Вacіllus thurіngіensіs у мікробіологічному контролі чисельності комах

Размещено на http://www.allbest.ru/

УМАнСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 579.64:632.937

03.00.07 мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

ВACІLLUS THURІNGІENSІS У МІКРОБІОЛОГІЧНОМУ КОНТРОЛІ ЧИСЕЛЬНОСТІ КОМАХ

Патика Тетяна Іванівна

Умань 2010

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН.

Науковий консультант ? доктор біологічних наук, професор КАНДИБІН Микола Васильович, Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний Інститут сільськогосподарської мікробіології РАСГН, головний науковий співробітник лабораторії зоологічної мікробіології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Іваниця Володимир Олексійович, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, проректор з наукової роботи, завідувач кафедри мікробіології і вірусології;

доктор сільськогосподарських наук Малиновська Ірина Михайлівна, Національний науковий центр «Інститут землеробства УААН», головний науковий співробітник лабораторії ґрунтової мікробіології;

доктор біологічних наук, професор Бровдій Василь Михайлович, Національний педагогічний університет ім. М.П. Драгоманова, завідувач кафедри зоології.

Захист відбудеться "05" лютого 2010 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 74.844.02 в Уманському державному аграрному університеті за адресою: 20305, м. Умань, вул. Інститутська, 1, навчальний корпус № 4, аудиторія 178.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Уманського державного аграрного університету за адресою: 20305, м. Умань, вул. Інститутська, 1.

Автореферат розіслано "28" грудня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В.П. Карпенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біологізація сільськогосподарського виробництва є досить складним, наукоємним завданням, розв'язання якого пов'язано з впровадженням сучасних систем управління агроландшафтом, у тому числі фітосанітарною ситуацією, при поєднанні з екологічно безпечним використанням засобів захисту рослин від шкідливих організмів (фітофагів, сегетальної фітобіоти, збудників хвороб). Світові тенденції становлення та розвитку стійких агроекосистем свідчать, що запобігти негативним втручанням у функціонування агробіоценозів, обмежити застосування хімічних пестицидів, зберегти біологічну різноманітність, що еволюційно склалася, в природі можливо за умови здійснення фундаментальних комплексних і прикладних біоценотичних досліджень, які спрямовані на реалізацію природного потенціалу екосистем, ефективного використання їх біологічних можливостей.

Саме тому вчені вважають за необхідне будувати орієнтацію на екологічно доцільне господарювання, яке формується останнім часом у деяких країнах. У цьому аспекті мікробіологічний метод захисту рослин від комах-шкідників з використанням природних ентомопатогенів (зокрема, Bacillus thuringiensis (Bt) як ентомоцидних агентів) є екологічно і соціально безпечною ланкою з точки зору збалансованості і стабільності функціонування агроекосистем.

Загальновизнано, що одним із найбільш перспективних і широко використовуваних на сьогодні біопестицидів для контролю чисельності і шкідливості фітофагів є мікробні препарати на основі ентомопатогенних бактерій Bt. Різноманітність цієї групи бактерій із кожним роком поповнюється новими серотипами, що відрізняються багатобічною дією на комах: антифідантною, метатоксичною, фізіологічною, тератогенною, дерепродукційною, що обумовлює високу біологічну, економічну, соціальну ефективність біопрепаратів на їх основі.

На сьогодні описано понад 70 різновидів Bt, ефективних проти широкого спектру фітофагів із рядів Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Coleoptera, одночасно не токсичних для корисної ентомофауни, риб, теплокровних тварин і людини. Свідома інтродукція в агробіоценози мікроорганізмів з інсектицидними, ларвіцидними, фунгіцидними та іншими властивостями диктується глобальною проблемою, що виникла в результаті техногенно-інтенсивної системи землеробства, з широким застосуванням синтетичних інсектицидів, що супроводжується негативними наслідками: порушенням природних біоценозів, завдання збитків нецільовим об'єктам флори та фауни, здоров'ю людини, підвищенням ентоморезистентності до інсектицидів (пестицидний синдром), створенням потенційної загрози віддалених шкідливих наслідків.

Ефективне використання різноманітності природних популяцій ентомопатогенів Bt можливе на основі спеціальних комплексних науководослідних робіт, що спрямовані на глибоке вивчення різновидів і штамів ентомопатогенних бактерій, розробку сучасних принципів і підходів відносно оптимізації параметрів інтегрованого захисту рослин відповідно до економічних, екологічних, санітарно-гігієнічних потреб. Актуальність відзначених проблем, бажання поповнити їх новими відомостями з метою теоретичного обґрунтування і практичного використання зумовили вибір теми дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили в рамках НТП УААН (20012005 рр.) «Наукові основи сталих агроекосистем», підпрограми «Сільськогосподарська мікробіологія», проблеми «Теоретично обґрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологічно безпечного використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращення якості життя людини», за завданням «Розробити комплексні мікробні препарати для поліпшення азотного живлення рослин, захисту від шкідливих організмів та технології виробництва і застосування новостворених препаратів у сучасних агроекосистемах» (№ державної реєстрації 0101U003752).

НТП УААН (20062010 рр.) «Сільськогосподарська мікробіологія», «Провести скринінг та одержати нові високоефективні штами азотфіксувальних, фосфатмобілізувальних, ентомопатогенних, пробіотичних та мікроорганізмів-антагоністів збудників хвороб та розробити технології виготовлення нових мікробних препаратів для поліпшення живлення рослин та захисту від шкідливих організмів» (№ державної реєстрації 0108U001686).

НТП РАСГН (20062010 рр.) «Фундаментальні та пріоритетні прикладні дослідження щодо наукового забезпечення розвитку АПК РФ», завдання «Удосконалити існуючі та розробити нові біотехнології використання мікробного потенціалу агроценозів для виробництва конкурентоздатної сільськогосподарської продукції» (№ державної реєстрації 15070.7820003499.06.8.003.2).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було оцінити біологічний потенціал ентомопатогенних бактерій Bacillus thuringiensis (Bt) стосовно до шкідливих комах агробіоценозів і вивчити особливості інфекційного патологічного процесу, що виникає в популяціях шкідників під впливом окремих різновидів ентомопатогенів (BtH1 - Bac. thuringiensis var. thuringiensis, BtH10 Bac. thuringiensis var. darmstadiensis, BtH14 Bac. thuringiensis var. israelensis) для формування і вдосконалення науково?методичних, практичних принципів біотехнологічного виробництва препаративних форм на основі штамів Bt та ефективного їх використання у практиці рослинництва.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити ряд завдань: ентомопатогенний thuringiensis інфекційний агробіоценоз

вивчити фізіолого-біохімічні особливості штамів BtH1, BtH10 і BtH14, що обумовлюють ступінь ентомопатогенності;

здійснити селекцію перспективних штамів?продуцентів Bt з аналізом біологічних і господарсько-цінних властивостей;

оцінити ентомоцидну, ентомотоксичну дію нових штамів BtН1 і BtН10 на комах-шкідників агробіоценозів і ларвіцидність штамів BtН14 для кровосисних комарів;

провести аналіз інфекційно-патологічних взаємовідношень ентомопатогена Bt і комахи-хазяїна;

розробити науково-методичні підходи біотехнологічного одержання препаративних форм на основі високоактивних штамів Bt, що забезпечують максимальну продукцію ентомопатогенних компонентів;

розробити ефективні, екологічно безпечні технології застосування біопрепаратів на основі нових штамів Bt як засобів мікробіологічного контролю динаміки чисельності комах-шкідників;

оцінити екологічну пріоритетність використання біопрепаратів на основі Bt у сучасних агроекосистемах.

