Регуляція гемоксигеназної активності гемом у серці, судинах та легенях щурів при введенні субстрату та інгібітору no-синтаз

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

УДК 577.152.1:[612.1+612.2

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РЕГУЛЯЦІЯ ГЕМОКСИГЕНАЗНОЇ АКТИВНОСТІ ГЕМОМ У СЕРЦІ, СУДИНАХ ТА ЛЕГЕНЯХ ЩУРІВ ПРИ ВВЕДЕННІ СУБСТРАТУ ТА ІНГІБІТОРУ NO-СИНТАЗ

Филимоненко Вікторія Павлівна

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Каліман Павло Авксентійович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Лущак Володимир Іванович, Прикарпатський національний університет ім. Василя Стефаника Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри біохімії та біотехнології Інституту природничих наук, м. Івано-Франківськ

доктор медичних наук, професор Давидов Вадим В'ячеславович, Державна установа "Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України", завідувач лабораторії вiкової ендокринологiї та обміну речовин, м. Харків

Захист відбудеться “29” вересня 2010 р. о 1600 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “25” серпня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В.М. Дзюба

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гем безпосередньо або у складі гемопротеїнів виконує різноманітні функції в організмі ссавців (Tsiftsoglou A.S., 2006), але вільний гем виявляє прооксидантні та запальні властивості (Jeney V., 2002; Kumar S., 2005). Накопичення гему в крові та активація вільнорадикальних процесів відбувається внаслідок гемолізу та/або міолізу за дії різноманітних стресорних факторів (бактеріальні токсини, опромінення, гіпертермія, лікарські препарати тощо) та є поширеним явищем. Серце, судини та легені - тканини, що беруть участь у кровозабезпеченні організму, тісно взаємодіють з компонентами крові, в тому числі з гемовмісними продуктами, що робить їх одними з основних мішеней прооксидантних ефектів гему. Моделлю гем-індукованого пошкодження тканин, яка широко використовується, є рабдоміоліз (руйнування скелетних м'язів з вивільненням міоглобіна в кров та, як наслідок, накопиченням гему в крові), що викликається внутрішньом'язовим введенням гіпертонічного розчину гліцеролу. Головним механізмом захисту від ушкоджуючих ефектів гему в тканинах є його зв'язування та руйнування гемоксигеназами (ГО), які каталізують деградацію гему до білірубіну, моноксиду вуглецю та йонів заліза (Kikuchi G., 2005). На теперішній час добре охарактеризовані 2 ізоферменти ГО: конститутивний (ГО-2), що є домінуючою ізоформою в серці, судинах та легенях, та індуцибельний (ГО-1), що індукується при дії на організм стресорних факторів та забезпечує адаптацію клітин в умовах стресу (Maines M.D., 1997).

Розширення уявлень про регуляторні функції гему, а також про захисні та регуляторні властивості продуктів ГО реакції обумовлюють підвищений інтерес до вивчення системи гем-ГО у різних тканинах ссавців (Bach F.H., 2005; Idriss N.K., 2008; Trасz M.J., 2007). Відомо, що за фізіологічних умов ГО відіграє важливу роль у функціонуванні серцево-судинної системи та легень (Beltowski J., 2004; Ohta K., 2004; Ryter S.W., 2007). Крім того, індукція ГО-1 є ключовим захисним механізмом клітин за низки патологічних станів, котрі супроводжуються розвитком оксидативного стресу (Bauer M., 2008). Протекторний вплив ГО системи реалізується через декілька механізмів, що включають зниження вмісту вільного гему, потужного прооксиданту, а також збільшення концентрації біологічно активних продуктів реакції (Kirkby K.F., 2006). Продукти ГО реакції виявляють регуляторні та захисні ефекти: антиоксидантні, антизапальні, антиапоптозні, антипроліферативні та вазодилататорні. Захисний вплив індукції ГО-1 показаний при запаленнях різного генезу, ушкодженнях за ішемії-реперфузії, гіпертензивних станах, атеросклерозі та інших захворюваннях серцево-судинної системи та легень (Ndisang J.A., 2010; Orozco L.D., 2007; Xia Z.Y., 2010), але в умовах накопичення гему в крові ГО в серці, судинах та легенях недостатньо вивчена.

Активація експресії ГО-1 вважається маркером оксидативного стресу. З іншого боку, оксидативний стрес супроводжується також порушеннями й у L-аргінін-NO-синтазній системі (Furuichi M., 2009; Pacher P., 2007). Показано, що коригування вмісту NO за цих умов може бути ефективним засобом попередження та лікування низки захворювань серцево-судинної системи та легень (Xie X.Q., 2008). Більш того, гем-ГО та L-аргінін-NO-синтазна системи тісно взаємопов'язані. Оксид азоту здатний як активувати синтез ГО-1 (Bouton C., 2000, Durante W., 1997) та підсилювати індукцію ферменту гемом (Foresti R., 2006), так й інгібувати активність ізоферментів ГО (Ding Y., 1999; Kinobe R., 2004; Wang J., 2003). В свою чергу ГО система є ключовим регулятором утворення NO (Chung H.T., 2008). Тканини серця, судин і легень характеризуються подібним рівнем ГО активності та співвідношенням ізоформ фермента, проте відрізняються активностями конститутивних та індуцибельних NO-синтаз (Гула Н.М., 2007; Kan W., 2004).

