Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.115:582.232:57.017.8

Автореферат

Ліпідний склад cyanophyta (cyanobacteria)

та флуоресцентні характеристики їх фотосинтетичного апарату за альтернативних умов вуглецевого живлення

03.00.04 - біохімія

Михайленко Наталія Феліксівна

Київ - 2010

Робота виконана у відділі мембранології та фітохімії

Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України.

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

Ситник Костянтин Меркурійович,

Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України,

головний науковий співробітник

відділу фітогормонології.

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор

Божков Анатолій Іванович,

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна,

директор Науково-дослідного інституту біології,

завідувач кафедри молекулярної біології та біотехнології;

доктор біологічних наук, професор

Паршикова Тетяна Вікторівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри фізiології та екологiї рослин.

Захист відбудеться “ 22 ” березня 2010 р. о 14 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект Академіка Глушкова, 2, корпус 12,

біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету

імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 18 ” лютого 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої радиТ.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Полярні ліпіди є невід'ємною складовою мембран. Вони утворюють їх матрикс, а деяка частка ліпідів входить до найближчого оточення білкових молекул і сприяє підтриманню ними активних конформацій. Специфічний ліпідний склад характерний для мембран, в яких протікають процеси фотосинтетичного перетворення енергії. На відміну від більшості фосфоліпідних мембран, ліпідна складова фотосинтетичних тилакоїдних мембран представлена в основному гліколіпідами. Це два нейтральні галактоліпіди - моногалактозилдіацилгліцерол (МГДГ) і дигалактозилдіацилгліцерол (ДГДГ), а також два аніонні ліпіди - сульфоліпід сульфохіновозилдіацилгліцерол (СХДГ) і єдиний фосфоліпід - фосфатидилгліцерол (ФГ) (Золотарьова О. та ін., 2008). Для окремих класів ліпідів та їх молекулярних видів показана специфічна роль у функціонуванні білкових комплексів фотосинтетичних мембран (Siegenthaler P.-A., Trйmoliиres A., 1998; Dцrmann P., Benning C., 2002; Domonkos I. et al., 2008). Значний внесок у вивчення ролі ліпідів у функціонуванні фотосинтезуючих організмів зробили, серед інших, українські вчені (Лозова Г., 1975; Мануильская С., 1987;

Таран Н., 2000; Оканенко О., 2002; Оканенко О., Таран Н., 2005).

Cyanophyta (Cyanobacteria, синьозелені водорості, ціанобактерії) - прокаріотичні організми, які першими на Землі набули здатність до оксигенного фотосинтезу. Первинні процеси фотосинтезу в Cyanophyta протікають у системі тилакоїдних мембран, які містять набір пігмент-білкових комплексів, що забезпечують поглинання енергії світла та її трансформацію на хімічну енергію АТФ і НАДФН. Унікальною особливістю синьозелених водоростей є функціонування і взаємодія в одній і тій самій тилакоїдній мембрані як фотосинтетичного, так і дихального ланцюга транспорту електронів (Peschek G. et al., 2004), у той час як цитоплазматична мембрана містить лише всі необхідні компоненти дихального електронтранспортного ланцюга. Ліпідний склад і тилакоїдних, і цитоплазматичних мембран Cyanophyta є тотожним якісно і близьким кількісно до ліпідного складу тилакоїдів хлоропластів вищих рослин (Wada H., Murata N., 1998).

У переважній своїй більшості Cyanophyta не є облігатними фотоавтотрофами, вони здатні також ефективно засвоювати екзогенні й ендогенні органічні речовини (Кузьменко М., 1981). Найлегше утилізується глюкоза (Mьhling M. et al., 2005), яка до того ж відіграє ключову роль у регуляції метаболізму вуглецю (Semenenko V. et al., 1984; Rolland F. et al., 2006), пригнічуючи фотосинтез не лише шляхом інгібування реакції кінцевим продуктом, але й завдяки регуляції біосинтезу ферментів (Сиваш О. та ін., 2001; Hanson J., Smeekens S., 2009). Було доведено, що глюкоза може відігравати роль первинного посередника при передачі регуляторних сигналів до геному вищих рослин, зокрема, завдяки наявності рецепторів глюкози в цитоплазматичній мембрані та активації каскаду специфічних протеїнкіназ. Найбільш відомим є регуляторний механізм, опосередкований гексокіназою (ATФ: D-гексоза

6-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.1) - ферментом, який здійснює каталіз першої реакції в метаболічному шляху утилізації глюкози (Jang J.-C. et al., 1997; Harrington G., Bush D., 2003;

Cho J.-I. et al., 2009). Залежну від гексокінази репресію генів у клітинах рослин здатні викликати і структурні аналоги глюкози, такі як маноза і 2-дезоксиглюкоза.