Об'єкт дослідження - селекційні, технологічні дослідження нових штамів BtН1, BtН10 і BtН14 та їх ентомопатологічні взаємовідношення, що виникають в популяціях комах-шкідників; розробка принципів технології виробництва і застосування екологічно безпечних препаратів на основі Bt.

Предмет дослідження - штами ентомопатогенних бактерій Bt, виділені з природних популяцій хворих і загиблих комах різних еколого-географічних регіонів; біотести комахи рядів Diptera, Coleoptera: Musca domestica L., Aedes aegypti, Leptinotarsa decemlineata Say.; біотехнологічні розробки препаративних форм на основі високоактивних і технологічних штамів-продуцентів.

Методи дослідження:

лабораторні - визначення культурально-морфологічних, фізіолого-біохімічних, молекулярно-генетичних особливостей високоефективних штамів групи Bt, що обумовлюють ступінь ентомопатогенності, селекційних і токсигенних критеріїв їх активності, ентомоцидної, ларвіцидної активності біоагентів мікробних препаратів методами мікробіології, ентомології, патології членистоногих, молекулярної біології, гістології, екології та токсикології;

польові - вивчення ефективності застосування мікробних препаратів, їхнього впливу на чисельність фітофагів і кількісні та якісні показники продуктивності сільськогосподарських культур;

математичні методи статистичної обробки експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше дана комплексна характеристика корисних біологічних особливостей нових штамів Bt різних серотипів (Н1, Н10 і Н14) у рамках виробництва і застосування екологічно безпечних препаратів для мікробіологічного контролю чисельності комах-шкідників. Визначено критерії чутливості комах до Bt і особливості протікання інфекційного і патогенного процесів, що викликаються цими бактеріями (результативність дії, післядії біоагентів). Показано, що селекційні штами Bt є активними продуцентами ентомотоксинів із високим рівнем екзотоксиногенності та ентомоцидної активності штамів BtН1 і BtН10 щодо контактних генерацій Leptinotarsa decemlineata Say. і Musca domestіca L. і ларвіцидною активністю штамів BtН14 відносно Aedes aegypti. Встановлено, що розвиток інфекційних процесів та їх інтенсивність перебувають у прямій залежності від вірулентності і контагіозності мікроба-патогена, а також від видових та індивідуальних особливостей макроорганізму.

Уперше проведено філогенетичний аналіз сероваріантів Bt. При порівнянні нуклеотидних послідовностей за 16S рРНК встановлено існування штамового поліморфізму в середині групи ентомопатогенів ВtН1, ВtН10, ВtН14, який пов'язаний з їх ентомоцидною активністю.

Створено новий методичний напрям та запропоновано методи оцінки формування можливої популяційної ентоморезистентності до Bt та препаратів, створених на їх основі.

Розроблено науково-методичні підходи біотехнологічного одержання мікробних препаратів на основі перспективних штамів Bt з виробничо-цінними властивостями і з врахуванням особливостей мікробів-продуцентів, а також цільових призначень.

Практичне значення отриманих результатів. Основні результати досліджень, висновки, пропозиції та рекомендації можуть бути використані для вирішення питань забезпечення раціонального застосування фітозахисних біопрепаратів, збереження функції природних регуляторних механізмів як вагомого фактора підтримки гомеостазу і стійкого розвитку агроекосистем, підвищення їх екологічної безпеки, ефективності та одержання продукції високої якості.

Отримані результати комплексних досліджень загальних та специфічних біологічних особливостей штамів трьох серологічних варіантів ВtН1, ВtН10, ВtН14 розширюють знання в галузі удосконалення технологій виробництва і застосування бактерій Bt, що проявляють інфекційні та патогенні властивості відносно популяцій комах-шкідників.

Розроблені науково-методичні підходи підбору перспективних і високоактивних штамів?продуцентів біопрепаратів Бітоксибациліну, Бацилотурінгу, Бациколу і Бактокуліциду при біотестуванні на інсектарних інтактних і контактних популяціях комах дозволяють у лабораторних і природних умовах проводити оцінку ентомоцидної, ларвіцидної активності штамів, ступінь формування популяційної ентоморезистентності, що дозволяє удосконалювати та підвищувати результативність селекційних процедур і методів біологічної оцінки за токсигенністю, вірулентністю. У ланках популяцій з використанням вдосконалених методів у різних екологічних умовах ефективно здійснена поетапна оцінка багатобічної дії штамів Bt на комахах-шкідниках (антифідантної, метатоксичної). Науково-практичні розробки рекомендуються і можуть бути використані для розвитку великомасштабних і регіональних систем виробництва біопрепаратів на основі Bt, для застосування їх з різними механізмами дії в агробіоценозах, як екологічно пріоритетних засобів контролю чисельності популяцій комах-шкідників.

Особистий внесок здобувача. Розробка, обґрунтування і обговорення з консультантом та іншими провідними співробітниками інституту питань концепції визначення напрямів досліджень. Розробка робочих гіпотез, модифікація тих, що існують, і створення власних нових методів досліджень за окремими розділами роботи, планування і виконання досліджень, узагальнення отриманих результатів. Паралельно виконана робота з підготовки для видання друкарських робіт, у тому числі двох монографій («Экология Bacillus thuringiensis», 2007; «Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis», 2009).

