Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 577.352:612.822.3

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МОДУЛЯЦІЯ ГЛІЦИНОВИХ РЕЦЕПТОРІВ КАНАБІНОЇДАМИ В НЕЙРОНАХ ЦНС ЩУРІВ

03.00.02 - біофізика

ЯЦЕНКО НАТАЛІЯ МИХАЙЛІВНА

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник:

Кришталь Олег Олександрович, доктор біологічних наук, професор, академік НАН України, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран.

Офіційні опоненти:

Білан Павел Володимирович, доктор біологічних наук, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи.

Іванова Світлана Юріївна, кандидат біологічних наук Міжнародний центр молекулярної фізіології НАН України, науковий співробітник.

Захист дисертації відбудеться "15" березня 2011 р. о 14-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий "14" лютого 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гліцин є одним із основних гальмівних нейромедіаторів у ЦНС дорослих ссавців. Гліцинергічна передача встановлена в спинному та деяких відділах головного мозку (Legendre, 2001). І хоча в гіпокампі та корі головного мозку показана значна кількість функціональних гліцинових рецепторів (Chattipakorn and McMahon, 2002), їх роль не визначена. Структури та механізми, що необхідні для синаптичної та позасинаптичної гліцин-рецепторно опосередкованої передачі, були знайдені в гіпокампі (Engblom et al., 1996). Також отримані імуно-цитохімічні дані про синапичну і позасинаптичну експресію гліцинових рецепторів у гіпокампі (Brackmann et al., 2004). Нарешті, колокалізація гліцинових транспортерів та гліцинових рецепторів у цій структурі (Jursky and Nelson, 1995) дозволяє припустити можливість активації екстрасинаптичних гліцинових рецепторів. Декілька повідомлень вказують на те, що гліцинові рецептори можуть опосередковувати інгібіторну дію гліцину в гіпокампі (Chattapakorn and McMahon, 2003). Проте, дотепер фізіологічна роль та умови за яких гліцинові рецептори активуються в гіпокампі невідомі. Виходячи з цього, було б доцільно переглянути роль гліцину і гліцинових рецепторів у процесах регуляції нейронної активності в гіпокампі при нормальних і патологічних умовах.

Відомо, що канабіноїди приймають участь в регуляції процесів пам'яті та навчання, формуванні емоцій, больової активності, а також в регуляції вегетативних функцій організма (Pertwee, 1999). Можливість модуляції канабіноїдами синаптичних подій має багаточисленні функціональні наслідки, що дає можливість використовувати їх у терапевтичних цілях. Нещодавні відкриття виявили, що канабіноїди усувають симптоми, пов'язані з надмірною збудливістю нейронів (Wallace et al., 2003). Основний психоактивний компонент канабісу дельта 9-тетрагідроканабінол, як і інші канабіноїди, активує G-білок з'вязані канабіноїдні рецептори СВ1, які у великій кількості експресуються в мозку майже всюди (Matsuda et al., 1990). Сильна психотропна дія канабіноїдів значно обмежує область їх використання. Пошук інших мішеней канабіноїдів, вплив на які може зберігати такі позитивні наслідки використання канабіноїдів як анальгезія, є важливою частиною вивчення дії цих речовин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до загального плану науково-дослідних робіт відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України в рамках науково-дослідних робіт "Дослідження молекулярно-генетичних механізмів фізіологічних та патофізіологічних процесів та розробка методів їх корекції" (номер державної реєстрації - 0107U005336), "Механізми внутрішньоклітинної та міжклітинної сигналізації; вивчення шляхів їх модуляції та пошук нових фармакологічних впливів" (номер державної реєстрації - 0107U010843).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні впливу канабіноїдів на електрофізіологічні характеристики гліцин-активованого струму, та функціональне значення такого впливу на мережеву нейронну активність в гіпокампі.

Для досягнення поставленої мети в роботі слід було вирішити такі завдання:

1. За допомогою метода "петч клемп" у режимі фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина" і внутрішньоклітинної перфузії дослідити дію ендогенних та синтетичних канабіноїдів на такі характеристики гліцин-активованого струму, як пікова амплітуда, кінетика активації, кінетика десенситизації і кінетика деактивації.

2. Використовуючи вищезазначені методи встановити можливі механізми модуляції гліцинових рецепторів канабіноїдами.

3. З'ясувати можливу функціональну роль модуляції гліцинових рецепторів канабіноїдами.

Об'єкт дослідження - ліганд-керовані гліцинові рецептори гіпокампу та мозочку щурів.

Предмет дослідження - модулюючі впливи канабіноїдів на функціонування гліцинових рецепторів.

Методи дослідження - "петч клемп" у режимі фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина", внутрішньоклітинна перфузія, реєстрація популяційної активності нейронів та компьютерний аналіз амінокислотних послідовностей різних субодиниць гліцинових і канабіноїдних рецепторів.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі досліджена дія синтетичних та ендогенних канабіноїдів на гліцинові рецептори. Вперше показано, що канабіноїди значною мірою модулюють фунціонування гліцинових рецепторів в гостроізольованих гіпокампальних пірамідних нейронах та Пуркіньє нейронах мозочка. Отже, крім добре відомої теорії ретроградної дії канабіноїдів, яка припускає дифузію посередника від постсинаптичних елементів до пресинаптичної клітини, отримані результати вперше виявляють пряму дію ендоканабіноїдів на гліцинові рецептори.

