Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ

УДК 577.21+582.282.23+663.14:663.53

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ДО ВИСОКИХ ТЕМПЕРАТУР ТА ЕТИЛОВОГО СПИРТУ У НЕКОНВЕНЦІЙНИХ ДРІЖДЖІВ

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ІЩУК ОЛЕНА ПЕТРІВНА

Львів 2010

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України, м. Львів

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович, Інститут біології клітини НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Пирог Тетяна Павлівна, Національний університет харчових технологій, завідувач кафедри біотехнології мікробного синтезу

доктор сільськогосподарських наук, професор Захарів Орест Ярославович, Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького, професор кафедри мікробіології та вірусології

Захист відбудеться “ 7 ” квітня 2010 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова 14/16.

Автореферат розіслано “5” березня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Убийвовк В. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Виробництво біопалива, зокрема паливного етанолу, є пріоритетною технологією сьогодення. Загальне використання енергії людством зростає. Викопне паливо є вичерпним, його спалювання викликає погіршення екологічної ситуації. Альтернативним потенційно невичерпним джерелом енергії, використання якого не викликає парниковий ефект, є рослинна біомаса, яка є дешевою і широко розповсюдженою сировиною. Рослинна біомаса складається в основному з лігноцелюлози.

Ферментація лігноцелюлози за участю мікроорганізмів є перспективним способом виробництва етанолу. Проте традиційний промисловий продуцент етанолу Saccharomyces cerevisiae не здатний утилізувати лігноцелюлозу та деякі продукти гідролізу відповідного полімеру. Так, незважаючи на те, що S. cerevisiae ефективно зброджує глюкозу, дикі штами пекарських дріжджів не здатні до ферментації пентози ксилози.

Неконвенційні дріжджі Hansenula polymorpha та Dekkera bruxellensis мають низку переваг у порівнянні з S. cerevisiae в процесі одержання рідкого біопалива. H. polymorpha та D. bruxellensis належать до природних ферментаторів ксилози. Дріжджі H. polymorpha мають значний потенціал для використання у процесі одночасної сахарифікації та ферментації лігноцелюлози, оскільки є термотолерантними мікроорганізмами, максимальна температура росту яких становить 50°С. Дріжджі D. bruxellensis виявляють високу резистентність до етанолу та асимілюють різноманітні джерела вуглецю.

Вивчення механізмів термотолерантності та резистентності до етанолу на моделях H. polymorpha та D. bruxellensis має фундаментальне і прикладне значення. В основному, дослідження механізмів резистентності до етанолу та підвищеної температури у дріжджів проводились на S. cerevisiae. Незважаючи на інформацію про участь в цьому процесі ряду генів, молекулярні механізми відповідної резистентності є недостатньо вивченими. Конструювання штамів H. polymorpha та D. bruxellensis з покращеною стійкістю до високих температур та етанолу є важливим для біопаливної промисловості.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною планових досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАНУ за темою: «Розробка методів генетичної інженерії для етанолотолерантних дріжджів Brettanomyces bruxellensis з метою одержання ефективних алкогольних ферментаторів цукрів рослинної біомаси» (№ держреєстрації 0107U008203, договір №16, 07.2007 - 12.2009). Окремі розділи дисертаційної роботи виконувались в рамках міжнародних грантів: INTAS #05-1000005-7730 «Non-Conventional Yeasts: Metabolic Engineering for development of improved bio-fuel producing strains», FEMS Research Fellowship 2005-2 «The Development of Molecular Biology Tools for Brettanomyces yeast species». Автор дисертаційної роботи є одним із виконавців вищезгаданих досліджень.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи була ідентифікація генів, відповідальних за резистентність до високих температур та етилового спирту у неконвенційних дріжджів H. polymorpha та D. bruxellensis на основі генетичного, біохімічного та молекулярно-біологічного дослідження мутантних штамів цих дріжджів. Відповідно до мети, були заплановані наступні завдання:

1. Дослідити функцію кислої трегалази (Ath1p) у метаболізмі трегалози та термотолерантності H. polymorpha;

2. Сконструювати штами H. polymorpha з підвищеною резистентністю до високої температури за рахунок збільшення вмісту трегалози в клітинах та надекспресії генів білків теплового шоку;

3. За допомогою інсерційного мутагенезу отримати мутанти H. polymorpha, чутливі до високої температури та етилового спирту; ідентифікувати гени, які відповідають за резистентність до етанолу та високих температур у цих дріжджів;

4. Вивчити вплив експресії гену MPR1 S. cerevisiae, що кодує ацетилтрансферазу, на толерантність до етанолу у H. polymorpha;

5. Сконструювати штами H. polymorpha з покращеною високотемпературною ферментацією ксилози за рахунок надекспресії гену PDC1, який кодує піруватдекарбоксилазу;

6. Розробити методи молекулярної генетики для дріжджів D. bruxellensis. метаболізм трегалоза ксилоза штам

Об'єкт дослідження. Об'єктом дослідження даної роботи є закономірності термо- та етанол-резистентності у неконвенційних дріжджів.

Предмет дослідження. Предметом дослідження цієї роботи є гени та відповідні білкові продукти, що залучені у резистентності до високих температур та етилового спирту у дріжджів H. polymorpha та D. bruxellensis.