Апробація результатів роботи. Результати досліджень, основні положення та висновки дисертації доповідалися, публікувалися та обговорювалися на засіданнях Вченої ради Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, Вченої ради і методичної комісії ДНУ Всеросійського науково?дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології РАСГН, засіданнях лабораторії мікробіометоду (ІСГМ), лабораторії мікробіології і патології комах і гризунів (ВНДІСГМ) у 20022009 рр., а також наукових конференціях, симпозіумах, з'їздах, нарадах: на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених і фахівців з проблем виробництва зерна в Україні (Дніпропетровськ, 2002); Всеукраїнських науковопрактичних конференціях «Засади сталого розвитку аграрної галузі» (Київ, 2002), «Проблеми сучасного землекористування» (Чабани, 2002); Міжнародній ювілейній науковопрактичній конференції, присвяченій 75річчю Інституту картоплярства Національної академії наук Білорусі (Мінськ , Самохваловічи, 2003); Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); «Наукова спадщина академіка М.М. Гришка» (Глухів, 2005); «Агроекологічні проблеми сьогодення та шляхи їх вирішення» (Полтава, 2005); «Nature 2000: Architecture of Landscape and Planning of Space as basic factor for protection of native animal species - moulding the stage of succession in forest areas» (Польща, Тучно, 2005); Міжнародній науковопрактичній конференції «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом грунтах» (Краснодар, 2006); «Екологія: наука, освіта, природоохоронна діяльність» (Умань, 2007); International scientific conference «S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology» (Yalta, 2007); Postgraduate Course «Applied and fundamental aspects of responses process in the root-microbe systems» and Meeting of the plant-microbe interactions” (St.Petersburg, Russia, 2007); «Формування конкурентоздатності пiдприємств АПК» (Полтава, 2008); Всеросійській науковопрактичній конференції «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Кіров, 2008); Науковопрактичній конференції «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, АР Крым, 2009); ХІІ з'їзді Товариства мікробіологів України (Ужгород, 2009); ІІ Всеукраїнському з'їзді екологів з міжнародною участю «Екологія 2009» (Вінниця, 2009); VI науковій конференції молодих вчених «Мікробіологія в сучасному сільськогосподарському виробництві» (Чернігів, 2009).

Публікації. Основні положення дисертації висвітлені у 45 друкованних виданнях, з них 2 монографії, 20 статей у спеціалізованих виданнях, 2 патенти України, 18 тез, 3 науково-методичні роботи.

Структура та обсяг дисертації. Загальний обсяг роботи становить 352 сторінок машинописного тексту, серед них 280 - основного тексту. Дисертація складається зі вступу, 7 розділів, висновків, рекомендацій виробництву, додатків. Вона ілюстрована 91 таблицями, 19 рисунками, 9 фотографіями, додатками. У списку літератури 343 найменувань, у тому числі 82 іноземними мовами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, які містять аналіз експериментальних і теоретичних досліджень вітчизняних та зарубіжних авторів щодо проблеми мікробіологічного методу захисту рослин від комах-шкідників, починаючи від історії зародження цього методу та закінчуючи сучасним його станом. Особливу увагу приділено відомостям про ентомопатогенні мікроорганізми групи Bacillus thuringiensis - як основних сучасних ентомопатогенних продуцентів різних біопрепаратів та домінантних агентів мікробіоконтролю чисельності комах. На основі аналізу літературних джерел показано актуальність даної проблеми та доцільність додаткових досліджень у цьому напрямі.

Об'єкти, методи й умови проведення досліджень. Дослідження проводилися в Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН, лабораторії мікробіометоду (20022005 рр.), а також у ДНУ Всеросійському науково-дослідному Інституті сільськогосподарської мікробіології РАСГН спільно зі співробітниками лабораторії мікробіології і патології комах і гризунів (2006 - 2009 рр.).

У роботі використано штами ентомопатогенних бактерій Bacillus thuringiensis різних серологічних варіантів (BtH1 - Bac. thuringiensis var. thuringiensis, BtH10 Bac. thuringiensis var. darmstadiensis, BtH14 Bac. thuringiensis var. israelensis) з колекції мікроорганізмів ВНДІСГМ РАСГН: референтні екзотоксиногенні штами BtH1 800, BtH1 98, BtH10 109, ларвіцидний штам BtH14 7-1/23, штами ентомопатогенних бактерій з колекції ІСГМ УААН: BtH1 -187, BtH1 -218, BtH1 -240, BtH1 -302, BtH1 -315, BtH1 -348, BtH1 -330, BtH1 -349, а також відселектовані, нові штами Bt, що виділяли з природних популяцій хворих і загиблих комах різних еколого-географічних регіонів Україні, Росії (BtH1 -14, BtH1 -20, BtH10 -18, BtH10 -23, BtH14 -87/19, BtH14 -87/12, BtH14 -87/3, BtH14 -33).

Як модельні біотести використовували природні та інсектарні популяції комах (інтактних і контактних генерацій) з різним ступенем чутливості до бактеріального зараження, зокрема личинок кімнатної мухи (Musca domestica L.) для штамів BtH1 і BtH10 як спеціалізований тест на екзотоксиногенність (визначення термостабільного векзотоксину); личинок молодшого віку колорадського жука (Leptinotarsa decemlineata Say.) для штамів BtH1 і BtH10, як тест на ентомоцидну активність; личинок комарів роду Aedes aegypti різного віку для штамів BtH14 як тест-об'єкт за міжнародним стандартом Інституту Пастера для визначення ларвіцидної активності; личинок Culex pipiens molestus та Anopheles maculipennis.

У дослідах використовували біопрепарати інсектицидної, ларвіцидної дії у вигляді різних форм, які створені на основі активних, технологічних штамів трьох серологічних варіантів Bt (1-го, 10-го і 14-го серотипів): Бітоксибацилін (БТБ) - сухий порошок, рідку форму, пасту; Бацилотурінг рідку форму; Бацикол - рідку форму; Бактокуліцид - сухий порошок і рідку форму.

Виділення ентомопатогенних штамів Bt проводили методом скринінгу за ознакою інсектицидності згідно з методиками, які опубліковані у роботах А. А. Євлахової (1965), О. І. Швецової, А. Я. Лескової (1984), М. В. Кандибіна (1989).

Морфологічний фенотип колоній чистих культур Bt та їх продуктивність визначали загальноприйнятими у мікробіології методами із використанням прийомів, описаних в оригінальних роботах ряду авторів (Ф. Герхард, 1984; Методы почвенной микробиологии, 1986; «Методы почвенной микробиологии и биохимии» за ред. Д. Г. Звягінцева, 1991).

Технологічні параметри розвитку культур ентомопатогенних бактерій Bt визначали за І. Л. Работновою (1989), Г. А. Нікітіним (1992).

Вплив складу та співвідношень азотних і вуглецевих компонентів поживних середовищ на штами-продуценти біопрепаратів, оптимальні режими культивування визначали за методами, які описані в оригінальних роботах І. Ванкової (1962), Н. П. Ісакової, Е. Р. Зурабової, Н. М. Барбашової (1972).

Культуральні, фізіолого-біохімічні особливості виділених штамів Bt визначали методами, які використовуються як диференціальна діагностика за схемою H. de Barjac, 1968; 1990; O. Lysenko, 1985, у порівнянні з референтними штамами. Штами ідентифікували також за визначником (Берджі, 1997), і за допомогою аналізу первинної послідовності фрагменту 16S рРНК (T. Маніатіс, 1984; T. L. Madden, 1996; D. Moreira, 1998; K. Brajesh, 2006).