Механізми передачі індукованого глюкозою регуляторного сигналу в Cyanophyta практично не досліджені, хоча, враховуючи подвійну природу їх тилакоїдних мембран, можуть відрізнятися від шляхів, добре відомих для багатьох інших груп живих організмів. Глюкоза, відіграючи роль не лише субстрату дихання, але й репресора фотосинтезу, може впливати на молекулярну організацію і функціонування мембран синьозелених водоростей. Вивченню функціональних особливостей і ліпідного складу мембран Cyanophyta, сформованих за умов різних типів живлення, присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з планами фундаментальних науково-дослідних робіт відділу мембранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України: “Особливості еволюційного становлення систем світлозбору та синтезу АТФ у фотосинтезуючих організмів” (1997-2001 р.р.; № д/р 0198U003791); “Розробка технології генетичної трансформації ціанобактерій з метою інтенсифікації продукування корисних речовин” (2002-2006 р.р.;

№ д/р 0102U001462).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи був аналіз ліпідного складу та ефективності протікання фотохімічних реакцій у Cyanophyta (Cyanobacteria) при переходах до альтернативних типів живлення.

У завдання роботи входило:

1) визначити швидкості нагромадження біомаси представниками гормогонієвих синьозелених водоростей за умов фотоавтотрофного, фотоміксотрофного і хемогетеротрофного живлення;

2) проаналізувати вміст хлорофілу a як основного фотосинтетичного пігменту синьозелених водоростей при вирощуванні їх у зазначених умовах;

3) шляхом індукування флуоресценції хлорофілу in vivo дослідити функціональний стан фотосистеми ІІ Cyanophyta в умовах альтернативних варіантів забезпечення вуглецем;

4) визначити вміст окремих класів полярних ліпідів у клітинах синьозелених водоростей при різних типах їх живлення та проаналізувати співвідношення між цими класами;

5) дослідити сумарний жирнокислотний склад ліпідів Cyanophyta при альтернативних типах їх живлення.

Об'єкт дослідження - механізми впливу екзогенних джерел вуглецю на структурно-функціональну організацію синьозелених водоростей.

Предмет дослідження - ліпідний склад і функціональні характеристики фотосинтетичного апарату Cyanophyta при альтернативних типах живлення.

Методи дослідження - біохімічні (екстракція органічними розчинниками - для виділення та очищення ліпідів, тонкошарова хроматографія - для фракціонування ліпідного екстракту, газорідинна хроматографія - для розділення та ідентифікації метилових естерів жирних кислот, спектрофотометричні методи - для кількісного визначення хлорофілу, гліко- і фосфоліпідів та визначення спектрів поглинання пігментів, спектрофлуориметрія - для визначення спектрів збудження та емісії флуоресценції пігментів); біофізичні (метод індукції флуоресценції хлорофілу in vivo); альгологічні (для культивування синьозелених водоростей).

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше проведено комплексний порівняльний аналіз ліпідного складу і характеристик фотосинтетичного апарату Cyanophyta, вирощуваних за альтернативних умов вуглецевого живлення. Визначено темпи росту Cyanophyta, функціональну активність фотосистеми ІІ, вміст у клітинах хлорофілу a і полярних ліпідів при додаванні до середовища культивування D-глюкози, D-манози або цитрату натрію. Показано, що під впливом екзогенної глюкози в Cyanophyta відбуваються кількісні зміни складу мембранних ліпідів, а саме, зростання вмісту фосфатидилгліцеролу в клітинах і підвищення його частки в сумарній кількості полярних ліпідів, у більшості випадків - за рахунок зменшення відносного вмісту моногалактозилдіацилгліцеролу, збільшення відносного вмісту олеїнової кислоти в ліпідах і зменшення - пальмітоолеїнової кислоти. Уперше встановлено, що маноза - структурний аналог глюкози, який практично не включається в метаболізм Cyanophyta - викликає якісно подібні зміни складу мембранних ліпідів, що свідчить про участь опосередкованого гексокіназою механізму передачі сигналу в регуляції структурних перебудов мембран. Уперше показано, що пригнічення глюкозою фотосинтетичної активності Cyanophyta пов'язано з інгібуванням фотохімічних реакцій у

фотосистемі ІІ. Гальмівна дія манози на активність фотосистеми ІІ обмежується частковим блокуванням відтоку електронів з її реакційних центрів, не впливаючи на ефективність фотохімічного розділення зарядів у відкритих реакційних центрах фотосистеми ІІ.