Наші дані вперше демонструють, що синхронна активність нейронів, яка виникає у відповідь на стимуляцію високочастотними короткими пачками в присутності бікукуліна в СА1 ділянці гіпокампу, виявляє парадоксальну чутливість до селективних гліцинових блокаторів вказуючи на те, що гліцинові рецептори опосередковують цю активність. Тобто, гліцинові рецептори можуть брати участь у генерації синхронної ритмічної активності в гіпокампі.

Висловлено гіпотезу про те, що вплив канабіноїдів на синаптичні процеси в мозку може проходити двома шляхами: ретроградно діяти на вивільнення нейромедіатору та безпосередньо на постсинаптичні гліцинові рецептори.

Практичне значення одержаних результатів. Наші результати вказують на важливість гліцинових рецепторів в активності нейронної мережі гіпокампа і пропонують гліцинові рецептори як нову фармакологічну мішень ендоканабіноїдної міжклітинної сигналізації.

Дана робота належить до галузі фундаментальних досліджень. Теоретичне значення отриманих результатів полягає у зв'ясуванні можливих механізмів дії канабіноїдів в мозку. На базі отриманих даних конкретизується роль гліцинових рецепторів в гіпокампі, а також наслідки модуляції їх канабіноїдами.

Представлені результати можуть допомогти розробити нові фармакологічні препарати на основі прямої дії канабіноїдних агоністів на гліцинові постсинаптичні рецептори.

Особистий внесок здобувача. Всі електрофізіологічні експерименти на ізольованих клітинах, а також обробка експериментальних даних були виконані особисто автором. Здобувач брав активну участь в обговоренні результатів та формулюванні висновків. Експерименти на зрізах виконані спільно з д.б.н. Лозовою Н.О. Для отримання даних та первинного обрахунку результатів експериментів використовувалось програмне забезпечення, удосконалене к.б.н. Т. Цинцадзе.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались на 4ій конференції "Federation of European Neuroscience Societies" (Лісабон, Португалія, 2004), в університеті Heidelberg (Німеччина, 2005), 6ій конференції "Federation of European Neuroscience Societies" (Женева, Швейцарія, 2008), міжнародній школі "European Synapse Summer School" (Бордо, Франція, 2008) та поточних семінарах сектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 праць, з них 3 статті у фахових наукових журналах, затверджених ВАК України, та тези 4 доповідей у збірках матеріалів наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 227 найменувань. Дисертацію викладено на 149 сторінках стандартного машинопису, вона містить 36 рисунка.

Матеріали і методи дослідження. В експериментах використовувались білі щури лінії Вістар віком 7-19 днів. Тварини утримувались у стандартних умовах віварію Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Електрофізіологічні вимірювання методом "петч клемп" у режимі фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина" з внутрішньоклітинною перфузією проводились на ізольованих пірамідних нейронах гіпокампа зони СА1 і СА3, та нейронах Пуркіньє мозочка. Гліцинактивовані відповіді нейронів реєструвалися при знаходженні клітин у розчині Рінгера наступного складу (у мілімолях на 1 л): NaCl - 130; CaCl_2-3; KCl - 5; MgCl_2-2; HEPES-NaOH - 10 (pH 7.4), який містив 10 мкМ бікукуліну для запобігання активації ГАМК_А-рецепторів. Гліцинактивовані струми індукували аплікацією агоніста у різних концентраціях. Внутрішньоклітинний (піпетковий) розчин мав наступний склад (у мілімолях на 1 л): Tris-PO_4-70, EGTA - 5, TEA-Cl - 40, Tris-Cl - 30, Mg-ATФ - 5, ГTФ - 0.5 (pH 7.2).

Реєстрація популяційної активності нейронів проводилась на зрізах гіпокампа. Для отримання збуджуючих постсинаптичних потенціалів (ЗПСП) в зоні СА1 гіпокампа використовували біполярну стимуляцію колатералей Шафера. Експеримени проводили в розчині такого складу (у мілімолях на 1 л): NaCl - 135; KCl - 5; NaHCO_3-26; CaCl_2-2; MgCl_2-1; глюкоза - 20. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю 95 % O₂ та 5 % CO₂ для підтримання pH на рівні 7.35-7.4.

Локальне вирівнювання амінокислотних послідовностей канабіноїдних рецепторів CB1 та CB2 з амінокислотними послідовностями б1, б2 та в субодиниць гліцинових рецепторів було проведено за допомогою інтернет-програми LALIGN/PLALIGN sequence alignment tools, що знаходиться у вільному доступі на сайті European Bioinformatics Institute (http://fasta.bioch.virginia.edu).

Експериментальні дані представлені як середні значення ± стандартне відхилення (SD). Статистичний аналіз було здійснено із використанням програмного пакету "Microcal Origin 7.0" ("Microcal Software", США). Статистичні порівняння виконувалися за t-тестом Стьюдента при рівні значимості р = 0.05.