Екстракцію ДНК ентомопатогенних бактерій Bt здійснювали за методом J.J. Doyle (1987). Після електрофоретичного розділення в 1%-му агарозному гелі проводили візуальну детекцію отриманих зразків ДНК за D. Moreira (1998).

Полімеразно?ланцюгову реакцію (ПЛР) за 16S рРНК проводили за стандартними протоколами в ампліфікаторі BioRad My Cycler з використанням олігонуклеотидів SSU-642-F HAATHYGTGCCAGCAGC, SSU-1445-R GTCRTCCYDCCTTCCTC. Продукти ампліфікації після екстракції з 1%-го агарозного гелю використовували для клонування у вектор pAL-TA (T. Маніатіс, 1984; K. Joung, 2001). У автоматичному секвенаторі CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter) аналізували отримані нуклеотидні послідовності, які відповідали певним таксономічним одиницям Bt. Для виявлення найбільш якісних фрагментів і достовірності подальшого аналізу, проводили зіставлення нуклеотидних послідовностей гену 16S рРНК з даними GenBank. Побудову дендрограми, оцінку схожості серологічних варіантів здійснювали за отриманими нуклеотидними послідовностями та за допомогою комп'ютерної програми Vector NTI Advance 8,0.

Виявлення ступеню патогенності Bt з урахуванням вибіркової дії, кількісне визначення показників летальних концентрацій (ЛК50), рівень біосинтезу в-екзотоксину, д-ендотоксину визначали методами, які прийняті в мікробіології і патології членистоногих, у відповідності до методичних рекомендацій (Я. Вейзер, 1972; М. О. Біргер, 1982; А. Я. Лескова, 1984; Методические рекомендации по изучению микроорганизмов-регуляторов численности опасных насекомых и клещей, 1984; М. В. Яловіцин, 1985; М. В. Кандибін, 1989).

Інфікування тест-комах суспензіями штамів Bt проводили методом per os в різних концентраціях, включаючи сублетальні. Овіцидну, антифідантну, ларвіцидну, метатоксичні дії штамів Bt та їх ентомотоксинів на предімагинальні фази у тому числі сублетальні дози визначали за методиками М.В. Кандибіна (1973; 1989; 2008), О. Стусь (1972; 1987), А.Я. Лескової (1972; 1984). Сумарну оцінку патогенної дії препаративних форм на популяції фітофагів оцінювали за первинним летальним ефектом і післядією.

Схема дослідів за оцінкою ентомоцидної активності штамів BH1, BtH10 і ларвіцидності BH14:

Біотест Leptinotarsa decemlineata Say., L1-2	Розведення 1:2 (0,05 мл/1 г корму); 1:4 (0,025 мл/1 г корму); 1:8 (0,0125 мл/1 г корму). Облік: на 3, 5, 10, 15 добу
Musca domestica L., L2	Екзотоксиноутворення BH1 і BtH10
	Розведення 1:4 (0,025 мл/1 г корму); 1:8 (0,0125 мл/1 г корму); 1:16 (0,00625 мл/1 г корму); 1:32 (0,00312 мл/1 г корму). Облік: на 5 добу (кількість пупаріїв), на 9 добу (кількість мух, що вилетіли)
Aedes aegypti, L4	Ларвіцидна активність BtH14
	Доза патогена 0,25 мг/л; 0,125 мг/л; 0,06 мг/л Облік: на 13 добу

Гістологічний аналіз взаємодії «патогенхазяїн» на контактних та інтактних тест-об'єктах проводився згідно з методами, що наведені у роботах Б. Ромейса (1954), Є.Н. Павловського (1959) та А.І. Конського (1976).

Первинна токсикологічна оцінка біопрепаратів на основі Bt для теплокровних здійснювалася загальноприйнятими методами на мишах лабораторної лінії Ленінградська біла при пероральному і парентеральному введенні різних препаративних форм (І.В. Саноцький та ін., 1975; Л.В. Григор'єва, 1981; Т.Г. Омельянець та ін., 2004).

Планування польових досліджень, їх проведення виконували відповідно до методик польового досліду за Б.А. Доспєховим (1985). Ці досліди проводили в зоні Полісся України на експериментальних ділянках картоплі сорту «Луговська» ІСГМ УААН загальною площею 450 м2, площа облікової ділянки 10 м2, повторність 4- разова. Спосіб посадки гребеневий з міжряддям 70 см, між рослинами в ряду - 35 см, глибина посадки бульб - 8-10 см. Агротехніка вирощування загальноприйнята для зони Полісся.

У схему дослідів із вивчення впливу мікробних препаратів на основі Bt на чисельність колорадського жука були включені для порівняння варіанти з обробкою рослин картоплі хімічним інсектицидом (Банкол), біологічними - Бітоксибацилін (БТБ), Росія, Бацилотурінг, Україна. У дослідних варіантах вивчали антифіданту та ентомопатогенну дію препаратів, а також проводили облік урожаю картоплі, його товарності. Висновки щодо захисної дії препаратів робили на підставі таких показників як біологічна ефективність, яку розраховували за зниженням чисельності личинок фітофагу на 3, 6 добу після обробок, ступінь пошкодження рослин і урожай картоплі.

В умовах Північно-Західного регіону Російської Федерації (Ленінградська область) польові досліди проводили на полях господарств із загальною площею ділянок від 0,5 до 3 га, а також на дослідних полях ВНДІСГМ РАСГН з площею облікових ділянок 10 м2, повторність 4-разова, сорти картоплі - «Чародій», «Невська». Бульби картоплі висаджували на відстані 3035 см в ряду та 60 см між рядами. Агротехніка вирощування картоплі типова для даної зони.

Ефективність зразків біопрепаратів (БТБ, Бацилотурінг, Бацикол) оцінювали за обліками чисельності всіх фаз шкідника до обробки, через 3, 7 діб після першої обробки та через 10 діб після другої обробки.

Бактокуліцид випробовували проти кровосисних комарів і мошок у водоймищах різного типу (тимчасові невеликі воронки, підвальні дрібні затоплення, постійні зарослі ставки, озера), при різних температурних режимах.

Отримані дані статистично обробляли на персональному комп'ютері з використанням програм EXEL, Statistica 6, Vector NTI Advance 8,0; за допомогою методів математичної статистики, описаних П.Ф. Рокицьким (1973), М.А. Плохинським (1980), Т. Літтл (1981), Б.А. Доспєховим (1985), О.М. Царенко та ін. (2000).

