Молекулярно-біологічні властивості та фізико-хімічна характеристика іридовірусу комара aedes flavescens

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 578.84

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Молекулярно-біологічні властивості та фізико-хімічна характеристика іридовірусу комара aedes flavescens

03.00.06 - вірусологія

Рудь Юрій Петрович

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології Навчально-наукового центру “Інститут біології” Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бучацький Леонід Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник НДЛ фізико-хімічної біології Навчально-наукового центру “Інститут біології”.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних вірусів;

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Клестова Зінаїда Сергіївна, Інститут ветеринарної медицини НААН України, вчений секретар, зав. відділу координації та організації науково-дослідних робіт з сектором економічної оцінки наукових розробок.

Захист дисертації відбудеться 25.01.2011 р. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр. Глушкова 2, корпус 12, навчально-науковий центр “Інститут біології”, ауд. 434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради B.В. Джаган.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Кровосисні комарі є багаточисленним та поширеним компонентом гнусу. У місцях масового розмноження вони завдають значної шкоди народному господарству, знижуючи продуктивність праці людей та сільськогосподарських тварин. Разом з іншими членистоногими, кровосисні комарі є специфічними і механічними переносниками збудників вірусних, протозойних, бактеріальних і гельмінтозних захворювань людини і тварин. Дані для комарів родини Culicidae фауни України свідчать про них як про фактичних і потенційних переносників таких патогенів, як арбовіруси та збудника туляремії - Francisella tularensis. Найбільш масовими являються комарі родів Aedes, Anopheles, Culex і Culiseta.

Хоч застосування хімічних інсектицидів поки що є основним методом боротьби зі шкідливими комахами, у тому числі й комарами, все більше уваги приділяється екологічно безпечним методам і біологічним інсектицидам зокрема. Тому важливим завданням є пошук та всебічне вивчення нових патогенів комарів [Бучацький, 1981; Becnel, 2007]. За останні 10-15 років було виділено велику кількість нових іридовірусів, у тому числi й від комарів [Ahne et al., 1997; Webby et al., 1998; Hyatt et al., 1999; Chinchar et al., 2002; Sudthongkong et al., 2002; Williams, 2008]. Багато іридовірусів комарів, про яких є повідомлення в літературі, поки що не класифіковані і вважаються емерджентними. Для класифікації цих вірусів необхідно більше інформації щодо біологічних властивостей нових ізолятів, їхніх відмінностей від іридовірусів інших пойкілотермних тварин, які, як і личинки комарів, мешкають у воді. Тому в даний час у багатьох вірусологічних лабораторіях світу проводять ідентифікацію цих вірусів, яка стосується вивчення фізико-хімічних властивостей віріонів, аналіз послідовностей їхніх ДНК та розробку діагностикумів [Tidona et al., 1998; Wang et al., 2003; Essbauer et al., 2004; Coupar et al., 2005; Kitamura et al., 2006; Xu et al., 2008; Zhao et al., 2009; Gong et al., 2010].

Іридовіруси відіграють значну роль в інфекційній патології тварин [Бучацкий, 1990; Williams, 1998; Jakob et al., 2002]. Тому актуальним залишається вивчення екології іридовірусів комах з метою встановлення зв'язків між цими вірусами та широким колом їхніх хазяїв. Не дивлячись на те, що більшість іридовірусів комах мають високу видову специфічність, використання їх для боротьби зі шкідливими комахами не можливе через відсутність даних з безпеки для корисних людині тварин, даних про популяційну генетику й інші важливі біологічні властивості.

Вивчення властивостей віріонів іридовірусів комарів, їхньої інфекційності і патогенності дасть змогу оцінити потенціал розповсюдження цих вірусів серед різних видів хазяїв. Інформація про властивості іридовірусів комарів потрібна для їх практичного застосування у боротьбі зі шкідливими комахами та для досконалої класифікації. Вивчення послідовностей ДНК іридовірусів комарів дозволить скласти цілісне уявлення про ступінь еволюційної спорідненості представників родини Iridoviridae і зокрема роду Chloriridovirus, до якого належить лише один представник, виділений з комарів Aеdes taeniorhynchus.

Робота присвячена дослідженню молекулярно-біологічних та фізико-хімічних властивостей іридовірусу, виділеного нами з личинок комара Aedes flavescens, виловлених у природних водоймах Київської області.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України” (2006-2010 рр., номер держреєстрації: 0106U005749). Науковий керівник теми - д.б.н., проф. Поліщук В.П.

Мета і завдання дослідження: Метою даної роботи було встановити таксономічне положення іридовірусу, виділеного з личинок кровосисних комарів A. flavescens, дослідивши його молекулярно-біологічні та фізико-хімічні властивості.

У відповідності з поставленою метою досліджень вирішувались такі завдання:

1. Виділити іридовірус комара та підібрати чутливу модельну систему для його культивування.

2. Оцінити вплив фізико-хімічних факторів на іридовірус комара A. flavescens та дослідити його молекулярно-біологічні властивості.

3. Розробити метод експрес-діагностики іридовірусу комара A. Flavescens за допомогою ПЛР.

4. Визначити інфекційність досліджуваного вірусу для пойкілотермних тварин, що мешкають у воді.

Об'єкт дослідження - іридовірус, виділений з личинок кровосисних комарів A. flavescens.

Предмет дослідження - фізико-хімічні та молекулярно-біологічні властивості іридовірусу комара A. flavescens.

Для досягнення поставленої мети були застосовані такі методи досліджень:

1)метод культивування іридовірусу комара на личинках великої вощиної молі Galleria mellonella та перещеплюваній культурі клітин комарів Aedes aegypti Mos 20A; 2) метод очистки іридовірусу комара диференційним центрифугуванням; 3) методи визначення впливу фізико-хімічних факторів на іридовірус комара; 4) методи дослідження білків та ДНК іридовірусу комара 5) метод полімеразної ланцюгової реакції; 6) метод біопроби; 7) статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів.

* Ізольовано іридовірус личинок кровосисних комарів A. flavescens з природних водойм Київської області та охарактеризовано його фізико-хімічні та молекулярно-біологічні властивості;

* Проведено дослідження нуклеотидної послідовності фрагменту ДНК іридовірусу комара A. flavescens;

* Вперше розроблено високочутливий метод ПЛР-діагностики іридовірусу комара, що дозволяє діагностувати вірус при сублетальному перебігу захворювання;

* На моделі іридовірус комара A. flavescens - личинки великої вощиної молі G. mellonella вперше досліджено взаємодію фулеренів С₆₀ і віріонів іридовірусу комара, а також противірусні властивості нових синтетичних сполук та відібрано речовину, що має антивірусну активність проти іридовірусу комара.

