Структурні та метаболічні особливості тканин карася сріблястого Carassius Auratus в умовах температурної аклімації

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 577.121.7:597.554.3.044.084

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Структурні та метаболічні особливості тканин карася сріблястого Carassius Auratus в умовах температурної аклімації

03.00.19 - кріобіологія

Погожих Олена Геннадіївна

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис:

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Гулевський Олександр Кирилович Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу біохімії холодової адаптації, м. Харків

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук Солдатов Олександр Олександрович Інститут біології південних морів НАН України, завідувач відділу фізіології і біохімії тварин

Доктор біологічних наук Бабійчук Любов Олександрівна Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоцитології та кількісної морфології

Захист дисертації відбудеться 16.02.2010 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий 15.01.2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор, академік НАН УкраїниГольцев А. М.

лактатдегідрогеназа карась температурний адаптація

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Природа сезонних механізмів адаптації тварин вже багато років перебуває в центрі уваги дослідників. З одного боку, такий складний фактор, як сезон, може бути розкладений на ряд більш простих факторів, таких як температура, фотоперіод і т.д., які можуть бути вивчені окремо й у різних комбінаціях. З іншого боку, давно відомо, що зміни в організмі можуть бути пов'язані із сезонними ритмами, а не зі зміною температури або інших факторів. Прісноводні риби є однією зі стандартних моделей при вивченні подібних закономірностей.

Одним з найважливіших факторів, які істотно впливають на метаболічні процеси у риб як пойкілотермних тварин, є температура. Для кожного виду водних тварин існують свої оптимальні температурні межі, у яких вони найбільш активні. Зі зміною температури води нижче оптимальної, активність метаболічних процесів значно вповільнюється [Романенко В.Д. и др. 1991; Эккерт Р. и др. 1992; Озернюк Н.Д., 2000].

Сезонні коливання температури обумовлюють наявність адаптаційних механізмів, які дозволяють організму переживати несприятливі періоди. Одним з таких механізмів є стан гіпобіоза, характерний для багатьох безхребетних і хребетних, у тому числі і риб.

Стан гіпобіозу характеризується зниженням рівня метаболізму і перебудовою багатьох ланок регуляції метаболізму і генерування енергії. Встановлено, що при адаптації до низьких позитивних температур відбуваються істотні зміни в енергетичному обміні риб [Мороз И.Е. 1971; Романенко В.Д. и др. 1991; Storey К.В., 2004 ], а енергозабезпечення процесів аклімації риб до низьких температур здійснюється не за рахунок аеробного шляху, а переважно через механізм гліколізу, який набуває першорядне значення при зниженні температури нижче оптимальної. Відомо, що одним з важливих ферментів гліколізу є ЛДГ, разом з цим на теперішній час дані відносно цього ферменту при аклімації до низьких температур є суперечливами [Проссер К.Л., 1964; Зданович В.В. 1990; Романенко В.Д. и др. 1991; Vornanen M. et al. 2006]. Крім цього недостатньо встановлена роль субстратів ЛДГ у процесах температурної адаптації. Так само не встановлений зв'язок між енергетичним обміном і особливостями ультраструктури клітин тканин риб при пристосуванні до холоду. Є окремі роботи, що присвячені ультраструктурним змінам тканин риб [Johnston J.A. et al. 1980; Статова М.П. и др. 1985; Alvarez M. et al. 2006], але вони не створюють закінченої картини й не відбивають зв'язку з енергетичними процесами.

Велике значення для забезпечення структурного й функціонального гомеостазу мають білки [Смирнов Л.П. 1985; Guo X. F. et al. 1994; Vornanen M. 1994; McLean L. et al. 2007], склад і структура яких змінюється в процесі адаптації риб до факторів зовнішнього середовища [Коробoв В.Н. 1992; Watabe S. et al. 1995; Yamashita M. et al. 1996; McLean L. et al. 2007]. Однак дотепер якісні й кількісні зміни білкового складу клітин різних тканин при зміні температурних умов досліджені недостатньо.

Енергетичний обмін при холодовій адаптації перебуває в прямій залежності від присутності в організмі риб не тільки енергетичних запасів (ліпіди, глікоген), але й спеціальних регуляторних речовин, які відповідають за перемикання організму на інший фізіологічний і біохімічний режим існування [Swan H. et al. 1977; Иваницкий Д.А. и др. 1982]. Ці речовини мають гіпометаболічний і інші ефекти, причому для них, як було встановлено раніше, не існує видової специфіки [Шейман И.М. и др. 1986; Ашмарин И.П. 1986; Гулевский А.К. и др. 2005; Gulevsky A.K. et al. 2005].

Оскільки карась сріблястий Carassius auratus може переносити тривалі періоди гіпотермії й гіпоксії, можна припустити наявність у нього особливостей енергетичного обміну, структурних перебудов і наявність регуляторних ендогенних речовин, які дозволяють йому переживати тривалі сезонні зниження температури.

Всі перераховані проблеми вказують на актуальність проведення досліджень по вивченню структурно-функціональних механізмів температурної адаптації карася сріблястого.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі біохімії холодової адаптації в рамках планової теми НДР ІПКіК НАН України № 2.2.6.24 «Дослідження регуляторних пептидів прісноводних риб, які знаходяться у стані зимового спокою » № ДР 0106U002165.