Практичне значення одержаних результатів. Наведені в дисертації дані представляють інтерес для біотехнологічного використання Cyanophyta. Одержані результати експериментів дозволяють розробити рекомендації щодо оптимізації співвідношень між окремими класами гліцероліпідів і жирних кислот при здійсненні керованого впливу на продуктивність і метаболізм синьозелених водоростей. Результати роботи можуть бути використані при розробці технологій одержання фармакологічних препаратів на основі гліцероліпідів Cyanophyta. Дані, отримані в ході роботи, сприяють розвитку уявлень про механізми структурної реорганізації мембран синьозелених водоростей у відповідь на зміни умов культивування і роль у цих процесах гліцероліпідів. Матеріали можуть бути використані в навчальному процесі учбових закладів при укладанні курсів лекцій з біохімії, біотехнології, фотосинтезу та біоенергетики.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою особисто проведено пошук і аналіз даних вітчизняної і зарубіжної літератури, сформульовано завдання роботи, виконано експериментальні дослідження, оброблено, узагальнено та інтерпретовано одержані результати, підготовлено до друку наукові праці. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок досліджень, висунуто робочу гіпотезу щодо впливу екзогенних цукрів на склад фотосинтетичних мембран Cyanophyta та обґрунтовано методологію проведення експериментів. Спільно з

О.О. Сивашем проведено визначення спектрів поглинання пігментів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, основні положення та висновки дисертаційної роботи були представлені на 15-му Міжнародному симпозіумі з ліпідів рослин (Оказакі, Японія, 2002), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), XIII, XIV і XV конгресах Федерації європейських товариств біології рослин (Херсоніссос, Крит, Греція, 2002; Краків, Польща, 2004; Ліон, Франція, 2006), Міжнародній конференції “Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems” (Пущіно, Росія, 2006), 7-му Європейському симпозіумі з молекулярної біології ціанобактерій (Чеське Будейовіце, Чехія, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт, у тому числі розділ монографії, 5 статей у фахових виданнях, з них 4 - у тих, що затверджені переліком ВАК України, та 8 тез доповідей конференцій і з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з переліку умовних позначень, вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4-х розділів результатів досліджень та їх обговорення, висновків і списку літератури, який містить 386 бiблiографiчних посилань. Роботу викладено на 178 сторінках, проілюстровано 11 таблицями та 30 рисунками.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Біологічний матеріал. Дослідження проводили на альгологічно чистих культурах гормогонієвих синьозелених водоростей Spirulina (Arthrospira) platensis (Nordst.) Geitl. IBASU-B-26, Nostoc linckia (Roth) Born. et Flah. in sensu Elenk. f. muscorum (Ag.) Elenk. IBASU-B-85 та Nostoc linckia (Roth) Born. et Flah. in sensu Elenk. f. calcicola (Brйb.) Elenk. IBASU-B-86.

Водорості вирощували в стерильних умовах при температурі 27-28°С на рідких мінеральних середовищах: N. linckia - на середовищі Фітцджеральда № 11 у модифікації Цендера і Горхема (Zehnder A., Gorham P., 1960), а S. platensis - на середовищі Заррук (Zarrouk C., 1966). Культури освітлювали люмінесцентними лампами (щільність потоку фотонів

70-75 мкмоль·м-²·с-¹) з тривалістю чергування освітлення і темряви 12/12 год. Органічні речовини (D-глюкозу, D-манозу чи цитрат натрію) додавали в стерильних умовах через 15 діб після посіву. Після внесення добавок водорості продовжували культивувати в умовах, указаних вище, за винятком того, що освітлення робили цілодобовим, а частину культур, які містили 50 мМ глюкозу, переносили в темряву.