Практичне значення одержаних результатів.

* Дані, отримані в результаті дослідження властивостей іридовірусу комара A. flavescens, можуть бути використані при вивченні ролі компонентів вірусної оболонки в процесі взаємодії з клітиною та бути підставою для обґрунтування різного ступіня чутливості іридовірусів хребетних та безхребетних до фізико-хімічних факторів навколишнього середовища.

* Розроблений метод швидкої діагностики іридовірусу комара можна рекомендувати для широкого застосування при проведенні моніторингу вірусу в навколишньому середовищі.

* Послідовність фрагменту ДНК іридовірусу комара A. flavescens допоможе скласти цілісне уявлення про ступінь еволюційної спорідненості родини Iridoviridae та роду Chloriridovirus зокрема.

* Результати дослідження взаємодії фулеренів С₆₀ та нових синтетичних сполук з іридовірусом комара можуть бути використані при створенні нових антивірусних препаратів.

* Основні положення даної роботи можуть бути використані при викладанні спеціальних курсів з екології вірусів на біологічних та агроекологічних факультетах вищих навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно здійснював підбір теоретичного матеріалу. Побудову схеми експериментів та формування ідеї роботи здійснено спільно з науковим керівником д.б.н., проф. Бучацьким Л.П. Автором власноруч здійснено більшість експериментів з вивчення фізико-хімічних та молекулярно-біологічних властивостей іридовірусу комара, розроблено метод діагностики вірусу в навколишньому середовищі, статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів дослідження. Деякі експерименти були здійснені автором спільно з д.б.н., проф. Прилуцьким Ю.І., к.б.н. Філенко О.М. та к.х.н. Воловненко Т.А. Визначення видової приналежності комара A. flavescens здійснено за участі проф. П.Я. Кілочицького.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені та обговорені на ХІІ з`їзді товариства мікробіологів України імені С.В. Виноградського (Ужгород, 2009), міжнародній конференції “Біологічні основи управління водними біоресурсами” (Київ, 2009), International Conference “Physics of Liquid Matter: Modern Problems” (Kyiv, 2010), Ukrainian-German symposium on physics and chemistry of nanostructures and on nanobiotechnology (Beregove, 2010), VІ міжнародній науковій конференції “Біоресурси і віруси” (Київ, 2010), міжнародній науково-практичній конференції „Сучасні системи біобезпеки та біозахисту в ветеринарній медицині” (Феодосія, 2010).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 11 наукових праць, в тому числі 6 статей у фахових виданнях, 4 тез доповідей та одержано 1 патент на корисну модель.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 131 сторінці машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення, узагальнення), висновків, списку використаних джерел, що містить 235 джерел, з них 214 - закордонних авторів. Робота ілюстрована 15 таблицями і 18 рисунками.

Основний зміст

Огляд літератури. Огляд літератури складається із шести підрозділів, в яких наведені сучасні дані про фізико-хімічні та молекулярно-біологічні властивості іридовірусів, їх поширення у світі та значення в епізоотології комах та пойкілотермних хребетних тварин. Висвітлено питання таксономічного положення великої кількості некласифікованих хлоріридовірусів комарів.

Огляд літератури обґрунтовує доцільність виконання роботи.

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом при дослідженні був іридовірус, виділений з личинок кровосисних комарів Aеdes flavescens, личинки великої вощинної молі Galleria mellonella, перещеплювальна культура клітин A. aegypti Mos 20A, короп Cyprinus carpio, чебачок Pseudorasbora parva, в'юн Misgurnus fossilis, даніо Danio rerio, а також нові синтетичні сполуки та фулерени С₆₀.

Для виділення іридовірусу з природних водойм від личинок кровосисних комарів використовували неспецифічного хазяїна - личинки G. mellonella та перещеплювальну культуру клітин A. aegypti Mos 20A. Наявність іридовірусу підтверджували за допомогою методу електронної мікроскопії на електронному мікроскопі ЕМ-125 при інструментальному збільшенні 15 000-30 000 та за допомогою атомно-силового мікроскопа NT-MDT.

Для очистки іридовірусу комара A. flavescens застосовували метод диференційного центрифугування. Вірусовмісну суспензію нашаровували на 30% розчин сахарози і центрифугували при 20000 об/хв протягом 40 хвилин на ультрацентрифузі Beckman L5-50B у роторі SW-40. Характерний райдужний осад свідчив про наявність віріонів іридовірусу комара. Кінцеву очистку іридовірусу комара проводили в градієнті щільності сахарози 10 - 50%. Вірусну фракцію відбирали за допомогою вакуумного насосу та відмивали центрифугуванням.

Препарати очищених віріонів та їхньої ДНК досліджувалися методами спектрального аналізу. Для визначення концентрації білка вірусного препарату використовували мікрометод Лоурі.

Для дослідження впливу температури на інфекційність іридовірусу комара вірусовмісну суспензію прогрівали при температурі 30, 45 і 60 ⁰С. Вплив ультрафіолетового опромінення вивчали під УФ-випромінювачем потужністю 30 Вт впродовж 15 хвилин. Дослідження впливу надвисокочастотного (НВЧ) опромінення проводили при потужності 90 і 750 Вт. До та після опромінення вимірювали температуру вірусної суспензії.

Для дослідження впливу органічних розчинників, детергентів, ферментів та рН середовища на інфекційність іридовірусу комара використовували етанол, хлороформ, ефір, 0,1% ДСН, 0,1М ЕДТА, протеїназу К (0,04 мг/см³), трипсин (0,025 мг/см³), 0,1М цитратний буфер (рН 3,0) та 0,1М NaOH (рН 11,0).

Для визачення антивірусної дії нових синтетичних сполук у пробірки з 10-кратними розведеннями іридовірусу комара вносили досліджувану речовину. Суміш інкубували протягом години при 28 ⁰С та інокулювали нею личинок G. mellonella.

Фотодинамічну інактивацію іридовірусу комара водорозчинними фулеренами С₆₀ проводили при довжині хвилі 400-850 нм. Тривалість експозиції становила 60 хвилин.

