Роль мітохондріальної пори в корекції функціональних порушень серця при старінні за умов активації біосинтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.13 - Фізіологія людини та тварин

Роль мітохондріальної пори в корекції функціональних порушень серця при старінні за умов активації біосинтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень

Чорна Сніжана Володимирівна

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник:

чл.-кор. НАН України, доктор медичних наук, професор

Сагач Вадим Федорович

завідувач відділу фізіології кровообігу

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна

професор кафедри біохімії

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

доктор біологічних наук

Серебровська Тетяна Вікторівна

провідний науковий співробітник

відділу з вивчення гіпоксичних станів

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Захист відбудеться “_10_” _травня_ 2011 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_08_” _квітня_ 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Старіння організму є складним біологічним процесом, що характеризується поступовим послабленням фізіологічних функцій всіх органів, зокрема серця та підвищенням чутливості його до дії стресових факторів [Lakatta E.G., 2001; Lakatta E.G. et al, 2001], що зумовлюють поширення серцево-судинних захворювань серед вікової патології [Фролькис В.В. и др., 1994]. В Україні перше місце посідають хвороби системи кровообігу, питома вага яких складає 52,4% від усіх хвороб. На сьогодні ішемічна хвороба серця залишається найпоширенішою патологією цього органу. В основі механізмів ушкодження міокарда лежать такі процеси, як порушення окислювального метаболізму клітин, обумовлене активацією перекисного окиснення ліпідів та білків, а також пошкодження мембран кардіоміоцитів вільними радикалами [Ланкін В.З. и др. 2000; Меерсон Ф.З. 1984; Levine R.L. et al., 2001]. Мітохондрії являються важливими внутрішньоклітинними органелами, яким окрім окисного фосфорилювання і синтезу аденіннуклеотидтрифосфату (АТФ) притаманна роль в регулюванні процесів, залежних від кальцію та опосередкованих дією вільних радикалів та загибелі клітин серця при фізіологічних і патологічних станах організму. Так, ушкодження мембран органел призводить до мітохондріальної дисфункції, зменшення синтезу АТФ, скоротливої активності та функціональних резервів серця і, як наслідок цього, зниження його насосної функції [Меерсон Ф.З. 1984; Молотков О.В. и др. 2008]. З метою збереження цілісності клітини, енергетичного обміну та іонного гомеостазу існує тісний зв'язок між мітохондріями і цитоплазмою за допомогою динамічних зворотних механізмів. У серці мітохондрії займають близько 30% об'єму кардіоміоцитів і забезпечують синтез більш ніж 90% АТФ, необхідного для серцевої діяльності. Одним із ключових факторів, що регулюють функціональний стан мітохондрій є кальцій. В кардіоміоцитах гомеостаз кальцію змінюється при таких патологічних станах, як ішемія, серцева недостатність тощо через зниження рівня АТФ в результаті недостатнього споживання кисню. Крім того, порушення функціонування дихального ланцюга, особливо під час реперфузії, призводить до зростання активних форм кисню (АФК). Перевантаження органел кальцієм і оксидативний стрес у поєднанні з іншими факторами, включаючи високі концентрації фосфату і низькі концентрації аденінових нуклеотидів, призводять до утворення неспецифічної мітохондріальної пори перемінної проникності (МППП) (mitochondrial permeability transition pore, МРТР) на внутрішніх мембранах мітохондрій [Bernardi P. et al., 1992; Crompton M., 1999; Halestrap A.P. et al., 2004], що супроводжується раптовим збільшенням проникності мембран мітохондрій для речовин з молекулярною масою нижче 1,5 кДа [Bernardi P. et al., 2006; Zoratti M., et al., 2005]. Відомо, що у формуванні основи будови мітохондріальної пори (МП) приймають участь потенціал-залежний аніонний канал (ПЗАК) [Colombini M., 2004; Shoshan-Barmatz V. et al, 2006] розташований на зовнішній мембрані мітохондрій, аденіннуклеотидтранслоказа (АНТ) [Belzacq A.S. et al., 2002] на внутрішній мембрані мітохондрій та мітохондріальна цис-транс пептиділ-проліл ізомераза - циклофілін Д (ЦиФ-Д) [Halestrap A.P. et al., 1990] у матриксі мітохондрій. Відкривання МП є вирішальним фактором в постішемічних реперфузійних ушкодженнях серця [Сагач В.Ф. та ін., 2007]. Зменшення ступеню реперфузійного ушкодження міокарду полягає у зниженні чутливості мітохондрій до індукторів МП або у збільшенні ймовірності блокування пороутворення [Petrosillo G. et al., 2009; Takeda T. et al., 1999], що може бути опосередковано як прямим інгібуванням МП такими агентами як циклоспорин А (ЦсА) і сангліферин, так і непрямим - шляхом зменшення впливу індукторів МП, таких як оксидативний стрес і навантаження мітохондрій кальцієм.

Зменшення показників оксидативного стресу шляхом використання антиоксидантів та скавенджерів вільних радикалів, зокрема убіхінону - коферменту Q (КоQ), в значній мірі захищає від реперфузійного ушкодження [Pepe S. et al., 2007; Sohal R.S. et al., 2007]. Встановлено, що ішемічно-реперфузійні порушення в серці в значній мірі залежать від ступеню чутливості МП до індукторів її відкривання. Кардіоміоцити здатні упереджати ці порушення завдяки функціонуванню антиоксидантної ферментної системи та ендогенним біологічним речовинам з антиоксидантними властивостями, таким як убіхінон - коферменту Q (КоQ), які можуть обмежувати процеси перекисного окиснення мембран [Glinn M.A. et al., 1997] і захищає ДНК [Tomasetti M. et al., 1999], білки мітохондрій [Thomas S.R. et al., 2001] від ушкоджуючих дій вільних радикалів. У цьому зв'язку мітохондрії розглядають як одні з перспективних об'єктів цитопротекціі при розробці технологій захисту органів і тканин від ушкоджуючих факторів та корекції їх наслідків. Недостатньо вивченим у попередженні залежних від віку функціональних змін мітохондрій є також тривалі фізичні навантаження, які використовують для комплексної адаптивної перебудови організму та поліпшення стану, зокрема, серцево-судинної системи хворих різного віку [Lennon S. L. et al., 2004; Starnes J.W. et al., 2003].

