Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Фізіологічні основи використання асоціацій діазотрофів з метою підвищення ефективності симбіотичної азотфіксації

03.00.12 - фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Пацко Олена Василівна

Київ-2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фізіології та екології рослин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Паршикова Тетяна Вікторівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри фізіології та екології рослин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Мусатенко Людмила Іванівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, завідувач відділу фітогормонології;

кандидат біологічних наук

Кругова Олена Дмитрівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу симбіотичної азотфіксації.

Захист відбудеться "25" жовтня 2010 року о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий "17" вересня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми дослідження. Серед заходів поліпшення азотного живлення рослин особливе місце належить теоретичним і практичним розробкам, спрямованим на суттєве підвищення існуючого рівня біологічного перетворення молекулярного азоту в органічні азотовмісні сполуки мікроорганізмами-азотфіксаторами. Інтенсивність процесу симбіотичної фіксації азоту атмосфери визначається взаємодією макро - та мікросимбіонтів [Волкогон В.В., 2004; Симаров А.А., 1990; Bromfield Е.Р., 2001]. Ефективність симбіозу істотно залежить від добору сортів вирощуваних бобових рослин і комплементарних їм активних штамів бульбочкових бактерій [Parsons R., 2001].

Тривалий час одним із способів підвищення інтенсивності симбіотичної азотфіксації була аналітична селекція активних штамів бульбочкових бактерій із природних популяцій [Коць С.Я., 2007; Курдіш І.К., 2005]. Сьогодні, завдяки застосуванню нових біотехнологічних підходів, у тому числі, методів молекулярної генетики і генної інженерії мікроорганізмів, з`явилася реальна можливість прискореного конструювання високоефективних штамів азотфіксуючих мікроорганізмів. Одним із таких методів є транспозоновий мутагенез, застосування якого дозволяє маркувати симбіотичні гени ризобій, які не мають самостійного фенотипового прояву, відкриваючи тим самим можливість виявлення основних рис структурно-функціональної організації симбіотичних ризобіальних генів, аналізу механізмів їхньої експресії в процесі взаємодії бактерій з рослиною-хазяїном і з`ясування окремих ланок механізму формування симбіотичних взаємовідносин між бобовими рослинами і діазотрофами [Курчак О.Н., 2001].

Пошук та підбір мікроорганізмів, здатних виступати як біологічні нодуляційні агенти і формувати симбіози на коренях рослин (серед яких перспективною в цьому плані є група фототрофних ціанобактерій) та створення на їх основі біопрепаратів для ефективного використання біологічного азоту є всі підстави вважати стратегічним напрямом досліджень, що відкриває широкі можливості підвищення врожайності агробіоценозів [Патика В.П., 2005].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася у рамках планів наукових досліджень НДЛ "Фізіологічних основ продуктивності рослин” кафедри фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка, бюджетної програми "Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України" (№ДР 0106U005749); проектів Міністерства освіти і науки України "Використання НВЧ-діелектрометрії для оцінки змін фізіологічного стану мікроводоростей під дією токсичних факторів” (№ ДР 0106U009254), "Дослідження фізіологічного стану мікроводоростей при дії біологічно активних сполук та підбір культур біосенсорів" (№ ДР 0105U006360) та "Вивчення особливостей вирощування Dunaliella salina Teod. з метою оптимізації умов її інтенсивного культивування" (№ ДР 0105U001075), де дисертантка була виконавцем окремих розділів за планом науково-дослідних робіт.

Мета та завдання дослідження. Головна мета досліджень - з'ясування стратегій оптимізації функціонування композицій автотрофних і симбіотичних азотфіксуючих організмів у агроценозах Medicago sativa (L.) та Glycine max (L.) для регуляції їхньої азотфіксувальної здатності й продуктивності.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

підібрати та апробувати ефективні композиції живих культур діазотрофів на основі синьозеленої водорості Nostoc punctiforme та бульбочкових бактерій Sinorhizobium meliloti, Bradyrhizobium japonicum (штамів аналітичної селекції та конкурентоспроможних штамів, отриманих методом транспозонового мутагенезу);

провести первинний скринінг ефективності композицій автотрофних і симбіотичних азотфіксуючих організмів (діазотрофів) за інтегральними фізіологічними (або ростовими) показниками;

з'ясувати видову специфічність фізіологічної реакції бобових у біохімічній ефективності симбіотичної азотфіксації рослин, інокульованих бінарними асоціаціями діазотрофів;

вивчити інтенсивність азотфіксувальної активності бобових та їхньої фотосинтетичної активності за інокуляції насіння різними штамами альгобактеріальних композицій;

визначити вплив інокуляції альгобактеріальними композиціями діазотрофів на загальну та біохімічну продуктивність бобових культур за амінокислотним складом вегетативної маси та насіння;

з`ясувати вплив альгобактеріальної інокуляції насіння на проантиоксидантну систему рослин люцерни в умовах окиснювального стресу.

Об'єкт дослідження - фізіологічні стратегії регуляції симбіотичної азотфіксації рослин.

Предмет дослідження - ефективність функціонування симбіотичних систем Medicago sativa (L.), Glycine max (L.) Merr. та альгобактеріальних композицій діазотрофів для регуляції продуктивності та стійкості рослин.