Враховуючи вищевикладене, а також здатність гему спричинювати активацію вільнорадикальних процесів, загального етіопатогенетичного фактору захворювань серцево-судинної системи та легень, дослідження регуляції гемоксигеназної активності гемом в серці, судинах і легенях при введенні субстрату та інгібітору NO-синтаз має важливе теоретичне та практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження було частиною держбюджетних тем кафедри біохімії Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна: “Антиоксидантна система еритроцитів та гемоксигеназна активність різних органів щурів за дії гемолітичних агентів” (№ державної реєстрацiї 0106U001583) та “Система гем-гемоксигеназа в адаптації метаболізму при оксидативному стресі за умов модуляції рівня NO-радикалів” (№ державної реєстрацiї 0109U001335).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було встановлення загальних шляхів регуляції гемоксигеназної активності гемом у серці, судинах і легенях щурів при введенні субстрату та інгібітору NO-синтаз. У зв'язку з метою були визначені наступні задачі дослідження:

Дослідити динаміку ГО активності та деяких показників прооксидантно-антиоксидантного статусу сироватки крові, серця, судин і легень щурів в двох моделях накопичення гему в крові: в гліцерольній моделі рабдоміолізу та при введенні хлориду геміну.

Вивчити вплив попереднього введення субстрату NO-синтаз, L-аргініну, на досліджені показники при накопиченні гему в крові за рабдоміолізу.

Довести участь гемоксигеназної системи в антиоксидантних ефектах L-аргініну в тканинах щурів при накопиченні гему в крові в умовах рабдоміолізу за допомогою попереднього введення інгібітору гемоксигеназної активності, Zn-протопорфірину.

Вивчити вплив попереднього введення інгібітору NO-синтаз, Nщ-нітро-L-аргініну, на динаміку ГО активності та деяких показників прооксидантно-антиоксидантного статусу сироватки крові, серця, судин і легень щурів за умов накопичення гему в крові при введенні хлориду геміну.

Об'єкт дослідження - регуляція гемоксигеназної активності гемом при введенні субстрату та інгібітору NO-синтаз.

Предмет дослідження - гемоксигеназна система та деякі показники прооксидантно-антиоксидантного статусу серця, судин і легень в умовах накопичення гему в крові та при попередньому введенні субстрату та інгібітору NO-синтаз.

Методи дослідження. Гемоксигеназну, супероксиддисмутазну та каталазну активності, а також вміст загального гему, ТБК-активних продуктів, білкових карбонільних похідних, відновленого глутатіону, білірубіну та нітритів визначали спектрофотометричними методами, вміст білка - фотоколориметричним методом. Постмітохондріальні фракції отримували методом диференційного центрифугування. Статистичний аналіз одержаних результатів здійснювали методом варіаційної статистики за допомогою стандартних пакетів комп'ютерних програм Exel, Statistica 6.0 та Biostat.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше показано накопичення загального гему та активацію гемоксигенази в серці, судинах та легенях щурів за гліцерольної моделі рабдоміолізу. Встановлено, що зміни прооксидантно-антиоксидантного статусу досліджених тканин обумовлені підвищенням в них вмісту гему, очевидно, внаслідок його надходження з кров'яного русла.

Встановлено, що попереднє введення ендогенного джерела оксиду азоту, L-аргініну, викликає більш раннє підвищення ГО активності в серці та легенях щурів за гліцерол-індукованого рабдоміолізу і виявляє антиоксидантну дію в цих органах. Показано, що інгібування гемоксигеназної активності Zn-протопорфірином блокує антиоксидантний ефект L-аргініну в серці та легенях щурів за рабдоміолізу, що свідчить про ключову роль індукції гемоксигенази L-аргініном в його захисному впливі.

Встановлено, що введення хлориду геміну викликає накопичення загального гему та збільшення гемоксигеназної активності в судинах, але не впливає на дані показники в серці та легенях щурів. В експериментах з використанням Nщ-нітро-L-аргініну показано, що за введення екзогенного геміну порушення прооксидантно-антиоксидантного балансу в судинах обумовлене утворенням активних форм кисню, а у серці - пов'язане з утворенням оксиду азоту у NO-синтазних реакціях. Встановлено, що введення інгібітору NO-синтаз викликає розвиток оксидативного стресу у судинах: накопичення гему, ТБК-активних продуктів та збільшення ГО активності. Показано, що попереднє введення Nщ-нітро-L-аргініну підсилює активацію ГО у судинах, яка викликана ін'єкцією геміну. Активація ГО у судинах в умовах пригнічення синтезу NO, очевидно, є компенсаторною реакцією клітин судин на зниження вмісту оксиду азоту.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені в даній роботі експериментальні дані доповнюють відомості про регуляцію ГО активності та механізми пошкодження тканин серця, судин та легень при накопиченні гему в крові та можуть бути підґрунтям для розробки шляхів корекції метаболізму серцево-судинної системи та легень за таких умов. Встановлена захисна дія донора оксиду азоту, що опосередкована більш ранньою індукцією гемоксигенази, дозволяє розглядати попереднє введення L-аргініну як один із засобів обмеження пошкодження серця та легень за умов значного накопичення гему в крові, зокрема при рабдоміолізі.

