Молекулярно-генетичний аналіз роду Beta L

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«ІНСТИТУТ ХАРЧОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ГЕНОМІКИ НАН УКРАЇНИ»

УДК 633.63: 575.113:575.174.015.3

03.00.22 - молекулярна генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ РОДУ BETA L

Шаюк Людмила Володимирівна

Київ - 2010



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті цукрових буряків Національної академії аграрних наук України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, академік НААН України Сиволап Юрій Михайлович Південний біотехнологічний центр у рослинництві НААН України і МОН України, директор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Галкін Анатолій Павлович Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу біоінженерії

доктор біологічних наук, Тищенко Олена Миколаївна Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу генетичної інженерії

Захист відбудеться 21 грудня 2010 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.254.01 у ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського 2а

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського 2а

Автореферат розісланий 19 листопада 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Ємець А.І.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження останніх десятиліть у галузі молекулярної генетики суттєво розширили наше уявлення щодо молекулярної організації геному еукаріот. Одним з напрямків молекулярної генетики є аналіз та характеристика генетичного різноманіття культурних рослин і диких видів їх родів на основі поліморфізму ДНК. Молекулярно-генетичний аналіз структури генотипів дозволяє суттєво розширити уявлення щодо філогенетичного положення, таксономічної належності та удосконалити технологію ідентифікації як на між-, так і внутрішньовидовому рівні (Антонов, 2000, Biancardi et al., 2005, Абрамсон, 2007 ).

Рід Beta L. представлений перехреснозапильними, трав'янистими, багаторічними рослинами, що поширені у Європі, Середній Азії, Північно-Західній Африці (Зосимович, 1940). Обширний географічний ареал та різні екологічні умови, де розповсюджені буряки, спричинили високий поліморфізм представників у дикому стані, що в свою чергу істотно ускладнило систематику роду. Як наслідок, багато дослідників підходить по-різному до вирішення проблем систематики та вивчення видів роду Beta L. (Letschert, 1993, Shen et al., 1998, Буренин и др., 1998). Тому в літературних джерелах представлені різні, часто навіть суперечливі дані стосовно кількості видів та їх філогенетичного положення. Зазначимо, що до одного з видів роду, а саме B. vulgarіs L., відносяться цукрові, столові, кормові та листкові буряки (Зосимович, 1940, Красочкин, 1971). Створення великої кількості їх сортів та гібридів вимагає наявності надійних та об'єктивних методів ідентифікації. У різних країнах світу, молекулярно-генетичні методи з успіхом використовуються для ідентифікації ліній та гібридів цукрових буряків (Dцrnte, 2001; Richards et al., 2004; Свирщевская и др., 2008; Smulders et al., 2010 Федулова, 2010). Поряд із цим, для оцінки та ідентифікації вітчизняних селекційних матеріалів цукрових буряків молекулярно-генетичні методи не залучались.

Отже, розробка та удосконалення методів дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. та цукрових буряків, зокрема, набувають важливого значення як для з'ясування філогенетичних взаємовідношень, так і як один з елементів більш досконалої експертизи системи захисту прав селекціонерів та моніторингу насіннєвого матеріалу різного походження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В основу роботи покладено дослідження, виконані у рамках науково-дослідних робіт Інституту цукрових буряків НААН України та Південного біотехнологічного центру у рослинництві НААН України: наукова програма “Цукрові буряки” на 1996-2000 рр. за завданням: «Розробити генетичні та фізіолого-біохімічні технології створення нових селекційних матеріалів цукрових буряків, стійких до комплексу несприятливих факторів середовища» (номер державної реєстрації 0196U012876); наукова програма “Цукрові буряки” на 2001-2005 рр. за завданням: «Розробити генетико-фізіологічні основи ідентифікації і маркування генотипів і методи створення толерантних до стресових умов вихідних матеріалів з використанням біотехнологій» (номер державної реєстрації 0101U001246); наукова програма «Сільськогосподарська біотехнологія» на 2001-2005 рр., підпрограма 1 «Новітні біотехнології в рослинництві» за завданням: «Розробити біотехнологічні методи і технології їх використання для створення та ідентифікації високопродуктивних і стійких до біотичних та абіотичних факторів селекційних матеріалів цукрових буряків» (номер державної реєстрації 0104U002616); наукова програма «Сільськогосподарська біотехнологія 2006-2010 рр.», підпрограма «Розробити біотехнології створення нових генотипів у рослинництві та генетичного контролю кількісних і якісних ознак» за завданням: «Розробити біотехнологічні методи оцінки вихідного селекційного матеріалу цукрових буряків за допомогою аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L.» (номер державної реєстрації 0105U007188) та за завданням «Використання ДНК-маркерів для дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму диких видів роду Beta L.» (номер державної реєстрації 0108U003677).

Мета і завдання досліджень. Метою дисертаційної роботи було встановлення молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. на між- і внутрішньовидовому рівні та проведення оцінки алельного стану мікросателітних локусів для ідентифікації ліній цукрових буряків селекції ІЦБ НААН України.

Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:

дослідити молекулярно-генетичний поліморфізм видів буряків та проаналізувати відповідність отриманих даних філогенетичній систематиці роду Beta L.; генетичний селекція цукровий буряк

провести молекулярно-генетичний аналіз поліморфізму Beta vulgaris ssp. vulgaris та Beta vulgaris ssp. maritima різного географічного походження;

дослідити алельний стан п'яти мікросателітних локусів у геномі цукрових буряків селекції ІЦБ НААН України;

оцінити рівень внутрішньолінійної гетерогенності у чоловічостерильних ліній та багатонасінних запилювачів цукрових буряків;

розробити молекулярно-генетичні формули за алельними варіантами мікросателітних локусів для ліній цукрових буряків селекції ІЦБ НААН України.

Об'єкт дослідження - молекулярно-генетичний поліморфізм буряків.

Предмет дослідження - поліморфізм RAPD-локусів у геномі диких видів роду Beta L. і підвидів B. vulgarіs L. та мікросателітних локусів у геномі ліній цукрових буряків селекції ІЦБ НААН України.

Методи дослідження : молекулярно-генетичні методи (виділення ДНК, ПЛР-аналіз (RAPD та SSR), електрофорез ДНК у агарозному гелі) та розрахунково-порівняльні методи (встановлення генетичних дистанцій, кластеризація, розрахунок розміру алелів, індексу інформативності локусу (РІС), частот алелів та генотипів).

Наукова новизна одержаних результатів. Унаслідок проведених досліджень отримано нові наукові результати, а саме:

- вперше встановлено алельний склад п'яти мікросателітних локусів: GZM 017, GZM 058, GZM 086, Bvm 3 та Bvm 4 у восьми чоловічостерильних ліній та шести багатонасінних запилювачів селекції ІЦБ НААН України, визначено генетичні дистанції між ними, а також ступінь міжлінійного і внутрішньолінійного поліморфізму;

- створено базу даних алельних характеристик за мікросателітними локусами для чоловічостерильних ліній і багатонасінних запилювачів вітчизняної селекції, які є компонентами схрещування при створенні перспективних гібридів на основі чоловічої стерильності;

- вперше проведено порівняльний аналіз алельного складу мікросателітних локусів ліній української селекції з європейськими формами, ідентифіковано специфічні для вітчизняних ліній алелі, які можуть слугувати тестами генетичного різноманіття досліджених ліній цукрових буряків.

Практичне значення одержаних результатів. Створено маркерні системи RAPD-праймерів з високою диференційною здатністю, які дозволяють встановити генетичні дистанції для диких видів роду Beta L., підвидів B. vulgarіs L. різного географічного походження та експериментально створених селекційних зразків. Розроблено методичні рекомендації із визначення молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

На основі молекулярно-генетичного аналізу поліморфних мікросателітних локусів визначено параметри ідентифікації восьми чоловічостерильних ліній і шести багатонасінних запилювачів, які використовуються в селекції цукрових буряків як компоненти схрещування при створенні перспективних гібридів на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності. Створено базу даних алельних характеристик чотирнадцяти ліній цукрових буряків за мікросателітними локусами GZM 017, GZM 058, GZM 086, Bvm 3 та Bvm 4 з метою вдосконалення системи захисту авторських прав на новостворені оригінальні лінії.

Розроблено Національний стандарт України із встановлення молекулярно-генетичного поліморфізму селекційних матеріалів цукрових буряків.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено пошук, аналіз та узагальнення наукових джерел вітчизняних і зарубіжних авторів за темою дисертаційної роботи, розроблено програму експериментальних досліджень та проведено їх, проаналізовано результати та підготовлено до друку праці. Основні положення і висновки дисертаційної роботи сформульовані автором та обговорені з науковим керівником - академіком Сиволапом Ю.М.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на засіданнях методичної та Вченої ради Інституту цукрових буряків НААН України (2001-2009 рр.); IV Міжнародній конференції «Геном растений» (Одеса, Україна, 2003 р.); VIII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім.. М.І.Вавилова (Алушта, Автономна Республіка Крим, Україна, 2006 р.), методично-координаційній раді Південного біотехнологічного центру у рослинництві НААН України (Одеса, Україна, 2007 р.), Міжнародній науковій конференції «Теоретичні основи і сучасні методи створення однонасінних гібридів цукрових буряків» (Київ, Україна, 2008 р.).

Публікації. Основні результати досліджень за темою дисертаційної роботи викладено в десяти друкованих працях, що включають: шість статей, із них три у фахових виданнях, один ДСТУ, одні методичні рекомендації та дві тези доповідей у збірках матеріалів конференції.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, 5 розділів, висновків, рекомендацій виробництву, списку використаної літератури та додатка, включає 10 таблиць, 29 рисунків. Список використаних літературних джерел має 194 найменувань, з яких 141 латиницею.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано та узагальнено результати досліджень різних авторів з питань структурно-функціональної організації геному буряків, методів виявлення молекулярно-генетичного поліморфізму та класифікації видів роду Beta L., підвидів B. vulgarіs L. різного географічного походження, а також розглянуто аспекти створення перспективних гібридів цукрових буряків на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності.

Матеріали та методи досліджень. Рослинна вибірка для дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. складалась з десяти диких видів буряків та чотирьох форм виду B. vulgaris.

У дослідженнях внутрішньовидового генетичного різноманіття B. vulgaris L. використали вісім зразків B.v.ssp. maritima та шість зразків B.v.ssp. vulgaris європейського та азіатського походження.