Наукова новизна роботи. За допомогою інсерційного мутагенезу ідентифіковано новий ген дріжджів H. polymorpha (ETT1), який відповідає за резистентність до етанолу та високих температур. Показано позитивний вплив гетерологічної експресії гену MPR1 S. cerevisiae на резистентність H. polymorpha до етанолу. У результаті проведених досліджень вперше було сконструйовано рекомбінантні штами H. polymorpha, які виявляють підвищену резистентність до високої температури та етилового спирту. Розроблено систему трансформації та репортерну систему для дріжджів D. bruxellensis. Клоновано та проведено аналіз центромерних послідовностей цих дріжджів.

Практичне значення роботи. Сконструйовані у даній роботі рекомбінантні штами дріжджів формують ґрунтовну основу для вивчення різноманітних аспектів резистентності до етанолу та високих температур. Проведені дослідження відкривають шлях до конструювання ефективних продуцентів паливного етанолу в процесі одночасної сахарифікації та ферментації (SSF) лігноцелюлози за умов підвищеної температури.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто вибрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом спільно з науковим керівником розроблено програму проведення досліджень, вибрано методи розв'язання поставлених завдань та самостійно, або в деяких випадках спільно з іншими працівниками, виконано представлені у роботі експерименти. Практично вся експериментальна частина дисертаційної роботи була виконана здобувачем особисто, за винятком деяких експериментів, що проводилися спільно з співробітниками відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України (м. Львів, Україна). Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено з науковим керівником. Результати вищезгаданих досліджень опубліковано у спільних публікаціях. Підготовку публікацій у фахових наукових журналах та збірниках тез конференцій за результатами дисертаційної роботи здобувач здійснював разом із співавторами.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені у вигляді тез та стендових доповідей наступних наукових конференцій: Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), XXV Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах ISSY-25 (Фінляндія, 2006), 2-й з'їзд Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), XXII Міжнародний Конгрес по дріжджах ICY-2008 (Київ, 2008), XXVII Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах ISSY-27 (Париж, Франція, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях та тези 6 доповідей у матеріалах конференцій, наукових з'їздів та конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, розділу, в якому викладено отримані результати та їх обговорення, аналізу й узагальнення результатів, висновків і списку використаних джерел. Дисертаційну роботу викладено на 178 сторінках комп'ютерного набору. Вона містить 70 рисунків та 8 таблиць. Список використаної літератури охоплює 267 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. У роботі використовували штами дріжджів Hansenula polymorpha NCYC495 leu1-1 (Wickerham, 1951), CBS4732s (Lahtchev et al., 2002) та Dekkera bruxellensis CBS2499, CBS2547, CBS2796, CBS4602. Штами дріжджів вирощували при 25 °С (D. bruxellensis) та 37 °С (H. polymorpha) на багатих середовищах YPD (0,5 % дріжджовий екстракт, 1 % пептон, 2 % глюкоза), YPS (0,5 % дріжджовий екстракт, 1 % пептон, 2 % сахароза) чи YPX (1 % дріжджовий екстракт, 1,5 % пептон, 2 % ксилоза) та на стандартному мінімальному середовищі YNB (0,67 % Yeast Nitrogen Base, 2 % глюкоза / 2 % сахароза). Для вирощування ауксотрофних штамів на мінімальному середовищі додавали відповідні фактори росту - лейцин, урацил в концентрації 40-50 мг/л. Агаризовані середовища містили 2 % агар. Методи культивування бактерій E. сoli, ампліфікації та виділення плазмідної ДНК, а також використані молекулярно-генетичні методи описані в Sambrook et al., 1989, із застосуванням модифікацій, згідно з інструкціями виробників ферментів та аналітичних наборів.

У роботі використовували методи класичної та молекулярної генетики, а також біохімічні методи дослідження. Для трансформації H. polymorpha сконструйованими векторами використовували метод електропорації, як описано в Faber et al., 1994. Для аналізу рекомбінантних штамів дріжджів використовували методи ПЛР-аналізу, гібридизації ДНК за Саузерном та вестерн-гібридизації. Визначали активність низки ферментів у безклітинних екстрактах; рівень алкогольної ферментації ксилози та глюкози (Gonchar et al., 2001) та ін. У роботі широко використовували методи комп'ютерного аналізу та комп'ютерні бази даних відомих генів та білків.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження ролі гену ATH1 у термотолерантності та мобілізації трегалози у H. polymorpha

Як було описано раніше, трегалоза важлива для термотолерантності H. polymorpha (Reinders et al., 1999). У цих та інших дріжджів синтез трегалози є одним із елементів відповіді на тепловий шок. Reinders та співавтори показали, що при втраті активності трегалозо-6-фосфатсинтази (першого ферменту синтезу трегалози) клітини H. polymorpha є нездатними до синтезу трегалози і чутливими до теплового шоку. Однак, для H. polymorpha вплив збільшення внутрішньоклітинного рівня трегалози на термотолерантність не досліджувався. Метаболізм трегалози детально вивчено у дріжджів S. cerevisiae, у яких внутрішньоклітинний рівень трегалози підтримується завдяки збалансованій дії ферментів її синтезу та гідролізу (Kim et al., 1996). Два ферменти беруть участь у гідролізі трегалози: кисла трегалаза (кодується геном ATH1) і нейтральна трегалаза (кодується геном NTH1) (Keller et al., 1982; Londesborough and Varimo, 1984). Кисла трегалаза необхідна для росту S. cerevisiae у середовищі з трегалозою як єдиному джерелі вуглецю та енергії (Nwaka et al., 1996). Делеція гену ATH1 у S. cerevisiae має кращий ефект на підвищення рівня внутрішньоклітинної трегалози, ніж делеція гену NTH1 (Kim et al., 1996). Було показано, що Дath1 мутант S. cerevisiae є більш толерантним до висушування, інкубації при низькій температурі, етанольного та осмотичного стресів (Kim et al., 1996; Garre et al., 2009; Parrou et al., 2005). Зниження активності кислої трегалази у S. cerevisiae покращує толерантність до етанолу та підвищує продуктивність алкогольної ферментації (Jung and Park, 2005).