Результати використовуються при викладанні курсів «Біохімія» і спецкурсів «Біохімія клітини» та «Регуляція метаболізму» на кафедрі біохімії біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження було виконано під науковим керівництвом доктора біологічних наук П.А. Калімана, в співпраці з кандидатом біологічних наук І.В. Нікітченко, з якими автор має спільні публікації. Усі результати, наведені в рукописі, були отримані здобувачем самостійно. Дисертантом особисто підібрано і проаналізовано літературу за темою дослідження, проведено вибір досліджуваних показників, здійснено постановку експериментів і статистичну обробку отриманих експериментальних даних. Отримані дані обговорювалися дисертантом сумісно з І.В. Нікітченко та П.А. Каліманом.

Апробація результатів дисертації. Результати та основні положення дисертаційної роботи були повідомлені на 2 з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007 р.); на ІІ, III та IV міжнародних конференціях молодих науковців “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007, 2008 та 2009 р.р.); на V Львівсько-Люблінській науковій конференції “Сучасні аспекти експериментальної та клінічної біохімії” (Львів, 2008 р.); на V національному конгресі патофізіологів України “Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів” (Запоріжжя, 2008 р.); на конференції-конкурсі робіт молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2009” (Київ, 2009 р.).

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових журналах і 13 тез доповідей.

Структура й обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 143 сторінках і складається з наступних розділів: вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів і обговорень (3 розділи), узагальнення отриманих результатів, висновків та списку використаної літератури (298 літературних джерела, з яких 254 - іноземних авторів). Робота містить 40 рисунків і 8 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

гемоксигеназний антиоксидантний аргінін сироватка

Огляд літератури. Огляд складається з 6 підрозділів, у яких висвітлено сучасні уявлення про властивості та функції гему в організмі ссавців, про молекулярні властивості та основні принципи регуляції ключового фермента деградації гему, гемоксигенази; приділено увагу питанням участі ГО в функціонуванні серцево-судинної системи та легень, зв'язку ГО з системою оксиду азоту, а також ролі ГО при рабдоміолізі. Крім того, в огляді обґрунтовано вибір напрямків досліджень і наведено способи вирішення задач, що поставлені в роботі.

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар вагою 200-250 г. Рабдоміоліз відтворювали шляхом внутрішньом'язової ін'єкції 50 % водного розчину гліцеролу в дозі 1 мл/100 г маси тіла по 1/2 дози в кожний стегновий м'яз (Nath K.A., 1992). L-аргінін (Arg) вводили внутрішньочеревинно в дозі 60 мг/100 г маси тіла за 0,5 год. до введення гліцеролу (Нікітченко І.В., 2007), Zn-протопорфірин (Zn-PP) - підшкірно в дозі 2 мг/100 г маси тіла за 0,5 год. до введення гліцеролу (Кукоба Т.В., 2006). Екзогенний гемін у вигляді хлориду вводили внутрішньочеревинно в дозі 1,5 мг/100 г маси тіла (Никитченко И.В., 1992), Nщ-нітро-L-аргінін (L-NNA) - внутрішньочеревинно в дозі 3,5 мг/100 г маси тіла за 0,5 год. до введення хлориду геміну (Кургалюк Н.М., 2001). Контрольним тваринам вводили відповідний об'єм фізрозчину. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 2 та 24 год., а в серії дослідів з використанням Zn-PP - за 24 год. після основного впливу. Об'єктами дослідження були сироватка крові, гомогенати судин, гомогенати та постмітохондріальні фракції серця і легень.

Вміст загального гему визначали піридингемохромним методом і виражали в нмоль гему/мл сироватки чи мг білка (Paul K.G., 1953). Гемоксигеназну активність визначали методом двопроменевої спектрофотометрії та виражали в нмоль білірубіну/хв на мг білка (Sardana M.K., 1985). Про активацію вільнорадикального окиснення судили за вмістом ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) та вмістом білкових карбонільних похідних (БКП) і виражали в нмоль МДА/мл сироватки чи мг білка (Ohkawa H., 1979) та нмоль БКП/мл сироватки чи мг білка (Арутюнян А.В., 2000; Levine L.R., 1994), відповідно. Наявність змін в утворенні оксиду азоту визначали за вмістом його стабільних метаболітів, нітрит-аніонів, фотометричним методом з реактивом Гріса і виражали в мкг NO2-/мг білка (Green L.C., 1982). Для визначення супероксиддисмутазної (СОД) активності використовували спектрофотометричний метод (Ланкин В.З., 1976; Beauchamp L., 1971). Активність виражали в умовних одиницях (ум. од.)/хв на мг білка. Каталазну активність визначали методом диференційної спектрофотометрії і виражали в мкмоль Н2О2/хв на мг білка (Murclund S., 1981). Вміст відновленого глутатіону (GSH) визначали спектрофотометрично за кількістю утвореного комплексу з алоксаном і виражали в мкмоль GSH/г тканини (Путилина Ф.Е., 1982). Отримані експериментальні результати статистично обробляли, вид розподілу визначали за допомогою

W-критерію Шапіро-Уілка, оцінку значимості розходжень між групами отриманих даних проводили за допомогою непараметричного U-критерію Манна-Уітні або параметричного t-критерію Ст'юдента (Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2002).

