Морфофункціональні зміни клітин крові, зябер і хвостового плавця риб при оцінці якості водного середовища і дії токсичних чинників

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність проблеми. Проблема забруднення водного середовища набуває все більшої гостроти, що зростає з кожним роком. Зміна екологічних факторів у біосфері, викликана постійним антропогенним впливом, призводить до погрозливої ситуації, щодо виживання та здоров'я живих організмів. Тому в комплексі заходів, спрямованих на запобігання негативним впливам на здоров'я, пов'язаних з водним фактором, важливе місце повинна займати оцінка якості води, її безпечності для людини (Левич А.П., 2004). Тому розробка ефективних методів для оцінки як прямого, так і опосередкованого впливу техногенних та інших забруднювачів на живі організми стає все більш актуальною.

Антропогенні зміни водних екосистем не можуть не відображатись на фізіологічному стані гідробіонтів, зокрема риб. Актуальність питання про використання гематологічних показників риб для моніторингу була відзначена багатьма авторами (Аленичев С.В., 2000; Лугаськова Н.В., Насыйров Р.А., 2001). Гематологічні показники добре відображають реакцію декількох систем організму на вплив різноманітних фізіологічних та патологічних факторів на організм (Кондратьева И.А., Киташова А.А., 2002). Умови перебування накладають відбиток на морфологічні особливості і кількісні показники червоної й білої крові. До того ж, гематологічні показники являються високо специфічними для виду і змінюються в достатньо вузьких межах, що дозволяє використовувати їх в якості маркерів різних фізіологічних та патологічних процесів.

Незважаючи на фундаментальні дослідження, проведені в області іхтіогематології (Житенева Л.Д. та ін., 1989; Иванова Н.Т., 1983), рівень знань про особливості морфології клітин крові риб та можливість їх використання для екологічного моніторингу все ще не достатні. Зокрема, наявні відомості про склад, морфологічні особливості та кількісну динаміку лейкоцитів у прісноводних та морських риб обмежені, а тому не дозволяють ефективно використовувати показники білої крові в якості морфофізіологічного індикатора. Серед перспективних методологічних підходів до використання показників крові у якості біомаркерів слід відзначити мікроядерний тест, який успішно використовується на рибах як метод дослідження генотоксичності водних розчинів різних класів сполук in vivo, так і для моніторингу хімічного забруднення води in situ (Arkhipchuk V.V., Garanko N.N., 2005; Cavaє T, Ergene-Gцzьkara S., 2005).

Таким чином, дослідження цитоморфологічних параметрів клітин крові та інших тканин (зябра і хвостовий плавник) дозволить одержати інформацію про стан імунітету особини, рівня її впливу стресових чинників й стабільності геному (по частоті мікроядер та ядерних аномалій в еритроцитах), що в сукупності з іншими параметрами, одержуваними при популяційних дослідженнях (генотип, особливості морфології) може дати відомості, надзвичайно корисні у практичному й у теоретичному відношенні.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було оцінити гематологічні показники та охарактеризувати морфофункціональні зміни клітин периферичної крові і деяких тканин (зябра, хвостовий плавник) костистих риб в нормальних умовах та при дії токсичних речовин.

Відповідно до поставленої мети у роботі вирішували такі завдання:

1. Дослідити лейкоцитарну формулу крові та фоновий рівень порушень структури ядра еритроцитів деяких найбільш поширених представників океанічних (антарктичних), морських і прісноводних риб в нормі;

2. Дослідити зміну клітинного складу лейкоцитів крові риб при впливі токсичних речовин органічної та неорганічної природи;

3. Дослідити вплив токсичних речовин органічної та неорганічної природи на морфологічні параметри ядра еритроцитів, клітин зябер та хвостового плавця риб;

4. Проаналізувати напрямок морфофункціональних змін в клітинах риб у відповідь на токсичний вплив за допомогою методів дослідження апоптозу;

5. Дослідити вплив проб води з природних водойм на гематологічні показники та показники цитогенетичної стабільності еритроцитів, клітин зябер та хвостового плавця риб в процесі біотестування та біомоніторингу.

1. Матеріали і методи дослідження

В роботі досліджували клітини периферичної крові, хвостового плавця та зяберні клітини риб.