Поліморфізм мікросателітних локусів дослідили для восьми чоловічостерильних ліній та шести багатонасінних запилювачів цукрових буряків, які є компонентами схрещування при створенні перспективних гібридів на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності.

Виділення ДНК із рослинних зразків проводили з використанням ЦТАБу (Li H. et al., 2001). Зразки видів та підвидів являли собою суміш ДНК п'яти рослин. Зразки ДНК ліній цукрових буряків були представлені окремими генотипами, по тридцять п'ять для кожної лінії.

Для дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму видів роду Beta L. та підвидів B. vulgaris використали двадцять одиничних праймерів завдовжки від 10 до 22 нуклеотидів. Поліморфізм ліній цукрових буряків детектували за п'ятьма МС-локусами: GZM 017, GZM 058, GZM 086, Bvm 3 та Bvm 4.

RAPD-аналіз проводили згідно з методикою Сиволапа та ін. (1999). Для проведення SSR-аналізу керувалися даними, опублікованими Mцrchen et al. (1996), Dцrnte (2001).

Реакцію ампліфікації проводили у програмованих термостатах «Терцик» (ДНК-технологія, Росія), «AMПЛИ 4L» (Biokom, Росія) та «TC 48» (Cleaver Scientific Ltd, Великобританія).

Розподіл продуктів ампліфікації проводили у 2% та 4%-агарозному гелі (Agarose SFRTM, Amresco) за допомогою електрофорезу згідно з методикою Westermeier (2001).

Генетичну подібність та генетичні дистанції обчислювали відповідно Nei et al. (1983). На основі генетичних дистанцій здійснили розподіл генотипів за допомогою кластерного аналізу (Unweighted pair group average). Для характеристики поліморфізму мікросателітних локусів розрахували частоти ідентифікованих алелів та індекс поліморфності локусу (РІС). Внутрішньолінійний поліморфізм селекційних зразків цукрових буряків оцінили на основі частот генотипових класів за алелями мікросателітних локусів.

ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНОГО ПОЛІМОРФІЗМУ ВИДІВ РОДУ BETA L.

Види роду Beta L. поширені в Індії, країнах Азії, Середземномор'ї, на африканському та європейському узбережжях Атлантичного океану. Умови довкілля на цих територіях доволі контрастні, що спричинило як міжвидове, так і внутрішньовидове розмаїття, а це, в свою чергу, обумовлює надзвичайну складність створення об'єктивної класифікації. Отже, виникає необхідність у дослідженні поліморфізму видів роду Beta L. на основі молекулярно-генетичного аналізу та встановленні відповідності отриманих даних філогенетичній систематиці роду.

Молекулярно-генетичний аналіз видів буряків здійснили за допомогою 11 RAPD-праймерів, що дозволили виявити 172 локуси, з яких 170 - поліморфні. Неполіморфні локуси було детектовано лише за допомогою одного праймеру - Р65. Ідентифікований рівень поліморфізму становив 99%, що є характерним для досліджень на міжвидовому рівні. За такого високого рівня поліморфізму всі інші статистичні показники були теж високими. ІСП (індекс специфічності праймеру) коливався у межах від 2,7 до 3,9. Найбільше значення цього показника встановлено для праймеру Р39 (3,9), дещо нижче - для праймерів Р74, Р60 та Р27 (3,6-3,8), а найнижче - для Р65 (2,7). Значення РІС (індекс поліморфності локусу) змінювалося у межах від 0,31 до 0,4. Найнижче значення цього показника було встановлене для локусів, отриманих за допомогою праймерів Р39 та Р65 (0,31), а найвище - для локусів, отриманих за допомогою праймерів Р27, Р55 та Р64 (відповідно 0,40; 0,41 та 0,40).

Аналіз генетичних дистанцій, отриманих на основі виявленого молекулярно-генетичного поліморфізму для видів роду Beta L., свідчать про наявність трьох генетично віддалених одна від одної груп, що співпадають з описаними у науковій літературі секціями, - Procumbentes, Beta та Corollinae (рис. 1).

Рис. 1. Дендрограма видів роду Beta L.

Для флори Середземномор'я, Канарських островів та острову Мадейра встановлено, що види одного роду, із зазначених кліматичних зон, значно різняться за морфологічними ознаками. Це відбувається внаслідок різних умов, у яких проходить природний добір. Така закономірність виявлена для багатьох родів рослин, у тому числі і для роду Beta L. За генетичними дистанціями, виявленими у наших дослідженнях, найбільш віддаленою у межах роду є саме секція канарських буряків (Procumbentes). Отже отримані результати вдало демонструють встановлену закономірність.

Серед видів секції Procumbentes найбільш віддаленим є B. patellaris. Для нього також характерна віддаленість від усіх інших видів роду. Генетична дистанція між B. webbiana та B. procumbens є низькою і у наших дослідженнях визначена як мінімальна міжвидова, оскільки сумнівів, що це окремі види, не виникає.

За результатами аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму види секції Beta, крім B. macrocarpa, що виділився окремою гілкою, утворюють два кластери (див. рис. 1). В один з кластерів згруповано три підвиди B. vulgaris. Генетичні дистанції, встановлені для них, не перевищують міжвидові. Четвертий використаний у дослідженнях підвид - B.v.ssp. аdanensis значно віддалений від усіх інших B. vulgaris. Значення генетичних дистанцій, отримані для B.v.ssp. аdanensis та інших підвидів B. vulgaris, перевищують міжвидові.