Методи дослідження - фізіологічні (лабораторне культивування мікроводоростей, визначення бактеріостатичного впливу мікроводоростей на культури бульбочкових бактерій, вирощування бактеріальних культур, оцінка життєздатності та інтенсивності росту бульбочкових бактерій, визначення сухої маси, інтенсивності фотосинтезу за моно - та бінарної інокуляції альго-бактеріальними композиціями діазотрофів); біохімічні (визначення азотфіксувальної активності кореневих бульбочок, вмісту основних фотосинтезуючих пігментів, активності процесів пероксидного окиснення ліпідів за утворенням ТБК-активних продуктів, активності супероксиддисмутази, кількості білка, кількісного та якісного складу амінокислот); біофізичні (флуоресцентний аналіз, визначення потенціальної фотосинтетичної активності); статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше обгрунтовано фізіологічні стратегії оптимізації симбіотичних взаємовідносин шляхом композиційного варіювання культур фотосинтезуючої синьозеленої водорості Nostoc punctiforme, азотфіксуючих конкурентоспроможних штамів бульбочкових бактерій, отриманих методом транспозонового мутагенезу Sinorhizobium meliloti та Bradyrhizobium japonicum для екологічно безпечного регулювання продуктивності та азотфіксувальної активності агроценозів.

Визначено, що симбіотичні системи Medicago sativa (L.) + Sinorhizobium meliloti Т17 + Nostoc punctiforme і Glycine max (L.) Merr. + Bradyrhizobium japonicum Т17-2 + Nostoc punctiforme є найбільш ефективними альгобактеріальними композиціями діазотрофів за активацією ростових (під час усіх фізіологічних фаз розвитку) та азотфіксувальних характеристик рослин.

Доведено, що ефективна робота симбіотичного апарату рослин за умов моно - та бінарної обробки насіння композиціями азотфіксуючих мікроорганізмів стимулює інтенсивність фотосинтетичних процесів, активізує процес надходження біологічного азоту в рослини, підвищує їхню продуктивність за рахунок максимального використання симбіотрофного азоту.

Вперше показано, що інокуляція насіння люцерни комплементарно підібраними азотфіксуючими композиціями мікроорганізмів сприяє підвищенню не лише продукційних (за якісним та кількісним вмістом амінокислот у вегетативній масі), але й адаптивних (за стійкістю до окиснювального стресу) властивостей рослин.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення симбіотичних взаємовідносин рослин люцерни і сої зі штамами бульбочкових бактерій та синьозеленої водорості Nostoc punctiforme дозволило підібрати високоефективні комплементарні пари цих симбіонтів, що рекомендовані для використання у сільськогосподарській практиці. Зокрема, результати досліджень дозволили рекомендувати ефективні заходи максимального використання симбіотрофного азоту, збільшення надходження біологічного азоту в рослини та підвищення їхньої продуктивності при застосуванні композицій азотфіксуючих та фотосинтезуючих мікроорганізмів Sinorhizobium meliloti Т17 + Nostoc punctiforme, Sinorhizobium meliloti І-7 + Nostoc punctiforme та Bradyrhizobium japonicum Т17-2 + Nostoc punctiforme.

Фізіологічні механізми регуляції азотфіксувальної активності як тесту екологічної та економічної доцільності застосування бактеріальних добрив є основою принципово нових науково обґрунтованих рекомендацій для створення високоврожайних агро-, фітоценозів, які характеризуватимуться екологічною чистотою продукції і невеликими енергетичними витратами рослини-хазяїна.

Застосування підібраних альгобактеріальних композицій діазотрофів рекомендовано для вдосконалення харчових та кормових технологій, пов'язаних з підвищенням виходу білка, оскільки проведеним комплексом досліджень показано можливість регулювання амінокислотного складу (кількості незамінних та замінних амінокислот) у насінні сої та у складі листків люцерни.

Теоретичні розробки досліджуваної проблеми включено до підручника "Екологія рослин”, використовуються при викладанні нормативних курсів "Фізіологія рослин” та спецкурсів "Біохімія рослин”, "Фотосинтез”, "Фізіологія та біохімія нижчих рослин”, "Стійкість рослин”, "Ембріологія рослин”, "Фізіологія насіння”.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук та аналіз літературних даних, разом з науковим керівником розроблено робочі гіпотези, обґрунтовано методологію постановки дослідів, виконано експериментальні дослідження.

В інтерпретації та узагальненні одержаних результатів брали участь д. б. н. Коць С.Я., ст. н. с. Воробей Н.А. (ІФРГ НАН України), що знайшло відображення в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на IX Конференції молодих дослідників "Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і грунтових мікроорганізмів" (Київ, 2005); XII з'їзді Українського ботанічного товариства (Одеса, 2006); ІІІ Міжнародній конференції "Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти" (Львів, 2007); Міжнародній науковій конференції "С.П. Костичев та розвиток сільськогосподарської мікробіології" (Ялта, 2007); ІV Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів "Молодь та поступ біології” (Львів, 2008); німецько-українському форумі ІнтерАГРО-2009 (Київ, 2009); І Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих вчених "Фундаментальні і прикладні дослідження в біології” (Донецьк, 2009); V Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів "Молодь та поступ біології” (Львів, 2009); Всеросійській науковій конференції "Фізіологія та генетика мікроорганізмів у природних та експериментальних системах” (Москва, Росія, 2009); IV з'їзді Українського товариства фізіологів рослин "Фізіологія рослин: проблеми та перспективи розвитку” (Київ, 2009); IX Міжнародній науковій конференції студентів та молодих науковців "Біологічні дослідження молодих учених в Україні" (Київ, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 17 наукових праць, із них 5 статей у фахових періодичних виданнях, затверджених переліком ВАК України, 12 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій та з'їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 158 сторінках машинописного тексту й складається зі вступу, інформаційної частини, що містить огляд літератури (1 розділ), експериментальної частини (5 розділів), висновків, списку цитованої літератури (284 джерела). Робота містить 32 рисунка та 27 таблиць.