Визначення параметрів флуоресценції хлорофілу. Флуоресценцію суспензії водоростей (концентрація хлорофілу 2 мкг/мл) аналізували з використанням флуориметра XE-PAM (Heinz Walz GmbH, Німеччина) за модифікованою нами методикою Кемпбелла та ін. (Campbell D. et al., 1998; Mykhaylenko N., 2005). Щільність потоку фотонів діючого світла відповідала тій, що використовувалася при культивуванні Cyanophyta. Обчислювали такі параметри флуоресценції: 1) F_V/F_M ? максимальну ефективність фотохімічних реакцій у фотосистемі ІІ (ФС ІІ) (Butler W., 1978); 2) F_V'/F_M' ? ефективність фотохімічних реакцій у відкритих реакційних центрах ФС ІІ (Genty B. et al., 1989); 3) q_P ? коефіцієнт фотохімічного гасіння флуоресценції (van Kooten O., Snel J., 1990); 4) _{PS II} ? флуоресцентну оцінку квантового виходу електронного транспорту у ФС ІІ (Genty B. et al., 1989); 5) q_N ? коефіцієнт нефотохімічного гасіння флуоресценції (van Kooten O., Snel J., 1990); 6) NPQ ? нефотохімічне гасіння флуоресценції за Штерном-Вольмером (Bilger W., Bjцrkman O., 1990).

Швидкість росту Cyanophyta при додаванні екзогенних джерел вуглецю до середовища культивування. Дослідження починали, коли культури знаходилися наприкінці логарифмічної фази росту. На рис. 1 наведено криві росту S. platensis, N. linckia 85 і N. linckia 86 у присутності різних концентрацій глюкози. За контрольних (фотоавтотрофних) умов приріст біомаси культури S. platensis відбувався більш повільними темпами, ніж в обох штамів Nostoc. Стимулююча дія 5 мМ глюкози проявлялася вже через одну добу культивування в

S. platensis, через чотири доби - у N. linckia 85 і лише за тиждень - у N. linckia 86; однак темпи приросту біомаси за 7 діб росту з 5 мМ глюкозою в Nostoc були вищими. У присутності 50 мМ глюкози спостерігався інтенсивніший приріст біомаси, причому він починався вже на першу добу в S. platensis і N. linckia 85 та через чотири доби - у N. linckia 86.

Примітка. Результати наведені у вигляді М SD (n = 9).

Усі три штами синьозелених водоростей виявилися здатними нагромаджувати біомасу в темряві за рахунок окиснення екзогенної глюкози, хоча їх ріст був значно пригніченим (табл. 1).

Таблиця 1 Нагромадження біомаси Cyanophyta при культивуванні в темряві після додавання 50 мМ D-глюкози

Примітки: 1. Результати наведені у вигляді М SD (n = 9).

2. Позначкою * відмічені дані, при порівнянні яких із попереднім значенням P ? 0,05.

На відміну від глюкози, інші екзогенні джерела вуглецю - маноза і цитрат натрію - у концентраціях 5 мМ на світлі дещо гальмували нагромадження біомаси Cyanophyta (дані не наведені).

Вміст хлорофілу a за альтернативних умов живлення. За фотоавтотрофних умов клітини S. platensis у порівнянні з N. linckia містили в середньому в 1,5 рази більше хлорофілу a в розрахунку на суху речовину, а концентрації хлорофілу в клітинах обох штамів

N. linckia були дуже близькими (рис. 2).

Примітки:

1.Результати наведені у вигляді М SD (n = 9).

2.Позначкою * відмічені дані, при порівнянні яких зі значенням для контрольної культури того ж віку P ? 0,05.

Через 4 дні досліду спостерігалася відчутна різниця в концентрації хлорофілу в клітинах різних штамів, які зростали в присутності 5 мМ і 50 мМ глюкози. У S. platensis, що росла в присутності 5 мМ глюкози, вміст хлорофілу практично не відрізнявся від контрольного зразка такого ж віку, а при концентрації глюкози в середовищі культивування 50 ммоль/л вміст хлорофілу зменшувався в 2,1 рази в порівнянні з контрольним зразком.