Основні результати дослідження та їх обговорення

Гемоксигеназна активність та показники прооксидантно-антиоксидантного статусу серця, судин та легень за введення гліцеролу та сумісного введення L-аргініну і гліцеролу. Встановлено, що введення гліцеролу спричинює 18-кратне підвищення вмісту загального гему у сироватці крові за 2 год. після ін'єкції (табл. 1). Таке значне накопичення гемовмісних продуктів у сироватці є результатом вивільнення гему і гемопротеїнів із пошкоджених м'язів та зруйнованих еритроцитів, що характерно для рабдоміолізу (Vanholder R., 2000). За добу вміст гему достовірно знижується порівняно з першими годинами, але перевищує контрольний рівень у 2,3 рази. Зменшення вмісту гему у сироватці за добу обумовлено переносом гему до різних органів та тканин. Так, накопичення гему спостерігається за 2 год. в серці, судинах та легенях (табл. 1). За добу у судинах вміст гему залишається збільшеним, а в серці та легенях не відрізняється від контролю. Коефіцієнти кореляції між вмістом гему у сироватці та його вмістом у серці та легенях становлять 0,95 і 0,92, відповідно (Р<0,01).

Накопичення гему в тканинах супроводжується активацією вільнорадикальних процесів, про що свідчить підвищення рівня ТБК-АП та БКП (табл. 1). Вміст ТБК-АП збільшується в усі досліджені терміни в сироватці та судинах, за 2 год. після впливу - у легенях та за 24 год. - у серці.

Таблиця 1 - Вміст загального гему, ТБК-АП та БКП у сироватці крові, судинах, серці та легенях щурів після введення гліцеролу, сумісного введення L-аргініну і гліцеролу та введення L-аргініну (Ms, n=4-10)

Примітки: * Р<0,05 відносно контролю; ** Р=0,002 відносно «Гліцерол, 2 год.» ; *** Р=0,02 відносно «Гліцерол, 24 год.».

Вміст БКП у сироватці підвищується в перші години рабдоміолізу, а за добу повертається до контрольного рівня. Зміни у вмісті продуктів вільнорадикального окиснення в сироватці крові корелюють з динамікою накопичення гему в цій тканині (коефіцієнти кореляції становлять не менше 0,79, Р0,03).

В серці та легенях збільшення рівня БКП відбувається за добу після введення гліцеролу (табл. 1). Дані про підвищення вмісту ТБК-АП та БКП в легенях щурів через 6 год. після ін'єкції гліцеролу отримані й в роботі (Rodrigo R., 2006).

Дані літератури про вплив попереднього введення донорів NO на протікання рабдоміолізу нечисельні та суперечливі (Wakabayashi Y., 1996; Warden D.H., 1999). В даній роботі був використаний природній попередник оксиду азоту, субстрат NO-синтаз, L-аргінін, що застосовується при лікуванні серцево-судинних патологій та легеневих гіпертензій (Gornik H.L., 2004; Tousoulis D., 2002).

Попереднє введення L-аргініну не виявляє суттєвого впливу на досліджені показники у крові після ін'єкції гліцеролу та не впливає на динаміку накопичення гему та ТБК-АП в судинах, яка спричинена ін'єкцією гліцеролу (табл. 1). У серці та легенях за сумісного введення донора NO і гліцеролу високий рівень гему теж зберігається в перші години після ін'єкції гліцеролу (табл. 1).

У той же час попереднє введення L-аргініну повністю запобігає підвищенню вмісту ТБК-АП та БКП у серці та легенях (табл. 1). Встановлений антиоксидантний ефект L-аргініну може бути обумовлений як антирадикальними властивостями саме амінокислоти (Lass A., 2002), так і здатністю оксиду азоту, що утворюється з

L-аргініну, взаємодіяти з алкоксильними та пероксильними радикалами (Chamulitrat W., 1998; Rubbo H., 2000). Більш того, відомо, що NO може нітрозилювати молекули гему, обмежуючи його прооксидантні ефекти (Осипов А.Н., 2007).

Проте головний механізм захисту клітин від надлишку гему - його зв'язування та руйнування ізоферментами гемоксигенази (Kikuchi G., 2005). Підвищення ГО активності після введення гліцеролу спостерігається у всіх тканинах: через 2 та 24 год. у судинах та за добу у серці та легенях (табл. 2), що, очевидно, є наслідком активації синтезу de novo ГО-1 надлишком гему (Zenke-Kawasaki Y., 2007).

Таблиця 2 - Гемоксигеназна, супероксиддисмутазна, каталазна активності та вміст GSH у судинах, серці та легенях щурів після введення гліцеролу, сумісного введення L-аргініну і гліцеролу та введення L-аргініну (Ms, n=4-10)

Примітка. * Р<0,05 відносно контролю.

Введення гліцеролу впливає й на інші показники антиоксидантної ланки в тканинах щурів: в серці та легенях за добу знижується СОД активність, а в серці в цей же час підвищується каталазна активність (табл. 2).