Селекційні дослідження Вacillus thuringiensis. Методом скринінгу відселектовано штами Bt з високими показниками ентомоцидності та технологічності. Одержано штами: BtH1 -14, BtH1 -20, BtH10 -18, BtH10 -23, BtH14 -87/19, BtH14 -87/12, BtH14 -87/3, BtH14 -33 (ВНДІСГМ), а також BtH1 -187, BtH1 -218, BtH1 -240, BtH1 -302, BtH1 -315, BtH1 -348, BtH1 -330, BtH1 -349 (ІСГМ), які за культурально-морфологічними, фізіологобіохімічними властивостями ідентифіковані як Bac. thuringiensis var. thuringiensis (BtH1), Bac. thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10), Bac. thuringiensis var. israelensis (BtH14).

З використанням комплекту автоматизованого обладнання проведена ПЛРампліфікація 16S рРНК генів Bt з подальшим рестрикційним аналізом отриманих ампліконів. Прослідковується загальна картина належності штамів, що вивчалися, до групи бактерій Bt. Опис різновидів не завжди є виправданим із точки зору філогенетичної систематики, основаної на фенотипових ознаках. На базі клонованих генів 16S рРНК ентомопатогенних бактерій BtН1, BtН10 і BtН14 здійснено порівняльний філогенетичний аналіз внутрішньовидових взаємозв'язків Bt (рис. 1).

Прослідковано філогенетично однорідні лінії (рівень схожості 16S рРНК штамів 1-го і 10-го серотипів становить від 90,0 до 94,0%; чіткого генетичного відокремлення штамів 10-го і 14-го серотипів не визначено).

Таким чином, при порівнянні нуклеотидних послідовностей за 16S рРНК встановлено існування штамового поліморфізму всередині групи ентомопатогенів BtН1, BtН10 і BtН14, пов'язаного з їхньою ентомоцидною активністю.

Селекцію штамів Bt здійснювали за ознаками і властивостями продуктивності, кількісного утворення кристалів ендотоксину (рис. 2).

Оцінка екзотоксиногенності штамів BtH1 на інсектарній популяції Musca domestica L. (табл. 1) показала переважну загибель личинок (від 86,0 до 100%) при інфікуванні їх BtH1 в розведеннях культуральної рідини 1:4 (25 мкл/г корму) і 1:8 (12,5 мкл/г корму). За продуктивністю і рівнем екзотоксиногенності для личинок кімнатної мухи нові штами не поступаються показникам референтного штаму BtH1 800.

Таким чином, в ході послідовних генерацій були відібрані перспективні штами BtН114, BtН120, що поєднують практично цінні властивості: висока вихідна технологічність стабільний титр спор 3,0 млрд/мл культуральної рідини; екзотоксиногенність за показниками ЛК50 для личинок другого віку Musca domestica L. до 3,0 мкл/г корму.

Для селектованих штамів BtН1018, BtН1023 рівень екзотоксиногенності становив 2,953,34 мкл/г корму. Ентомоцидність штамів BtН1 і BtН10 для личинок молодшого віку Leptinotarsa decemlineata Say. у межах 0,19% культуральної рідини.

Таблиця 1 - Оцінка рівня екзотоксиногенності BtH1 на личинках Musca domestica L.

Штам	Титр спор, млрд./мл культуральної рідини	% загибелі личинок при інфікуванні у концентрації екзотоксину, мкл/г корму:	ЛК50, мкл/г корму
		25	12,5	6,25	3,12
BtH1 14	3,09	100+0,0	100+0,0	85,0+1,6	75,0+1,3	3,0
BtH1 -20	3,27	100+0,0	100+0,0	81,9+1,5	72,9+1,0	3,0
BtH1 800	2,62	100+0,0	86,3+1,6	80,4+1,3	77,9+1,3	3,4

Виявлено оптимальні за продуктивністю і ларвіцидною активністю штами BtH14 -87/19, BtH14 -33 з титром спор 2,74,0 млрд./мл культуральної рідини. ЛК50 для личинок четвертого віку Aedes aegypti не перевищувала показників норм, але і була вищою, тобто з меншим значенням до 1,0 мкл/л води відповідно, що свідчить про високу активність і функціональність штамів цього серотипу.

Показано, що визначення кількісного складу екзотоксину можна здійснювати більш спрощеним методом біологічного тестування, а саме контактним (табл. 2). При різних дозах інфікування ЛК50 пероральним методом становила 2,84 і 2,74 мкл/г корму для BtH1 і BtH10 відповідно. Використовуючи контактний метод, показники ЛК50 у досліді становлять 28,030,0%.

Таблиця 2 - Визначення екзотоксиногенності BtH1 і BtH10 контактним методом і per os (біотест личинки ІІ віку Musca domestica L.)

Варіант досліду	% загибелі личинок при дозі зараження корму:	ЛК50, мкл/г корму	ЛК50, %
Метод per os (мкл/г корму)
BtH1	25	12,5	6,25	3,12	2,84	-
	100+0,0	100+0,0	90+1,0	74+0,7
BtH10	100+0,0	100+0,0	94+0,7	76+1,0	2,74
Контактний метод (занурювання личинок у суспензію на 1 хв.), %
BtH1	32,0+0,3	20,0+0,3	14,0+0,7	0	-	29,8
BtH10	40,0+0,7	22,0+0,3	18,0+0,3	0		28,4

Зберігання, пересіви та інші технологічні операції відіграють роль потужних стресів, які спонукають культури до модифікації, причому не обов'язково у вигідному для практики напрямі - селекційний підтримуючий відбір тут необхідний і можливий. В результаті узагальнення характеристик селектованих і оптимальних за біологічною активністю штамів BtН1 і BtН14 отримано показники господарсько цінних властивостей ентомопатогенів до початкового рівня (табл. 3).



Таблиця 3 - Характеристика селектованих штамів BtН1 і BtН14

Штам	Титр спор, млрд./мл культуральної рідини	Показники за тест-об'єктами
	після зберігання два роки	після селекції	після зберігання два роки	після селекції
BtН1 800	2,31	3,42	Личинки Musca domestica L., ЛК50, мкл/г корму
			5,8	3,0
BtН1 -20	2,38	3,34	4,45	2,95
BtН14 -33	2,65	4,4	Личинки Aedes aegypti, ЛК50, мкл/л води
			1,95	1,0
BtН14 87/19	2,53	4,18	2,75	1,3
BtН14 7-1/23	3,05	4,05	1,95	0,85

Встановлено, що при тривалому зберіганні культур BtН1, BtН10, BtН14 утворюються такі морфотипи колоній:

16% із загального числа утворюють 98100% спор і кристалів у співвідношенні 1:1;

38% утворюють таку ж кількість спор, але при співвідношенні спор і кристалів 1,5:1 або 2:1;

34% 20% проспор, 30% спор і кристалів, 50% вегетативних клітин;

12% акристалогенні варіанти.