З кожного зразка дослідного та контрольного матеріалу робили 10-кратні розведення в стерильній дистильованій воді в інтервалі 10^-1 - 10^-10. Матеріалом з кожного розведення інфікували личинок G. mellonella. Інфіковані личинки інкубували при температурі 20 ⁰С. Через 14 днів визначали наявність іридовірусу в кожній личинці візуально, оцінюючи колір осаду. Блакитний осад свідчив про наявність вірусу. Інфекційний титр іридовірусу комара визначали за загальноприйнятими методами.

Електрофорез білків віріонів іридовірусу комара A. flavescens проводили за методом Лемлі [Laemmli, 1970]. Для виділення ДНК іридовірусу комара використовували фенольно-хлороформний метод. При постановці рестрикційного аналізу використовували ендонуклеази рестрикції EcoRІ, BamHI, XbaІ, HindIII, HpaII та MspI (Fermentas). Беручи за основу нуклеотидні послідовності ДНК іридовірусів, було підібрано та синтезовано олігонуклеотидні праймери специфічні до ділянки консервативного гену малої субодиниці рибонуклеозид редуктази (КФ 1.17.4.2), тимідинкінази (КФ 2.7.1.21) та АТФази (КФ 3.6.3.14). Для розробки праймерів, визначення їхньої специфічності та фізичних властивостей використовували програмне забезпечення Vector NTI 11 (INVITROGEN) та Primer Premier 5. Крім того, специфічність праймерів перевіряли за допомогою онлайн-сервісу BLAST (www.ncbi.nim.nih.gov/blast). Ампліфікацію проводили на термоциклері “Eppendorf MasterCycler” (Німеччина). Після ПЛР продукти реакції аналізували в 1 % агарозному гелі в ТАЕ буфері. Результати електрофорезу спостерігали під ультрафіолетовим трансілюмінатором. Виділення ПЛР-продуктів із агарозного гелю здійснювали за допомогою набору “Silica Bead DNA Gel Extraction Kit” (Fermentas) згiдно протоколу виробника.

Нуклеотиднi послiдовностi ДНК іридовірусу комара досліджували на автоматичному ДНК-секвенаторі “Genetic Analyser 3130” (“Applied Biosystems”, США) з використанням набору для секвенування (“BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit”). Аналіз нуклеотидних послідовностей ДНК іридовірусу комара проводили за допомогою алгоритмів ClustalW (VectorNTI11, Invitrogen) та BLASTN. Нуклеотидні послідовності інших іридовірусів були отримані з бази даних Національного Центру Бiотехнологiчної Iнформацiї (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov).

Антигенну спорідненість досліджуваного іридовірусу комара A. flavescens з іншими іридовірусами (Aedes cantans, Aedes caspius, Culiseta annulata та Culiseta morsitans.), визначали у реакції зв'язування комплементу (РЗК) та реакції імунодифузії в агарі по Оухтерлоні.

Досліди з вивчення кола хазяїв та інфекційності іридовірусу комара A. flavescens для риби проводили методом біопроб на однорічках коропа Cyprinus carpio, чебачка Pseudorasbora parva, в'юна Misgurnus fossilis та акваріумної рибки даніо Danio rerio. Риб інфікували шляхом введення вірусовмісного матеріалу в очеревину.

Результати та їх обговорення

Виділення іридовірусу від личинок комара A. flavescens. З часу відкриття першого іридовірусу виділено велику кількість цих вірусів. Особливо багато їх ізольовано від комах, чому сприяв райдужний відтінок тіла інфікованих ними личинок. Так, у квітні-травні 2008 року в Київській області з природних водойм були відібрані хворі личинки комарів з характерним райдужно-зеленим відтінком. Було визначено видову приналежність інфікованих личинок кровосисних комарів: Aedes flavescens (Diptera, Culicidae).

Тіло інфікованих іридовірусом личинок мало райдужно-зелене забарвленням, натомість осад віріонів у процесі очистки методом диференційного центрифугування був блакитним. Слід зазначити, що типовий та єдиний представник роду Chloriridovirus, Іnvertebrate iridescent virus 3, спричиняє в інфікованих ним личинок комара A. taеniorhynchus райдужне забарвлення від переливчасто-жовтого до зелених тонів, а осаду віріонів притаманні відтінки від рожевого до помаранчевого.

У процесі пошуку чутливої модельної системи для накопичення виділеного іридовірусу комара A. flavescens була встановлена можливість використання з цією метою личинок великої вощинної молі G. mellonella. Так, у личинках великої вощинної молі G. mellonella інфекційний титр іридовірусу комара при ін'єкції гомогенату з інфікованих личинок становив 8,0±0,057 lg ІД₅₀/см³, а при інокуляції личинок G. mellonella очищеним та концентрованим препаратом іридовірусу комара A. flavescens інфекційний титр досягав значення в 11,2±0,1155 lg ІД₅₀/см³. Необхідно відмітити, що в обох випадках іридовірус не спричиняв райдужного забарвлення інфікованих ним личинок G. mellonella.

У результаті інфікування іридовірусом комара культури клітин A. aegypti Mоs 20A спостерігали ЦПД, яка спричинювалась очищеним вірусом при високій множинності інфікування (1-2Ч10² ІД₅₀/кл). Первинна ЦПД спостерігалась вже через 2-4 години інкубації. При температурі 32 ⁰С ЦПД проявлялась швидше, ніж при 27 та 21 ⁰С. Відповідно, первинна ЦПД не залежила від експресії вірусного генома і, скоріше за все, є функцією вихідного білка вірусу.

При низькій множинності інфікування (1-2 ІД₅₀/кл) рання цитотоксична дія вірусного білка не проявлялась. Через 7 днів після інфікування в культурі клітин A. aegypti Mоs 20A спостерігалась яскраво виражена ЦПД, яку можна пояснити репродукцією вірусу та накопиченням цитотоксичного білка іридовірусу (так звана дія “з середини”).

Таким чином, дослідження культивування іридовірусу комара A. flavescens в культурі клітин A. aegypti Mоs 20A показало, що продуктивність культури клітин була значно нижчою, ніж у личинках G. mellonella. Максимальний титр іридовірусу в комахах був 8,0±0,057 lg ІД₅₀/см³, а в культурі клітин лише 4,73±0,1453 lg ІД₅₀/см³. Тому для накопичення вірусу у великій кількості краще культивувати його на личинках великої вощинної молі G. mellonella.