Пригнічення СОД активності може бути обумовлене структурними порушеннями ферменту внаслідок ушкодження активними формами кисню, а активація каталази, можливо, пов'язана з накопиченням її субстрату, перекису водню, що показано в нирках щурів за рабдоміолізу (Guidet R., 1989). Як свідчать дані роботи (Rodrigo R., 2006), через 6 год. після введення гліцеролу в легенях щурів СОД та каталазна активності не відрізняються від контрольного рівню. Цими ж авторами показано, що за 6 год. після впливу зменшується вміст відновленого глутатіону. В нашому експерименті встановлено, що введення гліцеролу не впливає на рівень GSH в серці та легенях за 2 год. та викликає його зростання за добу (табл. 3). Отримані дані про активацію вільнорадикальних процесів в цих органах та дані літератури дозволяють припустити, що підвищення вмісту глутатіону є результатом активації його синтезу de novo у відповідь на розвиток оксидативного стресу.

Поряд з добре відомими функціями оксиду азоту в організмі показано, що NO бере участь у регуляції ГО активності. Оксид азоту та його метаболіти здатні як активувати експресію гену ГО-1 (Durante W., 1997; Wright M.M., 2006), підвищувати стабільність мРНК ферменту (Bouton C., 2000), підсилювати індукцію ферменту гемом (Foresti R., 2006), так і пригнічувати активності ізоферментів ГО, нітрозилюючи гем (Wang J., 2003) або амінокислотні залишки в молекулах ферментів (Kinobe R., 2004).

Попереднє введення L-аргініну не впливає на динаміку ГО активності в судинах, яка викликана гліцеролом (табл. 2). Відсутність ефекту при введенні попередника NO, можливо, пов'язана зі зниженням утворення оксиду азоту в NO-синтазних реакціях в умовах гіпоксії, що спричинена накопиченням гемовмісних сполук у крові. Автори роботи (Warden D.H., 1999) вважають, що в таких умовах весь оксид азоту, що утворюється, перехоплюється гемоглобіном з лізованих еритроцитів. Більше того, на пригнічену при рабдоміолізі здатність судин розширюватися не впливає попереднє введення не тільки донорів NO, а й ефектора NO-залежної вазодилатації, цГМФ, що, як припускають дослідники, обумовлено пошкодженням ендотелію активними формами кисню (Warden D.H., 1999).

У той же час у серці та легенях при сумісному введенні L-аргініну та гліцеролу спостерігається підвищення ГО активності вже через 2 год. (табл. 2). За добу активність ферменту не відрізняється від контрольних значень у серці та залишається підвищеною у легенях. Крім того, в легенях сам донор NO викликає збільшення активності ГО в перші години. Встановлене підвищення ГО активності, очевидно, обумовлене індукцією ГО-1 оксидом азоту, що утворюється з L-аргініну.

Попереднє введення L-аргініну нормалізує СОД та каталазну активності в серці і СОД активність в легенях (табл. 2). Крім того, введення донору NO призводить до зниження базальної каталазної активності через 24 год. в серці, що, ймовірно, пов'язане з нітрозилюванням гему або з нітрозируванням цистеїнових залишків у молекулі ферменту NO чи його метаболітами (Титов В.Ю., 2008).

Рівень GSH залишається підвищеним в серці та легенях за добу при сумісному введенні L-аргініну та гліцеролу. А через 2 год. після сумісного введення донору NO та гліцеролу і введення тільки L-аргініну в серці спостерігається зменшення вмісту GSH, що, ймовірно, обумовлене зв'язуванням його оксидом азоту з утворенням

S-нітрозоглутатіону. Останній, як відомо з літератури, пролонгує період напівжиття NO та виявляє потужні антиоксидантні властивоcті (Mayer B., 1998).

Література містить приклади захисного впливу L-аргініну в нирках тварин при рабдоміолізі, який, на думку авторів, пов'язаний з судинорозслаблюючими властивостями оксиду азоту, що утворюється (Maree A., 1994; Wakabayashi Y., 1996).

Як видно з отриманих нами даних, за гліцерольної моделі рабдоміолізу спостерігається накопичення гему у крові, судинах, серці та легенях, що супроводжується активацією вільнорадикальних процесів у досліджених тканинах і підвищенням ГО активності в судинах, серці та легенях. Попереднє введення L-аргініну не впливає на розвиток оксидативного стресу в сироватці крові та судинах за рабдоміолізу, проте в тканинах серця і легень виявляє антиоксидантний ефект.

Гемоксигеназна активність та показники прооксидантно-антиоксидантного статусу серця, судин та легень за введення гліцеролу та сумісного введення L-аргініну і гліцеролу в умовах інгібування гемоксигеназ. Враховуючи вищевикладені експериментальні дані щодо антиоксидантного ефекту L-аргініну за рабдоміолізу в тканинах, де спостерігалася більш рання індукція гемоксигенази, а також літературні дані про захисне значення індукції ГО-1 в нирках при рабдоміолізі, доцільно було дослідити вплив L-аргініну на прооксидантно-антиоксидантний стан вивчених тканин за гліцерольної моделі рабдоміолізу в умовах інгібування гемоксигеназної активності.

Попереднє введення інгібітору гемоксигеназ, Zn-протопорфірину, не впливає на динаміку ГО активності у судинах щурів після введення гліцеролу (табл. 3).

