбутилового ефіру у різних органах щурів тканино-специфічно порушується експресія мРНК PFKFB-3 та її альтернативний сплайсинг.

4. Доведено, що під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру за умов холодового стресу посилюється експресія основної ізоформи мРНК PFKFB-2 у таких життєво важливих органах, як печінка та легені, а в легенях ще і додаткової ізоформи мРНК PFKFB-2.

5. Показано, що під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру у легенях щурів порушується альтернативний сплайсинг мРНК PFKFB-2, в результаті чого утворюються альтернативні сплайс-варіанти, які не мають частини каталітичних доменів 6-фосфофрукто-2-кінази.

6. Встановлено, що під впливом тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру значно порушується експресія мРНК казеїнкінази-1?, циркадіальних транскрипційних факторів Per2, BMal1 і Clock та протеїнкінази SNARK у печінці, легенях та міокарді щурів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив екотоксиканта метил-третбутилового ефіру на експресію альтернативних сплайс-варіантів мРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази у щурів / А.В. Кундієва, Д.О. Мінченко, О.П. Яворовський, І.В. Завгородній, Ю.О. Паустовський, О.Г. Мінченко // Сучасні проблеми токсикології. - 2009. - № 1. - C. 37 - 43.

2. Expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3 and VEGF mRNA in rat liver, lung and heart: effect of methyl tertbutyl ether / D.O. Minchenko, A.V. Kundieva, K. Tsuchihara, O.P. Yavorovsky, Y.O. Paustovsky, H. Esumi, O.H. Minchenko // Ukr. Biokhim. Zh. - 2009. - Vol. 81, N 4. - P. 59-68.

3. Effect of methyl tertial butyl ether on the expression of PFKFB-3 and VEGF mRNA in rat liver and lung / D.O. Minchenko, K. Tsuchihara, O.P. Yavorovsky, Y.O. Paustovsky, A.V. Kundieva, H. Esumi, O.H. Minchenko // Studia Biologica. - 2009. - Vol. 3, № 2. - P. 5 - 14.

4. Експресія PFKFB-2?та її альтернативних сплайс-варіантів у печінці та легенях щурів як показник впливу метил-третбутилового ефіру на організм / Д.О. Мінченко, А.В. Кундієва, О.П. Яворовський, Ю.О. Паустовський, І.В. Завгородній, Р.О. Бачинський, О.Г. Мінченко // Науковий вісник НМУ ім. О.О. Богомольця. - 2009. - № 4. - С. 42 - 49.

5. Структурна організація, експресія та регуляція експресії генів 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази / Д.О. Мінченко, А.Ю. Бобарикіна, А.В. Кундієва, Н.М. Липова, І.В. Божко, О.О. Ратушна, О.Г. Мінченко // Біологічні студії/Studia Biologica. - 2009. - Т. 3, № 3. - С. 123 - 140.

6. Вплив метил-третбутилового ефіру на експресію мРНК протеїнкінази SNARK, казеїнкінази-1?, Clock, BMal1 та Per2 у щурів / А.В. Кундієва, Д.О. Мінченко, О.П. Яворовський, О.Г. Мінченко // Вісник КНУ імені Тараса Шевченка, Біологія. - 2010. - Вип. 55. - С. 6 - 10.

7. Rattus norvegicus 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 1 (Pfkfb1), mRNA isoform, complete cds, alternatively splice / D.O. Minchenko, O.H. Minchenko, M. Moenner, A. Bikfalvi, A.V. Kundieva, L.L. Karbovsky, O.O. Ratushna // GenBank accession number GQ422136, 15-SEP-2009.

8. Rattus norvegicus 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 2 variant 4 (Pfkfb2) mRNA, complete cds, alternatively splice / D.O. Minchenko, O.H. Minchenko, M. Moenner, A. Bikfalvi, J. Caro, A.V. Kundieva, I.V. Bozhko, O.O. Ratushna, L.L. Karbovsky // GenBank accession number GQ422137, 15-SEP-2009.

9. Rattus norvegicus 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 2 variant 5 (Pfkfb2) mRNA, complete cds, alternatively spliced / D.O. Minchenko, O.H. Minchenko, M. Moenner, J. Caro, H. Esumi, I.V. Bozhko, A.V. Kundieva, O.P. Yavorovsky, R. Marunych, O.V. Hubenya // GenBank accession number GQ422138, 15-SEP-2009.