Для визначення ролі гену ATH1 у термотолерантності та мобілізації трегалози у H. polymorpha було вирішено сконструювати штам з делецією відповідного гену. Як реципієнтний штам було вибрано мутант leu2 (NCYC495 leu1-1). Використовуючи плазміду, яка містила комплементуючий ген LEU2 S. cerevisiae, фланкований ділянками гену ATH1 H. polymorpha, було сконструйовано мутант Дath1 H. polymorpha шляхом делеції внутрішньої частини гену ATH1. Як і відповідний мутант S. cerevisiae, мутант Дath1 H. polymorpha не росте на середовищі з трегалозою як єдиному джерелі вуглецю та енергії (рис.1а). У результаті втрати активності кислої трегалази (рис.1б) мутант Дath1 H. polymorpha нагромаджує в 1,5 - 2,3 раза більше трегалози в клітинах, ніж штам дикого типу (NCYC495wt) за умов оптимальної та підвищеної температури (табл.1).

Збільшення внутрішньоклітинного рівня трегалози у H. polymorpha мало позитивний влив на термотолерантність клітин, оскільки було показано, що мутант Дath1 H. polymorpha має в 2 рази підвищену резистентність до теплового шоку (рис.2) і продукує в 6 разів більше етанолу на 2 день ферментації ксилози при температурі 50 °С (рис.3).

Конструювання штамів H. polymorpha з надекспресією білків теплового шоку Hsp16p та Hsp104p

Для перевірки впливу надекспресії генів білків теплового шоку на термотолерантність та високотемпературну ферментацію H. polymorpha, було сконструйовано штами H. polymorpha, які надекспресують гени білків теплового шоку. Для цього було обрано два гени білків теплового шоку H. polymorpha HSP16 та HSP104, що кодують низькомолекулярний білок теплового шоку та ATP-залежний молекулярний шаперон, відповідно.

Таблиця 1

Внутрішньоклітинний вміст трегалози штамів H. polymorpha

Низькомолекулярні білки теплового шоку належать до підродини білків теплового шоку розміру 12 - 43 кДа (Haslbeck et al., 2005), які супресують агрегацію денатурованих білків і сприяють передачі білків до інших шаперонів для відновлення нативної конформації (Han et al., 2004; Haslbeck et al., 1999; Kitagawa et al., 2002; Shearstone and Baneyx, 1999). Було показано, що низькомолекулярний білок теплового шоку Hsp16p S. pombe необхідний для експорту мРНК за умов теплового шоку (Yoshida and Tani, 2005), а ортолог відповідного білка у S. cerevisiae Hsp42p є типовим цитозольним білком теплового шоку, який виконує функцію шаперона за умов нормальної та підвищеної температур (Haslbeck et al., 2004).

Використовуючи програму BLAST, у базі даних H. polymorpha було ідентифіковано ген (ORF122 H. polymorpha) як найближчий гомолог S. pombe HSP16 (36 % ідентичності, 69 % подібності), який кодує низькомолекулярний білок теплового шоку розміром 36,2 кДа. Відповідна відкрита рамка трансляції H. polymorpha була позначена як HSP16.

Білок Hsp104p належить до AAA⁺ підродини білків теплового шоку, які беруть участь у структурних перебудовах білків та білкових комплексів (Cashikar et al., 2005). Білок теплового шоку Hsp104p S. cerevisiae розчиняє агрегати хімічно або температурно денатурованих білків, використовуючи енергію АTP і систему кошаперонів Hsp70р/Hsp40р (Weibezahn et al., 2004). Експресія Hsp104p S. cerevisiae є незначною за нормальної температури і значно зростає при підвищенні температури (Lindquist and Kim, 1996). Білок теплового шоку Hsp104p відіграє одну з ключових ролей у виживанні клітин дріжджів за умов екстремальних температур (Parsell and Lindquist, 1993), і його експресія забезпечує термотолерантність клітин S. cerevisiae (Lindquist and Kim, 1996). Hsp104p є консервативним білком. Амінокислотна послідовність Hsp104p H. polymorpha виявляє 64 % гомології до Hsp104p S. cerevisiae. Guerra та співавтори показали, що експресія Hsp104p H. polymorpha так само, як і для S. cerevisiae, індукується підвищенням температури (Guerra et al., 2005).