Мета і задачі дослідження.

Метою дисертаційної роботи було вивчення структурних і метаболічних особливостей різних тканин карася сріблястого при температурній аклімації в природних й штучних умовах.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1. Вивчити активність ЛДГ і вміст її субстратів і продуктів реакції у тканинах карася сріблястого Carassius auratus, що утримувався при різних температурних режимах.

2. Дослідити рівень АТФ в тканинах карася сріблястого при різних температурних умовах.

3. Дослідити склад білків тканин карася сріблястого залежно від сезону й температури утримання.

4. Вивчити ультраструктуру червоних і білих м'язів карася сріблястого при адаптації до різних температур.

5. Виділити фракцію до 5 кДа із мозку холодоадаптованих С. auratus, що перебувають у стані зимового спокою.

6. Вивчити вплив низькомолекулярної фракції на інтенсивність енергетичного обміну (активність ЛДГ, вміст лактату, пірувату, АТФ) у карася сріблястого при різкій зміні температури утримання.

Об'єкт дослідження. Адаптаційні процеси в тканинах карася сріблястого при температурній аклімації в природних й штучних умовах.

Предмет дослідження. Метаболізм і білковий склад тканин, ультраструктура клітин карася сріблястого залежно від сезону року і температурного режиму.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених задач були використані наступні методи: біохімічні - визначення активності ЛДГ, визначення кількості лактата, пірувата й АТФ, визначення білкового спектра методом SDS-електрофореза; морфологічні - електронна мікроскопія, морфометрія; статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше проведено комплексний аналіз енергетичного обміну метаболічних процесів із урахуванням ряду показників енергообміну (активність ЛДГ, вміст лактата й пірувата, рівень АТФ) у представника прісноводних риб - карася сріблястого.

Встановлено, що карась сріблястий С. auratus здатний досить швидко перемикати функціонування свого організму на літній режим, у той час як влітку риби не здатні швидко адаптуватися до зниження температури і у них спостерігаються різкі зміни показників енергообміну.

Вперше з мозку холодоадаптованих карасів cріблястих виділена біологічно активна низькомолекулярна фракція до 5 кДа, яка здатна запобігати їх загибелі при різкому зниженні температури води в літній період. Виявлено, що фракція до 5 кДа сприяє зміні показників енергообміну в даних умовах у напрямку їхньої нормалізації.

Вперше показано що в тканинах червоних м'язів, міокарда й печінки карася сріблястого в зимовий період з'являються білки з молекулярною масою 205 і 172 кДа відповідно, кількість яких різко зменшується при підвищенні температури утримання риб як при природній сезонній аклімації, так і в лабораторних умовах.

Виявлені закономірності змін, що відбуваються на субклітинному рівні у міоцитах червоних і білих м'язів карася сріблястого, вони зводяться до збільшення об'єму саркоплазматичного ретикулуму, збільшення кількості мітохондрій і зсунення їх в навколоядерну зону з утворенням багатьох межмітохондріальних контактів.

Практична і теоретична значимість отриманих результатів.

Отримані результати і їхнє узагальнення доповнюють і розширюють сучасні знання про адаптацію пойкілотермних тварин до низьких позитивних температур. Також виявлені факти мають значення для обґрунтування керованої гіпотермії гомойотермних тварин, в тому числі і людини.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником проведене планування експериментальної роботи. Здобувачем самостійно проведений аналіз даних літератури, отримані експериментальні дані у всіх розділах досліджень, здійснен їх первинний аналіз і статистична обробка. Автором роботи разом з науковим керівником О.К. Гулевським проаналізовані отримані результати, інтерпретовані отримані дані й сформульовані відповідні висновки. Спільні публікації відбивають результати спільного планування, проведення експериментів і обговорення результатів.

В опублікованих разом із співавторами роботах особистий вклад дисертанта полягає:

- у роботах [1,2] - у досліджені активності ЛДГ та вмісту пірувата у тканинах риб.

- у роботах [3, 7] - у приготуванні зразків для електронної мікроскопії, та їх аналізі.

- у роботах [4-6] - у проведенні експериментів щодо активності ЛДГ та вмісту її субстратів.

- у роботі [8] - у проведенні електрофоретичних досліджень.

- у роботах [9, 10] - у проведенні експериментів щодо активності ЛДГ та вмісту її субстратів та виділенні фракції до 5 кДа з мозку холодоадаптованих риб.

- у роботах [10-12] - у досліджені активності ЛДГ та статистичної обробки отриманих даних.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на конференціях: I міжнародної конференції молодих вчених «Біологія: від молекули до біосфери» (м. Харків, 2006); конференції молодих вчених ІПКіК разом з кафедрою UNESCO “Холод у біології й медицині” (м. Харків, 2007, 2008 р.); міжнародній конференції студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» ( м. Львів, 2007); міжнародній конференції «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» (г. Одеса, 2007); конференції з міжнародною участю “Нові кріобіотехнології для розв'язання фундаментальних і прикладних завдань медицини” (м. Харків, 2008).