10. Effect of methyl tertial butyl ether on the expression of rat 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-4 mRNA and its unique alternative splice variants / A. Kundieva, D. Minchenko, Y. Paustovsky, I. Zavgorodny, R. Bachynsky, O. Yavorovsky, O. Minchenko // The VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, 2009. Ukr. Biokhim. Zh. - 2009.

11. Expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3 and VEGF mRNA in the liver, lung and heart of methyl tertbutyl ether-treated rats / A. Kundieva, D. Minchenko, O. Yavorovsky, Y. Paustovsky, O. Minchenko //The VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, 2009. Ukr. Biokhim. Zh. - 2009. - 81, N 4 (special issue). - P. 164.

12. Вплив метил-третбутилового ефіру на експресію мРНК протеїнкінази SNARK, казеїнкінази-1?, Clock, bmal1 та per2 у щурів / А.В. Кундієва, Д.О. Мінченко, O.П. Яворовський, О.Г. Мінченко // Матеріали VIII міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції молодих вчених. Київ, 2010. Шевченківська весна, Київ. - 2010. - С. 40 - 41.

АНОТАЦІЯ

Кундієва А.В. Експресія 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази та ряду інших генів при дії метил-третбутилового ефіру на організм. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового степеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню молекулярних основ дії на організм метил-третбутилового ефіру, механізмів його впливу на експресію мРНК циркадіальних генів, казеїнкінази-1?, SNARK, VEGF та 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази (PFKFB) у різних органах щурів. Вперше було показано, що експресія генів PFKFB-4, PFKFB-3 та PFKFB-2 суттєво змінюється під впливом тривалої дії на організм метил-третбутилового ефіру у печінці, легенях та серці щурів і порушується альтернативний сплайсинг їх пре-мРНК. Виявлено новий альтернативний сплайс-варіант мРНК PFKFB4, що індукується під впливом метил-третбутилового ефіру. Встановлено, що зміни в експресії генів PFKFB-3 та PFKFB-4 під впливом метил-третбутилового ефіру є тканино-специфічними та дозо-залежними. У печінці та легенях також виявлені зміни в альтернативному сплайсингу пре-мРНК PFKFB-2, в результаті чого посилюється експресія варіантів PFKFB без каталітичних доменів 6-фосфофрукто-2-кінази. Встановлено, що під впливом тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру значно порушується експресія мРНК казеїнкінази-1?, циркадіальних транскрипційних факторів Per2, BMal1 і Clock та протеїнкінази SNARK у печінці, легенях та міокарді щурів.

Ключові слова: експресія мРНК, PFKFB, циркадіальні гени, SNARK, казеїнкіназа-1?, легені, печінка, щури.

Кундиева А.В. Экспрессия 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы и ряда других генов при действии метил-третбутилового эфира на организм. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена изучению молекулярных основ нарушения экспрессии генов 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы (PFKFB), казеинкиназы-1?, ряда циркадиальных генов в печени, легких и сердце крыс при продолжительном действии на организм различных доз метил-третбутилового эфира, экологически опасного химического соединения, которое добавляется в бензин в большом количестве для увеличения октанового числа. Установлено, что экспрессия мРНК PFKFB-4, PFKFB-3 и PFKFB-2 существенно нарушается в различных органах крыс под влиянием продолжительного действия на организм метил-третбутилового эфира, причем выраженность и направленность изменений в экспрессии генов существенно зависит от его дозы и по-разному проявляется в печени, легких и сердце крыс. Показано также, что при этом существенно нарушается и альтернативный сплайсинг пре-мРНК PFKFB-4, PFKFB-3 и PFKFB-2. Так, в печени крыс под влиянием продолжительного действия на организм метил-третбутилового эфира индуцируется экспрессия не выявляющегося у нормальных животных альтернативного сплайс-варианта пре-мРНК PFKFB-4. Этот сплайс-вариант имеет вставку после 11-го экзона размером 94 нуклеотидных остатка вследствие нарушения процесса вырезания 11-го интрона, причем с увеличением дозы метил-третбутилового эфира выраженность его индуцирующего эффекта значительно повышается. Экспрессия другого альтернативного сплайс-варианта пре-мРНК PFKFB-4, который имеет делецию каталитического домена фруктозо-2,6-бисфосфатазы также увеличивается в печени, но существенно снижается в легких под влиянием метил-третбутилового эфира. Оба альтернативных сплайс-варианта PFKFB-4 должны усиливать гликолиз. Под влиянием метил-третбутилового эфира существенно изменяется также альтернативный сплайсинг пре-мРНК PFKFB-3, причем в разных органах по-разному и дозо-зависимо.