Основний зміст роботи

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У першому розділі дисертації викладено огляд вітчизняної та зарубіжної літератури стосовно фізіолого-біохімічних особливостей формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу. Охарактеризовано основні фактори, що визначають симбіотичні взаємовідносини між партнерами симбіозу і його ефективність. Обґрунтовано доцільність досліджень за темою дисертаційної роботи.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В експериментах використовували рослини люцерни Medicago sativa (L.) сорту Ярославна селекції Інституту землеробства НААН та сої Glycine max (L.) Merr. сорту Мар`яна спільної селекції ІФРГ, Селекційно-генетичного інституту та Інституту землеробства НААН; та бульбочкові бактерії із колекції азотфіксуючих мікроорганізмів ІФРГ НАН України: для інокуляції насіння люцерни - виробничі штами Sinorhizobium (Rhizobium) meliloti 425а і 441 (селекції ВНДІСГМ С. - Петербург, Пушкін), штами аналітичної селекції АС08 і АС48, а також Tn5-мутанти штамів 425а S. meliloti - Т37, Т38, Т39, Т17 і 441 S. meliloti - І-2, І-7, І-10. Для інокуляції сої було залучено повільнорослі бульбочкові бактерії Bradyrhizobium japonicum-штам 634б і транспозанти штаму 646 B. japonicum - Т66, Т118, Т17-2.

Tn5-мутанти бульбочкових бактерій S. meliloti та B. japonicum було отримано у відділі симбіотичної азотфіксації ІФРГ НАН України внаслідок міжродової кон'югації з Esсherichia coli (pSUP2021:: Tn5) на агаризованому середовищі TY [Миллер Дж., 1976; Новикова Т.И., 1986].

симбіотична азотфіксація люцерна агроценоз

Для створення бінарних композицій азотфіксувальних мікроорганізмів застосовували культуру синьозеленої водорості Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot (із колекції Інституту гідробіології НАН України).

У лабораторних дослідженнях насіння пророщували у стерильних чашках Петрі після попередньої його поверхневої стерилізації (люцерни - 5 хв конц. Н₂SO₄, сої - 20 хв 70% етанолом). Насіння інокулювали моно - й бінарними суспензіями мікроорганізмів, виготовленими на основі бульбочкових бактерій S. meliloti, B. japonicum та синьозеленої водорості N. рunctiformе. Контролем слугували варіанти із обробкою насіння монокультурами S. meliloti, B. japonicum та N. рunctiformе. Пророщування та морфометричний аналіз ростових процесів проводили згідно з умовами, визначеними Держстандартом України ДСТУ 12038-84 [Лобода Н.В., 1991].

Вегетаційні та мікровегетаційні дослідження проводили в умовах модельних експериментів на вегетаційних майданчиках ІФРГ НАНУ за вологості субстрату 60% і природному освітленні. Рослини люцерни вирощували по 12 штук у 10-кілограмових пластикових посудинах, сої - по 6 штук у 15-кілограмових посудинах Вагнера, які стерилізували 20% Н₂О₂. Субстратом слугував промитий річковий пісок з додаванням мінеральної поживної суміші Гельрігеля [Гродзинський А. М., 1964] із 0,25 норми азоту (1 норма відповідає 708 мг Са (NO₃) ₂ Ч 4Н₂О на 1 кг піску). Залежно від схеми досліду насіння 60 хв інокулювали спеціально підготовленими суспензіями відповідних штамів S. meliloti, B. japonicum, синьозеленою водорістю N. рunctiformе, а також бінарними композиціями даних штамів діазотрофів.

Інтенсивність фотосинтезу визначали в контрольованих умовах за допомогою установки, змонтованої на базі оптико-акустичного інфрачервоного газоаналізатора ГІАМ-5М (Росія) за диференціальною схемою. Розрахунки параметрів газообміну виконували за загальноприйнятою методикою [Мокроносов А.Т., 1989].

Азотфіксувальну (нітрогеназну) активність визначали за рівнем ацетиленвідновлювальної активності (АвА) кореневих бульбочок ацетиленовим методом [Hardy R. W., 1968].

Визначення вмісту фотосинтетичних пігментів проводили за методикою Вельбурна [Wellburn A. R., 1994].

Специфічні зміни складу компонентів ліпід-пігментного комплексу та антиоксидантної системи досліджували у фотосинтетичних тканинах люцерни в умовах окиснювального стресу, викликаного гербіцидом дикватом. Інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) оцінювали за кількістю ТБК-активних продуктів на основі реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою [Heath R. L., 1968]. Активність супероксиддисмутази СОД визначали за методикою Андрєєвої Л.І. [1988].

Дослідження вмісту білка в листках люцерни та насінні сої проводили за методикою Лоурі [Lowry O. H., 1951].

Кількісний та якісний склад амінокислот у листках люцерни та насінні сої визначали методом іонообмінної рідинно-колоночної хроматографії з використанням автоматичного аналізатора [Козаренко Т.Д., 1975].

Життєздатність і кількісну оцінку інтенсивності росту (розмноження) бульбочкових бактерій проводили з застосуванням відповідних методичних прийомів: метод серійних розведень та метод підрахунку колоній [Фробишер М., 1965]. Концентрацію хлорофілу (С_хл) у клітинах водорості визначали методом диференціальної флуорометрії з використанням Planctofluorometer FL300 ЗМ розробки Красноярського університету [Гольд В. М., 1993].

Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за загальноприйнятими методиками [Доспєхов Б.А., 1985] з використанням ПЕОМ і залученням пакету спеціальних програм Microsoft Excel`00. Вірогідність різниці між варіантами оцінювали за критерієм Стьюдента і рівнем значущості Р?0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Скринінг ефективності симбіотичних систем люцерна-Sinorhizobium meliloti та соя - Bradyrhizobium japonicum за моно - та бінарної альгобактеріальної інокуляції. Одним із критеріїв оцінки ефективності та доцільності застосування бактеріальних препаратів є ступінь їхнього впливу на рослини на ранніх етапах розвитку. Відомо, що метаболіти ризосферних мікроорганізмів, у тому числі і синьозелених водоростей, можуть бути біологічними стимуляторами росту і розвитку рослин.