Ідентифіковані в геномі H. polymorpha гени білків теплового шоку HSP16 та HSP104 було клоновано на експресійні плазміди під контролем сильного конститутивного промотора H. рolymorpha GAPDH. Сконструйовано рекомбінантні штами H. рolymorpha, які містять відповідні експресійні плазміди, інтегровані в геном. У цих трансформантів було показано високий конститутивний рівень експресії Hsp16p та Hsp104p за умов оптимальної (37 °С) та підвищеної температури (49, 50 °С) (рис. 4).

Відповідь на тепловий шок - це короткотривала захисна відповідь клітини, яка дозволяє клітині витримувати тимчасове підвищення температури за рахунок індукції експресії генів білків теплового шоку. За умов тривалої дії сублетальних температур синтез білків теплового шоку припиняється. У даній роботі дослідження резистентності сконструйованих штамів H. рolymorpha до теплового шоку виявили, що резистентність H. рolymorpha до короткотривалої дії високої температури можна суттєво покращити за рахунок надекспресії генів білків теплового шоку (HSP16 і HSP104). Трансформанти, які містять експресійні плазміди HSP16 і HSP104, характеризувались підвищенням рівня виживання за умов теплового шоку в 2 і 10 разів відповідно (рис.2). Синергічний ефект комбінування надекспресії Hsp104p і Hsp16p проявлявся у 12-кратному зростанні рівня виживання за умов теплового шоку (рис.2). Незважаючи на ці дані, залишалось відкритим питання про те, чи конститутивна експресія білків теплового шоку (під котролем промотора GAPDH) може покращити толерантність H. рolymorpha не лише до короткочасної температурної обробки (за умов шоку), а і до тривалої дії високої температури.

Дослідження високотемпературної ферментації ксилози показало, що штами H. рolymorpha, які надекспресують гени білків теплового шоку та мутант Дath1 характеризуються покращеними параметрами алкогольної ферментації, зокрема ці штами продукують в 3-6 разів більші кількості етанолу при максимальній для H. рolymorpha температурі 50 °С (рис.3). При нижчих температурах (37, 48 °С) рівень продукції етанолу у трансформантів HSP та мутанта Дath1 був на рівні контрольного штаму (рис.3). Оскільки 50 °С є максимальною температурою, яку толерує H. рolymorpha, і при даній температурі ріст є суттєво пригнічений, ми припускаємо, що за даних умов значна частина білків клітини денатурує. Це припущення дозволяє пояснити позитивний ефект надекспресії генів HSP та збільшення внутрішньоклітинного рівня трегалози при ферментації ксилози при температурі 50 °С.

Ідентифікація генів H. рolymorpha, відповідальних за резистентність до етилового спирту

Для клонування генів H. рolymorpha, які відповідають за резистентность до етилового спирту, було використано інсерційний мутагенез. На першому етапі було отримано колекцію трансформантів інсерційною касетою, які відбирали за відновленням прототрофності реципієнтного штаму H. рolymorpha NCYC495 leu1-1. Далі перевіряли чутливість інсерційних трансформантів до стресових концентрацій етанолу (7-8 %). Таким чином було виявлено один інсерційний мутант H. рolymorpha (7Е), який виявився нездатним до росту на середовищі з 7 % етанолом і був в 300-500 разів більш чутливим до екзогенного етанолу, ніж реципієнтний штам (рис.5). Введена мутація не пошкоджує шлях утилізації етанолу, а лише механізми резистентності до його стресових концентрацій, оскільки мутант 7Е росте на середовищі з етанолом, як єдиному джерелі вуглецю та енергії.

Аналіз послідовності ДНК геномної ділянки, яка фланкує інсерційну касету у мутанта 7Е, виявив, що касета при інтеграції у геном розбила відкриту рамку трансляції №448, що виявляє 39 % гомології до гену MPE1 S. cerevisiae. Ген MPE1 S. cerevisiae кодує життєво необхідний білок, який є компонентом фактору розщеплення і поліаденілювання мРНК, необхідного для дозрівання мРНК. На відміну від S. cerevisiae, MPE1 H. polymorpha не є необхідним для життєдіяльності, а відповідає за резистентність до етанолу. Тому цьому гену H. polymorpha нами було дано нову назву: ETT1 (ethanol tolerance - толерантність до етанолу), а мутант 7Е відповідно було позначено ett1. MPE1 S. cerevisiae не комплементує мутацію ett1 H. polymorpha, однак часткову комплементацію забезпечує ген MPE1 дріжджів P. stipitis (рис.6). Як і H. polymorpha, дріжджі P. stipitis здатні ферментувати ксилозу. Отримані дані вказують на те, що Mpe1p P. stipitis, так само як Ett1p H. polymorpha, відповідає за резистентність до етанолу, а Mpe1p S. cerevisiae очевидно не виконує такої функції. Було виявлено, що амінокислотні послідовності генів MPE1 S. cerevisiae, ETT1 H. polymorpha та MPE1 P. stipitis містять спільні консервативні домени: убіквітин-подібний DWNN-домен та мотив цинкового пальця. Відмінності було виявлено при детальному аналізі DWNN-доменів білків S. cerevisiae, P. stipitis та H. polymorpha. За амінокислотною послідовністю DWNN-домен виявляє гомологію до убіквітину і може бути задіяним у процесі ковалентної модифікації білків убіквітином (Pugh et al., 2006). Відомо, що убіквітин містить консервативні амінокислотні залишки лізину (K), які є сайтами приєднання додаткових молекул убіквітину, що сприяє формуванню полі-убіквітинових ланцюгів (Weissman, 2001). Ланцюги убіквітину, які зв'язані через K48, K11 і K29, розпізнаються 26S-протеасомою, і відбувається деградація модифікованого убіквітином білка. Ланцюги, які зв'язані через залишки K6 і K63, беруть участь у чисельних непротеолітичних процесах, наприклад, у відповіді на стрес, репарації ДНК та ендоцитозі (Passmore and Barford, 2004). Убіквітин містить також два консервативні залишки гліцину (мотив GG) на С-кінці молекули. Мотив GG є сайтом розпізнавання протеази, яка розщеплює зв'язок між залишками гліцину та запускає процес кон'югації убіквітину (Pugh et al., 2006). Порівняння амінокислотної послідовності убіквітину з DWNN-доменами Mpe1p S. cerevisiae, P. stipitis та Ett1p H. polymorpha виявило відмінності у консервативних залишках амінокислот, які характерні для убіквітину (рис.7). Домен DWNN Ett1p H. polymorpha містить мотив GG та K6, у P. stipitis наявний лише K6, а у S. cerevisiae відповідних консервативних залишків убіквітину не було виявлено (рис.7). Ці дані можуть пояснити, чому мутацію ett1 H. polymorpha частково комплементує ген MPE1 P. stipitis, а не відповідний ген S. cerevisiae.