Рівень генетичних дистанцій, характерний для пар B.lomatogona / B.trigyna та B. сorolliflora / B.trigyna, є досить низьким, що може свідчити про формування виду B.trigyna на основі гібридизації між B.lomatogona та B. сorolliflora. Встановлено також генетичну спорідненість між B.іntermedia та видами B.lomatogona, B.trigyna, що вказує на можливе формування виду B.іntermedia унаслідок гібридизації між B.lomatogona та B.trigyna. Однак питання про самостійність виду B.іntermedia залишається відкритим, оскільки генетична дистанція, принаймні між ним та B.trigyna, не перевищує міжвидову.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ B. VULGARIS SSP. VULGARIS ТА B. VULGARIS SSP. MARITIMA

У процесі виведення нових перспективних гібридів буряків використовують дикорослі форми з метою збагачення геному культурних форм новими цінними ознаками. А це, в свою чергу, потребує всебічної оцінки не тільки культурних, а й дикорослих форм буряків.

За дослідженнями молекулярно-генетичного поліморфізму чотирнадцяти форм B. vulgaris різного географічного походження за допомогою дев'яти одиничних праймерів виявлено 190 локусів. У середньому на праймер припадає 21 локус. З усіх протестованих локусів неполіморфними виявилися шість. Рівень поліморфізму для всієї вибірки праймерів становить 97 %. ІСП (індекс специфічності праймеру) коливався у межах від 3,1 до 4,5. Найбільше значення цього показника встановлено для праймеру Р817 (4,5), дещо нижче - для праймерів Р819 та Р821 (3,9 та 4,0), а найнижче для - Р824 (3,1). Значення РІС змінювалися у межах від 0,29 до 0,39. Найвищим цей показник був встановлений для локусів, отриманих за допомогою праймерів Р 819 (0,39) та Р 824 (0,39), а найнижчим - у Р 818 (0,29). Отримані статистичні показники вказують на високу диференційну здатність як окремих праймерів, так і їх сукупності.

Результати аналізу генетичних дистанцій, розрахованих на основі поліморфізму ДНК-локусів, свідчать про розподіл форм буряків між трьома кластерами та двома окремими гілками (рис.2). Отриманий розподіл не відображає генетичної близькості відповідно походженню досліджених форм, принаймні тому, що європейські та азіатські культурні форми не утворюють окремі кластери.



Рис. 2. Дендрограма буряків різного географічного походження

У наших дослідженнях встановлено близькість форм B.v.ssp. maritima скандинавського походження та цукрових буряків. Повідомлення про аналогічний розподіл неодноразово зустрічаються у літературних джерелах (Буренин, 1990; Лісневич, 1999). Однак враховуючи те, що скандинавські форми B.v.ssp. maritima відносяться до північного гідрофільного, високоцукристого кліматипу, а цукристість є однією з основних ознак, на яку направлена селекція цукрових буряків, детектована близькість між цими формами може бути пов'язана з наявністю спільних морфо-фізіологічних ознак, притаманних цукровим бурякам та скандинавським формам B.v.ssp. maritima.

Схожий розподіл отримано в іншому кластері, до якого віднесено ізраїльську форму B.v.ssp. maritima, мангольд, кормові буряки та азіатський сортотип коренеплідних буряків Аданський помаранчевий. Особливу увагу привертає азіатська форма Аданська помаранчева. Популяції цих буряків є більш-менш однорідними за морфологічними ознаками, вирізняються низькою цвітушністю, формують округлі коренеплоди яскраво-помаранчевого забарвлення та за вмістом сухих речовин і структурою подібні до європейських столових буряків. Тобто, розподіл досліджених форм у цьому кластері теж може бути пов'язаним зі спільними морфо-фізіологічними ознаками.

Третій кластер утворюють середземноморські форми B.v.ssp. maritima з Греції та Франції, що відносяться до південного посухостійкого, низькоцукристого кліматипу з однорічним циклом розвитку. Згідно з генетичними дистанціями вони досить віддалені від культурних буряків, що співпадає з літературними даними (Letschert, 1993).

Окремо примикають дві гілки, котрі утворили різновиди B. vulgaris L. з Малої Азії та Китаю. Ці зразки представлені найбільш давніми формами коренеплідних буряків. Вони суттєво відрізняються від європейських буряків, а саме: коренеплід близький до примітивного типу, низька цукристість та помірна цвітушність. Однак вони стійкі до церкоспорозу та пероноспорозу, що робить їх особливо цікавими для селекції. Згідно з генетичними дистанціями ці форми значно віддалені від всіх культурних буряків, що суттєво ускладнить їх використання як донорів сільськогосподарськоцінних ознак.

ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНОГО ПОЛІМОРФІЗМУ ЛІНІЙ ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ

За результатами дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму п'яти мікросателітних локусів у ліній цукрових буряків вітчизняної селекції виявлено двадцять вісім алелей (табл. 1).