Результати досліджень та їх обговорення. Як і г-аміномасляна кислота, гліцин є гальмівним медіатором; він активує стрихнін-чутливі гліцинові рецептори (Legendere, 2001). В гіпокампі вивченню цих рецепторів не приділялось достатньої уваги через видиму відсутність гліцинергічної синаптичної передачі. Однак, роботи останніх років вказують на присутність позасинаптичних гліцинових рецепторів у гіпокампі (Chattipakorn and McMahon, 2002). В наших експериментах аплікація гліцину на ізольовані пірамідні нейрони гіпокампа щурів різного віку (7-17 днів) викликала типові хлорні трансмембранні струми. Амплітуда, кінетика активації та десенситизації гліцинактивованих струмів залежала від концентрації гліцину (Рис. 1).

Значення EC₅₀ (91 ± 5 мкМ, n = 4) корелює зі значеннями, які були отримані на свіжеізольованих клітинах гіпоталамуса (90 мкМ) (Akaike and Kaneda, 1989) та гіпокампа (69 мкМ) (Kondratskaya et al., 2002) в роботах інших дослідників. Коефіціент Хілла в наших експериментах становив 2.2 ± 0.2. Досліджувані струми повністю та зворотньо блокувалися селективними блокаторами гліцинових рецепторів стрихніном (1 мкM) та гінголідом В (2-10 мкM). Отримані результати вказують на наявність функціональних стрихнін-чутливих гліцинових рецепторів в пірамідних нейронах гіпокампа.

Нещодавні дослідження виявили, що гліцинові рецептори впливають на тонічне гальмування нейронної активності в гіпокампі (Keck, 2008). Такі функції мозку як навчання та пам'ять залежать від збалансованої регуляції між нейронним збудженням і гальмуванням. Численні дослідження були спрямовані на вивчення механізмів явища синхронізації та осциляцій в мозку ссавців при фізіологічних або патологічних станах, включаючи тета- і гамма-ритми та напади епілептичної (іктальної) активності. У гіпокампі, інтенсивні електричні подразнення (тетанізація) легко викликають довготривалу ритмічну синхронізацію (судомо-подібні розряди) у щурів in vitro (Rafiq et al., 1993) і in vivo (Bragin et al., 1997), а також в людей, пацієнтів з епілепсією (Gloor et al., 1982).

Рис. 1. Залежність характеристик гліцинактивованого струму (IGly) від концентрації агоніста (Gly). Ліворуч: записи IGly, отримані у відповідь на прикладання гліцину при збільшенні концентрацій від 20 до 300 мкМ. Записи отримані від одного пірамідного нейрона, що виділений ферментативно з СА3 ділянки гіпокампа. Гліцин прикладали на 4с при підтримуваному потенціалі -100 мВ в присутності 10 мкМ бікукуліну. Праворуч: залежність пікової амплітуди IGly від концентрації гліцину (n = 4). Дані подані як усереднені значення ± стандартна похибка вимірювання

Ми припустили, що в умовах інтенсивної активації гліцинові рецептори можуть також брати участь в процесах синхронізації нейронної активності. При високочастотній стимуляції, протокол якої імітував природній характер активності, ми виявили, що осциляції нейронної активності, які реєструються в зоні СА1, генеруються в СА3 зоні гіпокампа (Рис. 2) і значною мірою пригнічуються стрихніном (5-10 мкM) (Рис. 3) та селективним антагоністом гліцинових рецепторів гінголідом В (10-20 мкM).

Рис. 2. Синхронна активність в зрізах гіпокампа

Реєстрація (R) синхронної активності від ділянок СА1 та СА3 stratum radiatum гіпокампа у відповідь на стимуляцію (S) колатералей Шафера короткими пачками стимулів з високою частотою (7 стимулів, 50Гц) проводилась кожні 4 хвилини в присутності 30 мкМ бікукуліну. Активність зникала при перерізанні колатералей Шафера, це вказує на те, що саме в ділянці СА3 гіпокампа і виникають осциляції.

Така чутливість синхронної активності до селективних гліцинових блокаторів (Рис. 3) в наших дослідженнях вказуює на те, що гліцинові рецептори залучені в цю активність.

Ми припускаємо, що гліцинергічний вклад в синаптичну передачу може бути частиною механізму ритмічної синхронізації в гіпокампі. Потрібно зауважити, що модель осциляцій, яка була використана в наших дослідженнях ні в якому разі, не може розглядатись як модель епілепсії і є моделлю синхронної групової активності нейронів, що є лише складовою частиною епілептичного процесу.

Рис. 3. Гліцин-керована синхронна активність в зрізах гіпокампа. Ліворуч: записи подій в контролі, в присутності стрихніну та після усунення стрихніну з розчину. Праворуч: спектри потужності відповідних сигналів

В той же час, результати використаної нами моделі дозволяють зробити припущення про роль гліцинових рецепторів в тих процесах, основою яких являється синхронна активність нейронів. Зокрема, частота осциляцій, що генеруються нашою моделлю в точності співпадає з частотою тета-ритмів мозку. Таким чином, можна припустити, що гліцинові рецептори, активність яких виявилась принциповою для виникнення та підтримки осциляцій в нашій моделі, відіграють також визначальну роль у процесах запам'ятовування, просторової орієнтації і т. і. Той факт, що гліцинова компонента синаптичної активності в гіпокампі не знайдена, разом з накопиченими численними фактами про "несинаптичну" активність гліцинових рецепторів, дозволяє припустити, що роллю гліцинових рецепторів є (умновно кажучи) не передача інформації, а модуляція та тонка регуляція активності груп нейронів, що забезпечують передачу та обробку інформації. Модуляція функціонального стану гліцинових рецепторів може призводити до впливу на нейронну активність як поодиноких, так і груп нейронів. канабіноїд гліцин гіпокамп нейронна