Выявлено три новых уникальных альтернативных сплайс-варианта пре-мРНК PFKFB-2 с делецией и/или вставкой в каталитических доменах 6-фосфофрукто-2-киназы и фруктозо-2,6-бисфосфатазы и обнаружено увеличение уровня их экспрессии в легких крыс под влиянием больших доз метил-третбутилового эфира. Это свидетельствует об участии альтернативного сплайсинга в перестройке метаболизма при длительном воздействии на организм метил-третбутилового эфира. Увеличение уровня экспрессии сплайс-варианта PFKFB-2 с делецией 2 каталитических доменов 6-фосфофрукто-2-киназы, как и сплайс-варианта PFKFB-2 со вставкой в центральной части 6-фосфофрукто-2-киназы будет угнетать гликолиз. В то же время повышение уровня экспрессии сплайс-варианта пре-мРНК PFKFB-2 с делецией 2 каталитических доменов 6-фосфофрукто-2-киназы и вставкой в каталитической части фруктозо-2,6-бисфосфатазы будет снижать уровень функционально активной мРНК PFKFB-2. Это является принципиально новым научным фактом и может свидетельствовать об очень важной роли PFKFB и альтернативного сплайсинга их пре-мРНК в механизмах действия метил-третбутилового эфира. Установлено, что под влиянием метил-третбутилового эфира изменяется экспрессия мРНК VEGF и его уникального альтернативного сплайс-варианта в печени и легких крыс, причем выраженность его эффекта зависит от дозы и по-разному проявляется в этих органах.

Длительное применение метил-третбутилового эфира приводит также к существенному нарушению экспрессии циркадиальных генов, казеинкиназа-1? и протеинкиназы SNARK в различных органах крыс, причем оно обнаруживалось уже при очень низких дозах и проявлялось по-разному в различных органах. C увеличением дозы эффект этого химического соединения усиливается, причем иногда изменяется и направленность индуцируемых им изменений в экспрессии некоторых генов. Таким образом, имеет место дисрегуляция циркадиальных генов, что может быть обусловлено наличием обратных связей в механизмах их регуляции. Хотя детальный молекулярный механизм действия метил-третбутилового эфира на экспрессию изученных генов еще не выяснен, можно предположить участие системы «стресса эндоплазматического ретикулума» в реалазации его действия, поскольку циркадиальные гены являются компонентами этой системы.

Полученные результаты значительно расширяют наши представления о молекулярных основах действия метил-третбутилового эфира на организм на уровне экспрессии генов, ответственных за регуляцию основных метаболических процессов, их циркадиальный характер и нарушение которых может инициировать развитие ряда патологических состояний.

Ключевые слова: экспрессия мРНК, PFKFB, циркадиальные гены, SNARK, казеинкиназа-1?, легкие, печень, крысы.

Kundieva A.V. The effects of methyl tertbutyl ether on the expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase and several other genes in the organism. -Manuscript.

Dissertation for the PhD degree in specialty 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, Kyiv, 2010.

The thesis is devoted to the study of the molecular basis for the effects methyl tertbutyl ether has on the organism, the mechanisms of its effects on the expression of the mRNA of circadian genes, casein kinase-1???SNARK, VEGF and 6-phosphofructo-2-kinase/frustose-2,6-bisphosphatase (PFKFB) in various rat organs. It was first shown that long-term exposure to methyl tertbutyl ether causes radical changes in the expression of the genes PFKFB-4, PFKFB-3, PFKFB-2 in rat liver, lungs and heart and that it also effects the alternative splicing of their pre-mRNA. A new alternative splice variant of the mRNA of PFKFB-4, induced by exposure to methyl tertbutyl ether, was found. The changes in the expression of the genes PFKFB-3 and PFKFB-4 caused by methyl tertbutyl ether were found to be organ-specific and dose-related. Changes in the alternative splicing of the pre-mRNA of PFKFB-2 were found in the liver and lungs, as a result the expression of the PFKFB variants without 6-phosphofructo-2-kinase catalytic domains increases. It was shown that long-term exposure to methyl tertbutyl ether significantly changes the expression of the mRNA of casein kinase-1?? circadian transcription factors Per2, BMal1 and Clock and the protein kinase SNARK in rat liver, lungs and myocardium.

Key words: mRNA expression, PFKFB, circadian genes, SNARK, casein kinase-1?, lung, liver, rats.

Размещено на Allbest.ru