Крім цього, було показано, що, напротивагу MPE1 S. cerevisiae, ETT1 H. polymorpha не бере участі у процесингу 3'-кінців мРНК. Як модельний пре-мРНК транскрипт обрано мРНК гену CYC1 H. polymorpha, яку синтезували in vitro. Розщеплення мРНК гену CYC1 H. polymorpha досліджували in vivo (в екстрактах штамів NCYC495wt та ett1) та in vitro (використовуючи частково очищений за допомогою метало-хелатної хроматографії препарат Ett1p H. polymorpha). Виявлено, що білок Ett1p H. polymorpha не розщеплює пре-мРНК, оскільки в реакційній суміші для розщеплення пре-мРНК, яка містить препарат Ett1p, мРНК гену CYC1 залишається інтактною, а безклітинний екстракт мутанта ett1 розщеплює відповідний транскрипт (рис. 8).

З метою вивчення впливу експресії ETT1 на толерантність H. polymorpha до етилового спирту, було сконструювано штам, який надекспресує відповідний ген. Використовуючи плазміду, яка забезпечує мультикопійну інтеграцію, було отримано трансформант (ETT1-10), який містить приблизно 6-7 копій MPE1 H. polymorpha. Надекспресія гену ETT1 суттєво покращує резистентність H. polymorpha до етанолу, оскільки трансформант ETT1-10 характеризується покращеним ростом на середовищі з етанолом (на агаризованому середовищі резистентність підвищена в 10 разів, а в рідкому в 3,4 раза) (рис. 9).

Експресію гену ETT1 H. polymorpha досліджували за допомогою Вестерн-гібридизації. Для цього попередньо було сконструйовано гібридний білок Ett1p H. polymorpha, який злитий С-кінцем з зеленим флуоресцентним білком (GFP). Використовуючи поліклональні анти-GFP антитіла, було показано, що експресія ETT1 H. polymorpha регулюється етанолом (рис.10). Показано наявність повнорозмірного гібридного білка Ett1-GFP величиною 70 кДа у клітинах H. polymorpha, вирощених на середовищі з

7 % етанолом, на середовищі без етанолу відповідного гібридного білка не спостерігали, натомість з'являвся білок меншої молекулярної маси, що може свідчити про деградацію або протеоліз гібридного білка без індукції етанолом (рис.10).

У даній роботі було показано, що ETT1 H. polymorpha відповідає за резистентність до різних форм стресу. Крім резистентності до етанолу, трансформант H. polymorpha, який надеспресує ETT1, характеризується підвищеною резистентністю до денатуруючого агенту AZC, теплового шоку та має покращену кінетику росту при підвищених температурах 49 і 50 °С (рис.11). Мутант ett1 не був здатним до росту при підвищеній температурі взагалі і має суттєво знижений рівень алкогольної ферментації ксилози, продукція етанолу даним штамом при ферментації ксилози є дуже низькою (рис.11).

Було показано, що Ett1p H. polymorpha бере участь у підтриманні цілісності клітинної стінки, оскільки мутант ett1 має дефект у рості на середовищі з SDS, а штам ETT1-10 характеризується покращеним ростом. Температура, етанол, AZC та SDS викликають денатурацію білків. Наші дані показують, що експресія ETT1 H. polymorpha важлива за умов денатурації білків. Отже, надекспресія гену ETT1 у H. polymorpha впливає на відповідь клітини на стрес, оскільки мультикопійний трансформант ETT1-10 характеризується підвищеною резистентністю до ряду стресових факторів (рис.11). Це додатково підтверджують дані ростових характеристик штамів H. polymorpha на середовищі з рапаміцином. Було показано, що трансформант H. polymorpha ETT1-10 має дещо підвищену резистентність до рапаміцину (рис.12).