Таблиця 1 - Характеристика досліджених МС-локусів у ліній цукрових буряків

№ п/п	Назва локусу	Кількість алелів, шт	Розмір алелів, п.н.	Індекс інформативності локусу (РІС)
1	GZM 017	4	150, 170, 182,190	0,57
2	GZM 058	6	278, 293, 300, 305, 321, 333	0,74
3	GZM 086	8	130, 160, 170, 200, 210, 230, 244, 260	0,79
4	Bvm 3	4	110, 125, 135, 165	0,46
5	Bvm 4	6	65, 69, 79, 85, 89, 93	0,76

Ідентифіковані алелі рівномірно представлені у даній рослинній вибірці, що дало змогу отримати високі значення індексу поліморфності локусу, що коливався у межах від 0,46 до 0,79, а в середньому становив 0,66.

На основі виявленого молекулярно-генетичного поліморфізму обраховано генетичні дистанції та проведено кластеризацію досліджуваних зразків. Кількість досліджених МС-локусів виявилася достатньою для диференціації чотирнадцяти ліній (рис. 3).

Рис. 3. Дендрограма ліній цукрових буряків

Поліморфізм чоловічостерильних ліній цукрових буряків. За результатами аналізу алельного стану п'яти МС-локусів для ЧС ліній цукрових буряків вітчизняної селекції виявили від одного до чотирьох алелів. За наявності більше одного алеля у досліджених ліній встановлено нестачу гомозиготних класів, що, на нашу думку, може свідчити про перезапилення двох ліній, які мали у своєму складі ці алелі у гомозиготному стані.

У підсумку, нестача гомозиготних класів призвела до зростання частки гетерозиготних генотипів (рис. 4). За дослідженими МС-локусами цей показник для ЧС ліній коливався у межах від 10 до 49 %. Найбільше його значення характерне для ліній 194 та 198 (відповідно 49 і 46%). Середній рівень характерний для ліній 190, 191, 192, 193 та 202 (відповідно 35, 28, 33, 29 та 26 %). А найменшу частку гетерозиготних генотипів ідентифіковано для лінії 13.9 - 10 %.

Рис. 4. Рівень гетерогенності, виявлений у ЧС ліній цукрових буряків за МС-локусами

Поліморфізм багатонасінних запилювачів цукрових буряків. Аналіз внутрішньолінійного поліморфізму запилювачів цукрових буряків вітчизняної селекції свідчить про наявність від одного до чотирьох алелів. Для запилювачів, як і для ЧС ліній, виявлено нестачу гомозиготних класів. Загалом, частка гетерозигот у складі запилювачів за дослідженими локусами коливалася у межах від 39 до 71 % (рис. 5).



Рис. 5 Рівень гетерогенності, виявлений у запилювачів цукрових буряків за МС-локусами

Найвищим цей показник був у запилювача 314 (71 %). Його середній рівень ідентифіковано для запилювачів 364, 393 та 402 - відповідно 47 %, 55 % та 57 %. Найменша частка гетерозиготних генотипів характерна для запилювачів 247 та 395 (відповідно 39 і 43 %).

У порівнянні з ЧС лініями, для запилювачів характерний значно вищий рівень поліморфізму. Максимальне значення частки гетерозигот для ЧС ліній майже співпадає з її мінімальним значенням для запилювачів - відповідно 49 та 47 % (рис. 4 та 5).

Як відомо, специфіка створення високоадаптивних гібридів передбачає використання у якості компонентів гібридизації запилювачів, які за генетичною структурою являють собою не окремі лінії, а синтетики, що складаються з декількох ліній. Зрозуміло, що у синтетиків рівень поліморфізму буде вищий, як це і показано у наших дослідженнях.

Рівень гомо- та гетерозиготності, ідентифікований у досліджуваній нами вибірці ліній цукрових буряків за різними МС-локусами, був неоднаковим (рис. 6). Так, за локусами GZM 058 та GZM 086 з більшою частотою виявляли гетерозиготи, тоді як за локусом GZM 017 частота гомозиготних генотипів дещо перевищувала гетерозиготні, а за локусами Bvm 3 та Bvm 4 значна частина вибірки була гомозиготною.

Рис. 6. Розподіл гомозиготних та гетерозиготних генотипів, виявлених для МС-локусів у ліній цукрових буряків

На нашу думку, ідентифікація великої кількості алельних варіантів як в гомо-, так і в гетерозиготному стані, на внутрішньолінійному рівні пов'язана з певним селективним впливом на досліджувані МС-локуси. Так, за двома локусами GZM 017 та Bvm 3 констатуємо наявність у переважної більшості рослин алелі розміром відповідно 150 п.н. та 125 п.н. Зовсім інший розподіл маємо за МС-локусами GZM 086 та GZM 058, для яких не характерна присутність певного алеля у переважної більшості рослин. Для МС-локусу Bvm 4 теж не характерна поява певного алеля у переважної більшості рослин. У вибірці ліній цукрових буряків алелі, ідентифіковані за цим локусом, зустрічалися з частотою від 0,08 до 0,37. Однак для них характерний міжлінійний поліморфізм і майже відсутній поліморфізм всередині ліній.

Порівняльний аналіз алельного поліморфізму МС-локусів. Аналіз алельного складу МС-локусів, отриманого для дослідженої нами вибірки ліній цукрових буряків, порівняно з даними для європейських культурних форм, показав ряд відмінностей як за розміром алелів, так і за їх частотними характеристиками.