Публікації. По темі дисертаційної роботи опубліковано 9 статей в наукових фахових журналах і 3 тез доповідей на міжнародних і національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 141 сторінкці друкованого тексту. Дисертація складається із вступу, літературного огляду, опису матеріалів і методів досліджень, результатів та обговорення власних досліджень, заключної частини, висновків, списку використаних джерел, що містить 208 джерел на 23 сторінки. Дисертація ілюстрована 4 таблицями і 28 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Експерименти були проведені на 340 карасях сріблястих Carassius auratus, з середньою вагою 30 - 40г.

Частину риб, виловлених у зимовий період, утримували при температурі 20-22^оС тривалістю не менш 2 тижнів, іншу частину риб, утримували при температурі 4-5^оС (контроль). Частину риб виловлених влітку, розміщували в холодовій камері при температурі 4-5^оС, іншу частину при температурі 20-22^оС (контроль). Необхідну кількість тканини (білі м'язи, червоні м'язи, серце, мозок, печінка) поміщали в контейнери із пластику й зберігали в рідкому азоті.

Одну групу карасів, виловлених в літній період, розміщали в холодовій камері з температурою 4-5^оС, але їм перед тим внутришньочеревно була введена фракція до 5кДа із мозку холодоадаптованих (зимових) карасів, розведена у фізіологічному розчині для пойкілотермних тварин (0,6% NaCl), у кількості 4-5 мг на особину із середньою вагою 30 г.

Для одержання пептидної фракції з мозку адаптованих до холоду особин використовували карасів, виловлених у січні й лютому. Мозок витягали при температурі 4^оС, розфасовували в пластикові контейнери й зберігали в рідкому азоті при - 196^оС.

Виготовлення екстрактів із тканини мозку робили, як описано в роботі [Swan H et al., 1981] з деякими модифікаціями. Низькомолекулярну фракцію до 5 кДа виділяли методом ультрафільтрації на мембранному модулі “Vivaflow-200” фірми “Sartorius” (Німеччина). В отриманому фільтраті залишаються сполуки з молекулярною вагою менш 5 кДа. Фільтрат висушували у вакуумній термосушці при тиску -1 атм. і температурі 40^оС.

Для електронної мікроскопії брали білі й червоні м'язи риб з однакових ділянок тіла. Підготовку зразків для мікроскопіювання проводили за загальноприйнятою методикою [Карупу В.Я. 1984] з деякими модифікаціями. Ультратонкі зрізи готували за допомогою мікротома УМТП-5, офарблювали цитратом свинцю й аналізували під електронним мікроскопом УМВ-100.

Для проведення морфометрії фотографували скупчення мітохондрій в околоядерній зоні м'язових волокон при інструментальному збільшенні мікроскопа 6000^х. За допомогою приладу ПМА-1 [Загоруйко Г.Е. и др. 1979] проводили морфометричний вимір мітохондрій. Визначали: більший (D, µк) і менший (d, µк) діаметри контурів зрізів не менше 50 мітохондрій. Визначали показник суміжності мітохондрій - число межмітохондриальних контактів (?).

Для електрофоретичного дослідження мозок, серце, фрагменти печінки, червоних і білих м'язів гомогенизували в 0,1 М фосфатному буфері рН 8. Проби для електрофорезу готували на стандартному Sample-буфері (рН 6,8). Електрофорез проводили на приладі LKB 2117 Multiphor II у градієнтному 10-25% ПААГ, як описано в [Остерман Л.А. 1981]. Гелі фарбували барвником Кумасі- R250. У роботі використані стандарти молекулярної ваги фірми Fermentas UAB (Литва).

Загальний білок визначали як описано в [Скоупс Р. 1985].

Активність ЛДГ у напрямку лактат > піруват визначали за допомогою наборів фірми “Реагент”. Принцип метода заснований на тім, що L-лактат під впливом ферменту тканини в присутності нікотинамідадениннуклеотида в лужному середовищі окислюється в піруват [Колб В.Г. 1976]. По кількості утвореного пірувата судять про активність ферменту.

Активність ЛДГ у напрямку піруват > лактат визначали за методикою [Асатиани В.С. 1969].

Вміст АТФ (мкг/г сирої маси) визначали за методикою [Jaworek D. et al. 1974]. Хемілюмінесцентний аналіз проводили на приладі ATP Luminometer 1250, (LKB, Швеція).

Вміст пірувату (мкмоль/г тканини) визначали за методикою [Прохорова М.И. 1982], в основу якої покладений метод Цока і Лампрехта.

Зміст молочної кислоти (мкмоль/г тканини) визначали за методикою [Прохорова М.И. 1982], в основі якої лежить метод Хохорста.

Всі отримані цифрові дані були статистично оброблені з використанням критерію Манна-Уітні для вибірок з невідомим розподілом за програмою StatgraphicWin.

Результати досліджень та їх обговорення

Ультраструктурні зміни в тканинах карася сріблястого при температурній адаптації.

У період підготовки до несприятливого періоду в організмі риби відбувається перебудова її систем на всіх рівнях: органному, тканьовому, клітинному і молекулярному [Alvarez M. et al. 2001], білковий склад тканин і клітин також змінюється. Насамперед, це стосується скорочувальної системи м'язових волокон [Guo X.F. et al. 1994; Watabe S. et al. 1995;]. Однак досліджень по вивченню реакції структур клітин риб на процеси адаптації до різних температур є недостатньо.