Відомо, що канабіноїди беруть участь у регуляції процесів, пов'язаних з пам'яттю, навчанням та формуванням емоцій, контролі больової активності, а також у регуляції вегетативних функцій організму. Активна психотропна складова канабіса тетрагідроканабінол (ТГК) та ендогенні канабіноїди (анандамід, АЕА) мають широкий спектр дії в мозку: в гіпокампі вони впливають на навчання та пам'ять (Gerdeman et al., 2002); в базальних гангліях і гіпоталамусі вони модулюють локомоторну активність, вживання їжі (Tanda and Goldberg, 2003); у спинному мозку та в супраспинальних ділянках проявляють антиноцицептивні ефекти (Cravatt and Lichtman, 2004).

Останнім часом зростає інтерес до канабіноїдів як фактору ризику розвитку шизофренії. Екзогенні канабіноїди порушують нормальне функціонування ендогенної канабіноїдної системи, що є важливим регулятором нейронної передачі. Нещодавні дослідження продемонстрували аномалії функціонування ендоканабіноїдної системи у пацієнтів з шизофренією. Велика кількість даних свідчить про те, що когнітивна дисфункція, притаманна особам, які довгий час вживають маріхуану, нагадує у багатьох аспектах когнітивні особливості, що були запропоновані як ознаки шизофренії (Solowij, 2007). Зокрема, маються на увазі процеси селективної уваги, запам'ятовування та навчання, та взагалі інгібіторні регуляторні механізми мозку. Найбільш цікавими є спостереження, що одним з важливіших клінічних ознак шизофренії є відхилення від норми у пацієнтів в когнітивних тестах основних ритмів мозку в гамма, бета, дельта та тета діапазонах. Автори (Ford, 2008; Schmiedt, 2005) наводять свідчення того, що у пацієнтів з шизофренією спостерігаються порушення когерентності ЕЕГ-відповіді в тета-діапазоні.

На даний момент накопичено величезний об'єм даних про те, що ключовим ланцюгом у механізмі когнітивної функції мозку є осциляції популяційного потенціалу в тканинах мозку. Результати електрофізіологічних, психологічних та анатомічних досліджень вказують на те, що саме аномалії в синхронізованій активності нейронів можуть відігравати центральну роль у патофізіології шизофренії. Нейронні осциляціі є фундаментальним механізмом виникнення та підтримки точних часових відносин між нейрональними подіями, що, в свою чергу, є принциповим для функції пам'яті, сприйняття та свідомості. У пацієнтів з шизофренією, синхронізація у гамма, бета, тета, та дельта діапазоні є аномальною, що обумовлює принциповість ролі таких аномальних осциляцій для виникнення когнітивних дисфункцій та інших симптомів хвороби. Вважається, що порушення осциляцій може бути наслідком аномалій в роботі мозкових ланцюгів генерації ритмів, - мереж ГАМК-інтернейронів, або кортико-кортикальних зв'язків (Uhlhaas, 2010).

В наших дослідженнях тета-осциляціі значно пригнічувались ендогенним канабіноїдом анандамідом (Рис. 4) у присутності антагоністів канабіноїдних рецепторів.

Рис. 4. Модуляція ендоканабіноїдами гліцин-керованої синхронної активності в зрізах гіпокампа не опосередкована канабіноїдними рецепторами. Ліворуч: записи подій в контролі на фоні селективного блокатора СВ1 рецепорів (SR141716A, 2 мкМ) та в присутності анандаміда (АЕА, 20 мкМ). Праворуч: спектри потужності відповідних сигналів

Ці дані добре узгоджуються з попередніми спостереженнями, що як WIN 55,212-2 (синтетичний канабіноїд), так і АЕА пригнічують інтеректальну активність, викликану в середовищі зі зниженим Мg²⁺/підвищеним К⁺, зареєстровану в ділянці СА1 stratum pyramidale гіпокампа (Ameri et al., 1999).

Таким чином, наші результати дозволяють зробити припущення про те, що, принаймні частково, порушення пам'яті та інші когнітивні розлади у пацієнтів із шизофренією, а також у осіб, що вживають маріхуану, є наслідком розладу нормального функціонування гліцинергічної системи у відповідних областях мозку.

Ми припустили, що гліцинові рецептори можуть бути мішенню дії канабіноїдів. Для цього ми досліджували взаємодію канабіноїдів та гліцинових рецепторів в ізольованих пірамідних нейронах гіпокампа щурів. В нашій роботі ми показали, що ендоканабіноїди у фізіологічних концентраціях значно пригнічують пікову амплітуду та прискорюють кінетику активації та десенситизації струму (Рис. 5).