Для європейських культурних форм за МС-локусом Bvm 3 з високою частотою характерна наявність алеля розміром 110 п.н. У нашій вибірці його частота мала низьке значення, а найпоширенішим був алель 125 п.н. (рис. 7, А). Необхідно зазначити, що три алелі з чотирьох, виявлених у наших дослідженнях за цим локусом, а саме 125 п.н., 135 п.н. та 165 п.н., - є унікальними, оскільки у європейських форм алелі такого розміру не ідентифіковано навіть серед диких форм.

За МС-локусом Bvm 4 у вибірці вітчизняних ліній з найбільшою частотою виявлено алелі розміром 79 п.н. та 69 п.н. (рис. 7, Б). Алелі з такими розмірами не ідентифіковані у вибірці, представленій культурними формами європейської селекції, проте вони зустрічаються з невисокою частотою серед представників дикого виду B.v. ssp. maritima.

У локусі GZM 017 серед досліджених нами ліній з високою частотою виявлено алель з розміром 150 п.н., а серед європейських форм буряків даний алель хоча і був нами ідентифікований, проте з низькою частотою (рис. 7, В). Алель розміром 190 п.н. виявлено лише у вибірці українських ліній.

За локусом GZM 058 для українських ліній цукрових буряків, як і для європейських культурних форм, з найвищою частотою виявлено алель з молекулярною масою 293 п.н. (рис. 7, Г). За цим локусом українські лінії мають у своєму складі алелі розміром 278 п.н. та 333 п.н., які не ідентифіковані у європейських форм.

У наших дослідженнях за локусом GZM 086 ідентифіковано сім алелів, а для європейських - вісім (рис. 7, Д). Відмінність у алельному складі досліджених українських ліній цукрових буряків, порівняно з європейськими лініями, за цим локусом полягає у наявності алелів 130, 160, 230, 244, 260 п.н. та відсутності фрагментів розміром 165, 184, 186, 191, 212 п.н. З найбільшою частотою зустрічалися алелі розміром 160 п.н. та 130 п.н. У європейській вибірці алелі такого розміру не виявлено.

Рис. 7. Алелі, ідентифіковані у буряків різного походження за МС-локусами:

А) - алелі, виявлені у локусі Bvm 3;

В) - алелі, виявлені у локусі GZM 017;

Д) - алелі, виявлені у локусі GZM 086. Б) - алелі, виявлені у локусі Bvm 4;

Г) - алелі, виявлені у локусі GZM 058;

Порівняльний аналіз алельного складу МС-локусів українських ліній цукрових буряків та європейських форм буряків свідчить про значні розбіжності як за кількістю ідентифікованих алелів, так і за їх частотою. Алелі, що виявлено тільки у вибірці, представленій українськими лініями цукрових буряків, можна вважати унікальними, тобто такими, що характеризують генетичне різноманіття оригінальних вітчизняних ліній цукрових буряків.



ВИСНОВКИ

В дисертації наведено шляхи експериментального вирішення наукового завдання з визначення молекулярно-генетичного поліморфізму диких видів і культурних форм роду Beta L., оцінки між- та внутрішньолінійного поліморфізму чоловічостерильних ліній і багатонасінних запилювачів, порівняння алельного складу мікросателітних локусів європейських форм з лініями вітчизняної селекції, а також створено базу даних алельних характеристик для досліджених селекційних матеріалів цукрових буряків.

У результаті дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму видів і підвидів роду Beta L. підтверджено наявність генетично віддалених секцій та значну генетичну дивергенцію секції Procumbentes, до якої відносяться канарські види буряків.

Розподіл, отриманий на основі виявленого поліморфізму за 170 RAPD-локусами для видів B.іntermedia, B.trigyna та підвидів B. vulgaris, не відповідає представленому у існуючих класифікаціях, зокрема, генетичні дистанції між B. vulgaris ssp. аdanensis та іншими підвидами B. vulgaris перевищують міжвидові, а між видами B.іntermedia та B.trigyna вони є нижчими за міжвидові.

Встановлено, що розподіл, отриманий на основі виявленого молекулярно-генетичного поліморфізму за 190 RAPD-локусами для форм B. vulgaris ssp vulgaris та B. vulgaris ssp. maritima L., не відображає генетичної близькості за їх походженням і можливо пов'язаний з морфо-фізіологічними особливостями, що потребує подальших досліджень.

На основі визначеного алельного складу МС-локусів для ліній цукрових буряків вітчизняної селекції та їх частотних характеристик показано, що МС-локуси Bvm 3, Bvm 4 та GZM 017 зазнають селективного тиску на відміну від локусів GZM 086 та GZM 058.

За результатами оцінки міжлінійного та внутрішньолінійного алельного поліморфізму цукрових буряків за МС-локусами, встановлено, що максимальний рівень внутрішньолінійної гетерогенності для ЧС ліній відповідає мінімальному рівню гетерогенності запилювачів.

Порівняльний аналіз алельного складу МС-локусів українських ліній цукрових буряків з європейськими формами свідчить про значні розбіжності як за кількістю ідентифікованих алелів, так і за їх частотою. Алелі, виявлені лише у вибірці українських ліній, потенційно можуть бути використані для характеристики генетичного різноманіття вітчизняного генофонду цукрових буряків.

На основі визначеного алельного складу ліній цукрових буряків вітчизняної селекції за п'ятьма МС-локусами створено базу даних та розроблено молекулярно-генетичні паспорти, що відображають генетичну структуру ліній.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ З ВИКОРИСТАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для встановлення генетичної близькості диких видів роду Beta L., підвидів B. vulgarіs L. різного географічного походження та експериментально створених селекційних зразків пропонується використовувати сформовані маркерні системи RAPD-праймерів з високою диференційною здатністю.