Проведені нами дослідження свідчать, що обробка насіння люцерни монокультурами бульбочкових бактерій, синьозеленої водорості та їхніми бінарними сумішами приводить до посилення енергії проростання і збільшення схожості насіння порівняно з контрольним варіантом досліду, де насіння зволожували водою.

Так, при моноінокуляції насіння люцерни бульбочковими бактеріями енергія проростання становила 39,0-58,0%, а за інокуляції водоростю N. punctiforme - 72,0%, що на 45,5% перевищувало контроль (рис. 1).

Рис.1 Енергія проростання (А) та схожість (Б) насіння люцерни сорту Ярославна за моно - та бінарної інокуляції суспензіями бульбочкових бактерій і синьозеленої водорості: 1 - контроль (без інокуляції); 2 - N. punctiforme; 3а - 425а; 3б - 425а + N. punctiforme; 4а - І-2; 4б - І-2 + N. punctiforme; 5а - І-7; 5б - І-7 + N. punctiforme;

Примітка. Тут і далі: * - Р?0,05 щодо контролю; # - Р?0,05 щодо варіантів моноінокуляції

Одержані експериментальні дані свідчать, що за інокуляції люцерни бінарними композиціями мікроорганізмів енергія проростання її насіння істотно збільшувалась порівняно із моноінокуляцією штамами ризобій і коливалась у межах 61,0-79,1%. Стимулюючий вплив бінарних суспензій мікроорганізмів-діазотрофів виявлено і при визначенні схожості насіння. Необхідно відмітити, що суміш бульбочкових бактерій і синьозеленої водорості активніше діє на досліджувані показники насіння люцерни порівняно із дією монокультур S. meliloti. Найефективнішою бінарною композицією за впливом на показник схожості насіння (як і за впливом на енергію проростання насіння) виявилась комбінація мікроорганізмів S. meliloti І-7+ N. punctiforme.

Проведені на наступному етапі експериментальні дослідження показали стимулюючий вплив передпосівної інокуляції насіння люцерни штамами бульбочкових бактерій та синьозеленої водорості на наростання надземної маси впродовж вегетації рослин. Показники рістстимулюючого ефекту порівняно з контролем коливалися в межах 23-78% у фазу стеблування, 9-54% - на фазі бутонізації та 32-93% - на фазі початку цвітіння рослин та залежали від складових компонентів інокуляційних суспензій, які застосовували для обробки насіння. Надземна маса рослин люцерни за інокуляції N. punctiforme перевищувала аналогічні показники у варіантах, де насіння обробляли виробничим штамом 425а S. meliloti (на всіх фазах розвитку) та реізолятом АС08 (у фазу стеблування та бутонізації). За одержаними результатами вплив синьозеленої водорості N. punctiforme прирівнювався до дії перспективних високоефективних Tn5-мутантів І-7 і Т17 бульбочкових бактерій (які відібрані з попередніх досліджень і характеризуються підвищеною азотфіксувальною активністю і ефективністю) (рис.2).



Рис. 2 Динаміка наростання надземної маси люцерни, інокульованої моно - та бінарними суспензіями мікроорганізмів діазотрофів (А - фаза стеблування, Б - бутонізації, С - початку цвітіння): 1 - контроль (без інокуляції); 2 - N. punctiforme; 3а - 425а; 3б - 425а + N. punctiforme; 4а - АС08; 4б - АС08 + N. punctiforme; 5а - І-7; 5б - І-7 + N. punctiforme; 6а - Т17; 6б - Т17+ N. punctiforme;

* - Р?0,05 щодо контролю; # - Р?0,05 щодо варіантів моноінокуляції

Виявлена рістстимулююча активність ціанобактерій може бути пов`язаною із синтезом ними ауксино - і гібериліноподібних речовин - специфічних гормонів росту. Концентраційне співвідношення цих фітогормонів, створене за симбіотичної взаємодії мікроорганізмів з рослиною-хазяїном, формує навколо клітин водоростей сприятливе оточення для розмноження й росту інших діазотрофів, стимулює розвиток кореневої системи і ріст надземної маси [Трефилова Л.В., 2008], що в свою чергу забезпечує ефективне функціонування створених альгобактеріальних консорціумів з рослинним організмом.

Біохімічна ідентифікація ефективності симбіотичної азотфіксації бобових рослин, інокульованих змішаними культурами азотфіксуючих мікроорганізмів. Ефективність симбіотичної азотфіксації оцінювали за біохімічним маркером - виділеним етиленом. У результаті досліджень, проведених у стерильних лабораторних умовах, нами визначено, що водорость N. punctiforme мала найвищий рівень ацетиленвідновлювальної активності порівняно із залученими до інокуляції люцерни штамами бульбочкових бактерій. За досліджуваним показником вона перевищувала виробничий штам S. meliloti 425а і активний транспозант Т38 у 3,35 і 2,09 раза відповідно.

Подальше вивчення динаміки формування симбіотичних утворень та азотфіксувальної активності (АфА) люцерни в умовах вегетаційних досліджень дозволило виявити неоднозначний характер змін цих показників за участю у симбіозі різних штамів бульбочкових бактерій S. meliloti, які зазнали безпосереднього впливу культури N. punctiforme. Рослини, інокульовані моно - і бінарними суспензіями на основі штамів S. meliloti 425а і АС08, істотно відрізнялись за кількістю утворених кореневих бульбочок у ранній період формування симбіотичного апарату люцерни (фаза стеблування).