Для проведення електронної мікроскопії було обрано 2 групи тварин: 1 - риби, виловлені взимку, аклімовані при 20-22^оС, і 2 -виловлені взимку, утримані при температурі 4-5^оС. Вивчали ультраструктуру білих і червоних м'язів.

Білі м'язи аклімованих до різних температур карасів мають свої особливості. Зокрема ядра риб, аклімованих при 20-22^оС, мають ультраструктуру, що свідчить про підвищену активність у порівнянні з «зимовими». Це проявляється в тому, що ядра риб аклімованих при 20-22^оС мають округлу форму, каріоплазма має невисоку електронну щільність і незначну кількість комплексів гетерохроматину. Хроматин в основному перебуває в деконденсованому стані, що говорить про його функціональну активність, а значить про активність метаболичних процесів.

У карасів аклімованих при 20-22^оС кількість мітохондрій, локалізованих між міофібрілами, істотно не відрізняється від «зимових». Показник їхньої суміжності дорівнює 1,7 при скороченні і 1,2 у стані спокою при температурі 20-22^оС, та 1,85 і 1,3 відповідно при температурі 4-5^оС.

Саркоплазматичний ретикулум у білих м'язах карасів, аклімованих при 20-22^оС, зустрічається в помірній кількості. В основному, це сплюснені везикули помірних розмірів, розташовані в один ряд між міофібрілами. В «зимових» тварин виявлено помітно більше мембран саркоплазматичного ретикулуму, вони крупніші, мають округлу форму й розташовуються в декілька рядів між міофібрілами. Це може бути адаптаційним механізмом, що сприяє ефективній регуляції м'язового скорочення при зниженні температури.

Червоні м'язи риб, адаптованих до різних температур, також мають свої особливості. Ядра міофибрил карасів аклімованих при 20-22^оС мають еліпсовидну форму зі звитими краями. Каріоплазма має помірну щільність, де виявляється значна кількість щільних глобул гетерохроматину. Навколо ядра локалізовані мітохондрії. Ядра «зимових» тварин, мають більше округлу форму з рівними краями. Їхня каріоплазма більш електроннощільна й містить більше глобул гетерохроматину. Навколо ядра зосереджено багато мітохондрій, ліпідних включень і везикул. Описана картина свідчить про високу функціональну активність ядерного апарата червоних м'язів у тварин навіть при зниженій температурі.

Кількість мітохондрій помітно більша в м'язах «зимових» тварин у порівнянні з аклімованими в теплі. Кількість цих органел збільшується між міофібрілами, вони утворюють мітохондіальну сітку. За даними морфометрії показник суміжності мітохондрій дорівнює 1,2 при скороченні і 0,85 у стані спокою при температурі 20-22^оС, та 2,7 і 0,9 відповідно при температурі 4-5^оС.

Мережа саркоплазматичного ретикулуму м'язів «зимових» карасів, істотно краще розвинена в порівнянні з аклімованими при 20-22^оС.

Таким чином, можна зробити висновок, що й червоні м'язи карасів також піддані адаптивним процесам при аклімації до різних температур, що пов'язано, швидше за все, із системою регуляції й енергозабезпечення м'язового волокна.

Виходячи з щільності розташування анізотропних та ізотропних дисків у міофібрілах, можливо припустити, що у зимовий період більша частина червоних м'язових волокон перебуває в стані спокою, у той час як при аклімації до 20-22^оС більша частина міофибрилл перебуває в активному стані.

Зміни спектру білків в тканинах карася сріблястого при різних температурах утримання.

Також було проведено електрофоретичне дослідження білків тканин карася сріблястого. Було встановлено що насамперед практично повністю зникає смуга білку з молекулярною масою 205 кДа у червоних м'язах і серці після аклімації при 20-22^оС. Ці зміни можуть бути частиною комплексної перебудови скорочувальної системи м'язів при зміні температурного режиму.

У білих м'язах в умовах аклімації до температури 20-22^оС спостерігається тільки незначне зменшення вмісту білків з молекулярною масою 105 і 45 кДа. У літературі немає відомостей про білкові спектри головного мозку залежно від сезону й температури утримання. На отриманій електрофореграммі єдина відмінність у складі білків мозку холодоаклімованих і аклімованих при 20-22^оС карасів - це незначне збільшення смуги білка з молекулярною масою 117 кДа при температурі 20-22^оС.

Таким чином, на підставі отриманих експериментальних даних можна зробити висновок, що під час аклімації карася сріблястого C. auratus при температурі 20-22^оС у зимовий період змінюється спектр білків червоних м'язів, серця й печінки, що проявляється в істотному кількісному зменшенні смуг білків з молекулярною масою 205 і 172 кДа, відповідно. Умови аклімації «зимових» риб при 20-22^оС в експерименті відтворювали літній режим існування риб, тому що не спостерігалися відмінності в білкових спектрах «літніх» риб і «зимових» риб, аклімованих при 20^оС.