Таким чином, розуміння молекулярних механізмів у попереджанні формування МП при серцево-судинних захворюваннях, зокрема в умовах ішемії-реперфузії, відкриє нові перспективи для розробки засобів профілактики та лікування наслідків ішемічних ушкоджень органів і тканин. В останні роки відкривання МП розглядають як мішень терапевтичної кардіопротекції під час серцево-судинних захворюваннях, особливо при ішемії - реперфузії серця [Javadov S. et al., 2007; Halestrap A.P. et al., 2009;].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках плану наукових досліджень відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за темою “Вивчення ролі змін функціонального стану мітохондрій в реактивності серцево-судинної системи” (2006-2009), № державної реєстрації 0105U008559.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити зміни чутливості мітохондріальної пори до індукторів її відкривання та корекцію функціональних порушень серця у щурів при старінні за умов активації біосинтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

В експериментах на ізольованому серці дослідити зміни його скоротливої функції у відповідь на ішемію-реперфузію за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень у дорослих і старих щурів;

В дослідах на ізольованих мітохондріях серця дорослих і старих щурів дослідити чутливість МП до індукторів: Са²⁺ та феніларсиноксиду (ФАО) за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень;

Дослідити показники вільнорадикальних процесів, зокрема вміст стабільного перекису водню, швидкість генерації вільних радикалів кисню (супероксидного та гідроксильного радикалів) та вміст дієнового кон'югату і малонового діальдегіду в мітохондріях серця щурів за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень;

Визначити активності ізоферментів NOS (iNOS, cNOS) та вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту - нітрит- і нітрат- аніонів, низько- і високомолекулярних нітрозотіолів;

Дослідити рівнів експресії роз'єднувального білка 3 в мітохондріях серця дорослих і старих щурів за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень;

Визначити рівні експресії мРНК потенціалзалежного аніонного каналу і аденіннуклеотидтранслокази та білка потенціалзалежного аніонного каналу - компонентів МП - в серці дорослих і старих щурів.

Об'єкт дослідження: ізольоване серце та мітохондрії дорослих (5-6 міс.) і старих (22-24 міс.) щурів.

Предмет дослідження: параметри кардіодинаміки, індукція та інгібування мітохондріальної пори, показники оксидативного та нітрозативного стресів в мітохондріях серця, експресія білка та мРНК

Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні, біофізичні, молекулярно-генетичні та статистичні

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані нові дані щодо ролі мітохондріальної пори (МП) в корекції функціональних порушень серця у щурів при старінні за умов активації біосинтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень. Вперше встановлено, що активація in vivo синтезу убіхінону за допомогою курсового введення старим щурам попередників біосинтезу убіхінону - параоксибензойної кислоти, метіоніну та вітаміну Е - супроводжується підвищенням вмісту коензиму Q. Продемонстровано, що підвищення скоротливої функції серця за умов активації біосинтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень у старих щурів супроводжується зменшенням чутливості МП до Са²⁺ та ФАО з віком. Вперше показано, що зменшення чутливості МП до Са²⁺ після дії тривалих фізичних навантажень відбувається за рахунок підвищення активності сNOS, що забезпечує в достатній кількості синтез оксиду азоту. Досліджено, що тривалі фізичні навантаження та активація біосинтезу убіхінону сприяють попередженню оксидативного стресу шляхом зменшення продукції супероксидного та гідроксильного радикалів, вмісту перекису водню та нітрозативного стресу - вмісту низько- та високомолекулярних нітрозотіолів в мітохондріях серця старих щурів. Показано, що при старінні в серці щурів спостерігається підвищена експресія - компонентів МП - мРНК ПЗАК і АНТ та білка ПЗАК.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в даній роботі результати мають цінне практичне значення щодо протекторного впливу антиоксиданту убіхінону та підвищення його вмісту завдяки активації його біосинтезу, а також використання фізичних навантажень для корекції роботи ішемізованого серця за умов реперфузійних його порушень у старих щурів. У роботі показана можливість попереджувати відкривання МП шляхом зменшення вільнорадикальних процесів та підвищення рівня оксиду азоту за умов активації біосинтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень. Представлені результати досліджень є основою для розробки перспективних шляхів, направлених на зменшення ризику розвитку ішемічної хвороби серця, а також для профілактики та лікування інших патологічних станів серцево-судинної системи з віком.

Особистий внесок здобувача. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані у співпраці з науковим керівником чл.-кор. НАН України д.м.н., проф. Сагачем В.Ф. Автором самостійно здійснено експериментальні дослідження та підготовку матеріалів, аналіз літературних досліджень та отриманих експериментальних результатів, формулювання основних положень і висновків роботи. Біохімічні дослідження по визначенню показників вільнорадикальних процесів та активності NO-синтаз в мітохондріях серця проводили за участі с.н.с. Інституту біохімії НАНУ, к.б.н. А.В. Коцюруби. Спільно із с.н.с. Інституту біохімії НАНУ, к.б.н. О.Б. Кучменко проведено курсове введення старим щурам попередників біосинтезу убіхінону та визначено його вміст в мітохондріях серця. За участі співавторів публікацій проведено інтерпретацію отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації були представлені та обговорені на науково-практичних конференціях та конгресах: IV Всеросійська з міжнародною участю школа-конференція по фізіології кровообігу (29 січня -1 лютого 2008, Москва, Росія), “Захист міокарду: молекулярні, патофізіологічні і клінічні аспекти” (12-13 травня 2008, Санкт-Петербург, Росія), V Львівсько-Люблінська конференція з експериментальної та клінічної біохімії (Львів 15-16 травня 2008), 8^th Meeting of France- New EU Members 16^th JMRC Symposium «New Frontiers in Cardiovascular Research» (5^th-7^th June 2008, Krakow, Poland), V Національний конгрес патофізіологів України з міжнародною участю «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів» (17-19 вересня 2008 рік, Запоріжжя, Україна), IX Національний конгрес кардіологів України з міжнародною участю (24-26 вересня 2008 рік, Київ), VII Parnas conference on Biochemistry and Molecular Biology (3-7 October, 2009 Yalta, Ukraine), Advances in biomedical research (23-25 February 2010 Cambridge, United Kingdom), 18-ий з'їзд Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (20-22 травня, Одеса, Україна), 16^th European Bioenergetics Conference (17-22 July 2010, Warsaw, Poland), 7^th Conference on Mitochondrial Physiology - MiP2010 «The many functions of the organism in our cells» (25 September-1 October 2010, Obergurgl, Tyrol, Austria).