Рис. 5. Модуляція гліцинактивованих струмів анандамідом (АЕА). Записи гліцинових відповідей на прикладання 100 мкМ гліцину в контролі та в присутності 1 мкM АЕА, Vh= - 100 мВ. Зліва направо: нативні записи гліцинактивованих струмів; записи, нормовані щодо максимальної амплітуди струмів, прийнятої за одиницю; фази наростання струмів при збільшенні розгортки

Ступінь впливу канабіноїдів на гліцинопосередковані струми залежав від концентрації канабіноїдів (Yatsenko et al., 2005). Пік амплітуди, кінетика активації та десенситизації гліцин-активованого струму повільно та частково відновлювались після усунення речовин. Ендогенні канабіноїди зменшували значення амплітуди та постійної часу десенситизації (ф_des) струму при всіх досліджуваних підтримуваних потенціалах. Однак зміни кінетики десенситизації струму, спричинені впливом 2-арахідоноїлгліцеролом (2-AG), були більше виражені при позитивних мембранних потенціалах (Рис. 6).

Рис. 6. Середні значення параметрів гліцинактивованих струмів при дії ендогенного канабіноїда 2-арахідоноїлгліцеролу (2-AG) при різних підтримуваних потенціалах (мВ, вказані над стовпчиками)

Усереднені данні, що відображають вплив 1 мкМ 2-AG на пікову амплітуду IGly, постійну часу десенситизації фdes, час наростання струму від 20 до 80 % амплітуди ton та постійну часу деактивації фdeac, отримані при -100 мВ та +20 мВ на мембрані нейрона. Значення параметрів нормовані щодо контрольних значень у відсутності канабіноїду, прийнятих за 100 %.

В нашій роботі ми виходили з припущення, що між канабіноїдами та гліциновими рецепторами існує зв'язок, а саме, канабіноїди здатні модулювати активність гліцинових рецепторів. Адже відомо, що, наприклад, ТГК пригнічує функцію серотонінових рецепторів типу 3 (5-HT₃), причому даний ефект не пов'язаний з безпосередньою активацією канабіноїдних рецепторів (Barann et al., 2002). Аналогічно, такий ендогенний канабіноїд, як анандамід, може пригнічувати функціонування щільових з`єднань у стріарних астроцитах (Venance et al., 1995), а також активацію потенціалкерованих кальцієвих каналів в мембранах Т-канальців (Oz et al., 2000), калієвих каналів різних типів (Oliver et al., 2004), 5-НТ ₃-рецепторів в нейронах вузловатих гангліів щурів (Fan, 1995) і нікотинових ацетилхолінових рецепторів, експресованих в ооцитах Xenopus (Oz et al., 2003). Це вказує на ту обставину, що у ЦНС, імовірно, існують додаткові молекулярні мішені для дії канабіноїдів, і взаємодія їх з такими мішенями являється важливим шляхом модуляції нейронних функцій.

Той факт, що гліцинові належать до одної родини рецеторів з серотоніновими та нікотиновими, на які безпосередньо впливають канабіноїди, дає можливість припустити, що й гліцинові рецетори можуть бути мішенню дії канабіноїдів. В нашій роботі ми виявили, що вплив канабіноїдів на гліцинактивований струм не опосередковується активацією канабіноїдних рецепторів або G-білків, оскільки модуляція хлорного струму зберігалась в присутності блокаторів цих рецепторів та блокатора G-білків (Рис. 7).

Рис. 7. Модуляція гліцинактивованих струмів канабіноїдами не опосередкована СВ рецепторами. Усереднені данні, що демонструють вплив канабіноїдів (1 мкM) на пікову амплітуду IGly, фdes та ton в присутності антагоністів СВ1 рецепторів SR141716A (2мкМ) та AM-251 (1мкМ), або антагоніста СВ 3 рецепторів капсазепіна (CPZ, 1мкМ), а також, при використанні внутрішньоклітинно блокатора G-білків (GDPвS - 2мМ)

Також, комп'ютерний аналіз амінокислотних послідовностей підтвердив можливість прямої взаємодії канабіноїдів з молекулою гліцинових рецепторів. Результати локального вирівнювання амінокислотних послідовностей канабіноїдних рецепторів і різних субодиниць гліцинових рецепторів показало, що при низькому рівні загальної гомології амінокислотних послідовностей певні фрагменти б1, б2 та в субодиниць гліцинових рецепторів містять декілька фрагментів, які виявляють високий рівень гомології до таких ділянок CB1 та CB2 рецепторів, що, вважається, відповідають за взаємодію з агоністом (Mahmoudian, 1997; Tao et al., 1999; Shim et al., 2003).

Разом ці дані вказують на пряму модуляцію гліцинових рецепторів канабіноїдами. Можна зробити висновок, що канабіноїди взаємодіють безпосередньо з гліциновими рецепторами, впливаючи на їх фунціонування в ЦНС.

Сильна психотропна дія канабіноїдів значно обмежує область їх використання. Велике практичне значення може мати виявлення шляхів впливу канабіноїдів, не пов'язаних з істотною прямою активацією канабіноїдних рецепторів. У цьому разі не повинні виникати небажані наркотичні ефекти, котрі зазвичай супроводжують дію канабіноїдів, але такі речовини у даному випадку можуть зберігати певні терапевтичні властивості. Деякі нещодавні дослідження виявили те, що ці речовини можуть викликати ефекти, які не опосередковуються активацією ідентифікованих канабіноїдних рецепторів (Venance et al., 1995; Oz et al., 2000, 2003; Barann et al. 2002; Di Marzo et al., 2002; Oliver et al., 2004). Наприклад, арахідоніл-гліцин, ендогенна сполука що є структурним аналогом анандаміду, є прикладом такої речовини. Не активуючи канабіноїдні рецептори, арахідоніл-гліцин демонструє анальгетичний ефект у моделях нейропатичного болю (Vuong et al., 2008).