Проте, сезонні ритми значно впливають на білковий склад тканин С. auratus, тому що в риб, виловлених навесні зі ставка, де температура води була 5°С, тільки в червоних м'язах присутній білок з молекулярною масою 205 кДа, характерний для «зимових» риб, а в міокарді ці розходження вже не спостерігаються. У печінці також зникає білок з молекулярною масою 172 кДа. Це свідчить про те, що в тканинах карася у весняний період, незважаючи на низьку температуру навколишнього середовища, відбуваються біохімічні зміни, спрямовані на перемикання організму на літній режим функціонування.

Особливості енергетичного обміну в тканинах карася сріблястого при природній та штучній температурній аклімації.

Пристосувальні механізми метаболізму, спричинені коливаннями температури, тісно пов'язані із процесами генерування енергії в метаболічних шляхах гліколізу й циклу трикарбонових кислот. Про функціональний стан цих процесів частково судять по активності окремих ферментів при різних температурах, а також по кількості їхніх субстратів. Оскільки лактатдегідрогеназа є одним з ферментів гліколізу, показники її активності використовують як визначення рівня анаеробного обміну.

У результаті проведених экcпериментів було з'ясовано, що активність ЛДГ у напрямку піруват > лактат (яке переважає при анаеробних умовах) у зимовий період вище в червоних м'язах карася (рис. 1) . Це не суперечить даним авторів [Swan H. et al. 1977; Hardewig I. et al. 1998], які повідомляли про переважне перемикання організму риб на анаеробний енергообмін у зимовий період. При цьому в білих м'язах такої різниці не спостерігається, що, імовірно, пояснюється тим, що в даному типі м'язів переважає анаеробний шлях одержання енергії незалежно від сезону [Лав М.Р. 1976]. Аклімація карасів в лабораторних умовах у зимовий період при температурі 20-22^оС приводила до істотного зниження активності ЛДГ у порівнянні із зимовими величинами у всіх вивчених тканинах. У червоних м'язах активність ферменту верталася на літній рівень, а в білих м'язах була навіть нижче.

При утриманні риб в холодовій камері влітку з метою аклімації їх до температури 4-5^оС, всі карасі гинули протягом 3-5 діб. Активність ЛДГ у напрямку піруват > лактат, яку вимірювали на 3 добу холодової аклімації риб, виявилася надзвичайно низькою у білих й у червоних м'язах. Після аклімації при 4-5^оС активність ЛДГ у напрямку піруват > лактат становила в білих м'язах усього лише 11,7% і 13,2% стосовно «літнього» і «зимового» значення відповідно, а в червоних м'язах - 20% і 15,2% стосовно «літнього» і «зимового» значенням відповідно. Надзвичайно різке падіння активності ЛДГ в напрямку піруват > лактат у м'язах в цих умовах здається особливо примітним. Швидше за все, дані обставини не є єдиною причиною загибелі карасів при зниженні температури влітку, однак воно свідчить про порушення регуляції виробництва енергії в метаболічних шляхах. Анаеробний шлях одержання енергії набуває першорядного значення при зниженні температури й гіпоксії, однак форма ЛДГ, що здійснює заключний етап гліколізу, виявляється нездатною функціонувати при охолодженні влітку.

Стратегія змін активності ЛДГ під час холодової аклімації в літній період принципово відрізняється від сезонних змін активності. При настанні холодної пори року в червоних м'язах активність ЛДГ підвищується, залишаючись практично незмінною в білих м'язах. Цю особливість білих м'язів можна пояснити тим, що в них здійснюється переважно анаеробний спосіб енергообміну [Лав М.Р.1976], тому ізоформа ЛДГ, що бере участь у гліколітичному процесі, характеризується високою активністю незалежно від пори року.

Але при раптовому й різкому зниженні температури організм не встигає перемкнути свої системи на оптимальне функціонування в змінених умовах, внаслідок чого спостерігаються різноманітні фізіологічні й біохімічні порушення, які надалі можуть привести до загибелі.

Відомо, що перехід естивуючих і гібернуючих тварин до стану гіпометаболізму при зміні температурного режиму здійснюється з участю низькомолекулярних сполук що утворюються в тканинах мозку [Swan H et al., 1981; A. K. Gulevsky et al., 2005]. Для дослідження можливої регуляції адаптаційного процесу у риб, з мозку «зимових» карасів була виділена низькомолекулярна фракція до 5 кДа.

Як можна побачити на рис. 1, у риб, яким напередодні холодової аклімації влітку була введена фракція до 5 кДа з мозку холодоадаптованих карасів, різкого падіння активності ЛДГ у порівнянні з «літніми» особинами не спостерігається ні в білих, ні в червоних м'язах, більш того в білих м'язах активність ЛДГ зростала на 13%. Це може свідчити про те, що отримана фракція містить певні сполуки, які здатні включати механізми біохімічної адаптації до низьких температур, що забезпечують високий рівень активності ЛДГ.

Однак тільки за рівнем активності ЛДГ неможливо судити про інтенсивність гліколізу й циклу трикарбонових кислот, тому є логічним визначити вміст лактата й пірувата, які є субстратами й продуктами ЛДГ у тканинах карася при 4-5 і 20-22^оС.