Таблиця 3 - Гемоксигеназна активність та вміст білірубіну у сироватці, судинах, серці та легенях щурів після введення гліцеролу, сумісного введення L-аргініну і гліцеролу та сумісного введення гліцеролу, L-аргініну і Zn-РР (Ms, n=4-11)

Примітка. * Р<0,05 відносно контролю.

Zn-PP є конкурентним інгібітором (Labbe R.F., 1999), а вміст гему у судинах підвищений як за сумісного введення донору NO та гліцеролу, так і в умовах попереднього введення Zn-PP (табл. 4) і корелює з динамікою ГО активності в цій тканині (r=0,95, P=0,05). Отже, відсутність впливу Zn-PP на активність ферменту може бути пов'язана зі зняттям інгібування високою концентрацією субстрату, гему.

У серці введення Zn-РР призводить до пригнічення ГО активності до 68% від контрольного рівня (табл. 3). В легенях попереднє введення Zn-РР запобігає підвищенню активності ферменту після сумісного введення L-аргініну і гліцеролу (табл. 3). Швидкість деградації гему оцінювали й за вмістом в тканинах одного з кінцевих продуктів ГО реакції - білірубіну. Цей метаболіт розпаду гему утворюється в різних тканинах, надходить у кров і транспортується до печінки, де підлягає кон'югації (Tenhunen R., 1968). Зміни вмісту білірубіну в серці та легенях (табл. 3) корелюють з динамікою ГО активності в цих органах (r=0,9, Р<0,01).

Попереднє інгібування ГО активності Zn-РР у серці та легенях позначається й на вмісті гему. Попереднє введення Zn-РР викликає різке, більш ніж двократне, підвищення вмісту гему в обох органах за добу після основного впливу (табл. 4).

Таблиця 4 - Вміст загального гему, ТБК-АП та БКП у сироватці, судинах, серці та легенях щурів після введення гліцеролу, сумісного введення L-аргініну і гліцеролу та сумісного введення гліцеролу, L-аргініну і Zn-РР (Ms, n=4-11)

Примітки: * Р<0,05 відносно контролю; ** Р<0,05 відносно «Гліцерол».

Більше того, інгібування гемоксигеназ знімає антиоксидантний ефект

L-аргініну, викликаючи більш сильне підвищення вмісту ТБК-АП у серці порівняно з введенням тільки гліцеролу та двократне накопичення цих сполук у легенях порівняно з контролем, а також зростання вмісту БКП в обох органах, як і після ін'єкції гліцеролу (табл. 4).

Інгібування ГО активності повністю блокує нормалізуючий вплив L-аргініну і щодо антиоксидантних ферментів - активність СОД у серці та легенях знижена, а каталазна активність в серці підвищена, як і після введення лише гліцеролу (табл. 5).

Таблиця 5 - Супероксиддисмутазна та каталазна активності у серці та легенях щурів після введення гліцеролу, сумісного введення L-аргініну і гліцеролу та сумісного введення гліцеролу, L-аргініну і Zn-РР (Ms, n=4-11)

Примітка. * Р?0,01 відносно контролю.

Таким чином, отримані дані свідчать, що введення інгібітору гемоксигеназ не впливає на розвиток оксидативного стресу в крові та судинах щурів за рабдоміолізу, що, очевидно, пов'язано з відсутністю ГО у крові та зняттям інгібуючого ефекту Zn-РР високою концентрацією гему у судинах. Проте в серці та легенях Zn-РР пригнічує гемоксигеназну активність, що супроводжується прооксидантним впливом. Блокування антиоксидантного впливу L-аргініну в серці та легенях за рабдоміолізу введенням Zn-РР вказує на провідну роль ранньої індукції гемоксигенази L-аргініном в його захисному ефекті.

Гемоксигеназна активність та показники прооксидантно-антиоксидантного статусу серця, судин та легень за введення хлориду геміну та сумісного введення Nщ-нітро-L-аргініну і хлориду геміну. Введення хлориду геміну супроводжується підвищенням вмісту загального гему у сироватці крові у 2,9 рази у перші години та 1,5 рази за добу після впливу (табл. 6).

У гомогенаті судин концентрація гему збільшується за 2 год. після ін'єкції хлориду геміну, а за добу не відрізняється від контрольних значень (табл. 6). Вміст загального гему у сироватці корелює з його вмістом у судинах (r=0,75, Р=0,05).

У постмітохондріальних фракціях серця і легень концентрація гему не змінюється в жоден з досліджених термінів (табл. 6). Відсутність накопичення гему у серці та легенях за підвищення його вмісту у сироватці крові, ймовірно, пов'язана з переважанням специфічних механізмів транспорту гему, внаслідок чого гем з кров'яного русла надходить, перш за все, до печінки (Никитченко И.В., 1992).

Одночасно з накопиченням гему у сироватці крові та судинах спостерігається підвищення вмісту ТБК-АП (табл. 6). У легенях концентрація даних сполук не змінюється в жоден з досліджених термінів (табл. 6). У серці введення екзогенного геміну не впливає на вміст ТБК-АП у перші години та викликає зростання цього показника за добу (табл. 6). Подібна динаміка встановлена у серці й для вмісту нітритів, стабільних метаболітів оксиду азоту, концентрація яких не змінюється за 2 год. та збільшується за добу після ін'єкції геміну (табл. 6). На вміст БКП у сироватці крові, серці та легенях введення хлориду геміну у обраній дозі не впливає (табл. 6).