Вміст хлорофілу в клітинах штаму N. linckia 85 у присутності екзогенної глюкози знижувався відносно контрольного зразка: на 12,7 % після додавання 5 мМ глюкози і на 22,3 % - після додавання 50 мМ глюкози. На противагу цьому, якщо впливу екзогенної глюкози зазнавав культивований на світлі штам N. linckia 86, то вміст хлорофілу майже не змінювався в порівнянні з контролем. Отже, між різними штамами Cyanophyta, навіть тими, що належать до одного і того ж виду, існують значні відмінності характеру коливань вмісту хлорофілу у відповідь на додавання глюкози до середовища культивування.

При позбавленні синьозелених водоростей освітлення і додаванні 50 мМ глюкози як екзогенного джерела вуглецю і енергії відбувався поступовий розпад хлорофілу; через 4 доби експерименту його вміст у N. linckia 85 і S. platensis був значно нижчим, ніж у фотоавтотрофних культурах.

Усі досліджені штами синьозелених водоростей, вирощувані впродовж 4-х діб після додавання 5 мМ манози, мали знижений у порівнянні з контрольними культурами вміст хлорофілу a; у S. platensis це зниження було набагато більше вираженим, ніж у N. linckia.

Через 4 доби після додавання 5 мМ цитрату натрію до середовища культивування вміст хлорофілу в S. platensis знижувався в порівнянні з контрольною культурою того ж віку і,

навпаки, не змінювався в N. linckia.

Екскреція пігментів у середовище культивування Cyanophyta. Після додавання глюкози (незалежно від концентрації) до культур як N. linckia, так і S. platensis, у середовищі культивування незабаром з'являлися тетрапірольні сполуки з червоно-помаранчевою флуоресценцією (_max 615-618 нм). Положення смуги Соре (_max 400 нм) і максимумів у видимій ділянці спектра (Q-смуга порфіринів) у спектрі збудження флуоресценції дали підстави ідентифікувати цей пігмент як порфірин, ймовірніше за все, копропорфірин (Mykhaylenko N. et al., 2004). Зниження вмісту хлорофілу, яке супроводжується екскрецією порфіринів, у присутності глюкози може бути зумовленим блокуванням біосинтезу тетрапірольних пігментів на стадії утворення копропорфіриногену ІІІ (Stadnichuk I. et al., 1998), що при виділенні в середовище культивування спонтанно перетворюється на копропорфірин ІІІ (Быховский В., Зайцева Н., 1989). Це припущення підтверджується тим, що виділення з клітин тетрапірольних сполук, хоча і в набагато менших кількостях, відбувається також при хемогетеротрофному рості культур.

Якісний склад гліцероліпідів. У всіх трьох штамів синьозелених водоростей завжди були присутні всі чотири основні класи полярних гліцероліпідів: МГДГ, ДГДГ, СХДГ і ФГ. Інші фосфоліпіди, зокрема фосфатидилхолін, не були виявлені на хроматограмах при застосуванні специфічних реагентів. Визначення кількості фосфоліпідів у загальному ліпідному екстракті і вмісту в цьому ж екстракті ФГ, відділеного за допомогою тонкошарової хроматографії, давало тотожні результати. Кількість моноглюкозилдіацилгліцеролу - безпосереднього попередника МГДГ у шляху біосинтезу останнього - у досліджених нами зразках знаходилася поза межами чутливості вживаних методів визначення.

Відносний вміст полярних гліцероліпідів у синьозелених водоростей при альтернативних типах живлення. За умов фотоавтотрофного росту відносні частки гліколіпідів у загальній кількості полярних ліпідів клітин S. platensis були меншими, а відносна частка ФГ - утричі більшою порівняно з обома штамами N. linckia (табл. 2). З часом відносна частка ФГ зростала в S. platensis, проте значних змін сумарної кількості негативно заряджених ліпідів (ФГ і СХДГ) не було зареєстровано в жодного з штамів.

Таблиця 2 Вміст полярних гліцероліпідів у клітинах Cyanophyta при культивуванні на світлі після додавання D-глюкози, % від загальної кількості (моль)

Примітки:

1.Результати наведені у вигляді М SD (n = 3).

2.P ? 0,05 при порівнянні даних: # - з попереднім значенням, * - зі значенням для контрольної культури того ж віку, † - зі значенням для культури того ж віку, забезпеченої 5 мМ глюкозою.