Як показали результати електронно-мікроскопічних досліджень очищеної вірусної суспезії, віріони іридовірусу комара A. flavescens мають типову для іридовірусів морфологію та ультраструктуру. Іридовірус комара A. flavescens складається із зовнішньої ліпідної оболонки, білкового капсиду та внутрішньої ліпідної мембрани. У центрі вірусних частинок розташований сферичний нуклеопротеїн. Віріони мають гексагональну форму, їхній діаметр становить 200 ± 5 нм.

Дослідження очищеної вірусної суспензії методом атомно-силової мікроскопії показало, що віріони іридовірусу комара A. flavescens мають типову для іридовірусів морфологію. Не зважаючи на те, що віріони іридовірусу комара A. flavescens деформувались у процесах їх фіксації та сканування, вірусні частинки мали типову сферичну форму, а їх діаметр складав 200 ± 5 нм.

Дослідження впливу фізико-хімічних факторів на репродукцію іридовірусу комара A. flavescens в личинках G. mellonella. Як показали результати досліджень, витримування вірусної суспензії іридовірусу комара A. flavescens при підвищених температурах знижувало його інфекційність для личинок G. mellonella. Так, прогрівання вірусної суспензії при 45 ⁰С впродовж

30 хвилин знижувало інфекційність вірусу всього на 0,95 lg IД₅₀/см³, а експозиція вірусу при температурі 60 ⁰С впродовж 30 хвилин фактично його повністю інактивувала (табл. 1).

Вивчення інфекційного титру вірусу після обробки його ультрафіолетовими променями показало, що порівняно з контролем (7,2±0,0577 lg ІД₅₀/см³) інфекційний титр опроміненого іридовірусу знизився до 3,35±0,0291 lg ІД₅₀/см³ (табл. 1).

Електромагнітне випромінювання при досліджуваній потужності практично не впливало на інфекційність іридовірусу комара A. flavescens (табл. 1). Відомо, що мікрохвильова радіація на біологічні об'єкти має сукупний ефект - температурний та радіаційний. У наших дослідженнях скоріше за все ми спостерігали саме температурний ефект, який полягав у різкому збільшені температури за короткий проміжок часу. Локальні перегріви при досягнені критичної для іридовірусів температурної точки призводили до порушення цілісності деяких вірусних частинок, що викликало незначне зниження інфекційного титру.

Таблиця 1 Вплив фізичних факторів на інфекційність іридовірусу комара A. flavescens

Фактор впливу	Експозиція	Інфекційний титр, lg IД50/см3
Ультрафіолетове опромінення	15 хвилин	3,35±0,0291
Температура (0С)	30	4 години	7,1±0,0289
	45	30 хвилин	6,25±0,0289
	60	30 хвилин	1,39±0,0581
НВЧ опромінення	750 Вт	10 секунд	7,17±0,0722
		30 секунд	6,21±0,0876
		60 секунд	5,83±0,0723
Контроль		7,2±0,0577

Іридовірус комара A. flavescens виявився стійким до дії етилового ефіру (табл. 2). Однією з фізико-хімічних властивостей іридовірусів комах, що вирізняють їх серед іридовірусів риб та амфібій, є стійкість до дії ефіру. Ця стійкість може бути обумовлена високим (до 27%) вмістом фосфатидилінозитола, який є кислим фосфоліпідом, і ефіром повністю не екстрагується. При обробці вірусної суспензії хлороформом інфекційний титр іридовурусу комара A. flavescens знижувався на 3 порядки і становив 4,14 IД₅₀/см³.

Таблиця 2 Вплив органічних речовин та рН на інфекційність іридовірусу комара A. flavescens

Фактор впливу	Концентрація речовини	Експозиція та температура	Інфекційний титр, lg IД50/мл
Хлороформ	50%	1 година, 25 0С	4,17±0,0794
Ефір етиловий	50%	1 година, 25 0С	7,0±0,1155
Етанол	70%	1 година, 25 0С	0,0±0
ДСН	0,1%	1 година, 25 0С	7,13±0,0882
ЕДТА	0,1 М	1 година, 25 0С	6,95±0,0578
NaOH, рН 11,0	0,1 М	1 година, 25 0С	3,02±0,0726
Цитратний буфер, рН 3,0	0,1 М	1 година, 25 0С	1,46±0,0872
Трипсин	0,025 мг/мл	1 година, 25 0С	7,16±0,0333
Протеіназа К	0,04 мг/мл	1 година, 37 0С	4,53±0,1281
Контроль		1 година, 25 0С	7,2±0,0577

Іридовірус комара A. flavescens виявився чутливим до дії етанолу. Ні в одній із повторностей личинки великої вощинної молі не інфікувались цим вірусом і при центрифугуванні їхніх гомогенатів характерного райдужного забарвлення осаду не спотерігали. Було показано також, що досліджуваний вірус витримував дію 0,1% ДСН та 0,1 М ЕДТА без суттєвого зниження інфекційного титру (табл. 2).

При дії на іридовірус комара A. flavescens ферментів, що гідролізують білки, виявилася стійкість цього вірусу до трипсину, але чутливість до протеїнази К (табл. 2).

Спільним для всіх іридовірусів є їхня чутливість до кислого та лужного середовища. Відомо, що іридовіруси стабільні в діапазоні рН від 4,0 до 10,0. Нами вивчалась стійкість вірусу при рН 3,0 та 11,0. Результати наших досліджень показали, що інфекційність іридовірусу комара A. flavescens при цих значеннях рН різко знижувалась (табл. 2).

Дослідження молекулярно-біологічних властивостей іридовірусу комара A. flavescens. За результатами наших досліджень віріони іридовірусу комара A. flavescens містять 12 структурних білків молекулярною масою від 14,5 до 122 кДа (табл. 3). Молекулярна маса головного капсидного білку іридовірусу комара A. flavescens становить 48 кДа. За літературними даними, очищені віріони іридовірусів містять до 36-ти структурних білків молекулярною масою від 5 до 250 кДа, а молекулярна маса головного капсидного білка (МСР) іридовірусів варіює в діапазоні 45-55 кДа. Слід зазначити, що молекулярна маса МСР іридовіруса комара A. taeniorhynchus, типового представника роду Chloriridovirus, становить близько 55 кДа, а до складу його віріону входять 9 білків молекулярною масою від 15,5 до 98 кДа.