У дослідженнях використовували: акваріумних риб Carassius auratus, Danio rerio, вирощених в акваріумах лабораторії; прісноводних риб Carassius auratus gibelio, Cyprinus carpio, Abramis brama, виловлених в р. Ворскла Полтавській області; 30 Mugil cephalus, виловлені поблизу м. Афіни, на узбережжі Середземного моря (Греція) впродовж жовтня 2007р; антарктичні види риб: 135 екземплярів Notothenia coriiceps, 85 екземплярів Trematomus bernacchii і 120 екземплярів Chaenocephalus aceratus. Представники усіх антарктичних видів булі піймані під час зимівлі 2003-2004 р. в ході 9 Української Антарктичної експедиції в районі станції «Академік Вернадський».

В умовах лабораторії риби знаходились в стандартних умовах: температура води становила 23±1єС, значення рН - в межах 7,7-8,2, в акваріумах проводили постійну аерацію за допомогою мікрокомпресора. Риб годували 2 рази на добу живими артеміями. В роботі з тест-організмами дотримувались етичних норм і правил роботи з хребетними тваринами.

В роботі досліджувався вплив розчинів мідного купоросу в концентраціях іону Сu2+ 0,1 та 2,5 мг/л та солі кадмію CdCl2 в концентраціях іону Сd2+ 0,005 та 1,0 мг/л, розчини бензидину в концентраціях 10, 20 та 40 мг/л. Риби утримувались в досліджуваних розчинах протягом 4 діб з застосуванням аерації та стандартним режимом годівлі.

Для дослідження впливу антропогенного забруднення, зразки води були відібрані з прісноводних об'єктів України: рік Десна та Дніпро у районі міста Києва, загалом три станції. Зразок № 1 -- зразок води з ріки Дніпро (р-н Гідропарк, м. Київ); зразок № 2 - зразок води з ріки Дніпро (р-н Бортничі, м. Київ); зразок №3 - зразок води з ріки Десна (с. Хотянівка). Риби утримувались в досліджуваних розчинах протягом 4 діб з застосуванням аерації та стандартним режимом годівлі.

У морській затоці Саронікос (Середземне море) біля міста Афіни, було обрано дві станції: район Перама (зразок №4), із значним рівнем антропогенного забруднення завдяки присутності підприємств важкої промисловості та близькості порту Пірей, а також район Анавісос, у східній частині затоки, з низьким рівнем антропогенного забруднення (зразок №5). В означених пунктах для дослідження було виловлено по 15 особин Mugil cephalus.

Для приготування цитологічних препаратів кров відбирали з хвостової вени та робили мазки, які далі висушували та фіксували в 96% етанолі.

При дослідженні формули крові риб використовували загальновідомі методи фарбування цитологічних препаратів крові. Для визначення формули крові в чотирьох ділянках мазка підраховували 1250 клітин, ідентифікуючи їх за класифікацією, запропонованою Н.Т. Івановою (Иванова Н.Т. 1983), а потім вираховували відсоток кожного типу клітин.

Генотоксичність оцінювалась за мікроядерним тестом на клітинах риб: еритроцитах, клітинах зябер та хвостового плавця (Al-Sabti, 1991). Аналіз препаратів крові, зябер та клітин хвостового плавця проводили під світловим мікроскопом із загальним збільшенням х1000 підраховували кількість клітин з мікроядрами та іншими патологіями мітозу, загальна кількість проаналізованих клітин на цитологічному препараті складала 3 тисячі клітин в кожному випадку.

Для виявлення клітин зябер риб в стані апоптозу з свіжовиділених фрагментів зябрової тканини готували мазки-відбитки на предметному склі. Відбитки зябрової тканини фіксували метанолом. Фарбування цитологічних препаратів проводили флуоресцентним ядерним фарбником Hoechst 33258. Морфологічні зміни визначали під флуоресцентним мікроскопом ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, Росія) при збільшенні в 500 разів у області збудження 360-440 нм та емісії 480-700 нм.

У роботі використовували наступні флуоресцентні сполуки: 1) пропідію йодид - для виявлення клітин із пошкодженням проникності плазматичної мембрани, робоча концентрація 1-2 мкг/мл; 2) FITC-мічений кон'югат анексину V.

Міжнуклеосомну фрагментацію ДНК еритроцитів риб в стані апоптозу досліджували за допомогою електрофорезу у гелі 1,5% агарози. Зони ДНК виявляли в ультрафіолетовому світлі.

Лектиноцитохімічний аналіз цитоморфологічних змін клітин крові риб за дії негативних чинників водного середовища із використанням ферментативних кон'югатів лектинів здійснювався як описано раніше (Franz S. et al., 2007). У дослідженні використовували лектини RCA (Ricinus communis agglutinin) та NPL (Narcissus pseudonarcissus Lektin). Аналіз та статистичну обробку результатів проводили за допомогою стандартного пакету програм Excel (для Windows 98) та STATISTICA 6.0. Статистичну достовірність оцінювали за параметричним t-критерієм Ст'юдента.