Особливу увагу привертають свідчення про те, що канабіноїди, ТГК та анандамід, викликали збільшення амплітуди гліцинактивованих струмів в ооцитах Xenopus і в свіжоізольованих нейронах вентрально-тегментальної зони (Hejazi et al., 2006), а в умовах стимуляції кальційзалежного синтезу ендоканабіноїдів спостерігали потенціацію гліцинактивованих синаптичних струмів в під'язикових мотонейронах (Diana and Bregestovski, 2005). Крім того, показано, що анальгетичний вплив ТГК та анандаміду зберігається в деяких тестах у генетично модифікованих мишей, котрі не мають канабіноїдних СВ1-рецепторів (Di Marzo et al., 2000). Ці данні вказують на існування функціонально важливих мішеней для канабіноїдної сигналізації в мозку крім СВ1-рецепторів.

Було виявлено, що синтетичний аналог WIN 55,212-2 призводив до суттєвого збільшення пікової амплітуди хлорного струму, який викликався низькими концентраціями гліцину (20-40 мкМ). Хоча, час активації та десенситизації струму значно зменшувався при додаванні канабіноїду. Було встановлено, що за наявності AM-251, блокатора СВ1 канабіноїдних рецепторів, вплив WIN 55,212-2 на максимальну амплітуду, час активації і десенситизації струмів, які викликались 40 і 300 мкМ гліцину, також залишався без змін (Яценко та ін., 2007).

Гальмівна нейропередача в ЦНС представлена головним чином амінокислотами ГАМК і гліцином, які активують іонотропні ГАМК_А і гліцинові рецептори відповідно. Відомо, що речовини, які збільшують гальмівні струми, мають виявляти заспокійливий і анальгетичний ефекти, м'язове розслаблення. Наприклад, концентрації ароматичного спирту пропофолу, що викликають знеболення, збільшували гліцинактивовані струми в нейронах мозку і рекомбінантних клітинах (Mascia et al., 1996). Більше того, анестезуючі концентрації трихлоретинолу, ефірів і таких летких галогенованих гідрокарбонатів, як галотан, енфлуран, ізофлуран, метоксифлуран і севофлуран були ефективніші при низьких концентраціях гліцину. Прикладання алкоголю також призводило до збільшення струмів, опосередкованих ГАМК_А і гліциновими рецепторами (Mihic, 1999).

Модуляція гліцинових рецепторів спиртами може пояснювати поведінкові прояви цих речовин. Наприклад, леткі препарати виявляють заспокійливі (Bowen et al., 1996) та антиконвульсивні властивості (Wood et al., 1984), викликають короткочасне відчуття ейфорії (Evans and Balster, 1991), а також зменшують координацію рухів (Moser and Balster, 1985). Канабіноїди викликають помірну ейфорію, зміни у сенсорному сприйняті, антиноцицепцію, труднощі у координації рухів (Pertwee, 2001), поведінкові реакції деякою мірою схожі з дією анестетиків та етанолу. Таким чином, можна припустити, що посилення функціонування гліцинових рецепторів при дії усіх цих сполук відповідає за їх вплив на поведінку, причому ендогенні канабіноїди є природними "анестетиками", тобто сполуками, що посилюють гальмування.

Як вже зазначалось, систематичне використання ТГК і синтетичних канабіноїдів призводить до антиноцицепції та антигіперальгезії в різних експериментальних моделях гострого болю та запалення у тварин. Але механізми цього явища не з'ясовані для багатьох випадків. Для частини випадків відомо, що анальгетичній ефект досягається за рахунок прямої дії канабіноїдів на власні канабіноїдні рецептори.

На фоні цих данних дуже цікаво виглядають результати дослідження нейропатичного болю, в яких анальгетичний ефект викликався арахідоніл-гліцином, ендогенною сполукою, що є структурним аналогом анандаміду, не активує канабіноїдні рецептори, але виявляє анальгетичний ефект (Vuong et al., 2008). Більш того, в роботі (Yang et al., 2008) встановлений прямий вплив арахідоніл-гліцину на гліцинові рецептори. В роботі показано, що, залежно від субодиничного складу рецепторів, дія сполуки є потенціюючою або інгібуючою.

З іншого боку, існують численні данні про роль власне гліцинових рецепторів в больових синдромах. В деяких випадках, наприклад, усування нейропатичного болю досягалось за рахунок потенціації гліцинових рецепторів (Dohi et al., 2009; Hermanns et al., 2008; Morita et al., 2008) шляхом інгібування систем зворотнього захоплення гліцину. В роботі (Dohi et al., 2009) показано, що терапевтичний ефект гліцину, як і іншого гальмівного нейромедіатора ГАМК, залежить від стадії нейропатії, посилюючи больові симптоми на ранніх стадіях розвитку нейропатіі, та полегшуючи симптоми, коли патологія досягла розвитку. Автори пояснюють це явище зміною зовнішньоклітинних умов в процессі пошкодження нервів, зокрема, зміною трансмембранного градієнта хлору, в залежності від якого дія гліцинових рецепторів є гальмівною або збуджуючою.

Отже, цілком очевидно, що принаймні в частині випадків, в яких канабіноїди проявляють анальгетичну дію, ця дія опосередкована модуляцією гліцинових рецепторів.