У зимовий період кількість лактата в м'язах найбільша, при аклімації до 20-22^оС його вміст зменьшується і найнижчий його рівень спостерігається влітку, що свідчить про зменшення ролі гліколізу в енергозабезпеченні організму риб у літній період.Слід зазначити, що вміст лактата після холодової аклімації риб в літній період значно підвищується у всіх досліджених тканинах у порівнянні з контролем.Можна припустити, що фракція до 5 кДа якимось чином дозволяє підтримувати активність ЛДГ на досить високому рівні незважаючи на велику кількість утвореного субстрату. У риб, яким була введена фракція до 5 кДа, вміст лактату в порівнянні з контрольним «літнім» рівнем у білих м'язах не змінюється, у червоних м'язах зростає на 75% (рис.2).

Незважаючи на наявність сезонних змін активності ЛДГ у напрямку піруват > лактат вміст пірувату в зимовий період у м'язах майже не відрізняється від «літнього» значення (рис. 3). Можна висловити припущення, що оскільки червоні м'язи покладаються в основному на аеробний спосіб енергообміну, і, отже, піруват їм потрібний більшою мірою, він продовжує витрачатися з досить високою швидкістю, незважаючи на низьку температуру.

Узагальнюючи дані про вміст пірувата після 3-добової холодової аклімації влітку й дані про інші біохімічні показники, можна зробити висновок, що при різкому зниженні температури влітку організм карасів не здатний швидко перейти на зимовий режим існування й відтворити відповідне включення й функціонування сезонних адаптаційних механізмів.

Введення фракції до 5 кДа із мозку холодоадаптованих карасів рибам напередодні холодової аклімації змінює вміст пірувата. У білих м'язах кількість його значно менше ніж у особин, що утримувалися в тих же самих умовах без введення фракції, хоча й не досягає «літнього» значення. У червоних м'язах введення фракції приводить до збільшення кількості пірувату в 1,6 рази в порівнянні зі значеннями в зимовий і літній періоди, а також після 3-денної холодові акклімації влітку без введення фракції. Можна зробити висновок, що введення фракції до 5 кДа із мозку холодоадаптованих карасів сприяє частковій нормалізації рівня пірувата при зниженні температури влітку.

Для більш повного уявлення всієї картини енергетичного обміну важливо не тільки знати особливості зміни кількості метаболітів, але й особливості вмісту й витрати універсального акумулятора енергії - АТФ. Процеси адаптації пов'язані зі структурно - функціональними перебудовами, які вимагають додаткової кількості енергії, у зв'язку із цим було актуальним визначення кількості АТФ у тканинах карася при аклімації до різних температур.

Кількість АТФ у білих м'язах взимку нижче в порівнянні з літнім періодом (рис.4). Проте в червоних м'язах у зимовий і літній періоди кількість АТФ не відрізняється. Можливо, це пояснюється тим, що судячи з кількості лактата взимку, гліколітичні процеси в червоних м'язах протікають досить інтенсивно, що й дозволяє підтримувати кількість АТФ на постійному рівні.

Холодова аклімація не впливає на вміст АТФ ні в білих, ні в червоних м'язах, а введення фракції до 5 кДа із мозку «зимових» риб перед холодовою аклімацією влітку приводить до різкого падіння кількості АТФ у білих м'язах (рис. 4) і до менш різкого, але все-таки достовірного зниження рівня АТФ у червоних м'язах. З одного боку фракція може сприяти ефективному використанню АТФ для потреб організму при різкій зміні температурних умов, а з іншої сторони ця фракція, можливо, перемикає організм карася в режим зниженого енерговиробництва.

Таким чином проведені дослідження свідчать про те, що механізми сезонної адаптації карася сріблястого Carassius auratus включають перебудову структурної організації клітин і метаболізму, що насамперед пов'язане з утворенням макроергів. Виявлені в тканині мозку холодоадаптованих риб низькомолекулярні сполуки, мають здатність регулювати «включення» механізмів температурної адаптації.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведене теоретичне та експериментальне узагальнення наукової задачі, спрямованої на вивчення здатності до температурної адаптації карася сріблястого Carassius auratus і встановлено, що вона пов'язана з особливостями структурної організації клітин і метаболізму, а також з наявністю низькомолекулярних регуляторних сполук, виявлених у тканині мозку.

1. Дослідження ультраструктури м'язів Carassius auratus при різних температурах аклімації дозволило встановити, що для білих та червоних м'язових волокон у зимовий період спостерігається збільшення обсягу саркоплазматичного ретикулуму, збільшення кількості мітохондрій і зсунення їх в навколоядерну зону з утворенням багатьох міжмітохондріальних контактів.

2. Щільність розташування анізотропних та ізотропних дисків у міофібрилах свідчить про те, що у зимовий період більша частина червоних м'язових волокон перебуває в стані спокою, у той час як при аклімації до 20-22^оС більша частина міофибрилл перебуває в активному стані.

3. Спектр білків тканин C. auratus перетерплює сезонні зміни, що проявляється в появі білків з молекулярною масою 205 кДа у червоних м'язах і міокарді й білка з молекулярною масою 172 кДа у печінці в зимовий період.