2. Результати досліджень та їх обговорення

Порівняльний аналіз лейкоцитарної формули крові досліджуваних видів риб. Проведено порівняльний аналіз лейкоцитарної формули крові антарктичних риб: Notothenia coriiceps, Trematomus bernacchii, Chaenocephalus aceratus, а також Carassius auratus gibelio, Cyprinus carpio, Abramis brama, виловлених в Полтавській області та Carassius auratus auratus з акваріумів лабораторії. В крові риб у Notothenia coriiceps спостерігали найвищий вміст бластних клітин серед всіх досліджуваних видів риб, в середньому в 5 разів вище ніж у риб Trematomus bernacchii та Chaenocephalus aceratus, і в десятки разів в порівнянні з прісноводними видами риб (табл. 1). В крові особин Cyprinus carpio та Abramis brama бластних клітин не спостерігали.

Таблиця 1. Лейкоцитарна формула крові (%) антарктичних риб

Примітка: *р<0,05 в порівнянні з прісноводними видами риб (за сукупними результатами для чотирьох прісноводних видів)

Кількість паличкоядерних нейтрофілів у різних груп прісноводних риб достовірно не відрізнялася. В той же час у антарктичних видів цей показник становив близько 3%, тобто був значно вищим в порівнянні з Carassius auratus auratus (р < 0,05). Відсоток сегментоядерних нейтрофілів у Антарктичних видів був вищим (р < 0,05). ніж у Carassius auratus та Abramis brama і майже не відрізнявся від даного параметру у Carassius auratus gibelio та Cyprinus carpio.

Таблиця 2. Лейкоцитарна формула крові (%) прісноводних риб

Примітка: *р<0,05 в порівнянні з океанічними видами риб (за сукупними результатами для трьох океанічних видів).

Лейкоцитарна формула крові антарктичних риб значно відрізняється від лейкограмми прісноводних риб більш високим вмістом поліморфноядерних лейкоцитів 23,26% за рахунок зниження частки лімфоцитів (р < 0,05).

Кількість еозинофілів у прісноводних риб вище в 2,25 разів, ніж у крові антарктичних особин (р < 0,05). Вищий вміст еозинофілів у прісноводних риб з природного середовища порівняно з рибами, адаптованими до умов акваріума, також можливо пов'язаний з забрудненням водойм в яких було виловлено цих риб, оскільки, згідно з літературними даними збільшення вмісту еозинофілів в крові риб може свідчити, як про інфекційний чи інвазійний вплив, так і про присутність ксенобіотиків в воді (Roche H., Boge G., 1996).

Частка базофілів в крові антарктичних видів в порівнянні з даними для прісноводних видів значно більша (р < 0,05). Базофіли деякими авторами класифікуються як псевдоеозинофіли, або «базофіли, псевдоеозинофіли» і їх кількість варіює від 0,4 до 0 % у карпових риб, причому їх функція в крові риб до кінця не вивчена (Минеев А.К., 2002).

Значно більш вираженою різниця поміж прісноводними та океанічними видами була у випадку моноцитів. Рівень моноцитів в крові усіх досліджуваних антарктичних видів був біля 7-8 відсотків, в той час як у прісноводних риб на них припадало близько 4-х відсотків.

Кількість лімфоцитів в крові у прісноводних особин була достовірно вищою (р < 0,05) в порівнянні з даними антарктичних видів риб.

Отже, отримані дані свідчать, що лейкоцитарна формула крові антарктичних видів риб характеризується певною специфікою в порівнянні з прісноводними та лабораторними видами. Відмінності спостерігаються в основному по моноцитам (7,34% у антарктичних видів та 4,14% у прісноводних риб), еозинофілам (0,08 % та 0,18 %, відповідно у антарктичних та прісноводних видів риб) базофілам (6,59% та 5,02%) та лімфоцитам (76,73% у антарктичних риб та 84,189% у прісноводних).

Рівень мікроядер та порушень структури ядра в еритроцитах досліджуваних видів риб. Досліджено рівень мікроядер та інших порушень структури ядер еритроцитів периферичної крові Carassius auratus gibelio, Cyprinus carpio, Abramis brama, виловлених в Полтавській області, та Carassius auratus auratus з акваріумів лабораторії.