При переході до фотоміксотрофного росту на глюкозі в S. platensis відносна частка МГДГ у сумарній кількості полярних ліпідів знижувалася порівняно з фотоавтотрофним

зразком уже через 24 години. Дія 50 мМ глюкози була набагато більше вираженою, ніж

5 мМ, і з часом різниця з контролем зростала (див. табл. 2). У N. linckia відносна частка МГДГ зменшувалася порівняно з контролем лише в забезпечених 5 мМ глюкозою культурах: у штаму 86 - уже через 1 добу, а в штаму 85 - через 4 доби.

У S. platensis відносна частка ДГДГ у сумарній кількості полярних ліпідів під дією

5 мМ глюкози на першу і сьому доби експерименту була приблизно на третину нижчою, ніж у культурі, вирощуваній без добавок (див. табл. 2). Однак на четверту добу відносна частка ДГДГ зростала до рівня фотоавтотрофної культури (така ж сама динаміка спостерігалася і для вмісту хлорофілу a в клітинах). Відносна частка ДГДГ у підживленої 50 мМ глюкозою

S. platensis весь час була істотно нижчою, ніж у контролі.

Додавання глюкози приводило до значних коливань відносної частки сульфоліпіду в досліджених штамів Cyanophyta (див. табл. 2). У забезпечених 5 мМ глюкозою синьозелених водоростей частка СХДГ у переважній більшості випадків була вищою, ніж у забезпечених 50 мМ глюкозою.

На відміну від галактоліпідів, відносна частка ФГ у сумарній кількості полярних ліпідів у присутності глюкози практично завжди сильно зростала; вона ніколи не були меншою, ніж у відповідних фотоавтотрофних культур (див. табл. 2). На збільшення відносної частки ФГ у S. platensis позитивно впливали як тривалість культивування з глюкозою, так і підвищення її концентрації з 5 мМ до 50 мМ. У результаті, наприкінці тижневого досліду зростання частки ФГ у клітинах, вирощуваних у присутності 50 мМ глюкози, було максимальним - на 93 % у порівнянні з фотоавтотрофною культурою аналогічного віку і в 2,4 рази від початку експерименту. У N. linckia 85 відносні частки ФГ також стабільно зростали під дією екзогенної глюкози, однак ефект був виражений не настільки сильно - так, через 96 годин після внесення 50 мМ глюкози відносна частка ФГ ставала лише на 21 % більшою, ніж у контрольній культурі. У N. linckia 86 при підживленні культури 5 мМ глюкозою частка ФГ у загальній кількості полярних ліпідів підвищувалася істотно, хоча дещо менше, ніж у S. platensis. Разом з тим, після додавання 50 мМ глюкози в цього штаму відносна частка ФГ була дуже лабільною: якщо через одну добу вона зростала максимально серед 3-х вивчених штамів (на 70 % у порівнянні з культурою того ж віку, вирощуваною без добавок), то на 4-ту добу експерименту - мало відрізнялася від контрольного показника.

У результаті при підживленні синьозелених водоростей глюкозою звичайно помітно збільшувалася сумарна частка негативно заряджених ліпідів (СХДГ і ФГ). Зростання її в

S. platensis було особливо показовим - у присутності екзогенної глюкози половина всіх мембранних ліпідів (а в ряді дослідів - більша їх частка) була представлена аніонними ліпідами. В основному приріст відбувався за рахунок ФГ, проте збільшення кількості сульфоліпіду

могло також відігравати певну роль, особливо на ранніх стадіях впливу глюкози, чи при невеликій її концентрації. Це спростовує висунуту Френцен (Frentzen M., 2004) гіпотезу про збереження в мембранах Cyanophyta постійної сумарної частки СХДГ і ФГ.

Перехід синьозелених водоростей до хемогетеротрофного способу живлення (у темряві в присутності 50 мМ глюкози) супроводжувався змінами ліпідного складу, характер яких деякою мірою збігався зі змінами, викликаними утилізацією глюкози на світлі (рис. 3). Відносні частки МГДГ у сумарній кількості полярних ліпідів знижувалися приблизно однаково в усіх трьох штамів. Відсотки ДГДГ і СХДГ підвищувалися в N. linckia та не відрізнялися від контрольних значень у S. platensis. Як і у випадку культивування синьозелених водоростей з екзогенною глюкозою при освітленні, після 4-х діб хемогетеротрофного росту завжди збільшувався внесок ФГ у сумарну кількість полярних ліпідів. Як наслідок, за цих умов сумарна частка аніонних гліцероліпідів зростала.