Зрозуміло, що найбільш цінний перший морфотип, оскільки він відповідає всім вимогам виробничо-цінного штаму. Останні морфотипи виключаються з роботи.

Визначення чутливості личинок комарів Aedes, Culex і Anopheles до BtH14, який не продукує екзотоксин, показало, що найчутливішими до біоагенту виявилися личинки комарів роду Aedes, Culex (табл. 4).

Таблиця 4 - Активність BtH14 для личинок комарів різного виду і віку

Вид комарів	ЛК50, мкл/л води
	L1	L2	L3	L4
Aedes aegypti (інсектарна популяція)	0,59	0,75	0,90	1,35
Culex pipiens molestus (природна популяція)	0,51	0,76	0,87	1,28
Aedes communis (природна популяція)	0,71	0,98	1,19	1,68
Anopheles maculipennis (природна популяція)	0,88	1,21	1,44	1,85

Отже, діючий початок біопрепаратів на основі Bt визначається наявністю ентомотоксичних компонентів - спор, кристалічного д-ендотоксину, термостабільного в-екзотоксину, що зумовлює призначення препаратів із урахуванням чутливості різних видів комах.

Таким чином, дослідження культурально-морфологічних, фізіолого-біохімічних, молекулярно-генетичних, токсигенних особливостей виділених штамів ентомопатогенів дозволили зробити висновок про їх ідентифікаційну належність до групи Bacillus thuringiensis. Вивчення токсигенного потенціалу штамів Bt показує високу ентомоцидність відносно ряду видів комах (Leptinotarsa decemlineata Say., Musca domestіca L., Aedes aegypti).

Вплив Вacіllus thurіngіensіs на комах-шкідників агробіоценозів. Вивчення особливостей інфекційного патологічного процесу, що виникає в популяціях комах-шкідників при інтродукції BH1 і BtH10, показало структурну дезорганізацію кишкового епітелію інфікованих личинок, особливо молодшого віку контактної популяції колорадського жука. Встановлено збільшення клітинного об'єму, що вказує на гістопатологічні ефекти ентомотоксинів в середньому відділі кишечника (рис. 3).

Неінфіковані відділи середньої кишки (контрольні варіанти) являють собою шари епітеліальних клітин, що добре збереглися. У передніх і задніх частинах травного каналу інфікованої комахи гістологічні зміни спостерігаються рідко, що залежить від хітинового шару, що вистилає ці відділи кишечника. Розвиток та інтенсивність токсико-септицемичних процесів мають непостійний характер і залежать як від тест-комахи (видова, вікова специфічність), так і від конкретного штаму бактерій Bt.

Антифідантний ефект препаратів Bt носить контактний характер і здійснюється спочатку через смакові рецептори. Після надходження частини препарату в організм трофічні функції порушуються за рахунок пригнічення діяльності центральної нервової системи, розладів трофічних ритмів, пригнічення секреції травних ферментів. Оцінка антифідантної дії штамів BtН1 і їх складової частини в-екзотоксину на личинок колорадського жука в польових умовах показала (табл. 5), що личинки споживають незначну частину листкової поверхні рослин, помітно відстаючи в рості та розвитку. При цьому їх маса в 2-3 рази менше контрольних.

Таблиця 5 - Вплив препаратів Bt на личинок Leptinotarsa decemlineata Say. (ІСГМ УААН), 20022005 рр.

Варіант досліду	Ступінь пошкодження листкової поверхні, %, бал	Маса личинок відносно контролю, %	Кількість пошкоджених рослин, %	Загибель личинок, % через 6 діб
Контроль (без хімічних і мікробних препаратів)	73,0 (4 бала)	100	42,3	-
Банкол	14,5 (2 бала)	86,0	6,5	98,5
БТБ	19,5 (2 бала)	88,0	20,2	80,0
Бацилотурінг	10,0 (1 бал)	79,0	12,8	87,0

В польових умовах показана ентомоцидність нових штамів BtН1 187, 218, 240, яка становить від 86,0 до 94,0%, що свідчить про перспективність в плані технологій їх ефективного застосування в агроценозі картопляного поля.

Слід підкреслити, що контроль чисельності комах за допомогою Bt не обмежується антифідантним і летальним ефектами. У подальшому на частину популяції, що залишилася, Bt діє метатоксично.

Спеціальні експерименти показали, що метатоксична дія Bt спостерігається у комах предімагинальних фаз при інфікуванні їх сублетальними дозами цих бактерій. У частини такої популяції у процесі розвитку та метаморфозу спостерігається явний тератогенез (потворність), виражений в утворенні проміжних форм між личинками і лялечками (едалтоїди), потворних лялечок або імаго, що свідчить про ненормальну зміну і дію гормону линяння екдизону; а також у відсутності в імаго окремих органів (кінцівок, крил); у порушенні процесу і подовженні термінів линяння або метаморфозу (табл. 6). Метатоксичний ефект забезпечує вищу ефективність препаратів на основі Bt у польових умовах (табл. 7). Загибель лялечок до 52,0% від загальної кількості, зниження плодючості від 45,0 до 96,0% порівняно з контролем.

Морфологічні порушення в личинок колорадського жука ІІІIV віку під впливом Bt бувають різноманітні, аж до зникнення щелеп. Відмічено зниження життєздатності дочірніх поколінь, що вижили, після отриманих сублетальних доз ентомопатогена, виявлено дерепродукційний ефект, що свідчить про участь спорокристалічного комплексу і ентомотоксичних метаболітів у всіх цих процесах.

Таблиця 6 - Загибель інфікованих личинок Leptinotarsa decemlineata Say. в період метаморфозу після обробки BtН1

Концентрація BtН1, %	Загибель личинок після інфікування
	L2	L3	L4
	всього на добу обліку	в т.ч. за час ліньки на ІІІ вік	%	всього на добу обліку	в т.ч. за час ліньки на IVвік	%	всього на добу обліку	в т.ч. у період утворення лялечок	%
0,1	150	64	42,7+1,6	32	22	68,7+1,4	22	13	59,0+1,4
0,5	168	159	94,2+1,3	96	63	65,5+1,3	70	53	75,7+1,9
1,0	165	159	98,0+0,2	29	10	41,6+1,6	111	96	86,4+1,6

Отже, ентомотоксини Bt спричиняють в організмі комах глибокі зміни, що призводять до летального або метатоксичного ефектів. При цьому порушуються фізіологічні процеси линяння (запізнення або їх відсутність), метоморфозу.



Таблиця 7 - Метатоксична дія BtН1 на природну популяцію Leptinotarsa decemlineata Say.