Зменшення кількості і загальної маси бульбочок у люцерни, інокульованої сумішами S. meliloti 425а + N. punctiforme або S. meliloti АС08 + N. punctiforme, послабило інтенсивність симбіотичної азотфіксації рослин цих варіантів порівняно із рослинами, обробленими відповідно штамами 425а і АС08 у фазу стеблування (рис.3).

Рис.3 Динаміка азотфіксувальної активності люцерни, інокульованої моно - та бінарними суспензіями мікроорганізмів (бульбочкові бактерії + N. punctiforme); А - фаза стеблування, В - бутонізації, С - бутонізації - початку цвітіння.

Умовні позначення:

І - моноінокуляція (S. meliloti),

ІІ - бінарна інокуляція

(S. meliloti + N. punctiforme)

# - Р?0,05 щодо варіантів моноінокуляції

На основі одержаних результатів ми дійшли висновку про наявність депресивного впливу ціанобактерій N. punctiforme на штами 425а і АС08 S. meliloti у процесі сумісної інокуляції ними насіння люцерни. Вірогідно, N. punctiforme відіграв роль фактора, який послабив інтенсивність інвазії бульбочкових бактерій 425а і АС08 S. meliloti до коренів люцерни і, як наслідок, сповільнив процеси нодуляції. У подальшому у цих рослин збільшилась загальна кількість бульбочок, проте переважала частка дрібних, що можливо як наслідок інтродукції ризобій S. meliloti 425а і АС08 із насінням у субстрат, розмноження їх та вторинного інфікування люцерни. На жаль, механізм впливу N. punctiforme на бульбочкові бактерії не досліджений і потребує уточнення. Зі збільшенням кількості (дрібних) бульбочок у фазу бутонізації у люцерни, інокульованої сумішами AC08+ N. punctiforme або 425а + N. punctiforme, зросла її загальна АфА, але це не забезпечило істотних переваг бінарної інокуляції за цим показником у цю (бутонізації) та наступну (бутонізації-початок цвітіння) фази вегетації рослин (рис. 3).

В результаті досліджень виявлено також особливості функціонування бобово-ризобіальних систем люцерни, сформованих внаслідок інокуляції її композиціями Tn5-мутантів S. meliloti + N. punctiforme. У фазу молодих бульбочок (у люцерни - це фаза стеблування), коли процес азотфіксації є ще малоактивним, різниця за АфА була не суттєвою між відповідними варіантами із моно - і бінарною інокуляцією за участю Tn5-мутантів Т17 і І-7. Однак у фази бутонізації і бутонізації-початку цвітіння за АфА значно переважали бульбочки рослин, інфікованих сумішами І-7 + N. punctiforme і Т17 + N. punctiforme (рис.3). У цьому випадку рівень АфА, можливо, залежав від сумісності партнерів у інокуляційній суспензії, генетично детермінованої активності нітрогеназного комплексу мікросимбіонта та модулюючого впливу ціанобактерій. Доказом певної регуляторної ролі N. punctiforme у формуванні бульбочок слугує їх більша маса у період бутонізації-початку цвітіння у люцерни, інокульованої альгобактеріальними композиціями на основі N. punctiforme і Tn5-мутантів Т17 або І-7.

Динаміка вмісту фотосинтетичних пігментів та залежність інтенсивності фотосинтезу від активності симбіотичного апарату. Відомо, що різні штами бульбочкових бактерій та їх асоціації з іншими організмами через азотний метаболізм рослини впливають на повноцінне формування та подальше функціонування фотосинтетичного апарату. Саме наявність доступного рослинам азоту визначає ефективність функціонування симбіотичних угруповань і завдяки включенню його у різноманітні структурні та регуляторні білки можлива індукція та модуляція низки процесів, що здійснюються на мембранах органоїдів (у тому числі й на мембранах хлоропластів), та відбуваються зміни їхньої структурної організації. Характер взаємодії відібраних нами штамів мікроорганізмів вивчали у серії вегетаційних досліджень і оцінювали також за їхнім впливом на пігментний склад рослин.

Показано, що застосування усіх досліджених штамів бульбочкових бактерій S. meliloti для інокуляції насіння призводило до позитивних змін у динаміці накопичення фотосинтетичних пігментів у листках люцерни порівняно з контролем (рис.4).

Рис. 4. Вміст хлорофілів у листках рослин люцерни (фаза цвітіння) за моно - та бінарної інокуляції штамами ризобій та синьозеленою водорістю:

1 - абсолютний контроль (рослини без інокуляції);

2 - рослини, інокульовані синьозеленою водорістю N. punctiforme;

3а - рослини, інокульовані виробничим штамом 425а S. meliloti; 3б - рослини за інокуляції суспензією ризобій 425а + N. punctiforme; 4а - рослини, інокульовані штамом аналітичної селекції АС08; 4б - рослини за бінарної інокуляції композицією АС08 + N. punctiforme; 5а - рослини, інокульовані Tn5-мутантом S. meliloti І-7; 5б - рослини за бінарної обробки І-7 + N. punctiforme; 6а - рослини, інокульовані Tn5-мутантом S. meliloti Т17; 6б - рослини за бінарної обробки насіння асоціацією Т17 + N. punctiforme

* - Р?0,05 щодо контролю; # - Р?0,05 щодо варіантів моноінокуляції

У досліджуваних рослин люцерни, насіння яких перед посівом обробляли бінарними композиціями бульбочкових бактерій та синьозеленої водорості, відмічали найвищі показники вмісту хлорофілів а та b, що підтверджує стимулюючий вплив даних асоціацій мікроорганізмів на формування фотосинтетичного апарату рослин. Особливо чітко ця відмінність спостерігалась за бінарної інокуляції композиціями АС08 + N. punctiforme та Т17 + N. punctiforme. Так, при поєднанні мікроорганізмів АС08 + N. punctiforme вміст хлорофілу а і b зростав порівняно з інокуляцією насіння лише ризобіями АС08 на 75,0 і 40,7% відповідно, а у випадку зі штамом Т17 + N. punctiforme - на 114,6 і 82,9% порівняно з відповідним йому варіантом монообробки Т17.