Таблиця 3 Молекулярні маси білків іридовірусів комарів A. flavescens та A. taeniorhynchus

№	Молекулярна маса білків, Да
	A. flavescens	A. taeniorhynchus [Wagner, 1973]
1	14 500	15 500
2	18 000	19 000
3	34 000	30 000
4	48 000	37 000
5	53 000	54 000
6	57 500	68 500
7	60 000	84 000
8	63 000	94 000
9	80 500	98 000
10	108 500
11	114 000
12	122 000

Електрофореграмма гідролізу ДНК іридовірусу комара A. flavescens рестриктазами BamHI, EcoRІ, HindIII, XbaІ, HpaII, MspІ та комп'ютерний аналіз ДНК іридовірусу комара A. taeniorhynchus показали відмінність в кількості фрагментів рестрикції для обох вірусів. Для визначення молекулярної маси ДНК іридовірусу комара A. flavescens були встановлені розміри кожного фрагменту. Розміри ДНК, одержані в результаті рестрикційного аналізу, коливаються в межах 108 - 163 т.п.н., що відповідає приблизно 110-115 х 10⁶ Да. Використання ендонуклеаз рестрикції MspІ та HpaII, дозволило встановити, що ДНК іридовірусу комара A. flavescens не метильована по сайту CpG, оскільки для даних рестриктаз було отримано однакову кількість ідентичних фрагментів (табл. 4). За літературними даними відомо, що ДНК іридовірусів безхребетних не містить метильованих залишків цитозину. Отримані нами дані узгоджуються з літературними і дозволяють зробити висновок, що геном іридовірусу комара A. flavescens не містить гену метилтрансферази.

Після аналізу всіх доступних ДНК-послідовностей іридовірусів було підібрано та синтезовано олігонуклеотидні праймери, специфічні до ділянок генів малої субодиниці рибонуклеозидредуктази, АТ-Фази та тимідинкінази. Як показали результати наших досліджень, обрані пари олігонуклеотидних праймерів ампліфікували ділянки ДНК іридовірусу комара A. flavescens.

Таблиця 4 Рестрикційний аналіз ДНК іридовірусів A. flavescens та A. taeniorhynchus

Ендонуклеаза рестрикції	A. taeniorhynchus [Delhon, 2006]	A. flavescens
	Кількість фрагментів	Довжина фрагментів, т.п.н.	Кількість фрагментів	Довжина фрагментів, т.п.н.
BamHI	24	0,323-23,9	11	5,3-24,1
EcoRI	11	0,238-55,753	23	2,1-24,3
HindIII	45	0,08-23,969	25	1,3-13,0
XbaІ	19	0,021-31,765	18	3,1-24,3
HpaII	560	0,004-6,272	19	1,5-11,9
MspI	560	0,004-6,272	19	1,5-11,9

Високочутливий метод полімеразної ланцюгової реакції дозволив встановити, що частка інфікованих личинок комарів, виловлених у природних водоймах Київської області, при сублетальній чи гострій іридовірусній інфекції становить близько 15 %, що в 3 рази перевищує їх кількість, ніж при діагностуванні захворювання за допомогою світлооптичних методів. Таким чином, при оцінці епізоотичної ситуації доцільно використовувати запропонований нами метод швидкої та високоспецифічної діагностики, що дозволяє ідентифікувати іридовірус у личинках комара при сублетальній інфекції без прояву характерних зовнішніх ознак захворювання. іридовірус комар пойкілотермний

Як показали результати досліджень, довжина фрагменту ДНК, ампліфікованого за допомогою праймерів, підібраних до гену АТФази іридовірусів, становить 404 п.н. Аналіз нуклеотидної послідовності фрагменту ДНК іридовірусу комара A. flavescens не виявив високого ступеня гомології з послідовностями ДНК інших іридовірусів. До того ж порівняння нуклеотидної послідовності фрагменту ДНК іридовірусу комара A. flavescens з нуклеотидними послідовностями з бази даних Національного Центру Бiотехнологiчної Iнформацiї показало, що ампліфікований фрагмент ДНК на 75 % ідентичний з послідовністю гена, що кодує ATP-binding protein бактерії Pseudomonas fluorescens. Це може свідчити про присутність подібної до цього гену нуклеотидної послідовності в ДНК іридовірусу комара A. flavescens.

Обрані пари олігонуклеотидних праймерів специфічних до гену тимідинкінази Koi herpesvirus (KHV) та іридовірусу комара ампліфікували ділянку ДНК іридовірусу комара A. flavescents розміром близько 800 пар нуклеотидів. Цей факт можна пояснити наявністю в геномах вірусів консервативних генів, характерних для ДНК-вмісних вірусів з родин Iridoviridae та Herpesviridae, що дає можливість розробки єдиного ПЛР-методу діагностики обох цих вірусів. Одним з таких консервативних генів виявився ген тимідинкінази, фрагмент якого був успішно ампліфікований з використанням специфічних праймерів, підібраних до KHV та іридовірусу комара.

Вивчення антигенної спорідненості іридовірусу комара A. flavescens з іншими іридовірусами. Застосування методу імунодифузії в агарі показало, що утворюються лінії приципітації, які свідчать про антигенну спорідненість іридовірусу A. flavescens з іридовірусами комарів A. cantans, A. caspius, C. annulata та C. morsitans. У досліджуваного іридовірусу було виявлено антиген, що давав перехресну реакцію з антисироватками до цих іридовірусів. Про близьку антигенну спорідненість досліджуваних штамів іридовірусу комарів свідчать також результати реакції зв'язування комплементу. Титр іридовірусу комара A. flavescens складав 1:1024 з антисироватками до іридовірусу комара A. cantans та 1:512 з антисироватками до іридовірусу комара C.annulata. Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновки про те, що іридовірус, виділений із личинок комара A. flavescens має високий рівень антигенної спорідненості з іншими штамами іридовірусів комарів роду Aedes та Culiseta.