Показник	% від загальної кількості
Загибель лялечок	36,752,0
Поява потворних імаго в залежності від загальної кількості лялечок, що утворилися	15,319,3
Зниження плодючості (стосовно до контрольних)	44,895,9
Загибель личинок дочірнього покоління	18,032,2

Польові дослідження показали, що для контролю чисельності та попередження шкідливої діяльності листогризних комах прийнятні терміни, протягом яких вони не встигають нанести рослинам істотної шкоди, доцільне застосування біопрепаратів на основі штамів BtН1. Щоб отримати належний фітозахисний ефект від застосування біоінсектициду, потрібно знати основні біологічні особливості шкідників, проти яких буде застосований препарат, його характер дії на фази розвитку комахи та терміни, найбільш оптимальні для застосування. Ентомоцидність біопрепаратів на основі BtН1 стосовно до різних видів комах неоднакова: за ступенем чутливості до біопрепаратів комахи займають різні положення, до повної нечутливості.

Селективна дія відносно твердокрилих комах-шкідників сільськогосподарських культур активно виявляється у ентомопатогенів BtН10 (ssp. darmstadiensis). Штами BtН10 подібно до BtН1 володіють антифідантним ефектом. Тератогенної та дерепродукційної дії не спостерігалося. Проте, мабуть, наявність у BtН10 екзотоксину, схожого з таким у BtН1 (за дією на мух), повинно спричиняти подібні ефекти. Головною відмінною особливістю BtН10, порівняно з біопрепаратами-аналогами групи Bt, є його селективна дія відносно небезпечних видів твердокрилих комах-фітофагів, включаючи імаго. Застосування Бациколу проти шкідників доцільно співвідносити зі складом популяції. Зважаючи на неодночасну появу личинок листоїдів із яєць, слід проводити повторну обробку через 78 діб після першої обробки (або через 23 тижні, залежно від масової появи личинок молодшого віку, L1-2). Порівняльні дослідження за оцінкою перспективних штамів BtН1 і BtН10 у польових умовах виявили їх практично однакову ефективність відносно личинок колорадського жука - 93,094,0%.

Унікальність дії BtН14 на личинок двокрилих комах пов'язана виключно з особливостями їх кристалічного ендотоксину. Контроль комарів є складним завданням, оскільки ці двокрилі володіють колосальним потенціалом розмноження, коротким часом зміни генерацій, високою екологічною пластичністю і великими здібностями до поширення, у тому числі шляхом пасивного перенесення в повітряних потоках. Для успішного практичного використання ларвіцидних біопрепаратів доцільно проводити облік багатьох чинників і обставин, зокрема характеристики біотопів водоймищ, їх площу, що підлягає обробці, глибину, особливості водопостачання, проточність, міру заростання і органосольові показники води. При виборі дози препарату обов'язково повинні враховуватися видовий склад комарів та їх чисельне співвідношення.

Встановлена висока (93,0100%) біологічна ефективність штамів BtН14 для Aedes aegypti протягом 48 годин. Певної залежності ефективності біоагента від температури водоймища не виявлено. За результатами випробувань BtН14 відмічено його придатність у широкому інтервалі ландшафтно-кліматичних зон та у всіх типах водоймищ (природних, штучних).

Різносторонні випробування ефективності штамів BtН14 у контролі чисельності комарів показали їх перспективність використання проти рослиноїдних комарів, зокрема проти рисового, грибного комариків (Cricotopus silvestris, Licoriella fucorum). Біологічна ефективність у дослідженнях становила 94,0 - 100%.

Поживний грибний субстрат, що містив яйця Licoriella fucorum, обробляли суспензією BtН14 у концентрації від 1,0 до 10,0%, при цьому встановлена 100% загибель личинок, що відродилися. Мінімально використовувані концентрації ентомопатогена були не ефективні відносно личинок ІІІIV віку.

Таким чином, антифідантні, ентомоцидні, ларвіцидні та інші властивості ентомотоксинів Bt, призводячи до відповідних ефектів у комах, тим самим не лише підсилюють дію препаратів, що містять токсини, але і пролонгують терміни цієї дії. Обов'язковою умовою ефективного використання препаратів групи Bt, так само як і всіх інших біоінсектицидів, є облік особливостей біопрепарату і механізму його дії. Контактно-кишкова дія біопрепаратів Bt на комах обумовлює максимальний інсектицидний ефект і гарантоване стримування чисельності шкідливих об'єктів на рівні, що не перевищує економічного порогу шкідливості.

Технологічні аспекти виробництва біопрепаратів на основі Вacіllus thurіngіensіs. Технологія виробництва препаратів на основі ентомопатогенних бактерій Bt розроблялася з урахуванням фізіологічних, біохімічних та інших особливостей мікробів-продуцентів і, відповідно, цільових призначень. Є ряд основних вимог, а саме: селективність (вибірковість) дії, висока ефективність, безпека для довкілля, корисної флори і фауни, зручність у виробництві і застосуванні, стабільність цінних властивостей препарату при його зберіганні та використанні в агробіоценозах.

Дана якісна характеристика компонентів поживних середовищ (джерел вуглецевого і азотного живлення) для штамів-продуцентів біопрепаратів з подальшим визначенням найбільш засвоєних форм цих поживних елементів, оптимальної норми посівного матеріалу, рН середовища, аерації. Встановлено, що найкращим джерелом азоту для штаму BtН1-20 є кукурудзяний екстракт як найповноцінніший компонент поживного середовища, який відповідає потребам цієї культури. Найкраще зростання і розвиток штаму відбувається при використанні глюкози і мальтози як джерела вуглецю (при співвідношенні С:N 7:1), при цьому досягається найбільший вихід ентомоцидних компонентів у культурі (на 48 годині росту титр спор 1,7 млрд. спор/мл).

Максимальне накопичення титру спор і кристалів, інтенсивність екзотоксиноутворення відбувається в поживному середовищі, що містить 3,0% кукурудзяного екстракту і 0,5?0,75% глюкози.

Дріжджеполісахаридне і кукурудзяноглюкозне поживні середовища є оптимальними для ферментації культури BtН1 -14, оскільки забезпечують титр спор у межах 2,73,58 млрд./мл культуральної рідини і вміст екзотоксину на рівні 2,73,62 мкл/г корму.

Технологічність і активність штамів BtН10 зростає при введенні до складу середовища кормових дріжджів (табл. 8).

Таблиця 8 - Ентомоцидна активність штаму BtН10 109 на середовищах різного складу

Склад середовища, %	Остаточний рН	Титр спор, млрд./мл культуральної рідини	ЛД50, мкл культуральної рідини для L2 Leptinotarsa decemlineata Say.
борошно соєве	дріжджі кормові	крохмаль кукурудзяний
2,5	-	1,5	7,95	3,45	56,0
3,0	-	2,0	8,15	3,78	48,4
3,0	0,5	2,5	8,6	1,3	3,98
2,5	1,5	1,5	8,8	2,43	3,45
3,0	1,25	1,5	8,7	3,79	4,16
3,0	1,25	2,0	8,3	3,68	3,86

Найбільша ентомоцидна активність штамів BtН10 виявляється при культивуванні їх на середовищах з соєвим борошном, дріжджами кормовими, крохмалем кукурудзяним, а також на середовищах, що містять як джерело вуглецю сахарозу і мелясу.