Важливим фактором, який регулює процес формування симбіозу бобових рослин та ризобій, є наявність у субстраті доступного азоту. Як мінеральна, так і симбіотрофна його форми позитивно впливають на повноцінне формування і подальше функціонування фотосинтетичного апарату рослин. У фазу цвітіння серед варіантів моноінокуляції найефективнішим за впливом на інтенсивність процесу фотосинтезу виявився штам АС08, який майже вдвічі за досліджуваним показником перевищував виробничий штам 425а. За бінарної інокуляції АС08 з N. punctiforme інтенсивність фотосинтезу залишалась на рівні, який фіксувався у фазу бутонізації (рис.5).

Рис. 5. Інтенсивність фотосинтезу (мг СО₂/год на одну рослину) у люцерни (фаза початку цвітіння) за моно - та бінарної інокуляції штамами ризобій та синьозеленою водорістю:

1-рослини, інокульовані синьозеленою водоростю N. punctiforme; 2а-рослини, інокульовані виробничим штамом 425а S. meliloti; 2б - рослини за інокуляції суспензією ризобій 425а + N. punctiforme; 3а - рослини, інокульовані штамом аналітичної селекції АС08; 3б - рослини за бінарної інокуляції композицією АС08 + N. punctiforme; 4а - рослини, інокульовані Tn5-мутантом S. meliloti Т17; 4б - рослини за бінарної обробки Т17 + N. punctiforme

У варіантах альгобактеріальної інокуляції 425а + N. punctiforme і Т17 + N. punctiforme відмічали зростання інтенсивності фотосинтезу порівняно з монообробкою відповідними ризобіями. Найефективнішою бінарною композицією за впливом на інтенсивність досліджуваного процесу виявилась Т17 + N. punctiforme, яка на 43,7% перевищувала відповідний варіант моноризобіальної обробки Т17. Очевидно, що за даних умов при взаємодії синьозеленої водорості з ризобіями формується більш активний симбіотичний апарат, який, в свою чергу, посилює "запит" на асиміляти зі сторони кореневої системи, стимулюючи тим самим фотосинтетичну активність листків. Біохімічною основою такого "запиту” є інтенсивне розвантаження закінчень ситоподібних елементів у бульбочках, що створює концентраційний пул транспортних форм вуглецю (у першу чергу, сахарози) в провідній системі та прискорює їх відтік із листків. Це, в свою чергу, знімає обмеження на фотосинтез, яке накладається його продуктами за принципом зворотного зв'язку, та прискорює фотосинтетичну асиміляцію вуглецю.

Отже, результати досліджень свідчать, що ефективна робота симбіотичного апарату рослин за умов моно - та бінарної обробки насіння композиціями азотфіксуючих мікроорганізмів значною мірою стимулює процес накопичення фотосинтезуючих пігментів та підвищує інтенсивність фотосинтезу. А це, вочевидь, сприяє накопиченню органічних речовин і, як наслідок, приводить до підвищення врожайності рослин, оскільки в основі біологічної продуктивності рослинного організму, в тому числі і здатного до симбіотичної азотфіксації, лежить фотосинтетична асиміляція вуглецю.

Вплив альгобактеріальної інокуляції на продуктивність та білкову цінність люцерни і сої. Покращення азотного живлення рослин - один із головних факторів підвищення їхньої продуктивності. Дослідження застосування мікробних препаратів у рослинництві свідчать, що більшість бактерій здатні суттєво стимулювати ріст рослин, підвищувати врожайність та покращувати якість продукції.

Проведені нами дослідження показали, що особливості взаємодії симбіопартнерів за умов штучної інокуляції рослин змішаними суспензіями азотфіксуючих мікроорганізмів зумовили відмінності за урожаєм зеленої маси люцерни між варіантами досліду із моно - та бінарною інокуляцією (табл.1)

Таблиця 1

Продуктивність люцерни та вміст білка в листках за інокуляції моно- та бінарними сумішами мікроорганізмів

Інокулянт	Урожай надземної маси, г/посудину	Вміст білка в надземній масі,%
	І укіс	ІІ укіс	Сумарний урожай	% до моноіно-куляції	фаза бу-тонізації	% до моноіно-куляції
Без інокуляції	17,6	19,7	37,3		13,2
N. punctiforme	21,4	24,2	45,6		14,6
425а	22,2	22,4	44,6		16,8
425а + Nostoc	23,7	23,9	47,6	106,7	18,0	107,0
АС48	19,8	21,9	41,7		15,3
АС48 + Nostoc	22,5*	23,0	45,5	109,1	16,4	107,1
Tn5-мутант І-7	21,3	23,9	45,3		17,5
І-7 + Nostoc	24,6*	25,5*	50,1	110,7	19,3	110,3
Tn5-мутант Т17	21,8	25,1	46,9		18,3
Т17 + Nostoc	26,2*	29,1*	55,4	117,9	20,5	112,0
НІР0,05	2,0	2,4	-	-	0,7	-

Примітка: * - суттєва різниця між варіантами моно - і бінарної інокуляції (Р?0,05)

У варіантах бінарної інокуляції І-7+N. punctiforme і Т17+N. punctiforme врожайність рослин люцерни підвищувалась на 10,7 і 17,9% порівняно з моноризобіальною інокуляцією цими ж штамами. У випадку з виробничим штамом 425а та штамом аналітичної селекції АС48 за бінарної інокуляції з N. punctiforme достовірного підвищення врожайності не спостерігали, але порівняно з контролем, як за моно - так і за бінарної інокуляції, приріст урожаю становив 11,6-27,5%.