Дослідження кола хазяїв іридовірусу комара A. flavescens. Літературні дані свідчать про можливість іридовірусів комах інфікувати амфібій та рептилій. Незважаючи на те, що характерним хазяїном хлоріридовірусів є комари родів Aedes, Culex, Culizeta, результати наших досліджень свідчать про патогенність іридовірусу комара A. flavescens для представників віддалених таксономічних груп. Було встановлено, що при внутрічеревній ін'єкції іридовірус комара A. flavescens в інфекційній дозі 4,0 lg IД₅₀/см³ спричиняє загибель коропа, чебачка та даніо (табл. 5). Зниження інфекційного титру свідчить про відсутність репродукції вірусу в організмі піддослідних тварин. Тому загибель риб, скоріше за все, обумовлена токсичністю білкових факторів іридовірусу.

Таблиця 5 Інфекційний титр іридовірусу комара A. flavescens в організмі загиблих риб

Вид риби	Інфекційний титр, lg IД50/см3	Смертність, %
		Дослід	Контроль
Короп	3,44±0,0839	60,0±4,0850	0,0±0
Чебачок	1,64±0,0809	75,0±2,8868	0,0±0
Даніо	1,51±0,754	62,5±2,5	0,0±0
В'юн	0,0±0	0,0	0,0±0

Дослідження антивірусних властивостей нових синтетичних сполук та фулеренів С₆₀ на моделі іридовірус комара A. flavescens - личинки великої вощинної молі G. mellonella. З 8-ми досліджуваних нових синтетичних сполук антивірусними властивостями відносно іридовірусу комара A. flavescens характеризувалась сполука 2-{[3-циано-3-(1-метил1,3-дигідро-2Н-бензимідазол-2-ілиден)-2-оксопропіл]-[(4-метилфеніл) сульфоніл] - аміно} -оцтова кислота. При її застосуванні в МПК інфекційний титр іридовірусу комара знижувався порівняно з контролем (8,2±0,1155 lg ІД₅₀/см³) на 4 порядки і становив 4,0±0,1155 lg ІД₅₀/см³. Незначними антивірусними властивостями характеризувалась також сполука 2-[(1,3-диметил-2,6-діоксо-1,2,3,6-тетрагідро-4-піримідиніл) - сульфаніл] - N- (3-нітробензіліден)-ацетогідразид, яка знижувала інфекційний титр вірусу з 8,2±0,1155 lg ІД₅₀/см³ до 7, 23±0,0723 lg ІД₅₀/см³. З метою дослідження впливу нових синтетичних сполук на віріони іридовірусу комара було проведено електрофорез вірусної суспензії після експозиції з досліджуваними речовинами. Контролем слугував необроблений вірус. Результат електрофореграмми білків іридовірусу комара свідчить, що речовина 2-{[3 - циано - 3 - (1 - метил-1, 3 - дигідро - 2Н - бензимідазол - 2 -ілиден) - 2- оксопропіл]-[(4 - метилфеніл) сульфоніл] - аміно} - оцтова кислота має антивірусну активність. Вміст білків іридовірусу комара виявився значно меншим у порівнянні із контрольними зразками. Як показали результати наших досліджень, лінії мінорних білків іридовірусу комара були відсутні, а лінії головного капсидного білку та інших мажорних білків під дією цієї речовини були не такими чіткими, як в контролі. Фотодинамічна інактивація іридовірусу комара A. flavescens фулеренами С₆₀ впродовж 2,5 хвилин призводила до зниження інфекційного титру вірусу на 2 порядки. Інфекційний титр іридовірусу комара в личинках G. mellonella після експозиції протягом 2,5 хвилин становив 9,0±0,0577 lg ІД₅₀/см³. Порівняно з контрольними варіантами під час експозиції тривалістю 10 та 30 хвилин інфекційний титр вірусу знижувався на 2,93±0,0693 та 3,88±0,0635 lg ІД₅₀/см³ відповідно. У контрольних варіантах інфекційний титр іридовірусу комара становив 11,2±0,1155 lg ІД₅₀/см³. Показники інфекційного титру іридовірусу комара після фотодинамічної інактивації впродовж години не відрізнялись суттєво від показників фотодинамічної інактивації тривалістю 30 хвилин. Інфекційний титр іридовірусу комара A. flavescens після фотодинамічної інактивація впродовж години становив 7,16±0,0436 lg ІД₅₀/см³.

Присутність С₆₀ у вірусній суспензії без фотодинамічної інактивації так само як і дія світла на вірусну суспензію без С₆₀ не впливали на інфекційний титр іридовірусу комара. Як показали результати електронно-мікроскопічних досліджень вірусної суспезії, віріони іридовірусу комара A. flavescens у присутності фулеренів С₆₀ утворювали конгломерати у вигляді тяжів. Деякі віріони були позбавлені зовнішньої оболонки, яка надає вірусним частинкам сферичної форми. Такі віріони мали ярко виражений ікосаедричний тип симетрії, який притаманний іридовірусам, позбавленим зовнішньої ліпідної оболонки.

Висновки

1. З личинок кровосисних комарів Aedes flavescens виділений ентомопатогенний іридовірус. Вірус має гексагональну форму, діаметр його віріонів 200 нм. За молекулярно-біологічними, а також фізико-хімічними властивостями віріонів та їхньої ДНК, виділений штам іридовірусу кровосисних комарів A. flavescens віднесений до роду Chloriridovirus родини Iridoviridae.

2. Іридовірус комара A. flavescens може реплікуватися в личинках великої вощинної молі G. mellonella, його інфекційний титр в личинках сягає 8,0-8,2 lg ІД₅₀/см³, а також у перещеплюваній культурі клітин комарів A. aegypti Mоs 20A, де інфекційний титр вірусу сягає 4,5-5,0 lg ІД₅₀/см³. Тому оптимальною системою для накопичення іридовірусу в лабораторних умовах являються личинки великої вощинної молі, оскільки продуктивність культури клітин значно нижча.

3. Іридовірус комара A. flavescens чутлитвий до ультрафіолетового опромінення, нагрівання, хлороформу, етанолу, рН 3,0 і 11,0 та протеїнази К, але стійкий до етилового ефіру, трипсину, 0,1 % ДСН та 0,1 М ЕДТА.

4. Віріони іридовірусу комара A. flavescens містять 12 білків молекулярною масою від 14,5 до 122 кДа, молекулярна маса головного капсидного білка 48 кДа. Розміри ДНК за рестрикційним аналізом становлять 152 - 163 т.п.н. Кількість білків та їхня молекулярна маса, а також різниця в сайтах рестрикції ДНК свідчать про значний ступінь відмінності цього штаму іридовірусу від типового представника роду Chloriridovirus - іридовірусу комара A. taeniorhynchus.