Таблиця 6 - Вміст загального гему, ТБК-АП і БКП у сироватці крові, судинах, серці та легенях та нітритів у серці щурів після введення хлориду геміну, сумісного введення Nщ-нітро-L-аргініну і хлориду геміну та введення Nщ-нітро-L-аргініну (Ms або Mе (квартилі); n=4-10)

Примітки: * Р<0,05 відносно контролю; ** Р<0,0001 відносно «Хлорид геміну, 2 год.».

Відомо, що оксид азоту може виявляти як антиоксидантні, так і прооксидантні властивості, що залежить від його вмісту, вмісту інших радикалів, антиоксидантного статусу клітини тощо (Pacher P., 2007). Для з'ясування ролі NO у встановлених змінах був використаний конкурентний інгібітор NO-синтаз L-NNA.

Попереднє введення Nщ-нітро-L-аргініну не впливає на динаміку накопичення гему та ТБК-АП у сироватці крові та судинах, яка спричинена хлоридом геміну (табл. 6). Введення лише L-NNA не впливає на базальний вміст даних показників у сироватці, а у судинах викликає підвищення концентрації гему та ТБК-АП через 2 год. після впливу (табл. 6). У легенях за сумісного введення Nщ-нітро-L-аргініну та хлориду геміну та введення тільки L-NNA вміст гему і ТБК-АП залишається на рівні контролю (табл. 6). У серці попереднє введення інгібітору NO-синтаз не впливає на вміст гему (табл. 6), проте запобігає накопиченню ТБК-АП (табл. 6), що свідчить про участь оксиду азоту, утвореного в NO-синтазних реакціях, в активації вільнорадикальних процесів у цьому органі. Останнє підтверджується даними щодо нормалізації вмісту нітритів у серці в цей же час (табл. 6). Відсутність змін в динаміці ТБК-АП у сироватці та судинах за сумісного введення L-NNA та хлориду геміну свідчить, що порушення прооксидантно-антиоксидантного стану цих тканин спричинені утворенням активних форм кисню, а не азоту. Інтенсифікація вільнорадикальних процесів у сироватці та судинах пов'язана з накопиченням вільного гему та обумовлена його прооксидантними властивостями.

В перші години після введення екзогенного геміну спостерігається підвищення ГО активності у судинах, що зберігається й за добу (табл. 7).

Таблиця 7 - Гемоксигеназна, супероксиддисмутазна та каталазна активності у судинах, серці та легенях щурів після введення Nщ-нітро-L-аргініну і хлориду геміну та введення Nщ-нітро-L-аргініну (Ms або Mе (квартилі); n=4-10)

Примітки: * Р<0,05 відносно контролю; ** Р=0,01 відносно «Хлорид геміну, 2 год.».

У серці та легенях активність ферменту не відрізняється від контрольних значень в усі досліджені терміни після введення хлориду геміну (табл. 7), що, очевидно, пов'язане з низьким вмістом гему в цих органах за введення геміну.

Введення хлориду геміну викликає незначне підвищення СОД активності у серці вже у перші години, що підсилюється за добу після впливу (табл. 7). На СОД активність у легенях та каталазну активність в обох органах екзогенний гемін не впливає (табл. 7). Відомо, що активність СОД регулюється як активними формами кисню, так і оксидом азоту (Барабой B.A., 2006; Jung О., 2007).

Крім того, оксид азоту бере участь у регуляції гемоксигеназної активності. За сумісного введення інгібітору NO-синтаз та хлориду геміну в судинах спостерігається більш виражене підвищення гемоксигеназної активності, ніж при введенні тільки хлориду геміну, через 2 год. та нормалізація показника за добу (табл. 7). Підсилення активації гемоксигенази N-нітро-L-аргініном за введення геміну, очевидно, пов'язане з різними шляхами, за якими реалізують свої ефекти ці агенти. При цьому введення самого інгібітору збільшує активність ферменту в перші години та не впливає за добу (табл. 7). В серці та легенях ГО активність зберігається на рівні контролю в усіх досліджених групах тварин (табл. 7).

Підвищення ГО активності у судинах в умовах пригнічення утворення NO показано у літературі за сильної гіпоксії за рахунок активації ГО-2 (Wu L., 2005) та при атеросклерозі за рахунок індукції ГО-1 (Siow R.C., 1999). В нашому експерименті спостерігалося накопичення гему в судинах, тому збільшення ГО активності, очевидно, є результатом індукції ГО-1 субстратом. Відомо, що моноксиду вуглецю притаманні судинорозслаблюючі властивості. Підвищення ГО активності у судинах в умовах зниження основного вазодилататору судинної стінки, оксиду азоту, ймовірно, є компенсаторним механізмом для підтримання нормального тонусу судин.

Попереднє введення N-нітро-L-аргініну не впливає на підвищення СОД активності у серці у перші години та попереджає підсилення активації супероксиддисмутази за добу після введення хлориду геміну (табл. 7), що свідчить про участь в даному ефекті оксиду азоту, утвореного в NO-синтазних реакціях.