Для ідентифікації ліній цукрових буряків та порівняння їх генетичної структури пропонується використовувати поліморфізм МС-локусів, з подальшою оцінкою генетичних дистанцій та проведення кластерного аналізу із залученням створеної бази даних алельних характеристик.

З метою захисту авторських прав та підвищення ефективності реєстрації оригінальних ліній цукрових буряків рекомендується використовувати молекулярно-генетичні паспорти, складені за алельними характеристиками поліморфних мікросателітних локусів.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шаюк Л. В. Деякі питання у філогенії роду Beta L. та можливість їх вирішення / Л. В. Шаюк // Цукрові буряки. - 2000. - Т. 5 (17). -С.14-15.

2. Шаюк Л.В. Исследование генетического полиморфизма рода Beta с помощью ПП-ПЦР / Л.В. Шаюк, Н. В. Роїк, Ю. М. Сиволап // ІV Міжнародна наук. конфер. «Геном рослин»: Зб. тез. - Одеса: «Лара». - 2003. - С. 43. Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження, опрацьовано отримані результати та підготовлено тези.

3. Roik M. Molecular genetic polymorphism investigation of the genus Beta L. by using RAPD analysis / M. Roik, Yu. Syvolap, L. Shayuk // Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання. Тези доп. міжнар. наук.-практ. конфер. Оброшино. - 2005. - С.251-252. Здобувачем особисто проведено дослідження та підготовлено тези.

4. Шаюк Л.В. Дифференциация видов рода Beta L. с помощью RAPD анализа / Л. В. Шаюк, Н. В. Роик, Ю. М. Сиволап // Фактори експериментальної еволюції організмів. Зб. наук. праць. - 2006. - Т. 3. - С.154-159. Дисертантом особисто проведено дослідження, результати яких наведено у статті, та підготовлено статтю.

5. Шаюк Л.В. Використання молекулярних маркерів для уточнення систематики роду Beta L. / Л. В. Шаюк, М. В. Роїк, Ю. М. Сиволап // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2007. - Т 116.- С. 290-293. Здобувачем особисто проведено дослідження, опрацьовано отримані результати та написано статтю.

6. Роїк М.В. Визначення молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. з допомогою полімеразної ланцюгової реакції: Метод. рекомендації / М. В. Роїк, Ю. М. Сиволап, Г. П. Петюх, Л. В. Шаюк, А. І. Баб'яж, Н. В. Білоус. - К.: ТОВ «ПоліграфКонсалтинг», 2007. - 27 с. Дисертантом узагальнено наукові відомості та власні експериментальні дані стосовно дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. та підготовлено методичні рекомендації.

7. ДСТУ 4566: 2006 Буряки цукрові. Методи визначення молекулярно-генетичного поліморфізму. - введ. 2007-07-01. - К.: Держспоживстандарт України. 2008. - 11 с. Здобувачем особисто проведено дослідження з встановлення поліморфізму мікросателітних локусів у цукрових буряків та підготовлено національний стандарт до друку.

8. Роїк М.В. Молекулярно-генетичний поліморфізм Beta vulgaris L. та Beta maritimа L. / М. В. Роїк, Ю. М. Сиволап, Л. В. Шаюк // V Міжнародна наукова конференція «Геном рослин»: Зб. наук. статей. - Одеса: Інтерпринт, 2008. - С. 119-121. Дисертантом особисто проведено експериментальні дослідження та підготовлено статтю.

9. Роїк М.В. Використання ДНК-маркерів для дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму роду Beta L. / М.В. Роїк, Л.В. Шаюк, І.П. Шевчук // Інститут цукрових буряків УААН: Зб. наук. пр. - 2010. - Вип. 11. - С. 50-55. Здобувачем особисто проведено дослідження та написано статтю.

10. Шаюк Л. В. Алельний поліморфізм за мікросателітними локусами у ліній цукрових буряків / Л. В. Шаюк // Вісник аграрної науки. -2010. - № 2(682). - С. 73-74.



АНОТАЦІЯ

Шаюк Л.В. Молекулярно-генетичний аналіз роду Beta L. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Київ, 2010 р.

Дисертація присвячена дослідженню молекулярно-генетичного поліморфізму видів, підвидів та культурних форм буряків. Підтверджено наявність генетично віддалених секцій у роді Beta L. та значну генетичну дивергенцію секції Procumbentes, до якої відносяться канарські види буряків. Встановлено, що генетичні дистанції між B. vulgaris ssp. аdanensis та іншими підвидами B. vulgaris перевищують міжвидові, а між видами B.іntermedia та B.trigyna є нижчими за міжвидові. Встановлено, що розподіл, отриманий на основі виявленого молекулярно-генетичного поліморфізму підвидів B. vulgarіs L. різного географічного походження, не відображає генетичної близькості за походженням і можливо пов'язаний з їх морфо-фізіологічними особливостями.