5. Розроблений ПЛР-метод діагностики іридовірусу комара A. flavescens, збільшує точність виявлення вірусу втричі. Даний метод дозволяє ідентифікувати іридовірус у личинках кровосисних комарів при сублетальній інфекції, без прояву характерних зовнішніх ознак захворювання.

6. Іридовірус, виділений із личинок кровосисних комарів A. flavescens має значну антигенну спорідненість з іншими штамами іридовірусів комарів роду Aedes та Culiseta, виділених в Україні.

7. Іридовірус кровосисних комарів A. flavescens здатний тривалий період часу перебувати в організмах прісноводних видів риб. Загибель піддослідних риб пов'язана з токсичністю білків вірусу.

8. Ефективними інгібіторами інфекційності іридовірусу комара в модельній системі іридовірус комара A. flavescens - личинки великої вощиної молі G. mellonella є речовина 2-{[3-ціано-3-(1-метил-1,3-дигідро-2Н-бензимідазол-2-ілиден)-2-оксопропіл]-[(4-метилфеніл) сульфоніл]-аміно}-оцтова кислота та фулерени С₆₀, які знижують інфекційний титр вірусу на 4,2 та 4,04 lg ІД₅₀/см³ відповідно.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Рудь Ю.П. Біологічні властивості іридовірусів риб / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // Вісник КНУ імені Тараса Шевченка. Біологія. - 2008. - Вип. 52-53. - С. 91-95. (Дисертантом проведено пошук літератури, підготовлено статтю до друку.)

2. Рудь Ю.П. Експериментальне інфікування коропа іридовірусом комара / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // Рибогосподарська наука України. - 2009. - №1. - С. 102-106. (Дисертантом проаналізовано літературу, виконано експериментальну частину, підготовлено статтю до друку. Інтерпретацію отриманих результатів та висновки здійснено разом з науковим керівником.)

3. Рудь Ю.П. Експрес діагностика іридовірусу комара MIV методом полімеразної ланцюгової реакції / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // Ветеринарна біотехнологія. - 2009. - №14. - С. 302-306. (Дисертантом визначено ідею роботи, проведено пошук та узагальнено літературні дані. Виконано експериментальну частину. Підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено особисто.)

4. Рудь Ю.П. Ампліфікація гену тимідинкінази як зручний метод діагностики ДНК-вірусів риб / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // Міжвідомчий тематичний науковий збірник “Рибне господарство” - Київ: 2009. - Вип. 67. - С. 175-178. (Дисертантом виконано експериментальну частину, підготовлено статтю до друку. Інтерпретацію отриманих результатів та висновки здійснено разом з науковим керівником.)

5. Рудь Ю.П. Вплив фізичних та хімічних факторів на іридовірус комара Aedes flavescens / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // Фізика живого. - 2010. - Т. 18, №1. (Дисертантом проаналізовано літературу, виконано експериментальну частину, здійснено інтерпретацію отриманих результатів та підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено колективно).

6. Рудь Ю.П. Експериментальне інфікування прісноводних видів риб іридовірусом комара / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // Вет. медицина: між. відом. наук. зб. - Харків., 2010. - Вип. 94. - С. 94-96. (Дисертантом проаналізовано літературу, виконано експериментальну частину, підготовлено статтю до друку. Інтерпретацію отриманих результатів та висновки здійснено разом з науковим керівником.)

7. Патент на корисну модель № 52258 “Спосіб ідентифікації іридовірусу комара”. Бюл. № 16 від 25.08.2010 р. / Рудь Ю.П., Бучацький Л.П.

8. Рудь Ю.П. Ідентифікація іридовірусу комара (MIV) в організмі коропа методом полімеразної ланцюгової реакції / Ю.П. Рудь, Л.П. Бучацький // ХІІ з'їзд мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (25-30 травня 2009 р. м. Ужгород): Тези доповідей. - Ужгород, 2009. - с. 464.

9. Spectroscopic studies of mosquito iridescent virus (MIV) in liquid TRIS-HCl buffer / V.M. Kravchenko, A.S. Fedchenkova, Yu.P. Rud [et al.] // International Conference: Physics of Liquid Matter: Modern Problems (May 21-24, 2010, Kyiv): Book of Abstracts. - Kyiv, 2010. - P. 258.

10. Photodynamic inactivation of mosquito iridovirus (MIV) by C₆₀ fullerenes / Yu. Rud', S. Prylutska, L. Buchatskyy [et al.] // Ukrainian-German symposium on physics and chemistry of nanostructures and on nanobiotechnology (September 6-10, 2010, Beregove): Book of Abstracts. - Beregove, 2010. - P. 244.

11. Рудь Ю.П. Молекулярна характеристика іридовірусу, ізольованого від комара Aedes flavescens / Ю.П. Рудь // VІ міжнародна наукова конференція “Біоресурси і віруси” (14-17 вересня, 2010, Київ): Тези доповідей. - Київ, 2010. - С. 271.

Анотація

Рудь Ю.П. Молекулярно-біологічні властивості та фізико-хімічна характеристика іридовірусу комара Aedes flavescens. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2010.

Дисертація присвячена дослідженню молекулярно-біологічних та фізико-хімічних властивостей іридовірусу, виділеного нами з личинок комара Aedes flavescens, виловлених у природних водоймах Київської області.

Встановлено можливість репродукції іридовірусу в умовах in vitro на культурі клітин A. aegypti Mоs 20A та in vivo в личинках великої вощинної молі G. mellonella. Досліджено морфологічні особливості та ультраструктуру вірусних частинок. Іридовірус має гексагональну форму, діаметр віріонів становить 200 нм.

Іридовірус комара A. flavescens чутлитвий до ультрафіолетового опромінення, нагрівання, органічних розчинників, рН 3,0 і 11,0 та протеїнази К, але стійкий до ефіру, трипсину та детергентів. Кількість білків та їхня молекулярна маса, а також різниця в сайтах рестрикції ДНК свідчать про значний ступінь відмінності цього штаму іридовірусу кровосисних комарів від типового представника роду Chloriridovirus - іридовірусу комара A. taeniorhynchus.