Результати проведеного дослідження свідчать, що введення хлориду геміну викликає накопичення гему в сироватці крові та судинах і підвищення ГО активності лише в судинах, не впливаючи на дані показники в серці та легенях. Попереднє введення інгібітору NO-синтаз підсилює активацію ГО у судинах. Введення тільки L-NNA призводить до накопичення гему та зростання ГО активності у судинах. Активація вільнорадикальних процесів за введення екзогенного геміну в крові та судинах пов'язана з накопиченням гему, а у серці - з прооксидантними ефектами оксиду азоту, що утворений в NO-синтазних реакціях.

ВИСНОВКИ

Значне накопичення загального гему у крові, спричинене внутрішньом'язовим введенням гліцеролу, та надходження його до тканин серця, судин та легень щурів супроводжується порушенням прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у бік підсилення вільнорадикальних процесів в досліджених тканинах: накопиченням ТБК-активних продуктів, білкових карбонільних похідних та змінами в антиоксидантній системі. У тканинах серця, судин та легень підвищується ГО активність за гліцерол-індукованого рабдоміолізу.

Попереднє введення субстрату NO-синтаз, L-аргініну, викликає більш раннє підвищення гемоксигеназної активності та відновлення прооксидантно-антиоксидантного балансу у серці та легенях за гліцерольної моделі рабдоміолізу. Введення тільки L-аргініну також веде до підвищення ГО активності у легенях через 2 год. після ін'єкції. У сироватці та судинах введення L-аргініну не впливає на зміни, спричинені внутрішньом'язовою ін'єкцією гліцеролу.

Інгібування гемоксигеназ Zn-протопорфірином запобігає відновленню прооксидантно-антиоксидантного балансу у серці та легенях після сумісного введення L-аргініну та гліцеролу, що свідчить про ключову роль індукції гемоксигенази L-аргініном в його захисному ефекті.

Введення екзогенного геміну викликає трикратне підвищення вмісту гему у сироватці крові та його надходження до тканин судин, що супроводжується змінами прооксидантно-антиоксидантного статусу цих тканин: накопиченням ТБК-активних продуктів в сироватці та судинах і підвищенням ГО активності в судинах.

Попереднє введення неспецифічного конкурентного інгібітору NO-синтаз, N-нітро-L-аргініну, не впливає на динаміку накопичення гему та ТБК-активних продуктів в сироватці та судинах, проте підсилює підвищення ГО активності, що викликане введенням екзогенного геміну, у судинах. Введення тільки L-NNA викликає підвищення базального рівня загального гему і ГО активності у судинах.

В серці та легенях рівень гему та ГО активність не відрізняються від контрольних значень після введення хлориду геміну. Як показали експерименти з використанням N-нітро-L-аргініну, порушення прооксидантно-антиоксидантного статусу серця (підвищення вмісту ТБК-активних продуктів, рівня нітритів та збільшення СОД активності), спричинені введенням екзогенного геміну, обумовлені, головним чином, утворенням оксиду азоту в NO-синтазних реакціях.

Порівняння впливу різних концентрацій гемовмісних продуктів в крові на гемоксигеназну активність та деякі прооксидантно-антиоксидантні показники досліджених тканин виявило, що надходження гему до тканин серця та легень та активація гемоксигенази визначаються рівнем гему у крові, а порушення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги може бути обумовлене як прямим, так і непрямим впливом вільного гему.

В умовах накопичення гемовмісних продуктів у крові активація гемоксигенази може бути викликана як підсиленням утворення оксиду азоту за введення субстрату, L-аргініну, так й інгібуванням NO-синтаз N-нітро-L-аргініном.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Калиман П. А. Гемоксигеназная активность в тканях сосудов и сердца крыс при совместном введении ингибитора NO-синтаз и хлорида гемина / П. А. Калиман, В. П. Филимоненко, И. В. Никитченко // Український біохімічний журнал. - 2008. - Т. 80, № 2. - С. 128-134. (Филимоненко В.П. отримала всі експериментальні дані, наведені в статті, та провела їх статистичну обробку, готувала статтю до друку).

2. Филимоненко В. П. Антиоксидантные эффекты L-аргинина в сердце крыс при экспериментальном рабдомиолизе / В. П. Филимоненко, И. В. Никитченко, П. А. Калиман // Український біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 1. - С. 114-121. (Автор роботи особисто отримала всі експериментальні дані, наведені в статті, та провела їх статистичну обробку).

3. Филимоненко В. П. Нарушение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в сосудах, сердце и легких крыс при накоплении гем-содержащих продуктов в крови / В. П. Филимоненко // Вісник ХНУ імені В. Н. Каразіна. Серія: Біологія. - 2009. - Вип. 9, № 856. - С. 50-56.

4. Филимоненко В. П. Вплив L-аргініну на про- та антиоксидантний статус судин і легень щурів в умовах експериментального рабдоміолізу /

5. В. П. Филимоненко, І. В. Нікітченко, П. А. Каліман // Фізіологічний журнал. - 2009. - Т. 55, № 5. - С. 64-71. (Здобувач дослідила всі показники, наведені в статті, та провела статистичну обробку отриманих результатів, підготувала статтю до друку).

6. Филимоненко В. П. Гемоксигеназна активність у...