Рис. 3. Вміст полярних гліцероліпідів у клітинах Cyanophyta, вирощуваних протягом

4-х діб у темряві після додавання 50 мМ D-глюкози. 1 - освітлення, без добавок; 2 - темрява, + 50 мМ D-глюкоза.

Примітки:

1.Результати наведені у вигляді М SD (n = 3).

2.Позначкою * відмічені дані, при порівнянні яких із контрольним значенням P ? 0,05.

Під впливом 5 мМ манози зменшувалися відносні частки МГДГ у сумарній кількості полярних ліпідів (табл. 3). Частка ДГДГ знижувалася майже на чверть у S. platensis і приблизно на стільки ж зростала в обох штамів N. linckia. Відносні частки СХДГ при вирощуванні Cyanophyta з екзогенною манозою мало відрізнялися від контрольних значень. У присутності манози відносна частка ФГ у загальній кількості полярних ліпідів була більшою, ніж у контрольних зразках такого ж віку, а в S. platensis і N. linckia 85 - до того ж і більшою, ніж при додаванні 5 мМ глюкози. При культивуванні з 5 мМ манозою в S. platensis і N. linckia 85 спостерігалося підвищення відносної частки негативно заряджених ліпідів у порівнянні з культурами, вирощуваними без добавок.

Таблиця 3 Вміст полярних гліцероліпідів у клітинах Cyanophyta, вирощуваних протягом 4-х діб на світлі після додавання 5 мМ D-манози чи 5 мМ цитрату натрію, % від загальної кількості (моль)

Примітки:

1.Результати наведені у вигляді М SD (n = 3).

2.Позначкою * відмічені дані, при порівнянні яких із контрольним значенням P ? 0,05.

При культивуванні Cyanophyta з 5 мМ цитратом натрію відносна частка МГДГ у

S. platensis і N. linckia 85 зменшувалася (див. табл. 3); водночас у N. linckia 86 вона зберігалася на рівні, досить близькому до контрольного. Загальним для всіх трьох досліджених культур наслідком внесення 5 мМ цитрату натрію до живильного середовища було збереження вищих, ніж при фотоавтотрофному рості, часток ДГДГ у сумарній кількості гліцероліпідів. Відносні частки СХДГ під впливом 5 мМ цитрату натрію в S. platensis і N. linckia 86 зменшувалися до мінімальних значень, які спостерігалися для культури даного віку в присутності добавок чи без них (у першої - приблизно на третину, а в другого - на 12 % у порівнянні з контрольними зразками аналогічного віку). У N. linckia 85 додавання 5 мМ цитрату натрію не впливало на величину відносної частки СХДГ. Відносна частка ФГ у сумарній кількості полярних ліпідів Cyanophyta стрімко зростала при культивуванні з цитратом натрію, у S. platensis і N. linckia 85 - до максимальних величин, зареєстрованих для 19-денних культур. У результаті внесення 5 мМ цитрату натрію до живильного середовища в синьозелених водоростей зростали частки аніонних гліцероліпідів.

Згідно з гіпотезою (Gьler S. et al., 1996; Yu B. et al., 2002), можливою фізіологічною роллю сульфоліпіду у фотосинтетичних мембранах є часткове заміщення аніонних фосфоліпідів з метою збереження фосфату. Підвищення вмісту ФГ у клітинах Cyanophyta за умов гетеротрофного росту може означати його необхідність для належного функціонування певних комплексів дихального електронтранспортного ланцюга (Mykhaylenko N., 2005). Нагромадження ФГ, навіть інтенсивніше, ніж у присутності глюкози, ініціює і маноза - аналог глюкози, що не включається в клітинний метаболізм (Mykhaylenko N., Zolotareva O., 2003). Можна припустити, що до цього процесу залучені механізми регуляції експресії генів, опосередковані гексокіназою.

Оскільки МГДГ є необхідним компонентом фотосистеми ІІ (Gounaris K., Barber J., 1985; Murata N. et al., 1990; Loll B. et al., 2005; Guskov A. et al., 2009) і фотосистеми І (Makewicz A. et al., 1995, 1996; Jordan P. et al., 2001), тенденція до зменшення його вмісту в Cyanophyta при культивуванні з органічними добавками може бути зумовлена зниженням потреби клітин у продуктах фотосинтезу.

