Актуальність проблеми. На цей час клінічними та експериментальними дослідженнями встановлено, що трансфузії концентратів лейкоцитів є ефективним засобом при лікуванні інфекційних ускладнень у хворих з мієлодепресією після променевої та хіміотерапії та лейкопеній, які зумовлені введенням цитостатичних препаратів, а також при агранулоцитозах іншого походження [Мовшев Б.Е. и др., 2001, Рагимов А.А. и др., 2005; Charron D., 2007]. Тому удосконалення технології зберігання лейкоцитів донорської крові перед трансфузією становить великий інтерес для медичної практики [Румянцев А.Г., 1997; Мовшев Б.Е. и др., 2001]. На протязі останніх 40 років триває пошук оптимальних методів їх тривалого зберігання як при позитивних, так й негативних температурах. Найбільш чутливими лейкоцитарними клітинами до різних впливів та фізико-хімічних факторів є нейтрофільні гранулоцити [Ярилин А.А., 1999]. Зберігання концентратів лейкоцитів в умовах гіпотермії (4^оС) можливо лише в межах 24 годин, що обумовлено швидким виснаженням енергетичного потенціалу гранулоцитів. У свою чергу це призводить до інгібування їх функцій - здатності до хемотаксису та фагоцитозу [Lane T. A. et al., 1984; Lane T. A. et al., 1985; Заривчацкий М.Ф., 1995]. Кріоконсервування лейкоцитів дозволяє подовжити строк зберігання, однак навіть при оптимальних режимах охолодження після відігрівання в клітинах, що збереглися, виявляються нелетальні ушкодження, наслідком яких є порушення метаболізму нуклеїнових кислот, білків, АТФ [Цуцаева А.А. и др., 1983; Цуцаева А.А. и др., 2000] та ін. Крім того, мембрани гранул лейкоцитів чутливі до різного роду впливів і при порушенні їх цілісності гідролітичні ферменти виходять у цитоплазму клітин, викликаючи їх загибель [Луговой В.И. и др., 1983; Borregaard N. et al., 1997]. Для підвищення життєздатності лейкоцитів після зберігання були розроблені середовища, до складу яких входили бікарбонатний буфер, декстран, сироватка, глюкоза, АТФ, НАДН, НАДФH тощо [Hill R. S. et al., 1981; Tsvetkov T. S. et al., 1985; Lightfoot T. et al., 2001; Сведенцов Е.П. и др., 2006]. Проте задача по відновленню якості лейкоцитів перед їх введенням до кров'яного русла реципієнта залишається не вирішеною.

Відомо, що кордова кров - багате джерело біологічно активних речовин [Гольцев А.Н. и др., 1998; Морозова Р.П. и др., 1999; Гулевський О.К. та ін., 2005]. При дослідженні in vitro біологічної активності низькомолекулярних компонентів (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби встановлено їх стимулюючу дію на функціональний стан ембріональних фібробластів людини та клітин лінії BHK-21 clone 13/04 після кріоконсервування [Гулевский А.К. и др., 2009; Гулевский А.К. и др., 2010]. Дані, отримані в дослідженнях in vivo [Абакумова О.С., 2009; Моисеева Н.Н., 2009], дозволяють вважати, що низькомолекулярна фракція (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби має виражену імуномодулюючу та репаративну дію [Гулевский А.К. и др., 2007; Абакумова О.С., 2009; Моисеева Н.Н., 2009]. Однак вплив низькомолекулярної фракції кордової крові в складі реабілітуючих середовищ на кріоконсервовані лейкоцити не вивчено.

Тому дослідження впливу низькомолекулярної фракції кордової крові на функціональні властивості біооб'єктів, що піддавалися гіпотермічному зберіганню та кріоконсервуванню, з метою створення ефективних ресуспендуючих і живильних середовищ має важливе практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі біохімії холодової адаптації в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України "Використання низьких температур для виділення біологічно активних низькомолекулярних компонентів (менше 5 кДа) з кордової крові тварин з метою отримання ранозагоюючих препаратів" (шифр - 2.2.6.21 № ДР 0105U003917) та "Дослідження репаративної дії низькомолекулярної фракції з кордової крові на кріоконсервовані клітини" (шифр - 2.2.6.55 № ДР 0110U000403).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було обґрунтувати перспективу включення низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби до складу реабілітуючого середовища для підвищення функціональної активності лейкоцитів донорської крові людини після гіпотермічного або низькотемпературного зберігання.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові й препарату порівняння "Актовегін" залежно від їх вмісту в середовищі інкубації на функціональну активність лейкоцитів донорської крові людини.