Публікації. За результатам дисертаційної роботи опубліковано 20 наукових праць, у тому числі 6 статей у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 14 - у тезах конгресів, з'їздів, конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі списку скорочень, вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, заключення, висновків та списку використаних джерел із 284 найменувань. Роботу викладено на 166 сторінках та ілюстровано 57 рисунками і 1 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

В експериментах використовували дорослих білих щурів-самців лінії Вістар масою 200-250 г віком 5-6 міс. та старих щурів-самців масою 350-500 г віком 22-24 міс., яких утримували на стандартному раціоні віварію Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Дослідження проведені з урахуванням Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист тварин, які використовуються для експериментальних цілей (Страсбург, 1986).

Курсове введення старим щурам попередників біосинтезу убіхінону. Активацію біосинтезу убіхінону здійснювали шляхом курсового введення тваринам протягом 10 днів за допомогою зонда його попередників - параоксибензойну кислоту (ПОБК), донор метильних груп для синтезу КоQ - метіонін та модулятор - розчинений у рослинній олії Ь-токоферолацетат (вітамін Е) [Кучменко О.Б. та ін. 2004]. Досліди на ізольованому серці, ізольованих мітохондріях та біохімічні дослідження проводили на наступний день після останнього введення попередників біосинтезу убіхінону.

Тривалі фізичні навантаження щурів. Фізичне тренування дорослих та старих щурів здійснювали 5 днів на тиждень шляхом примусового плавання тварин у ванні з водою при температурі 32-34єС впродовж шести та чотирьох тижнів відповідно. Таким чином цикл тренувань для дорослих та старих тварин включав 30 і 20 днів зі сеансом тренувань та 12 і 8 днів відпочинку відповідно. Перший сеанс тренувань дорослих щурів тривав 2 хв, тривалість кожного наступного сеансу до 25-го дня збільшували на 4 хв і відповідно на 25-й день становила 74 хв. У наступні 5 днів циклу тривалість сеансу тренування становила 75 хв. Перший сеанс тренувань для старих щурів тривав 2 хв, а тривалість кожного наступного сеансу до 19 дня збільшувалась на 2 хв і на 19-й день становила 30 хв. У подальші 5 днів циклу тривалість тренувань сеансу тренування становила 30 хв.

Реєстрація показників скоротливої функції ізольованого серця щурів. Скорочувальну функцію серця досліджували на ізольованих серцях за методом Лангендорфа. Перфузію коронарних судин здійснювали ретроградно через аорту з постійним тиском 75-80 мм рт. ст. при 37⁰С розчином Кребса-Хензеляйта. Префузійний розчин безперервно аерували карбогеном (95% О₂ і 5% СО₂). Після 20-и хвилинного періоду стабілізації серця проводили 30-ти хвилинну ішемію шляхом повного перекривання перфузійного потоку з наступною реперфузією впродовж 40 хв. Стан скоротливої функції міокарда оцінювали за змінами значень тиску, який розвивав лівий шлуночок (ТЛШ), швидкісних показників скорочення (dP/dt_max і dP/dt_min) та кінцевого діастолічного тиску (КДТ). Величину коронарного потоку оцінювали за об`ємом перфузійного розчину, який відтікав від серця протягом 1 хв. Кисневу вартість роботи серця розраховували як відношення поглинання кисню до роботи серця, яку розраховували як добуток частоти скорочень на силу, що розвивається міокардом. Для визначення споживання кисню працюючим серцем у вихідному стані та через кожні 10 хвилин реперфузії вимірювали парціальний тиск кисню за допомогою газоаналізатора BMS-3 Mk2 (“Radioometer”, Данія) у перфузійному розчині, що притікав і відтікав від серця.

Реєстрація відкривання мітохондріальної пори. Фракцію мітохондрій отримували із серця щурів за методом диференційного центрифугування [Костерин С.А. и др., 1985] в нашій модифікації. Вміст білка в суспензії мітохондрій визначали за методом Лоурі [Lowry et al., 1951]. Дослідження відкривання МП проводили за допомогою спектрофотометричної (при л=520 нм) реєстрації набухання мітохондрій серця в інкубаційному середовищі ізотонічного складу у присутності індукторів (іонів Са²⁺ чи ФАО). Концентрація білка в інкубаційному середовищі становила 0,4 мг/мл.

Біохімічні методи. В мітохондріях серця щурів визначали швидкість генерації супероксидного (О₂?•) [Kuthan et al., 1982] та гідроксильного (^·ОН) [Conte et al., 1996] радикалів, вміст пероксиду водню (Н₂О₂) [Huwiler et al., 1984], малонового діальдегіду [Сталбная И.Д. и др., 1977] та дієнових кон'югатів (ДК) [Гаврилов и др., 1988]. Активність синтаз оксиду азоту (кальцій-залежної та кальцій-незалежної NO-синтаз) визначали в мітохондріях серця щурів за допомогою класичного методу [Salter M. et al., 1991] та сучасну його модифікацію [Vodovotz Y. et al., 1994], що пристосована до спектрофотометричного вимірювання одного з продуктів реакції - L-цитруліну. Вміст нітрит-аніону (NO^-₂) визначали в безбілкових аліквотах проб спектрофотометричним методом за кольоровою реакцією з реактивом Гріса методом Гріна [Green L.L. et al., 1982]. Вміст нітрат-аніону (NO^-₃) визначали спектрофотометрично у модифікації з бруцином. Вміст високо- і низькомолекулярних нітрозотіолів визначали за методом Saville [Padgett C.M. et al., 1998].

Визначення рівнів експресії білків Рівні експресії білків UCP3 і ПЗАК визначали за допомогою Вестерн-блот аналізу. Гель-електрофорез білків суспензії мітохондрій серця проводили в 7,5 % (для UCP3) та 12 % (для ПЗАК)- поліакриламідному гелі (ПААГ) в присутності додецилсульфату Na по Лемлі [Laemmli U.K. 1970] в камері Hoefer miniVE (“Amersham”). Після електрофоретичного розподілення білки переносили на PVDF-мембрану (“Sigma”) за допомогою системи напівсухого електроперенесення Hoefer miniVE Blot Module (“Amersham”). Після переносу білків мембрану блокували 5%-ним розчином сухого знежиреного молока протягом 18 - 20 год при 4єС та обробляли первинними моноклональними антитілами до UCP3 білка (“Sigma”, США) у розведенні 1:500 та ПЗАК - 1:1000 протягом 2 год при 20єС. Після цього мембрану відмивали в твін-фосфатному буфері (PBS-T) та інкубували з вторинними анти-кролячими IgG, кон'югованими з пероксидазою хрону (“Sigma”, США) у розведенні 1:4000 для UCP3 та 1:2000 для ПЗАК у PBS-T буфері протягом 1 год при 20єС. Кількісний розрахунок отриманих імуноблотів проводили шляхом їх сканування та обробки за допомогою комп'ютерної програми GelPro.