Відносний вміст жирних кислот у ліпідах Cyanophyta, вирощуваних у присутності екзогенних органічних речовин. Згідно з класифікацією типів дегідрування жирнокислотних залишків у синьозелених водоростей (Murata N. et al., 1992; Wada H., Murata N., 1998),

S. platensis належить до групи 3 (містить г-ліноленову кислоту - 18:3Д6,9,12), а N. linckia - до групи 2 (містить б-ліноленову кислоту - 18:3Д9,12,15 та має високий вміст пальмітоолеїнової кислоти - 16:1Д9) (рис. 4). У ліпідах досліджених штамів, як і більшості синьозелених водоростей, головною жирною кислотою була пальмітинова (16:0), великими були також відносні частки ненасичених С₁₈ жирних кислот - лінолевої (18:2Д9,12) та ліноленової.

N. linckia відрізнявся від S. platensis більшим відносним вмістом олеїнової (18:1Д9) і стеаринової (18:0) кислот разом із меншими частками ліноленової і пальмітинової кислот.

Рис. 4. Жирнокислотний склад ліпідів у Cyanophyta, вирощуваних протягом 4-х діб

після додавання D-глюкози. 1 - освітлення, без добавок; 2 - освітлення, + 5 мМ D-глюкоза;

3 - освітлення, + 50 мМ D-глюкоза; 4 - темрява, + 50 мМ D-глюкоза.

Примітки:

1.Для S. platensis 18:3 означає 18:36,9,12, для N. linckia - 18:39,12,15.

2.Результати наведені у вигляді М SD (n = 9).

Найбільш очевидним наслідком дії екзогенної глюкози на жирнокислотний склад ліпідів Cyanophyta при культивуванні на світлі було помітне підвищення відносного вмісту олеїнової кислоти, причому в S. platensis значніший ефект спостерігався під дією 50 мМ глюкози, а в N. linckia - під дією 5 мМ глюкози (див. рис. 4). Істотних змін у відносному вмісті пальмітинової кислоти не спостерігалося, а частки пальмітоолеїнової кислоти в ліпідах Cyanophyta при культивуванні з глюкозою дещо знижувалися відносно контрольних значень. Відносний вміст лінолевої кислоти під впливом 50 мМ глюкози зменшувався в усіх досліджених Cyanophyta, а також у N. linckia - під впливом 5 мМ глюкози. Частки б-ліноленової кислоти в N. linckia знижувалися при культивуванні з 5 мМ глюкозою, але зростали за присутності

50 мМ глюкози. Відносний вміст г-ліноленової кислоти в ліпідах S. platensis при культивуванні з глюкозою змінювався мало.

Як і при фотоміксотрофному рості на глюкозі, відносний вміст олеїнової кислоти в ліпідах Cyanophyta значно зростав при культивуванні в темряві після додавання 50 мМ глюкози (див. рис. 4). У N. linckia це зростання супроводжувалося помітним підвищенням часток насичених жирних кислот - пальмітинової і стеаринової. Зокрема, відносний вміст мінорної стеаринової кислоти в N. linckia 86 зростав у 5,2 рази в порівнянні з фотоавтотрофною культурою - з 2,7 % до 14,0 %. Відповідно, знижувався відносний вміст ненасичених жирних кислот (б-ліноленової, пальмітоолеїнової і лінолевої). Так, частка б-ліноленової кислоти зменшувалася в 2,6 рази (N. linckia 86) та в 1,9 рази (N. linckia 85), а частка пальмітоолеїнової кислоти - у 2,1 рази (N. linckia 85) і в 1,7 рази (N. linckia 86). У S. platensis помітних змін часток більшості жирних кислот не спостерігалося; оскільки олеїнова кислота в цього організму є мінорною, навіть 1,5-разове зростання її відносного вмісту не могло суттєво вплинути на загальний жирнокислотний баланс у ліпідах.

При вирощуванні Cyanophyta на світлі з додаванням 5 мМ D-манози або 5 мМ цитрату натрію зміни жирнокислотного складу, що спостерігалися, були в основному подібними до спричинених екзогенною D-глюкозою (табл. 4). У більшості випадків значно зростав відносний вміст олеїнової кислоти в ліпідах (лише у випадку вирощування N. linckia 86 з цитратом натрію різниця з контрольною культурою була статистично незначущою), а частки пальмітоолеїн...