2. Дослідити вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові на фагоцитарну активність лейкоцитів та їх здатність до генерації активних форм кисню після 24-годинного гіпотермічного зберігання.

3. Вивчити вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові на фагоцитарну активність лейкоцитів та їх здатність до генерації активних форм кисню після кріоконсервування.

4. Дослідити вплив препарату "Актовегін" на функціональну активність лейкоцитів після гіпотермічного або низькотемпературного зберігання.

5. Вивчити вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові й препарату "Актовегін" на секрецію запального цитокіну - фактору некрозу пухлини-б (ФНП-б) лейкоцитами донорської крові.

Об'єкт дослідження - функціональний стан лейкоцитів донорської крові людини після гіпотермічного або низькотемпературного зберігання в середовищі, що містить низькомолекулярну фракцію (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби.

Предмет дослідження - імунологічні та цитохімічні характеристики функціонального стану лейкоцитів донорської крові людини після гіпотермічного або низькотемпературного зберігання під впливом низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби.

кордова кров низькомолекулярна фракція

Методи дослідження: для вирішення поставлених задач були використані кріобіологічні, цитохімічні, імунологічні, клініко-лабораторні, проточної цитофлуориметрії та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше показана можливість відновлення функціональних властивостей лейкоцитів донорської крові людини після гіпотермічного або низькотемпературного зберігання в середовищі, яке містить низькомолекулярну фракцію (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби або препарат "Актовегін".

Уперше встановлено, що інкубація лейкоцитів після гіпотермічного зберігання або кріоконсервування в середовищі, що містить низькомолекулярну фракцію (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби, сприяла відновленню їх фагоцитарної активності й здатності до генерації активних форм кисню.

Уперше виявлено дозозалежний ефект низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби й препарату "Актовегін" в складі середовища на функціональну активність лейкоцитів донорської крові після гіпотермічного або низькотемпературного зберігання.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені в дисертаційній роботі дослідження показали стимулюючий вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби й препарату "Актовегін" в складі реабілітуючих середовищ на функціональну активність лейкоцитів донорської крові після зберігання при позитивних (4^оС) і ультранизьких (-196^оС) температурах.

Результати роботи є основою для розробки реабілітуючих середовищ, до складу яких входить низькомолекулярна фракція (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби або препарат "Актовегін", з метою відновлення функціональної активності лейкоцитів донорської крові людини після гіпотермічного зберігання або кріоконсервування.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено аналіз даних літератури, отримані результати експериментальних досліджень, проведені їх аналіз та статистична обробка. Разом з науковим керівником проф. Гулевським О.К. були визначені мета, задачі роботи та засоби їх рішення, обговорені результати та сформульовані висновки. У роботах, які опубліковані у співавторстві, відображено результати спільного планування, проведення експериментів та обговорення результатів, при цьому особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1-13] - проведення фракціонування донорської крові та дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів;

у роботах [3, 4, 6, 8-12] - проведення кріоконсервування концентратів лейкоцитів;

у роботі [5] - проведення гіпотермічного зберігання концентратів лейкоцитів;