В даній роботі ми показали, що канабіноїди в фармакологічно допустимих концентраціях прямо змінюють функцію гліцинових рецепторів в нейронах гіпокампа. Причому, існує двоїстий вплив цих речовин, залежно від концентрації гліцину, яка викликає хлорні струми. Збільшення амплітуди та прискорення кінетики десенситизації струму, якщо концентрація гліцину невелика, і зменшення амплітуди та також прискорення кінетики спаду струму при 100 мкМ гліцину і більше. Такий вплив канабіноїдів на функціонування гліцинових рецепторів може мати важливе значення для різних станів організму та умов залучення модуляції цього типу гальмівних рецепторів, особливо в гіпокампі, де вони відіграють тонку регуляторну роль в активності нейронної мережі.

ВИСНОВКИ

Ми дослідили взаємодію канабіноїдів з гліциновими рецепторами та функціональне значення такої на мережеву нейронну активність в гіпокампі. Були використані наступні методи: метод "петч клемп" у режимі фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина", внутрішньоклітинна перфузія, реєстрація популяційної активності нейронів та компьютерний аналіз амінокислотних послідовностей гліцинових і канабіноїдних рецепторів.

1. Гліцинові рецептори залучені в генерацію синхронної активності в гіпокампі, яка виявляє чутливість до селективних антагоністів цих рецепторів.

2. В ізольованих нейронах канабіноїди прискорюють кінетику активації та десенситизації хлорних гліцинактивованих струмів, уповільнючи кінетику їх деактивації. Ендогенні канабіноїди анандамід (АЕА) та 2-арахадоноілгліцерол (2-AG) у фізіологічних концентрація пригнічують амплітуду гліцинактивованих струмів, тоді як синтетичний канабіноїд WIN 55,212-2 призводив до збільшення амплітуди хлорного струму, який викликався низькими концентраціями гліцину.

3. Вплив канабіноїдів на гліцинактивовані струми зберігався в присутності блокаторів канабіноїдних рецепторів та G-білків, що свідчить про незалученість цих рецепторів і сигнальної системи G-білків.

4. За результатами локального порівняння амінокислотних послідовностей гліцинових і канабіноїдних рецепторів встановлені можливі місця взаємодії канабіноїдів з субодиницями гліцинових рецепторів, ділянки яких виявляють високий рівень гомології до сайтів зв'язування з агоністом у канабіноїдних рецепторах.

5. Канабіноїди однаково впливали на гліцинактивовані струми в пірамідних нейронах гіпокампа зон СА1 і СА3 та Пуркіньє нейронах мозочка, що вказує на загальність описаної дії.

6. Синхронна активність нейронної мережі в гіпокампі може змінюватись під впливом ендоканабіноїдів через пряму постсинаптичну дію на функціонування гліцинових рецепторів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

1. Glycine receptors in CNS neurons as a target for non-retrograde action of cannabinoids / Natalia Lozovaya, Natalia Yatsenko, Andrey Beketov, Timur Tsintsadze, Nail Burnashev // Journal of Neuroscience. - 2005. - Vol. 25. - P. 7499-7506. Особистий внесок здобувача - провела електрофізіологічні вимірювання та статистичну обробку результатів, брала участь в обговоренні даних та їх узагальненні, написанні та оформленні статті.

2. Н.М. Яценко / Вплив канабіноїдів на гліцинактивовані струми в пірамідних нейронах гіпокампу щурів / Н.М. Яценко, Н.О. Лозова // Нейрофізіологія/Neurophysiology. - 2007. - Т. 39, № 1. - С. 15-21. Особистий внесок здобувача - провела дослідження та опрацювання даних, проаналізувала літературні джерела, написання та оформлення статті.

3. Н.М. Яценко / Синтетичний аналог канабіноїдів WIN 55,212-2 збільшує амплітуду гліцинактивованих струмів / Н.М. Яценко, Т.Ш. Цінцадзе, Н.О. Лозова // Фізіологічний журнал. - 2007. - Т. 53, № 3. - С. 31-37. Особистий внесок здобувача - провела дослідження та опрацювання даних, проаналізувала літературні джерела, написання та оформлення статті.

Тези:

4. Н.М. Яценко, Н.О. Лозова. Дія синтетичного канабіноїда WIN 55,212-2 на гліцин-керовані канали в пірамідних нейронах гіпокампу та мозочку щурів // III конференція Українського товариства нейронаук з міжнародною участю: матеріали конф. - Донецк, Україна. - Нейронауки: теоретичні і практичні аспекти. - 2005. - Т. 1, № 1. - С. 143-144.

5. Modulation of glycine-activated chloride currents in CA1-CA3 hippocampal neurons by cannabinoids / Lozovaya N., Yatsenko N., Tsintsadze T., Burnashev N // FENS Abstr. - 2004. - Vol. 2. - A116.7.

6. Cannabinoid modulation of inhibitory synaptic transmission by a direct action on postsynaptic GABA(A) receptors / Min R., Golovko T., Yatsenko N., Lozovaya N., Mack V., Rozov A., Burnashev N. // FENS Abstr. - 2006. - Vol. 3. - A150.13.

7. Dual effects of cannabinoids on glycine-activated chloride currents / Yatsenko N., Lozovaya N., Burnashev N. // FENS Abstr. - 2008. - Vol. 4. - 145.37.