У найкращих варіантах досліду ЛД50 для личинок другого віку Leptinotarsa decemlineata Say. становила 3,45-4,16 мкл культуральної рідини.

Оптимальним середовищем за продуктивністю і ларвіцидною активністю штамів BtН14 виявилося модифіковане білково-вітамінне середовище (табл. 9), що забезпечує титр спор до 3,0 млрд./мл культуральної рідини.

При оцінці штамів цього серотипу особлива увага приділена продукції штамом кристалічного ендотоксину і ларвіцидної його активності. Рівень ларвіцидності прямо пропорційний кількості в препараті кристалічного ендотоксину.

Таблиця 9 - Вплив складу середовищ на технологічність і ларвіцидність BtН14

Склад середовища, %	Титр спор, млрд./мл культуральної рідини	ЛК50, мкл/л води для L4 Aedes aegypti
	BtН14 -87/19	BtН14 -7-1/23	BtН14 -87/19	BtН14 -7-1/23
Білково?вітамінний комплекс - 2,4 Кукурудзяне борошно - 2,0	3,5-4,45	3,04-4,26	0,98	0,82
Білково?вітамінний комплекс - 2,4 Пшеничне борошно - 2,0	2,3-3,1	2,48-3,20	1,35	0,96
Дріжджі пекарські - 2,4 Кукурудзяне борошно - 2,0	1,8-2,0	1,83-1,98	1,85	1,49
Дріжджі пекарські - 2,4 Пшеничне борошно - 2,0	1,5-1,7	1,42-1,68	1,95	1,41
Автолізат пекарських дріжджів - 2,4 Пшеничне борошно - 2,0	2,1-3,1	2,83-3,24	1,0	0,98

ЛК50 для личинок комарів IV віку в межах 0,98-1,35 мкл/л води, що свідчить про досить високу активність штамів?продуцентів кристалічного ендотоксину.

Зміни кислотності (рН) середовища, температурного режиму, аерації надають значний вплив на вихід остаточних продуктів метаболізму бактерій. Ці зміни можуть залежати як від технологічних умов культивування, так і від фізіологічних особливостей посівного матеріалу.

Вивчення динаміки розвитку культур Bt показало стабільність споро- і кристалоутворення при переході від лабораторних умов вирощування (колби) до виробничих у ферментері, а також порівняно невелику тривалість культивування (65 годин), яка забезпечує максимальне продукування біологічно активних речовин.

Порівняльна характеристика отриманої рідкої препаративної форми на основі BtН1 і BtН10, а також вихідного посівного матеріалу показала позитивну динаміку по всіх виробничо-цінних властивостях, без істотних коливань в показниках продуктивності і біологічної активності штамів (ступень токсигенності 2,52,9 мкл/г корму). Встановлено, що як посівний матеріал можна використовувати культуральну рідину і змивання спорової культури штаму, який був вирощений на скошеному МПА. Доза посівного матеріалу в межах 0,1-0,5 мл/50 мл поживного середовища не робить істотного впливу на продуктивність штамів групи Bt. У лабораторних дослідженнях 0,2% концентрацію можна прийняти за оптимальну. Спорову культуру у віці від 3х до 30 діб можна використовувати як посівний матеріал без технологічних втрат.

Таким чином, оптимізація основних параметрів і чинників зростання, якісна оцінка цільових продуктів синтезу, визначення ефективності технологічного процесу дозволяють отримувати вихідні стандартні дані для складання подальшої нормативно-технічної документації. Розроблені технології одержання мікробних препаратів на основі високоефективних штамів бактерій-продуцентів Bt Н1, Н10 і Н14 сприяють збереженню біологічних особливостей культур, їх функціональної активності та можуть бути використані у системах мікробіологічного виробництва.

Ефективність технологій застосування біоінсектицидів на основі Вacіllus thurіngіensіs у сучасних агроекосистемах

Формування популяційної резистентності у комах до Bacillus thuringiensis. Останнім часом виявився істотний негативний чинник широкого застосування синтетичних інсектицидів, а саме - формування до них популяційної, різнорівневої резистентності у комах-шкідників. Відмічена перехресна резистентність (крос-резистентність) до групи препаратів, а цей феномен вимагає збільшення доз таких препаратів і кратності обробок, що посилює екологічні наслідки (J. Keiding, J. Jespersen, 1991; Г.І. Сухорученко, 2001; О.Ю. Єрьоміна, С.А. Рославцева, 2006).

Спостерігається інтенсивне формування стійких популяцій членистоногих до довготривалого застосування інсектоакарицидів (В.Г. Коваленков, 2001). Процес формування резистентних популяцій набув безперервного характеру, що свідчить про генетичну пластичність шкідників сільськогосподарських культур і переносників трансмісивних інфекцій людини і тварин. Переважання в агроценозах резистентних шкідників унеможливлює оптимізацію фітосанітарного стану за допомогою лише хімічного методу. Звідси виникає виняткова актуальність залучення комплексу всіляких прийомів і засобів фітозахисту, багатоваріантної тактики біоценотичного контролю (В.А. Захаренко, В.О. Павлюшин, К.Е. Воронін, 2005).

До складових такого контролю разом з іншими належать мікробіологічні засоби, які за екологічною доцільністю, стабільністю значно перевершують інсектициди. Визначення рівня чутливості комах до інсектицидів є необхідним елементом при плануванні і здійсненні програм фітозахисних заходів. У дослідженнях з виявлення можливості формування популяційної резистентності у різних видів комах, у першу чергу до Bt різних серотипів, при широкому їх застосуванні було включено декілька основних позицій:

Визначення біологічної активності BtH1, BtH10 відносно до предімагинальної (личинкової) фази розвитку Musca domestica (L2) в аспекті рівня екзотоксиноутворення (в-екзотоксину), яка виражена в ЛК50.

Визначення ларвіцидної активності BtH14 для личинкової фази розвитку Aedes aegypti (L4), яка виражена в ЛК50.

Порівняльна оцінка ЛК50 контактних та інтактних популяцій тест-об'єктів від 1-го до 10-11-го покоління (для кожного виду комах).

Контактна популяція імаго Musca domestica, отримана при зараженні сублетальною дозою патогена Bt личинок дводобового віку інтактної популяції. Вказана доза відповідала 3,12 мкл препарату на 1 г корму і викликала 30-50% загибелі личинок. Контактні популяції впродовж всіх 1011 поколінь підтримували в однакових ...