Визначення експресії мРНК в серці щурів. Тотальну РНК виділяли з міокарду щурів за допомогою набору “Trizol RNA Prep 100”(Isogen, Росія). Зворотну транскрипцію, або синтез комплементарної до РНК молекули ДНК (кДНК), проводили використовуючи “Revert Aid H Minus First Stand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Литва). Полімеразну ланцюгову реакцію проводили на термоциклері “GeneAMPSystem 2700” (“Applied Biosystems”, США) з використанням комерційної тест-систем “АмпліСенс-200-1” та по парі олігонуклеотидних специфічних праймерів (Fermentas”, Litva) із наступною нуклеотидною послідовністю: ПЗАК (sense - 5'-CATATCAACCTGGGCTGTG-3'; antisence - 5'-TTGGCTGCTATTCCAAAGC-3') та АНТ (sense - 5'-TTCCCCACCCAAGCTCTCAACT-3'; antisence- 5'-CGGCTGTCACACTCTGGGCAATCA-3'). Отримані ампліфікати розділяли в 1,5%-му агарозному гелі, що містив бромистий етидій. Візуалізацію та оцінку яскравості ампліфікатів після горизонтального електрофорезу (170 В протягом 30 хв) проводили за допомогою трансілюмінатора та програмного забезпечення ViTran (“Біоком”, Росія).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив ішемії-реперфузії на скоротливу функцію серця щурів за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень. Введення тваринам попередників біосинтезу убіхінону (коензиму Q (KoQ)) супроводжується підвищенням вмісту KoQ та вітаміну Е в 1,7 та 1,8 рази відповідно порівняно зі старими тваринами (контрольними), які не отримували такий комплекс біологічно активних сполук. На ізольованому по Лангендорфу серці старих тварин за умов активації ендогенного синтезу убіхінону спостерігали тенденцію до збільшення таких показників функціонального стану, як скорочувальна функція міокарда, коронарний потік, а також до зменшення - кінцевого діастолічного тиску і кисневої вартості роботи серця порівняно з контрольними тваринами.

Тиск, який розвивав лівий шлуночок (ТЛШ) на 5-ій хвилині реперфузії ішемізованого серця старих щурів після введення їм попередників біосинтезу КоQ становив 437 мм рт.ст., в той час як у контрольних тварин - 243 мм рт.ст. (P<0,05), а на 40-й хвилині реперфузії цей показник відновлювався до 643 мм рт.ст. і лише до 405 мм рт.ст. - у контрольних тварин відносно вихідного рівня (P<0,05). Для тварин після введення їм попередників біосинтезу коензиму Q КДТ на 5-й хв реперфузії після 30 хв ішемії серця становив 297 мм рт.ст., а для контрольних тварин - 345 мм рт.ст. Після 40-ї хв реперфузії КДТ у дослідних тварин спостерігали тенденцію до зниження 141 мм рт.ст., тоді як у контрольних тварин - лише до 212 мм рт.ст. Коронарний потік (КП) у дослідних тварин до ішемії становив 12,3+1,8 мл/хв, а у контрольних тварин - 10,8+1,4 мл/хв. Впродовж реперфузії ішемізованого серця цей показник поступово знижувався в обох групах щурів. Однак протягом усіх часових проміжків під час реперфузії КП у тварин дослідної групи перевищував величину такого у контрольних щурів.

Киснева вартість роботи серця до ішемії у дослідній групі тварин була меншою на 24% порівняно з такою у контрольних тварин. На 40-й хв реперфузії ішемізованого серця щурів після введення попередників активації біосинтезу КоQ цей показник зростав лише на 32%, в той час як у контрольних тварин - на 58% відносно вихідних значень. Різниця між величинами показників кисневої вартості серця у контрольній та дослідній групі тварин на 40-й хв реперфузії серця становила 26%. Активація ендогенного синтезу убіхінону сприяє зменшенню кисневої вартості роботи серця у старих щурів, що свідчить про покращення функціонування роботи дихального ланцюгу в мітохондріях після ішемії - реперфузії серця.

У тренованих дорослих щурів спостерігали достовірне збільшення ТЛШ до 187,2+15,0 мм рт. ст. порівняно з серцями нетренованих (контрольних) тварин, у яких цей показник становив 149,9+6,5 мм рт.ст. У тварин контрольної групи через 5 хв реперфузії ТЛШ зменшувався на 39,6+2,8 %, а після фізичних навантажень - на 15,2+3,8 % порівняно з вихідним значенням. КДТ через 5 хв. реперфузії у нетренованих дорослих щурів становив 53,5+10,6, а у тренованих - 47,6+11,7 мм рт. ст. Через 40 хв реперфузії його величина становила 48,6+7,7 мм рт. ст. у нетренованих та 28,1+6,9 мм рт. ст. - у тренованих дорослих тварин. КП у тренованих дорослих тварин до ішемії становив 12,3+1,8 мл/хв., а у контрольних щурів - 10,8+1,4 мл/хв. Впродовж реперфузії серця цей показник поступово знижувався в обох групах щурів. Однак протягом усіх часових проміжків реперфузії КП тренованих тварин перевищував таку величину у контрольних.

Показники кисневої вартості роботи серця у тренованих тварин були нижчими протягом усіх часових проміжків реперфузії порівняно з нетренованими дорослими щурами. На 10-ій хв реперфузії серця цей показник у нетренованих тварин збільшувався на 128,7+26,1 %, тоді як у тренованих тварин - на 87,3+8,7 % відносно вихідних значень.