АНОТАЦІЯ

Яценко Н.М. Модуляція гліцинових рецепторів канабіноїдами в нейронах ЦНС щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено дослідженню дії синтетичних та ендогенних канабіноїдів на характеристики гліцин-активованих струмів. Показано, що канабіноїди (як синтетичні, так і ендогенні) у фізіологічних концентраціях модулюють гліцин-активовані струми в пірамідних нейронах СА3 і СА1 зони гіпокампу та в нейронах Пуркіньє мозочку, дуально впливаючи на пікову амплітуду, прискорюючи кінетику активації та десенситизації струму. Продемонстровано, що ефект канабіноїдів на гліцин-активований струм не опосередковується активацією канабіноїдних рецепторів.

Відомо, що гліцинові рецептори можуть регулювати роботу синаптичної мережі в гіпокампі. Ми показали залученість гліцинових рецепторів в синхронну активність, яка в гіпокампі може брати участь в процесах сенсорної обробки, пам'яті та контролі свідомого пересування. Проаналізована можливість модуляції активності гіпокампальної мережі через пряме інгібування гліцинових рецепторів ендоканабіноїдами, таким чином, відкриваючи нові механізми дії канабіноїдів.

Ключові слова: гліцинові рецептори; канабіноїди; гіпокамп; синхронна активність.

АННОТАЦИЯ

Яценко Н.М. - Модуляция глициновых рецепторов каннабиноидами в нейронах ЦНС крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию действия синтетических и эндогенных каннабиноидов на характеристики глицин-активируемых токов. Показано, что каннабиноиды (как синтетические, так и эндогенные) в физиологических концентрациях модулируют глицин-активируемые хлорные токи в пирамидных нейронах СА3 и СА1 зон гиппокампа и в нейронах Пуркинье мозжечка, двояко оказывая влияние на пиковую амплитуду, ускоряя кинетику активации и десенситизации тока. Показано, что эффект каннабиноидов на глицин-активируемый ток не опосредуется активацией каннабиноидных рецепторов.

Известно, что глициновые рецепторы могут регулировать работу синаптичекой сети в гиппокампе. Мы показали вовлеченность глициновых рецепторов в синхронную активность, которая в гиппокампе может принимать участие в просессах сенсорной обработке, памяти и контроле сознательного передвижения. Проанализирована возможность модуляции активности гиппокампальной сети прямым ингибированием глициновых рецеторов эндоканнабиноидами, таким образом открывая новые механизмы действия каннабиноидов.

Ключевые слова: глициновые рецепторы; каннабиноиды; гиппокамп; синхронная активность.

SUMMARY

Yatsenko N.M. - Modulation of glycine receptors by cannabinoids in rat CNS neurons. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree (PhD) in Biology by specialty 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

The present work is devoted to the investigation of a novel direct modulation of glycine-activated chloride channels by cannabinoids in isolated hippocampal pyramidal and Purkinje neurons.

Here, we demonstrate that cannabinoids may directly affect the functioning of inhibitory glycine receptor (GlyR) channels. In isolated hippocampal pyramidal and Purkinje cerebellar neurons, endogenous cannabinoids anandamide and 2-arachidonylglycerol, applied at physiological concentrations (0.2-2 µM), strongly inhibited the peak of the glycine-activated current (I_Gly) in a concentration-dependent manner. Meanwhile, the I_Gly onset and desensitization were accelerated in the presence of endocannabinoids. Endogenous cannabinoids significantly reduced peak of I_Gly at all tested holding potentials. However, the changes in the decay kinetics, induced by 2-AG, were more pronounced at positive membrane potentials.

In contrast to endocannabinoids, the synthetic cannabinoid agonist WIN 55,212-2 (1 µM) cause significant potentiation of the I_Gly peak amplitude, observed at the lowest concentration of Gly. With increasing concentrations of agonist, the potentiation significantly decreased. The WIN 55,212-2-induced acceleration of desensitization and rise time of I_Gly exhibited clear concentration dependence. As in the case of endocannabinoids, prominent voltage dependence of the I_Gly desensitization observed in control conditions was practically eliminated in the presence of WIN 55,212-2. This corresponds to a much more pronounced effect of WIN 55,212-2 on the desensitization kinetics at depolarized potentials.

The effects of cannabinoids on I_Gly were not attenuated in the presence of CB1R antagonists, vanilloid receptor 1 antagonists, and the G-protein inhibitor, suggesting that cannabinoid receptors activation are not involved in action of cannabinoids on GlyRs.

We also demonstrate that, in the presence of a GABA(A) receptor antagonist, GlyRs may contribute to the generation of synchronous activity induced by short bursts of high-frequency stimulation of inputs to hippocampal CA1 region, because this activity was diminished by selective GlyR antagonists (strychnine and ginkgolides B and J). The GlyR-mediated rhythmic activity was also reduced by cannabinoids (anandamide) in the presence of a CB1 receptor antagonist. These results suggest that the direct inhibition of GlyRs by endocannabinoids can modulate the hippocampal network activity.

Our findings suggest a fundamental importance of GlyR in hippocampal network activity and nominate GlyR as a novel target for endocannabinoid signaling.

Key words: glycine receptor; cannabinoids; hippocampus; synchronous activity.

Размещено на Allbest.ru

...