Відомо також, що якісним показником продуктивності бобово-ризобіального симбіозу є вміст білка в насінні або листках, визначення якого підтверджує встановлення симбіотичних зв'язків рослини з бульбочковими бактеріями. Вміст білка у всіх дослідних варіантах моно - та бінарної інокуляції підвищувався порівняно з контролем. Максимальний його вміст виявлено у листках люцерни за сумісної інокуляції насіння Тn5-мутантом Т17 з синьозеленою водоростю, за якої він зростав на 12,0% порівняно з монообробкою насіння Т17 та за бінарної інокуляції І-7 + N. punctiforme - вміст протеїну зростав на 10,3% стосовно варіанта моноінокуляції І-7.

Амінокислотний склад є головним критерієм оцінки біологічної цінності білків. Оцінка амінокислотного складу надземної маси люцерни показала, що порівняно з контролем абсолютно в усіх дослідних варіантах спостерігалось збільшення сумарного вмісту амінокислот. Встановлено, що у варіантах сумісної інокуляції ризобій із ціанобактерією збільшується загальний вміст амінокислот: у випадку з виробничим штамом 425а - на 12,7%, зі штамом аналітичної селекції - на 18,8; з транспозантом І-7 - на 35,7; з штамом Т-17 - на 25,1% порівняно з варіантами моноінокуляції відповідними штамами. Слід відмітити, що максимальний сумарний вміст амінокислот з-поміж усіх варіантів було зафіксовано у надземній масі люцерни, інокульованої монокультурою N. punctiforme - 12,78 мг/100мг білка. Особливо у даному варіанті в листках люцерни підвищувався вміст найбільш дефіцитної із незамінних для людини і тварин амінокислот - лізину - та фіксувалась її максимальна кількість. Хоча в усіх інших варіантах - і за дії монокультур ризобій, і за їх поєднання з N. punctiforme, - вміст цієї амінокислоти значно зростав порівняно з рослинами без інокуляції, що свідчить про збалансованість білка люцерни за амінокислотним складом. Слід відмітити, що в дослідних варіантах за вмістом таких амінокислот як метіонін, гістидин, аргінін та тирозин (які містяться в невеликих кількостях і можуть бути одним із факторів, що обмежує швидкість біосинтезу білка, особливо в генеративних органах) ці показники також переважали контрольний варіант, що є підтвердженням позитивного впливу бактеріальної інокуляції на якість сільськогосподарської продукції.

Вплив альгобактеріальної інокуляції насіння на про-антиоксидантну систему рослин люцерни в умовах окиснювального стресу. Сучасні сорти бобових рослин характеризуються високим потенціалом продуктивності. Проте, оскільки продуктивність і стійкість обернено залежні, пошук ефективних способів підвищення стійкості рослин є надзвичайно актуальним завданням. Глобальні зміни клімату, що спостерігаються в останні роки, забруднення навколишнього середовища радіоактивними ізотопами, важкими металами і пестицидами, еволюційні процеси в популяціях шкідливих організмів зменшують стійкість рослин до абіотичних та біотичних стресів, спричиняють коливання врожайності сільськогосподарських культур.

Аналіз одержаних результатів показав, що у фотосинтетичних тканинах рослин, інокульованих мікроорганізмами порівняно з рослинами без інокуляції, за короткочасної дії гербіциду (30 хв) вміст ТБК-активних продуктів знижувався у варіанті зі штамом T-17 на 18%, а у варіанті бінарної інокуляції T-17 + N. punctiforme залишався на рівні контролю. За умов наростання впливу стресового фактора (60 хв) продовжувалось зменшення вмісту ТБК-активних продуктів: у рослин інокульованих штамом T-17 - на 16,9%, за бінарної інокуляції - на 25%. Після 24 годин дії диквату на дослідні рослини суттєвого впливу як моно-, так і бінарних композицій мікроорганізмів на зниження вмісту ТБК-активних продуктів не спостерігали. У випадку бінарної інокуляції T-17 + N. punctiforme досліджуваний показник несуттєво знижувався порівняно з контролем, проте фіксувалась чітка різниця (15,4%) порівняно з моноінокуляцією цим же штамом (рис.6).

Рис.6. Вміст ТБК-активних продуктів у листках люцерни після обробки гербіцидом: А - через 30 хв, В - через 60 хв, С - через 24 год,

1-контроль (без обробки гербіцидом і без інокуляції);

2-контроль (без інокуляції, оброблений гербіцидом);

3-Т17, оброблений гербіцидом;

4-Т17+ N. punctiforme, оброблений гербіцидом

* - Р?0,05 щодо контролю, обробленого гербіцидом; # - Р?0,05 щодо варіантів моноінокуляції

За активністю СОД у фотосинтезуючих тканинах варіант бінарної інокуляції Т17+ N. punctiforme за короткочасної дії диквату (30 хв) виявився найефективнішим і перевищував у 2,5 раза контроль та варіант монокультуральної обробки штамом Т17 на 42,5%. Через 60 хв після обробки гербіцидом суттєвої зміни активності СОД у рослинах за моно - та бінарної інокуляції не відмічали, проте відносно до контролю ця різниця була суттєвою - зростала на 54%. За тривалої дії стресора (24 год) активність СОД залишалась на такому ж рівні (як і за короткочасного впливу) за моноінокуляції Т17, і на 23,4% зменшувалась порівняно з контролем за бінарної інокуляції з ціанобактерією, та на 34,4% - порівняно з варіантом моноризобіальної обробки Т17 (рис.7).