4. На склад білків впливає не тільки сезон, а і температура утримання, оскільки після 2-тижневої аклімації при 20-22^оС у зимовий період білкові спектри червоних м'язів, міокарда й печінки риб не відрізняються від таких у літній період, а у весняний період у риб, що утримуються при температурі 4-5^оС, тільки в червоних м'язах зберігається білок 205 кДа, типовий для зимових умов.

5. Аклімація при 4-5^оС у літній період призводить до загибелі риб протягом 3-5 діб. Введення низькомолекулярної фракції до 5 кДа, отриманої з мозку «зимових» карасів, здатне забезпечувати виживання риб за умов різкого зниження температури в літній період.

6. Низькомолекулярна фракція до 5 кДа, введена «літнім» рибам в умовах різкої зміни температурного режиму приводить до зниження рівня АТФ, а також до змін активності ЛДГ і вмісту пірувату й лактату в напрямку нормалізації цих параметрів.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Релина Л. И. Роль гликолиза при холодовой адаптации карася серебряного Carassius auratus gibelio / Л. И. Релина, Е. Г. Жегунова, Е. А. Грищенкова // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, №1. - С. 64-70.

2. Жегунова Е. Г. Влияние сезона и температурной акклимации на активность ЛДГ и содержание пировиноградной кислоты в тканях карася Carassius auratus / Е. Г. Жегунова, Л. И. Релина // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №1. - С. 85-87.

3. Жегунова О. Г. Вплив температурної адаптації на ультраструктуру білих та червоних м'язів карася сріблястого / О. Г. Жегунова // Науковий вісник національного аграрного університету. - 2008. - №126. - С. 42-50.

4. Релина Л. И. Сезонные изменения энергетического метаболизма у карася серебряного / Л. И. Релина, Е. Г. Жегунова, Е. А. Грищенкова // Міжвідомчий тематичний наук. збірник «Ветеринарна медицина» - 2008. - №89. - С. 308-312.

5. Изменения активности ЛДГ и содержания пирувата у карася серебряного в зависимости от времени года и температуры акклимации / А. К. Гулевский, Е. А. Грищенкова, Л. И. Релина, Е. Г. Жегунова, Е. В. Чаплай // Вісник проблем біології і медицини. - 2008. - №3. - С. 14-18.

6. Биохимические и морфологические аспекты сезонной и искусственной акклимации карася серебряного / А. К. Гулевский, Е. А. Грищенкова, Л. И. Релина, Е. Г. Жегунова, Е. В. Чаплай // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №4. - С. 499- 501.

7. Изменения ультраструктуры митохондрий скелетных мышц пресноводных рыб при разных температурах акклимации / Е. Г. Погожих, Г. Е. Загоруйко, Е. В. Иванова, Ю. В. Загоруйко, А. К. Гулевский // Вісник проблем біології і медицини. - 2009. - №3. - С. 39-45.

8. Гулевский А. К. Изменения состава протеинов тканей карася серебряного в зависимости от сезона и температуры содержания / А. К. Гулевский, Л. И. Релина, Е. Г. Погожих // Український біохімічний журнал - 2009. - Т.81, №5. - С. 93-99.

9. Влияние фракции до 5 кДа из мозга холодоадаптированных рыб на жизнеспособность карася серебряного в условиях холодового стресса / [ Грищенко В. И., Релина Л. И., Грищенкова Е. А., Погожих Е. Г., Сысоева И. В., Сысоев А. А. ] // Доповіді НАНУ. - 2009. -№ 11. - С. 155 - 159.

10. Активность ЛДГ у карася С. carassius при холодовой акклимации / А. К. Гулевский, Е. А. Грищенкова, Л. И. Релина, Е. Г. Жегунова, О. Л. Долгих // Тр. I Міжнар. конф. молодих вчених «Біологія: від молекули до біосфери». - Харків, 2006. - С. 68.

11. Zhegunova E. Seasonal changes of energetic metabolism in the crusian carp Carassius auratus / E. Zhegunova, L. Relina // Materials of III International Young Scientists conference. «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» - Odesa, 2007. - P. 234-235.

12. Жегунова О. Г. Рівень гліколізу у карася С. auratus при низьких температурах / О. Г. Жегунова // Тр. ІІІ Міжнар. наук. конф. молодих вчених [«Молодь та поступ в біології»]. - Львів, 2007. - С.50.

АНОТАЦІЯ

Погожих О.Г.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2010.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню змін структурно-морфологічних і біохімічних характеристик тканин карася сріблястого Carassius auratus під впливом сезонної аклімації й зміни температурних умов, а також пошуку регуляторних сполук, що контролюють перехід організму на новий фізіолого-метаболічний режим.

Дослідження ультраструктури м'язів C. auratus при різних температурах аклімації дозволило встановити, що для обох типів м'язових волокон у зимовий період спостерігається збільшення обсягу саркоплазматичного ретикулума, збільшення кількості мітохондрій з утворенням багатьох межмітохондриальних контактів.