Відомо, що рапаміцин інгібує протеїнкіназу TOR (target of rapamycin), яка бере участь у відповіді клітини на голодування. За умов вичерпання поживних речовин сигнальні шляхи протеїнкінази TOR та протеїнкінази А кооперативно блокують клітинний цикл і активують відповідь клітини на стрес (Hohmann and Mager, 2003; Cardona et al., 2009). У S. cerevisiae процес убіквітинування впливає на відповідь клітини на голодування (Cardona et al., 2009). Отримані дані дозволяють зробити припущення, що ETT1 H. polymorpha, ймовірно, бере участь у убіквітинуванні.

Експресія гену MPR1 S. cerevisiae у H. polymorpha

Крім денатурації білків та зміни текучості плазматичної мембрани, етанол підвищує рівень утворення вільних радикалів кисню (Costa et al., 1997). У S. cerevisiae було ідентифіковано ген ацетилтрансферази (MPR1), яка бере участь у захисті клітини від вільних радикалів кисню за умов етанольного стресу (Du and Takagi, 2007; Nomura and Takagi, 2004). Було вирішено з'ясувати, чи експресія гетерологічного гену MPR1 S. cerevisiae може покращити толерантність до етанолу у H. polymorpha, оскільки у H. polymorpha не було виявлено генів гомологічних до ацетилтрансферази S. cerevisiae. Ген MPR1 було клоновано з геномної ДНК штаму S. cerevisiae У1278b на експресійний вектор H. polymorpha під контроль сильного конститутивного промотора GAPDH.

Усі MPR1-трансформанти H. polymorpha, які експресували MPR1 S. cerevisiae, були більш резистентними до AZC та етанолу в порівнянні з реципієнтним штамом (рис.13). Рівень резистентності виявляв кореляцію з кількістю копій плазміди в геномі трансформантів. Так, трансформант з 3 копіями гену MPR1 S. cerevisiae мав вищий рівень резистентності в порівнянні з однокопійними інтегрантами (рис.13). Отже, резистентність H. polymorpha до етилового спирту може бути покращена за рахунок надекспресії гетерологічного гену ацетилтрансферази.

Конструювання штамів H. polymorpha з покращеною високотемпературною ферментацією ксилози за рахунок надекспресії гену PDC1

Один із підходів покращеня високотемпературної ферментації ксилози полягав у конструюванні штамів H. polymorpha, які надекспресують ген PDC1, який кодує піруватдекарбоксилазу. Піруватдекарбоксилаза є ключовим ферментом алкогольної ферментації і каталізує перетворення пірувату до оцтового альдегіду та диокису вуглецю. У дріжджів S. cerevisiae метаболізм оцтового альдегіду залежить від доступу кисню. Піруват окислюється до ацетил-СоА за участю ферментів піруватдегідрогеназного комплексу (Pronk et al., 1996) або відновлюється до етанолу за участю ферментів піруват- декарбоксилази і алкогольдегідрогенази. У дріжджів S. cerevisiae ферментація може здійснюватись за аеробних умов (De Deken, 1996), що створює конкуренцію за піруват між піруватдекарбоксилазою та піруватдегідрогеназою. Спроби надекспресії піруватдекарбоксилази у S. cerevisiae не покращували вихід етанолу з глюкози. На відміну від S. cerevisiae, H. polymorpha належить до Кребтрі-негативних дріжджів (Verduyn et al., 1992). Максимальна продукція етанолу у H. polymorpha відбувається за умов обмеженої аерації (Ryabova et al., 2003; Voronovsky et al., 2005). За цих умов збільшення активності піруватдекарбоксилази може бути важливим у розподілі пірувату між піруватдегідрогеназним комплексом та піруватдекарбоксилазою. Для підтвердження даної гіпотези ми вирішили клонувати та надекспресувати в H. polymorpha структурний ген піруватдекарбоксилази (PDC1) і дослідити ефект надекспресії відповідного гену на продукцію етанолу за умов підвищеної температури. Надекспресія PDC1 призводила до підвищеної активності піруватдекарбоксилази та підвищення рівня продукції етанолу з глюкози та ксилози за умов опримальної (37 °С) та підвищеної температури (48 °С). Мультикопійна інтеграція PDC1 у геном H. polymorpha призводила до 20-кратного зростання активності піруватдекарбоксилази з підвищенням продуктивності утворення етанолу в 3 рази під час ферментації ксилози при температурі 48 °С (рис.14).

Розробка методів генної інженерії для дріжджів D. bruxellensis

Дріжджі D. bruxellensis володіють високою природною резистентністю до етанолу та утилізують низку альтернативних джерел вуглецю. Однак, незважаючи на високий потенціал використання у виробництві паливного етанолу, не існує методів генної інженерії для цих неконвенційних дріжджів. Це ускладнює процес створення покращених штамів-продуцентів етанолу на основі D. bruxellensis та не дає можливості клонувати гени D. bruxellensis, які відповідають за високу резистентність до етанолу. Тому одним із завдань даної роботи була розробка методів генної інженерії для D. bruxellensis.