У старих тренованих тварин через 5 хв реперфузії ТЛШ становив 354,6 мм рт.ст., в той час як у старих тварин - 243 мм рт.ст. (P<0,05), а на 40-й хвилині реперфузії ТЛШ відновлювався до 543,6 мм рт.ст. і лише до 405 мм рт.ст. у нетренованих старих тварин відносно вихідного рівня (P<0,05). Для старих тренованих тварин КДТ на 5-й хв реперфузії після 30 хв ішемії серця становив 251,3 мм рт.ст., а для нетренованих (контрольних) тварин - 345 мм рт.ст. Після 40-ї хв реперфузії КДТ у тренованих тварин спостерігали тенденцію зниження його до 113,2 мм рт.ст., тоді як у контрольних тварин -до 212 мм рт.ст. КП у тренованих старих тварин до ішемії становив 13+0,91 мл/хв., а у старих щурів - 10+1,2 мл/хв. Протягом усіх часових проміжків реперфузії КП тренованих тварин перевищував таку величину у контрольних. Киснева вартість роботи серця до ішемії у старих тренованих була меншою на 12,5% порівняно з такою у нетренованих тварин. Різниця між величинами показників кисневої вартості серця у старих та старих тренованих тварин на 40-й хв реперфузії серця становила 29%.

Таким чином, активація ендогенного синтезу убіхінона та тривалі фізичні навантаження призводили до зменшення ступеню реперфузійних пошкоджень та кисневого обміну у міокарді.

Вивчення чутливості мітохондріальної пори до індукторів її відкривання (Са²⁺ та феніларсиноксиду (ФАО)) за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень. В експериментах КоQ₁₀ виявляв протекторну дію щодо кальцій-індукованого набухання мітохондрій у концентраціях 10^-6-10^-4 моль/л. Однак найбільш ефективною виявилась концентрація КоQ₁₀ 10^-5 моль/л, що відповідає і даним літератури [Li G. et al., 2005]. Показано, що КоQ₁₀ при концентраціях 10^-6 і 10^-5 моль/л зменшував величину Са²⁺-індукованого набухання мітохондрій серця дорослих щурів на 45 та 60 % відповідно. На мітохондріях серця старих щурів виявлена максимально ефективна щодо попередження набухання мітохондрій концентрація коензиму Q₁₀ - 10^-5 моль/л, яка зменшувала величину Cа²⁺-індукованого набухання на 50 % порівняно з такою за відсутності коензиму Q_10. Преінкубація мітохондрій з КоQ₁₀ в концентрації 10^-5 моль/л достовірно зменшувала величину ФАО-індукованого набухання мітохондрій серця дорослих та старих щурів на 46 та 37% відповідно. Необхідно відмітити, що кальцій-індуковане набухання мітохондрій в обох випадках повністю попереджалося класичним інгібітором мітохондріальної пори циклоспорином А (ЦсА), що є прямим доказом причетності утворення мітохондріальної пори до процесу набухання мітохондрій.

Мітохондрії, ізольовані з серця старих щурів, яким вводили попередники активації синтезу коферменту Q, мають величину набухання на 44% меншу порівняно з мітохондріями серця старих тварин. Встановлено, що Са²⁺ у діапазоні досліджуваних концентрацій 10^-7-10^-4 моль/л викликає дозозалежне набухання мітохондрій в серці дорослих, старих і старих щурів після курсового введення їм попередників біосинтезу КоQ. Са²⁺ в найменшій концентрації 10^-7 моль/л спричиняє мінімальне набухання мітохондрій серця старих і старих щурів за умов стимуляції біосинтезу КоQ. Різниця величина набухання мітохондрій серця старих щурів при дії Са²⁺ в концентрації 10^-4 моль/л після курсового введення біологічно активних сполук для синтезу коензиму Q становила 12±0,6 %, що у 1,5 рази менша за величину набухання мітохондрій старих щурів (Д=18±0,3 %) і наближається до такої - дорослих тварин (Д=11±0,3 %) (рис. 1 А).

В результаті дії іншого індуктора МП - модифікатора сульфгідрильних груп ФАО в діапазоні досліджуваних концентрацій 10^-7-10^-4 моль/л також спостерігали дозозалежне набухання мітохондрій і наближення величини набухання мітохондрій серця старих щурів після курсового введення їм попередників біосинтезу Q до такої дорослих тварин. Величина набухання мітохондрій у присутності ФАО (10^-4 моль/л) за умов активації біосинтезу КоQ зменшувалась у 1,5 рази порівняно з величиною набухання органел серця старих щурів (Рис.1 Б), що теж свідчить про зменшення чутливості мітохондрій до дії окислювача ФАО за вище вказаних умов.

Рис. 1. Концентраційна залежність різниці величини набухання за наявності іонів кальцію (А) та феніларсиноксиду (Б) мітохондрій серця дорослих (1), старих щурів до введення (2) і після курсового введення (3) попередників біосинтезу коферменту Q (n=5)

Величина набухання мітохондрій, ізольованих із серця щурів після їх адаптації до фізичних навантажень суттєво не відрізнялась від такої мітохондрій контрольних щурів. За умов дії природного індуктора МП - Са²⁺ в концентрації 10^-4 моль/л спостерігали зменшення на 37% величини набухання мітохондрій серця тренованих тварин порівняно з контрольними. Залежність величин набухання мітохондрій серця від Са²⁺ в діапазоні концентрацій 10^-7 - 10^-4 моль/л контрольних та тренованих щурів представлена на рис. 2. Показано, що величина набухання мітохондрій серця щурів після їх адаптації до фізичних навантажень була менша у порівнянні з такою мітохондрій серця контрольних щурів у присутності Са²⁺ в концентрації 10^-5 і 10^-4 моль/л.



Рис. 2. Концентраційна залежність різниці величини набухання за наявності іонів кальцію мітохондрій серця контрольних (1) та тренованих (2) дорослих щурів (n=5)

Величина набухання мітохондрій серця старих тренованих щурів мала тенденцію до зменшення у порівнянні з мітохондріями контрольних старих щурів, на відміну від дорослих. За умов дії природного індуктора МП - Са²⁺ в концентрації 10^-4 моль/л спостерігали також зменшення на 26% величини набухання мітохондрій серця тренованих тварин порівняно з контрольними. Залежність величин набухання мітохондрій серця від Са²⁺ в діапазоні концентрацій 10^-7 - 10^-4 моль/л старих тренованих щурів була менша у 1,5-2 рази порівняно з мітохондріями серця контрольних старих тварин (рис. 3).