Оцінено рівень внутрішньолінійної гетерогенності у чоловічостерильних ліній та багатонасінних запилювачів цукрових буряків. У результаті порівняльного аналізу алельного складу п'яти МС-локусів українських ліній цукрових буряків з європейськими формами виявлено значні розбіжності як за кількістю ідентифікованих алелів, так і за їх частотою. Створено базу даних алельного складу п'яти мікросателітних локусів та розроблено молекулярно-генетичні формули, що відображають генетичну структуру ліній цукрових буряків вітчизняної селекції.

Ключові слова: молекулярно-генетичний поліморфізм, рід Beta L., цукрові буряки, RAPD-аналіз, мікросателітний аналіз.



АННОТАЦИЯ

Шаюк Л.В. Молекулярно-генетический анализ рода Beta L. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев, 2010 г.

В диссертации обобщены исследования молекулярно-генетического полиморфизма видов рода Beta L., подвидов B. vulgaris и культурных форм сахарной свеклы, а также проведен сравнительный анализ аллельных вариантов пяти микросателлитных локусов у мужскостерильных линий и многосемянных опылителей сахарной свеклы украинской селекции с европейскими формами.

Генетический полиморфизм, выявленный у диких видов свеклы на основе 170 RAPD-локусов, свидетельствует о формировании внутри рода Beta L. трёх групп совпадающих с выделенными ранее секциями Procumbentes, Beta и Corollinae. Показано значительную генетическую удаленность секции Procumbentes, что подтверждает закономерность установленную для многих родов растений, виды которых распространены в средиземноморье и на Канарских островах. Установлено также, что значение генетических дистанций между B. vulgaris ssp. аdanensis и другими подвидами B. vulgaris превышает межвидовое, а между видами B.іntermedia и B.trigyna - не превышает.

В результате анализа молекулярно-генетического полиморфизма 190 RAPD-локусов, идентифицированных у азиатских и европейских форм B. vulgaris L., установлено генетическую близость между сахарной свеклой и скандинавскими формами B.v.ssp. maritima, а также между мангольдом, кормовой свеклой и азиатским сортотипом Аданская оранжевая. Показано генетическую удаленность B. vulgaris L. азиатского и китайского происхождения, а также средиземноморских форм B.v.ssp. maritima. Обобщение полученных результатов позволило предположить, что идентифицированный молекуляроно-генетический полиморфизм не отражает генетическую близость соответственно происхождению исследованных форм и возможно связан с морфофизиологическими особенностями, однако это требует дополнительных исследований.

Анализ аллельного полиморфизма пяти микросателлитных локусов линий сахарной свеклы украинской селекции свидетельствует о высоком уровне внутрилинейного полиморфизма многосемянных опылителей по сравнению с мужскостерильными линиями. Выявленные аллельные варианты позволили дифференцировать четырнадцать линий используемых для создания перспективных гибридов сахарной свеклы на основе мужской стерильности, что дало возможность предложить систему их паспортизации с помощью микросателлитных маркеров. В результате выполненных исследований создано базу данных аллельных характеристик микросателлитных локусов, которая отражает генетическую структуру линий.

Обобщение частотных характеристик идентифицированных аллельных вариантов в выборке отечественных линий сахарной свеклы позволило выявить различное селективное влияние на исследованные микросателлитные локусы, а именно - аллели МС-локусов Bvm 3, Bvm 4 и GZM 017 подвержены отбору в отличие от аллелей локусов GZM 086 и GZM 058.

Сравнительный анализ полученных данных аллельного состава МС-локусов линий украинской селекции с европейскими формами свидетельствует о значительных отличиях, как по количеству выявленных аллелей, так и по их частоте. Алели выявленные только у украинских линий, являются уникальными и могут использоваться для характеристики отечественного генофонда сахарной свеклы.

Ключевые слова: молекулярно-генетический полиморфизм, род BetaL., сахарная свекла, RAPD-анализ, микросателлитный анализ.



ANNOTATION

Shaiuk L. V. Molecular genetic analysis of the genus Beta L. - A Manuscript.

A thesis for obtaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences in Speciality 03.00.22 - Molecular genetics - Institute of Food Biotechnology and Genomics NAN of Ukraine, Kyiv, 2010.

The thesis deals with studies on molecular-genetic polymorphism of Beta L. species, subspecies as well as cultivated forms of beets. The presence of genetically remote sections inside Beta L. genus was confirmed as well as essential genetic divergence of the section Procumbentes to which Canarion beet species belong. There detected that genetic distances between B. vulgaris ssp. adanensis and other subspecies of B. vulgaris exceeded than interspecific ones, and the same time genetic distances between species . B. intermedia and B. trigyna are less than differences between species. It was found that the distribution, which was obtained on the results of molecular-genetic polymorphism between subspecies of B. vulgaris L. for different geographical origins, does not reflect genetic relationship to compare there origination and it is possibly connected with their morpho-physiological features.

A level of intra-lines heterogeneity for male sterile lines as well as multigerm pollinators of sugar beet was evaluated. Analysis of allelic composition for five MS-loci of sugar beet Ukrainian breeding lines to compare with cultivated European forms resulted in finding out considerable divergences for both in quantity of identified alleles and their frequency. A database of alleles compositions for five microsatellite loci was created and molecular-genetic formulas which reflect a genetic structure Ukrainian breeding lines of sugar beet was developed.

Key words: molecular-genetic polymorphism, genus Beta L., sugar beet, RAPD-analysis, microsatellite analysis.

Размещено на Allbest.ru

...