Зокрема, нами було розроблено інтегративну систему трансформації для D. bruxellensis. Серед колекції урацилозалежних мутантів за ознакою комплементації було ідентифіковано ura3 та ura5 мутанти. Для трансформації використовували плазмідні вектори, які містять гени URA3 D. bruxellensis та URA5 S. cerevisiae, а також ген стійкості до генетицину (APH). Успішним виявився метод електротрансформації клітин, оброблених ацетатом літію. Наявність плазміди в геномі трансформантів було підтверджено за допомогою ПЛР аналізу. Було показано, що оптична густина культури є критичною для успішної трансформації D. bruxellensis. Так, частота трансформації для культури з оптичною густиною 0,8 і 0,2 (OD₆₀₀) була, відповідно, в 5 і 40 разів вища у порівнянні з оптичною густиною 1,6 (рис.15).

Ефективну трансформацію забезпечують плазмідні вектори, які містять ARS/CEN-послідовності. Такі плазміди підтримуються в трансформантів автономно і не інтегрують в геном. Проте, плазміди, що містять ARS у своєму складі, не успадковуються з високою частотою до дочірних клітин і втрачаються при культивуванні в неселективних умовах. CEN-елементи (центромерні послідовності) забезпечують стабільне успадкування однієї - двох копій автономних плазмід і не втрачаються за неселективних умов. З метою розробки ефективної трансформації на основі реплікативних векторів для дріжджів D. bruxellensis було вирішено клонувати CEN-елементи D. bruxellensis. Для цього сконструйовано банк генів D. bruxellensis на основі вектора, який містить ген URA3 D. bruxellensis. Оскільки було невідомо, який розмір мають центромерні послідовності D. bruxellensis, для конструювання банку генів вибрали випадкові геномні фрагменти величиною 0,5 -10 т.п.н. Банк генів використовували для трансформації мутанта ura3, селекцію трансформантів проводили за прототроф- ністю за урацилом. Отримані трансформанти аналізували на наявність автономних плазмід. Таким чином було виділено з банку генів плазміди трьох класів, які містять спільні послідовності ДНК (позначені Мотив 1, 2, 3). Автономний статус даних плазмід у трансформантів D. bruxellensis було підтверджено через ретрансформацію ДНК трансформантів у бактерії а також за допомогою гібридизації за Саузерном. Аналіз послідовності ДНК ідентифікованих Мотивів 1, 2, 3 показав наявність послідовностей, які характерні для центромери S. cerevisiae: CDEI- і CDEIII-елементів. За допомогою гібридизації за Саузерном було показано, що ідентифіковані Мотиви 1-3 гібридизуються до різних хромосом D. bruxellensis, використовуючи всі 3 Мотиви як гібридизаційні зонди, було марковано всі хромосоми каріотипів різних штамів D. bruxellensis (рис.16). Гібридизаційні сигнали жодного з Мотивів 1-3 не перекривались на одній хромосомі, що свідчить про унікальну послідовність центромери для кожної хромосоми D. bruxellensis (рис.16).

Для перевірки активності промоторів D. bruxellensis було розроблено репортерну систему на основі гену LAC4 Kluyveromyces lactis, використовуючи схожі підходи, які були попередньо розроблені нами для дріжджів Candida famata. Ген LAC4 K. lactis успішно експресували в системі D. bruxellensis під контролем промотора гену цитозольного рибосомального білка YPR100W D. bruxellensis.

ВИСНОВКИ

У результаті виконання дисертаційної роботи було ідентифіковано гени, які забезпечують резистентність до високих температур та етилового спирту у дріжджів Hansenula polymorpha і сконструйовано поліпшені продуценти біопаливного етанолу з ксилози. З метою ідентифікації генів, які забезпечують високу резистентність до етанолу у Dekkera bruxellensis, було розроблено базові молекулярні методи для цього виду дріжджів. Головні наукові та практичні результати роботи представлені у викладених нижче висновках:

1. Показано роль кислої трегалази (Ath1p) та білків теплового шоку (Hsp104p, Hsp16p) у резистентності дріжджів H. polymorpha до високих температур.

2. Сконструйовано штами H. polymorpha з підвищеною резистентністю до високої температури за рахунок збільшення вмісту трегалози та надекспресії генів білків теплового шоку. Показано, що відповідні штами є більш резистентними до теплового шоку, мають покращений ріст та ферментацію ксилози при підвищеній температурі 50 °С.

3. Ідентифіковано новий ген ETT1 H. polymorpha, який відповідає за резистентність до етанолу та високих температур.

4. Сконструювано штами H. polymorpha з підвищеною резистентністю до етанолу за рахунок надекспресії генів ETT1 H. polymorpha або MPR1 S. cerevisiae, що кодує ацетилтрансферазу.

5. За допомогою надекспресії гену PDC1, що кодує піруватдекарбоксилазу, було створено штами H. polymorpha з покращеною високотемпературною ферментацією ксилози.

6. Розроблено методи генетичної інженерії для D. bruxellensis: створено інтегративну систему трансформації, клоновано центромерну ділянку та розроблено репортерну систему на основі гену LAC4 K. lactis, що кодує в-галактозидазу.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Development of a promoter assay system for the flavinogenic yeast Candida famata based on the Kluyveromyces lactis Я-galactosidase LAC4 reporter gene / O.P. Ishchuk, K.V. Dmytruk, O.V. Rohulya [et al.] // Enzyme and Microb Technol. 2008. Vol. 42 (3). P. 208-215. (Дисертант провів дослідження, проаналізував та систематизував отримані результати, взяв участь в обробці джерел літератури, підготовці та написанні статті).