Рис. 3. Концентраційна залежність різниці величини набухання за наявності іонів кальцію мітохондрій серця дорослих (1), старих (2) та старих тренованих (3) щурів (n=6)

Показано, що величина Са²⁺-індукованого набухання мітохондрій серця як дорослих, так і старих тренованих щурів за умов введення блокатору L-NAME збільшувалась на 26 % у порівнянні з тренованими тваринами, яким не вводили блокатор.

Таким чином, ендогенний шлях активації синтезу убіхінону та тривалі фізичні навантаження є ефективним щодо блокування пороутворення шляхом зменшення чутливості мітоходріальної пори до індукторів її відкривання в серці при старінні.

Дослідження показників вільнорадикальних процесів у серці щурів за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень. На сьогодні відомо, що активні форми кисню є потужними регуляторами, зокрема активаторами МП. Так, в мітохондріях серця старих щурів рівень генерації О₂?•становив 18,2±0,74 нмоль/хв*мг білка, що більше як в чотири рази перевищував такий в мітохондріях серця дорослих тварин (4,46±0,41 нмоль/хв*мг білка), і це свідчить про посилення продукції О₂?•в серці з віком (рис. 4А).

Однак, в умовах активації ендогенного синтезу КоQ та після дії тривалих фізичних навантажень в мітохондріях серця старих щурів рівні генерації О₂?•радикалу зменшувалися і становили 15,63±0,97 та 2,6±0,65 нмоль/хв*мг білка відповідно порівняно зі старими тваринами 18,2±0,74 нмоль/хв*мг білка (рис. 4А). В мітохондріях серця дорослих тренованих щурів швидкість генерації О₂? радикалу суттєво не відрізнялась від такої нетренованих щурів та становила 4,46±0,41 і 5,004±2,67 нмоль/хв*мг білка відповідно (рис. 4А). Тоді як в мітохондріях серця старих тренованих щурів швидкість генерації О₂? радикалу зменшувалась на 85 % у порівнянні зі старими нетренованими тваринами (рис. 4.А).



Рис. 4. Швидкість генерації супероксидного радикалу (А), гідроксильного радикалу (Б) та вмісту пероксиду водню (В) в мітохондріях серця щурів (n=5): 1 - дорослі щури; 2 - дорослі треновані щури; 3 - старі щури; 4 - старі треновані щури; 5 - старі щури після курсового введення їм попередників біосинтезу КоQ; * - різниця достовірна порівняно з дорослими щурами (P<0,05), ** - різниця достовірна порівняно зі старими щурами (P<0,01)

Швидкість генерації рівня ^.ОН в мітохондріях серця старих щурів теж достовірно перевищував такий в серці дорослих тварин і становив 1,15±0,11 та 0,42±0,04 ДE*10²/30хв*мг білка відповідно (рис. 4.Б). В умовах активації ендогенного синтезу КоQ в мітохондріях серця старих щурів рівня швидкості генерації ^.ОН радикалу мала лише тенденцію до зменшення (0,92±0,1 ДE*10²/30хв*мг білка) порівняно зі старими тваринами (1,15±0,11 ДE*10²/30хв*мг білка). Однак, в мітохондріях серця дорослих і старих тренованих щурів спостерігали недостовірне підвищення цього радикалу порівняно з нетренованими тваринами (рис.4. Б).

Досліджено, що вміст Н₂О₂ в мітохондріях серця старих щурів становив 42,0±1,43 пмоль/мг білка, який достовірно перевищував такий в мітохондріях серця дорослих щурів (15,32±0,32 пмоль/мг білка) (рис. 4. В). З огляду на те, що величини показників вільнорадикального стану в мітохондріях серця старих щурів достовірно перевищували такі в серці дорослих щурів, можна стверджувати, що з віком в мітохондріях підвищується інтенсивність утворення вільних радикалів кисню. Наші результати підтверджуються даними інших авторів про підвищення продукції вільних радикалів кисню у мітохондріях серця старих тварин [Lesnefsky E.J., et al 2003]. убіхінон навантаження мітохондрія серце

В умовах активації ендогенного синтезу КоQ в мітохондріях серця старих щурів вміст Н₂О₂ достовірно знижувався на 44% і становив 23,54±2,84 пмоль/мг білка, у порівнянні з таким показником для старих тварин (42±1,43 пмоль/мг білка) (p?0,01) (рис. 4. В). Після тривалих фізичних навантажень у дорослих щурів відбувалось незначне, але достовірне підвищення вмісту Н₂О₂ (2,49±0,18 пмоль/мг білка) в мітохондріях серця у порівнянні з контролем (1,52±0,10 пмоль/мг білка) (p?0,05), що може свідчити про досить високий рівень генерації супероксид-аніону за цих умов (рис. 4.В). За даними літератури підвищений вміст Н₂О₂ та рівень генерації ^.ОН радикалу та може активувати функціонування антиоксидантної ферментної системи [Moran M., et al 2004]. Однак, в мітохондріях серця старих тренованих щурів спостерігали зменшення на 35 % вмісту Н₂О₂ у порівнянні з нетренованими старими тваринами (рис. 4.В).

Таким чином результати свідчать про те, що активація біосинтезу убіхінону та тривалі фізичні навантаження викликають зменшення рівнів продукції АФК внаслідок послаблення вільнорадикальних процесів в серці старих щурів.

Згідно даним літератури, за старіння спостерігається накопичення в тканинах продуктів вільнорадикального окислення ліпідів. Подібна тенденція спостерігається і в наших дослідах. Продемонстровано, що вміст первинного проміжного продукту процесів ПОЛ - дієнових кон'югатів (ДК) - в мітохондріях старих щурів перевищував майже вдвічі порівняно з дорослими тваринами і становив 5,85±0,21 нг/мг білка та 3,6±0,25 нг/мг білка відповідно. Отримані нами результати вказують, що за умов введення комплексу попередників та модуляторів біосинтезу убіхінону вміст ДК знижується майже в 1,5 рази у мітохондріях серця порівняно зі старими контрольними тваринами. Тоді як в мітохондріях серця дорослих і старих тренованих щурів спостерігали тенденцію до зменшення цього проміжного продукту ПОЛ порівняно з нетренованими (контрольними) тваринами. Також показано, що вміст вторинного продукту ПОЛ - малонового діальдегіду (МДА) - в мітохондріях старих щурів перевищував майже втричі такий порівняно з дорослими тваринами і становив 5,86±0,74 та 2,06±0,38 нмоль/мг білка відповідно. Разом з цим за умов активації біосинтезу убіхінону в мітохондріях серця тварин відбувається достовірне зменшення у 2 рази вмісту МДА порівняно зі старими тваринами. Тоді як в мітохондріях серця дорослих тренованих щурів цей показник зменшувався у 3 рази, а в мітохондріях старих тренованих щурів у 3,5 рази порівняно з нетренованими дорослими та старими щурами відповідно.