Виявлено, що на склад білків впливає як сезон, так і температура утримання, оскільки після аклімації при 20-22^оС у зимовий період білкові спектри червоних м'язів, міокарда й печінки риб не відрізняються від таких у літній період, а у весняний період у риб, що утримуються при температурі 4-5^оС, тільки в червоних м'язах зберігається білок з молекулярною масою 205 кДа, характерний для зимових умов.

Різка зміна температури у літній період приводить до загибелі риб протягом 3-5 доби. Введення низькомолекулярної фракції до 5 кДа, отриманої з мозку «зимових» карасів, здатно забезпечувати виживання риб.

Фракція до 5 кДа приводить до зниження рівня АТФ, а також до змін активності ЛДГ і вмісту пірувата і лактата в напрямку нормалізації цих параметрів.

Результати роботи свідчать про те, що механізми сезонної адаптації карася сріблястого C. auratus включають перебудову структурної організації клітин і метаболізму, Виявлені в тканині мозку холодоадаптованих риб низькомолекулярні сполуки, мають здатність регулювати «включення» механізмів температурної адаптації.

Ключові слова: карась сріблястий, температурна аклімація, ультраструктура м'язів, білковий склад тканин, низькомолекулярна фракція.

АННОТАЦИЯ

Погожих Е.Г.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2010.

Диссертационная работа посвящена исследованию изменений структурно-морфологических и биохимических характеристик различных тканей карася серебряного Carassius auratus под влиянием сезонной акклимации и смены температурных условий, а также поиску регуляторных соединений, контролирующих переход организма на новый физиолого-метаболический режим.

Исследование ультраструктуры мышц C. auratus при различных температурах акклимации позволило установить, что для обоих типов мышечных волокон в зимний период наблюдается увеличение объема саркоплазматического ретикулума, увеличение количества митохондрий и смещение их в околоядерную зону с образованием множественных межмитохондриальных контактов.

Также было показано, что спектр белков тканей C. auratus претерпевает сезонные изменения, что проявляется в появлении белков с молекулярной массой 205 кДа в красных мышцах и миокарде и белка с молекулярной массой 172 кДа в печени в зимний период.

Обнаружено, что на состав белков оказывает влияние как сезон, так и температура содержания, поскольку после 2-недельной акклимации при 20-22^оС в зимний период белковые спектры красных мышц, миокарда и печени рыб не отличаются от таковых в летний период, а в весенний период у рыб, содержащихся при температуре 4-5^оС, только в красных мышцах сохраняется белок с молекулярной массой 205 кДа, характерный для зимних условий.

Резкая смена температуры с 20-22^оС до 4-5^оС в летний период приводит к гибели рыб в течение 3-5 суток, что сопровождается резким снижением активности ЛДГ и ростом содержания лактата в обоих типах мышц и возрастанием содержания пирувата в белых мышцах при сохранении количества АТФ на прежнем уровне.

Введение низкомолекулярной фракции до 5 кДа, полученной из мозга «зимних» карасей, способно обеспечивать выживание рыб при холодовой акклимации в летний период.

Низкомолекулярная фракция до 5 кДа приводит к понижению уровня АТФ, а также к изменениям активности ЛДГ и содержания пирувата и лактата в направлении нормализации этих параметров.

Результаты работы свидетельствуют о том, что механизмы сезонной адаптации карася серебряного Carassius auratus включают перестройку структурной организации клеток и метаболизма, что прежде всего связано с образованием макроэргических соединений. Обнаруженные в ткани мозга холодоадаптированных рыб низкомолекулярные соединения, обладают способностью регулировать «включение» механизмов температурной адаптации.

Ключевые слова: карась серебряный, температурная акклимация, ультраструктура мышц, белковый состав тканей, низкомолекулярная фракция.

ANNOTATION

Pogozhykh Ye. G.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree (PhD equivalent) in speciality 03.00.19 - cryobiology. - Institute for problems of cryobiology and cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2010.

The Dissertation is aimed to investigation of modifications of structure-morphological and biochemical characteristics of tissues of Carassius auratus under the influence of seasonal acclimation and changes of temperature conditions, and also on the search of regulatory compounds that control transition of the organism to a new physiology-metabolic mode.

Studying C. auratus muscle ultrastructure at various temperatures of acclimation allowed establishing that for both types of muscle fibers increase in volume of endoplasmic reticulum, increase in mitochondrium quantity with formation of numerous intermitochondrial contacts are observed in winter time.

It was revealed that the protein composition of tissues can be influenced on by the season, as well as by the temperature of keeping.

Abrupt switch of the temperature in summer period leads to the death of fish within 3-5 days.Injection of low-molecular 5kDa fraction, received from the brain of `winter' C. auratus, allows supporting of fish viability.

Low molecular 5kDa fraction administration leads to lowering in ATP level, changing in LDH activity, and piruvate and lactate content towards the normalization of these parameters.

The results obtained testify that mechanisms of seasonal adaptation of C. auratus include rearrangement of structural organization of cells and metabolism. Low-molecular compounds, which were found in the brain tissue of cold-adapted fish, possess ability to regulate `activation' of mechanisms of temperature adaptation.

Key words: goldfish, temperature acclimation, muscle ultrastructure, protein composition of tissues, low molecular fraction.

Відповідальний за випуск Г. О. Бабійчук.

Размещено на Allbest.ru

...