2. Overexpression of pyruvate decarboxylase in the yeast Hansenula polymorpha results in increased ethanol yield in high-temperature fermentation of xylose / O.P. Ishchuk, A.Y. Voronovsky, O.V. Stasyk [et al.] // FEMS Yeast Res. 2008. Vol. 8 (7). P. 1167-1174. (Дисертант провів дослідження, проаналізував та узагальнив літературні джерела, провів аналіз даних, написав та оформив статтю).

3. Construction of Hansenula polymorpha strains with improved thermotolerance / O.P. Ishchuk, A.Y. Voronovsky, C.A. Abbas, A.A. Sibirny // Biotechnol Bioeng. 2009. Vol. 104(5). P. 911-919. (Дисертант провів дослідження, аналіз та статистичну обробку результатів, проаналізував та узагальнив літературні джерела, написав та оформив статтю).

4. Ishchuk O.P. Heterologous expression of Saccharomyces cerevisiae MPR1 gene confers tolerance to ethanol and L-azetidine-2-carboxylic acid in Hansenula polymorpha / O.P. Ishchuk, C.A. Abbas, A.A. Sibirny // J Ind Microbiol Biotechnol. 2010. Vol. 37(2). P. 213-218. (Дисертант провів дослідження, проаналізував та узагальнив джерела літератури, експериментальні дані, взяв участь у написанні та оформленні статті).

5. Development of Kluyveromyces lactis LAC4 as reporter gene for Candida famata / O. Ishchuk, K. Dmytruk, B. Kshanovska [et al.] // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Lviv, 25-28 April 2004. Lviv, Ukraine, 2004. P. 102.

6. Metabolic engineering of Hansenula polymorpha for high temperature alcoholic fermentation of xylose / A.A. Sibirny, C.A. Abbas, O.B. Ryabova, O.P. Ishchuk, O.V. Verba, K.V. Dmytruk, Y.I. Demyanchuk, K.Y. Kapustyak, O.V. Stasyk, A.Y. Voronovsky // 25^nd International Specialised Symposium on Yeasts, Hanasaari, Espo, Finland, 18-21 June 2006. Hanasaari, Espo, Finland, 2006 - P. 147.

7. Construction of xylose utilizing Hansenula polymorpha strains resistant to high temperature and ethanol / O.P. Ishchuk, A.Y. Voronovsky, C.A. Abbas, A.A. Sibirny // 2^nd Ukrainian Congress for Cell Biology, Kyiv, 23-26 October 2007. Kyiv, Ukraine, 2007. P. 18.

8. Metabolic engineering for improvement of xylose conversion to ethanol in xylose utilizing yeasts Hansenula polymorpha and Pichia stipitis / A.Y. Voronovsky, K.V. Dmytruk, O.P. Ishchuk [et al.] // 12^th International Congress on Yeasts, Kyiv,11-15 August 2008. Kyiv, Ukraine, 2008. P. 278.

9. Construction of Hansenula polymorpha strains with improved fermentation of xylose at high temperatures / O.P. Ishchuk, A.Y. Voronovsky, C.A. Abbas, A.A.Sibirny // 12^th International Congress on Yeasts, Kyiv,11-15 August 2008. Kyiv, Ukraine, 2008. P. 199.

10. Identification of a novel gene conferring tolerance to ethanol and high temperature for the yeast Hansenula polymorpha / O. Ishchuk, A. Voronovsky, C. Abbas, A. Sibirny // 27^th International Specialised Symposium on Yeasts, Pasteur's legacy, Yeast for health and biotechnologies, Paris, 26-29 August 2009. Paris, France, 2009. P. 176.

АНОТАЦІЯ

Іщук О.П. Молекулярні механізми резистентності до високих температур та етилового спирту у неконвенційних дріжджів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2010.

Дисертація присвячена ідентифікації генів, відповідальних за резистентність до високих температур та етилового спирту у неконвенційних дріжджів Hansenula polymorpha та Dekkera bruxellensis. Показано роль кислої трегалази (Ath1p) та білків теплового шоку (Hsp104p, Hsp16p) у термотолерантності H. polymorpha. Ідентифіковано новий ген H. polymorpha (ETT1), який відповідає за резистентність до етанолу та високих температур. Трансформанти H. polymorpha, які надекспресують ETT1, мають в 3-10 разів підвищену резистентність до етанолу, денатуруючого агенту (AZC) та теплового шоку. Показано позитивний вплив гетерологічної експресії гену ацетилтрансферази MPR1 S. cerevisiae на резистентність H. polymorpha до етанолу. Трансформант, який містить 3 копії гену MPR1, характеризується в 10 разів підвищеною резистентністю до етанолу. Показано, що надекспресія гену PDC1, який кодує піруватдекарбоксилазу, у H. polymorpha може бути використаним для конструювання покращених продуцентів етанолу за умов підвищених температур, оскільки PDC1-трансформанти продукують втричі більше етанолу. Розроблено методи генної інженерії для D. bruxellensis: систему трансформації на основі векторів, які містять ауксотрофні (URA3 та URA5) та домінантний (APH) маркери, репортерну систему на основі гену LAC4 Kluyveromyces lactis. Клоновано та проведено аналіз центромерних послідовностей D. bruxellensis.