Дослідження зміни пулів стабільних метаболітів оксиду азоту та їх синтезу в мітохондріях серця дорослих та старих щурів за умов тривалих фізичних навантажень. Відкривання МП, як показано за останні роки, пов'язано з активністю NO-синтазами та рівнями оксиду азоту [Dedkova E.N., et al 2009]. В мітохондріях серця дорослих тренованих щурів було показано достовірне підвищення майже вдвічі активності cNOS відносно контролю (6,02±0,08 і 3,64±0,27 пмоль/хв*мг білка відповідно (p?0,05)) (рис.5.А). Тоді як в мітохондріях серця старих тренованих щурів таке підвищення було незначне відносно старих тварин (2,05± 0,691 і 1,84± 0,26 пмоль/хв*мг білка відповідно). Поряд з цим, за фізичних навантажень відбувалось достовірне незначне підвищення активності іNOS в мітохондріях серця дорослих щурів відносно контролю (3,07±0,21 і 1,73±0,24 пмоль/хв*мг білка відповідно (p?0,05)) (рис.5.Б). В мітохондріях серця старих тренованих щурів спостерігали достовірне зниження активності іNOS у порівнянні з мітохондріями серця старих тварин (12,29±3,11 і 9,25±1,24 пмоль/хв*мг білка відповідно (p?0,05)).



Рис. 5. Активність cNOS (A) та iNOS (Б) в мітохондріях серця щурів (n=5): 1 - дорослі щури; 2 - дорослі треновані щури; 3 - старі щури; 4 - старі треновані щури; * Р<0,05 - різниця достовірна порівняно з дорослими; ** - різниця достовірна порівняно зі старими щурами (P<0,05)

Відомо, що NО трансформується в такі стабільні метаболіти, як нітрит- (NO₂^-) та нітрат- (NO₃^-) аніонів [Bachmann S., et al 1994]. В мітохондріях серця старих щурів NO₂^- виявився майже вдвічі нижче, ніж у дорослих. Таке зниження вмісту NO₂^- відбувається на фоні зростання пулів нітрат-аніону. За дії тривалих фізичних навантажень в мітохондріях серця дорослих щурів стабільні пули NO₂^- знижуються на 46% порівняно з дорослими тваринами, тоді як за цих умов у старих тварин спостерігали його підвищення на 65% порівняно зі старими нетренованими тваринами. Активація біосинтезу убіхінону супроводжувалась підвищенням на 33% вмісту NO₂^- в серці старих щурів.

Найбільш окисленим стабільним метаболітом NO, а також субстратом нітратредуктази для його ресинтезу є нітрат-аніон [Мойбенко О.О. та ін., 2004; Ignarro L.J., et al 1999]. За нашими даними, в мітохондріях серця старих щурів спостерігали підвищення пулів NO₃^- порівняно з такими дорослих тварин. За дії тривалих фізичних навантажень спостерігали незначне підвищення пулів нітрат-аніону як в мітохондріях серця дорослих, так і старих щурів. Однак в мітохондріях серця старих тварин за умов активації біосинтезу убіхінону спостерігали достовірне зменшення на 28 % пулу NO₃ порівняно зі старими щурами.

Нітрозотіоли є ендогенними донорами та депо NO і утворюються в результаті зворотного процесу окислення SH-групи у складі низькомолекулярних (НМНТ) (в основному глутатіон) чи високомолекулярних (ВМНТ) (білки, до складу яких входять залишки цистеїну) тіолів активними метаболітами азоту. В мітохондріях серця старих щурів спостерігали підвищення вдвічі вмісту НМНТ порівняно з дорослими (220,3±26,01 та 108,3±16,75 пмоль/мг білка відповідно), що вказує на можливість накопичення в них оксиду азоту, а також пригнічення процесу його звільнення з депо. Тривалі фізичні навантаження на дорослих та старих щурів зменшували вміст НМНТ на 18 та 73 % відповідно в мітохондріях серця порівняно з дорослими та старими нетренованими тваринами. Крім того, в мітохондріях серця старих щурів за умов активації біосинтезу убіхінону також спостерігали зменшення вмісту НМНТ на 25 % порівняно зі старими щурами.

Дослідження рівнів експресії UCP3 в мітохондріях серця дорослих і старих щурів за умов активації ендогенного синтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень. На функціонування мітохондрій та відкривання МП можуть мати суттєвий вплив рівні роз'єднувальних білків (UCP). Незважаючи на великий інтерес до ролі UCP3, що експресуються в серці, на сьогодні молекулярні механізми їх біохімічної та фізіологічної функцій в повній мірі не з'ясовані. За допомогою методу вестерн-блоту у мітохондріях серця дорослих і старих щурів за умов активації біосинтезу убіхінону та після тривалих фізичних навантажень було встановлено рівні експресії UCP3 (рис. 6). Показано, що мітохондрії серця дорослих щурів (контроль) мають певний базальний рівень цього роз'єднувального білка, тоді як у старих тварин цей рівень зменшений на 63 % по відношенню до базального рівня (Рис. 6). В умовах активації ендогенного біосинтезу КоQ в мітохондріях серця старих щурів рівень експресії UCP3 відновлювався майже повністю у порівнянні з таким мітохондрій серця дорослих щурів

(рис. 6) і рівень експресії UCP3 підвищувався на 55% у порівнянні з таким мітохондрій серця старих щурів (рис. 6), що може в певній мірі свідчити про відновлення КоQ - залежного транспорту протонів через внутрішню мембрану мітохондрій до його матриксу.