Рис. 7. Активність СОД (у. о.) у листках люцерни після обробки

гербіцидом: А - через 30 хв, В - через 60 хв, С - через 24 год.

1 - контроль (без обробки гербіцидом і без інокуляції);

2 - контроль (без інокуляції, оброблений гербіцидом);

3 - Т17, оброблений гербіцидом;

4 - Т17+ N. punctiforme, оброблений гербіцидом

* - Р?0,05 щодо контролю, обробленого гербіцидом; # - Р?0,05 щодо варіантів моноінокуляції

Рослини, інокульовані альгобактеріальними композиціями, виявились більш стійкими до дії оксидного стресу, що можна пов`язати з індукцією синтезу та накопиченням оксиду азоту NО, що є сигнальною молекулою неспецифічних захисних реакцій рослини за дії оксидного стресу. У літературі існує дві гіпотези щодо механізмів дії NО за умов стресу. По-перше, NО може виступати як антиоксидант, напряму зв'язуючи АФК і таким чином захищаючи клітину від їхньої ушкоджуючої дії. Такий механізм спостерігали, зокрема, за обробки рослин картоплі дикватом [Nicholson R. L., 1992]. По-друге, NО може виступати як сигнальна молекула, що запускає каскад реакцій, які призводять до експресії певних генів [Wendehenne D., 2001]. За своїми хімічними та фізичними властивостями (мала молекула, швидкий метаболізм, відсутність заряду та високий коефіцієнт дифузії) NО сповна підходить на роль внутрішньоклітинного сигнального медіатора рослинних стресових відповідей.

Отже, інокуляція насіння люцерни створеними нами азотфіксуючими композиціями мікроорганізмів сприяє підвищенню стійкості рослин за дії окиснювального стресу, індукованого гербіцидами.

Висновки

1. Визначено стратегії оптимізації функціонування композицій автотрофних і симбіотичних азотфіксуючих організмів у агроценозах Medicago sativa (L.) та Glycine max (L.) для регуляції їхньої азотфіксувальної здатності й продуктивності.

2. Первинний скринінг інтегральних фізіологічних реакцій рослин хазяїв (Medicago sativa (L.) та Glycine max (L.) дав можливість визначити високопродуктивні альгобактеріальні композиції автотрофних і симбіотичних азотфіксуючих організмів (діазотрофів). За азотфіксувальною здатністю найефективнішими є композиції: Sinorhizobium meliloti Т17 + Nostoc punctiforme, Sinorhizobium meliloti І-7 + Nostoc punctiforme.

3. Доведено, що фізіологічна ефективність симбіотичного апарату рослин за інокуляції бульбочковими бактеріями та водоростями визначається комплементарністю інокуляційних партнерів. Функціональна активність N. punctiforme координує різноспрямований вплив на симбіотичні властивості ризобопартнерів залежно від їхнього генотипу. Найбільш комплементарними партнерами водорості Nostoc punctiforme є штами-транспозанти Sinorhisobium melliloti - T37, T I-2, T 17 та штам Bradyrhizobium japonicum - Т66.

4. Встановлено, що інокуляція рослин люцерни та сої активними Tn5-мутантами Sinorhisobium melliloti та Bradyrhizobium japonicum підвищує ефективність функціонування симбіотичних систем і зумовлює збільшення їхньої продуктивності за рахунок регуляції активності генів, що контролюють рівень азотфіксації, нодуляції, визначають конкурентоздатність та стійкість у певних екологічних нішах.

5. Виявлено можливість підсилення стимулюючого впливу штамів-інокулянтів бульбочкових бактерій на ріст і розвиток рослин за рахунок застосування їхніх композицій із синьозеленими водоростями. Найбільш ефективною альгобактеріальною композицією є Т17 S. melliloti + N. punctiforme, яка підсилювала вегетативний ріст люцерни і сприяла одержанню урожаю її надземної маси на 15,5% більшої порівняно із моноінокуляцією Т17.

6. Фізіологічні та біохімічні реакції симбіотичного апарата рослин за умов моно - та бінарної обробки насіння композиціями азотфіксуючих мікроорганізмів створюють пул доступного азоту, мінеральна та симбіотрофна форми якого забезпечують синтез пігментів фотосинтетичного апарату та підвищують інтенсивність фотосинтезу рослинного організму.

7. Обробка насіння різними видами діазотрофів з високим рівнем ацетиленвідновлювальної активності забезпечує оптимальне азотне живлення рослин, значно підвищує їхню стійкість до окиснювальних стресів.

8. На основі розроблених критеріїв оцінки та відбору високоефективних штамів бульбочкових бактерій і синьозелених водоростей на різних етапах формування їх симбіозу з люцерною та соєю, композиції Sinorhizobium meliloti Т17 + Nostoc punctiforme, Sinorhizobium meliloti І-7 + Nostoc punctiforme розглядаються як можливі складові для виготовлення бактеріальних препаратів, інокуляція якими покращує азотне живлення рослин, сприяє збільшенню вмісту амінокислот і білка в листках люцерни та насінні сої, поліпшує харчові цінності врожаю, що дає змогу розробити й вдосконалити сучасні агротехнології, спрямовані на одержання екологічно безпечної продукції.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Пацко О.В. Вплив інокуляції насіння азотфіксуючими мікроорганізмами на ріст та розвиток рослин люцерни / Н.А. Воробей, С.Я. Коць, О.В. Пацко, Т.В. Паршикова // Вісник КНУ. Сер. Біологія. - 2005. - В.45-46. - С.31-33. (Особистий внесок: проведення лабораторних та мікровегетаційних експериментів з визначення нітрогеназної активності створених композицій мікроорганізмів, підготовка матеріалів до друку).

...