Розроблений ПЛР-метод діагностики іридовірусу комара A. flavescens, збільшує точність виявлення вірусної інфекції втричі. Даний метод дозволяє ідентифікувати іридовірус у личинках комарів при сублетальній інфекції, без прояву характерних зовнішніх ознак захворювання.

За молекулярно-біологічними, а також фізико-хімічними властивостями віріонів та їхньої ДНК, виділений штам іридовірусу кровосисного комара A. flavescens віднесений до роду Chloriridovirus родини Iridoviridae.

Ключові слова: Iridoviridae, іридовірус комара, молекулярно-біологічні та фізико-хімічні властивості.

Аннотация

Рудь Ю.П. Молекулярно-биологические свойства и физико-химическая характеристика иридовируса комара Aedes flavescens. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию молекулярно-биологических и физико-химических свойств иридовируса, выделенного от личинок комара Aedes flavescens из естественных водоемов Киевской области.

Установлена возможность репродукции иридовируса в условиях in vitro на культуре клеток A. aegypti Mоs 20A и in vivo в личинках большой вощинной моли G. mellonella. Исследованы морфологические особенности и ультраструктура вирусных частиц. Іридовирус имеет гексагональную форму, диаметр вирионов составляет 200 нм.

Іридовирус комара A. flavescens чувствителен к ультрафиолетовому облучению, нагреванию, органическим растворителям, рН 3,0 и 11,0 и протеиназе К, но стоек к эфиру, трипсину и детергентам. Количество белков и их молекулярная масса, а также разница в сайтах рестрикции ДНК свидетельствуют о значительной степени отличия этого штамма иридовируса кровососущих комаров от типичного представителя рода Chloriridovirus - иридовируса комара A. taeniorhynchus.

Разработанный ПЦР-метод диагностики иридовируса комара A. flavescens, увеличивает точность выявления вирусной инфекции втрое. Данный метод позволяет идентифицировать иридовирус в личинках комаров при сублетальной инфекции, без проявления характерных внешних признаков заболевания.

По молекулярно-биологическим, а также физико-химическим свойствами вирионов и их ДНК, выделенный штамм иридовируса кровососущих комаров A. flavescens отнесен к роду Chloriridovirus семейства Iridoviridae.

Ключевые слова: Iridoviridae, иридовирус комара, молекулярно-биологические и физико-химические свойства.

Summary

Rud Yu.P. The molecular-biological properties and physicochemical characterization of an iridovirus from mosquito Aedes flavescents. - Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in specialty 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, Ukraine, 2010.

The research is dedicated to investigation of molecular-biological and physicochemical properties of iridovirus, isolated from mosquito Aedes flavescens in Kiev region.

Our results showed that mosquito iridovirus A. flavescens was able to replicate in both large wax-moth larvae G. mellonella and continued cell culture A. aegypti Mоs 20A. But for virus propagation in high infectious titer it is more advisability to use larvae G. mellonella, where the virus titer reach up to 8,0-8,2 lg ІD₅₀/ml.

AFM and EM observations revealed hexagonal virions with a diameter of 200 nm. The purified iridovirus particles showed a dense central core and three-layered membrane including an external lipoprotein envelope, an inner protein capsid and a lipid-containing membrane. These virions were morphologically similar to those of the Iridoviridae.

Iridovirus A. flavescens was sensitive to ethanol, chloroform but not sensitive to ether. Infectivity of virions was rapidly lost at pH 3.0 and 11.0 and by heating to 60 ⁰C. Sensitivity was detected following treatment by UW radiation and proteinase K. No sensitivity was detected for electromagnetic radiation, 0,1 % SDS, 0,1 M EDTA and trypsin.

Gradient SDS-PAGE of purified virions revealed the presence of 12 polypeptides ranging from 14,5 to 122 kDa. The molecular weight of a major capsid protein (MCP) was a 48 kDa. Interestingly that number of proteins of another mosquito iridovirus A. taeniorhynchus is 9 ranging from 15,5 to 98 kDa and molecular weight of MCP is approximately 55 kDa.

Restriction enzyme analysis of viral DNA with the endonucleases EcoRI, BamHI, HindIII, XbaI, MspI, and HpaII has revealed that the restriction fragment patterns of iridovirus A. flavescens differ from those obtained from experiments with iridovirus A. taeniorhynchus and iridoviruses of lower vertebrates. DNA of iridovirus A. flavescens is degraded by both MspI and HpaII. These enzymes have the same cleavage site (CCGG), however, whereas MspI is able to cleave viral DNA in the presence of methylcytosine, HpaII is not. Thus, DNA must be unmethylated and exhibits the expected characteristics of invertebrate iridovirus DNA.

Using nucleotide sequences of all iridoviruses a set of oligonucleotide primers was designed for ribonucleoside reductase small subunit, ATPase and thymidine kinase genes. After amplification of iridovirus A. flavescens genomic DNA, PCR products were visible on agarose gels. PCR product of ATPase target amplification of iridovirus A. flavescens don't show significant homologies to other iridoviruses, but demonstrate 75 % identity to ATP-binding protein of Pseudomonas fluorescens.

Experimental infection indicate that mosquito iridovirus A. flavescens is pathogenic for carp, zebrafish and stone moroco. The cumulative mortality reached up to 60-80% within 20 days. Probably the mortality of experimental fish was caused by the toxicity of virus proteins, because UW inactivated virions also lead to fish death.

It was shown that water soluble C₆₀ fullerenes under visible light interact with virions of iridovirus A. flavescens and lead to their destruction. Specifically, the photodynamic inactivation of virus during 1 h reduced the infectious titer of virus on 4.5 lg ID₅₀/ml. In addition among 8 new synthetic chemicals one was selected to have antiviral activity. This chemical reduced infectious titer of virus on 4.0 lg ID₅₀/ml.

Physicochemical and molecular approaches yielded results consistent with the suggestion that mosquito iridovirus A. flavescens was a member of the family Iridoviridae. Moreover RFLP analysis of viral DNA and molecular weight of MCP distinguished iridovirus A. flavescens from another mosquito iridovirus A. taeniorhynchus, the type species of the genus Chloriridovirus. Presently, a large number of mosquito iridoviruses, that have been reported in literature, are insufficiently studied and consequently they are not classified. Our observation may help to understand the relatedness of mosquito iridovirus A. flavescens within family Iridoviridae.

Key words: Iridoviridae, mosquito iridovirus, physicochemical and molecular properties.

Размещено на Allbest.ru

...