* - різниця достовірна порівняно з дорослими щурами (P<0,05),

** - різниця достовірна порівняно зі старими щурами (P<0,05)

Рис. 6. Відносна зміна експресії UCP3 в мітохондріях серця дорослих і старих щурів: 1 - дорослі щури; 2 - дорослі треновані щури; 3 - старі щури; 4 - старі треновані щури; 5 - старі щури після курсового введення їм попередників біосинтезу КоQ;

В умовах адаптації до тривалих фізичних навантажень рівень експресії UCP3 зменшувався на 65% у мітохондріях серця дорослих щурів порівняно з дорослими нетренованими тваринами (рис. 6). Зміна рівня експресії UCP3 у старих щурів після дії до них фізичного навантаження мала таку ж тенденцію до зниження, як і у нетренованих старих щурів, а по відношенню до дорослих щурів різниця рівнів експресії UCP3 складала 70 % (рис. 6).

Дослідження експресії мРНК ПЗАК і АНТ та білка ПЗАК - компонентів МП - в серці дорослих і старих щурів. Рівні експресії мРНК ПЗАК і АНТ в серці дорослих і старих щурів представлені на рис.7, А.

а)

б)

Рис. 7. Експресія гену ПЗАК та АНТ в тканинах серця дорослих (1) та старих (2) щурів (n=6); п.н. - пари нуклеотидів; * - різниця достовірна порівняно з дорослими щурами (P<0,05)

Показано, що в серці старих щурів рівень експресії мРНК ПЗАК підвищений в 1,7, а мРНК АНТ - в 1,8 разів порівняно з дорослими тваринами (рис.7, Б).

За допомогою методу Western-blott-аналізу показано, що рівень експресії білка ПЗАК в серці старих щурів також значно підвищений порівняно з дорослими тваринами (рис.8).

Рис. 8. Експресія білка ПЗАК в тканинах серця дорослих (1) та старих щурів (2) (n=6)

Відомо, що існує зв'язок між ПЗАК і білками сімейства Bcl-2. Раніше в наших дослідженнях, за допомогою методу ПЛР, було показано підвищення рівня експресії мРНК проапоптотичного Вах в серці старих щурів порівняно з дорослими [Сагач В.Ф. та ін. 2006].

Отже, підвищення рівнів експресії ПЗАК і АНТ як основних структурно-функціональних компонентів МП та підвищена чутливість МП до індукторів, спричинена збільшенням проникності мітохондріальних мембран у серці старих щурів, можуть бути одними із шляхів порушення їх бар'єрних властивостей та індукувати загибель клітин внаслідок дисфункції мітохондрій.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені теоретичні та експериментальні дані про роль мітохондріальної пори в корекції функціональних порушень серця у щурів при старінні за умов активації біосинтезу убіхінону та тривалих фізичних навантажень.

1. В умовах in vitro на ізольованих мітохондріях комерційний препарат коензим Q₁₀ (10^-5 моль/л) спричиняв зниження чутливості МП до індукторів її відкривання Са²⁺ і ФАО як у дорослих, так і старих щурів завдяки його властивості, як потенційного інгібітора мітохондріальної пори.

2. Активація in vivo синтезу убіхінону за допомогою курсового введенням старим щурам попередників біосинтезу убіхінону - параоксибензойної кислоти, метіоніну та вітаміну Е - супроводжується підвищенням вмісту КоQ та вітаміну Е.

3. Активація ендогенного синтезу коензиму Q та тривалі фізичні навантаження призводили до зменшення ступеню реперфузійних порушень та кисневого обміну серця старих тварин.

4. За умов активації біосинтезу убіхінону та дії тривалих фізичних навантажень у дорослих і старих щурів показано зменшення чутливості МП до Са²⁺ та ФАО.

5. Активація біосинтезу убіхінону та тривалі фізичні навантаження призводять до зменшення продукції активних форм кисню (О₂?, Н₂О₂, яОН) та перекисного окиснення ліпідів (ДК і МДА) внаслідок чого послаблюються вільнорадикальні процеси в серці старих щурів.

6. За умов тривалих фізичних навантажень зменшення чутливості МП до індуктора відкривання Са²⁺, відбувається за рахунок підвищення активності сNOS, що забезпечує в достатній кількості синтез оксиду азоту.

7. Тривалі фізичні навантаження та активація біосинтезу убіхінону сприяють попередженню нітрозативного стресу внаслідок зменшення вмісту низько- та високомолекулярних нітрозотіолів в мітохондріях серця старих щурів.

8. В мітохондріях серця старих щурів рівень роз'єднувального білка 3 (UCP3) зменшувався на 63 % по відношенню до дорослих тварин. В умовах активації ендогенного синтезу КоQ в мітохондріях серця старих щурів рівень експресії UCP3 підвищувався у порівнянні з таким мітохондрій серця старих щурів. Тривалі фізичні навантаження зменшували рівень UCP3 в мітохондріях серця дорослих та старих щурів порівняно з нетренованими тваринами.

9. Підвищення рівнів експресії мРНК і білка ПЗАК та мРНК АНТ спричиняють збільшення проникності мітохондріальних мембран у серці старих щурів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

1. Тімощук С.В. Вплив попередників біосинтезу убіхінону in vivo на чутливість відкривання мітохондріальної пори у серці старих щурів / Тімощук С.В., Вавілова Г.Л., Струтинська Н.А., Кучменко О.Б., Петухов Д.М. Донченко Г.В. Сагач В.Ф. // Фізіол. журн. - 2008. - Т.54, №3. - С.3-9. (Особистий внесок здобувача - участь у теоретичному обгронтуванні дослідження, проведенні експерименту, аналізі отриманих результатів та підготовці статті до друку)

2. Струтинська Н.А. Експресія UCP3 і чутливість мітохондріальної пори до індуктора Са²⁺ у серці старих щурів за умов активації біосинтезу коензиму Q / Струтинська Н.А., Тімощук С.В., Вавілова Г.Л., Коцюруба А.В., Сагач В.Ф. // Фізіол. журн. - 2009. - Т.55, №3. - С.44-54. (Особистий внесок здобувача - участь у проведенні експерименту, підборі методик, пошуку літературних джерел та виконанні статистичної обробки результатів).

3. Тімощук С.В. Кардіопротекторна дія коензиму Q за умов активації ендогенного його синтезу при ішемії-реперфузії серця старих щурів / Тімощук С.В., Вавілова Г.Л., Струтинська Н.А., Таланов С.А., Петухов Д.М., Кучменко О.Б., Донченко Г.В,. Сагач В.Ф. // Фізіол. журн. - 2009. - Т.55, №4. - С.58-63. (Особистий внесок здобувача - участь у теоретичному обгронтуванні дослідження, проведенні експерименту, аналізі отриманих результатів та підготовці статті до друку).

...