у роботах [3-6, 9-12] - дослідження здатності лейкоцитів до генерації активних форм кисню.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на науковій конференції з міжнародною участю "Новые криобиотехнологии для решения фундаментальных и прикладных задач медицины" (м. Харків, 2008); науково-практичній конференції "Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения" (м. Новий Світ, 2009); науковій конференції "Application of cryopreservation from human tissue engineering to plant genebank integration" (м. Ганновер, 2009); щорічній конференції молодих вчених "Холод в биологии и медицине - 2010" (м. Харків, 2010); Х Українському біохімічному з'їзді (м. Одеса, 2010); Всеросійській науково-практичній конференції "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (м. Кіров, 2010), V Всеросійському з'їзді трансплантологів (м. Москва, 2010), науково-практичній конференції "Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения" (м. Новий Світ, 2011).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 13 наукових праць, з яких 5 статей - в спеціалізованих наукових виданнях та 7 тез - у збірниках наукових праць міжнародних і національних науково-практичних конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, підсумку, висновків та списку літератури, що включає 251 джерело, викладеного на 27 сторінках. Загальний об'єм дисертації складає 144 сторінок друкованого тексту. Робота проілюстрована 8 таблицями та 37 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Об'єктом для дослідження був концентрат лейкоцитів донорської крові людини групи А (II), заготовленої на консерванті "Глюгіцир". Лейкоцити одержували двома методами: диференціальне центрифугування [Аграненко В.А. и др., 1985] та метод седиментації еритроцитів декстраном [Rowe A. W. et al., 1980; Гришина В.В. и др., 2004]. Концентрат лейкоцитів, отриманий методом диференціального центрифугування, зберігали 24 години при 5±1^оС у полімерному контейнері без перемішування [Аграненко В.А. и др., 1985].

Концентрат лейкоцитів, отриманий методом седиментації декстраном, кріоконсервували в режимі повільного охолодження [Crowley J. P. et al., 1974; Аграненко В.А. и др., 1986] із ДМСО в кінцевій концентрації 7,5%. Розчин кріопротектора готували ex tempora на плазмі, що містить декстран. Співвідношення об'ємів клітинної суспензії й розчину ДМСО становило 1:

1. Охолоджений розчин ДМСО в суспензію лейкоцитів вносили при постійному перемішуванні. Клітинну суспензію з концентрацією лейкоцитів 2х10⁷ клітин/мл та об'ємом 1,5 мл охолоджували в поліетиленових кріоконтейнерах фірми Nunc (V=1,8 мл) за допомогою програмного заморожувача ЗП 10 (СКТБ ДВ ІПКіК НАНУ) за наступною програмою: 2 ^о/хв до температури кристалізації із зупинкою процесу на 7-10 хв; 2 ^о/хв до - 25^оС і 10 ^о/хв до - 80^оС із наступним зануренням у рідкий азот. Для дослідження функціональної активності лейкоцитів після седиментації декстраном отриманий концентрат центрифугували, а осад ресуспендували в середовищі наступного складу: 10% -й розчин декстрану й 5% -й розчин сироваткового альбуміну у фізіологічному розчині в співвідношенні 1: 1 [Румянцев А.Г. и др., 2003]. Після ресуспендування лейкоцитів у суспензію вносили розчин глюкози до кінцевої концентрації 5мМ [Glasser L. et al., 1985]. Концентрацію лейкоцитів доводили до 2х10⁷ клітин/мл.

Кріоконсервований концентрат лейкоцитів зберігали при температурі - 196^оС в умовах низькотемпературного банку ІПКіК НАН України на протязі 10-30 діб, відігрівали на водяній бані при температурі 38^оС протягом 40-50 сек при інтенсивному погойдуванні контейнера [Сведенцов Е.П. и др., 2008]. Кріопротектор і лізовані еритроцити видаляли шляхом повільного розведення розчином (10% -й розчин декстрану й 5% -й розчин сироваткового альбуміну) з наступним центрифугуванням і видаленням надосадової рідини [Румянцев А.Г. и др., 2003]. Осад ресуспендували в тому ж розчині й вносили глюкозу до кінцевої концентрації 5 мМ [Glasser L. et al., 1985].

Життєздатність клітин оцінювали за допомогою забарвлення трипановим синім [Kusaba N. et al., 1998].

Крім того, ступінь ушкодження лейкоцитів оцінювали методом проточної цитофлуориметрії на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur (Becton Dickinson, США) за міжнародним ISHAGE протоколом з використанням ДНК барвника 7-AAD [Schmid I. et al., 1992].

Виділення фракції з компонентами молекулярною масою до 5 кДа із цільної кордової крові великої рогатої худоби, підданої кріодеструкції, проводили методом ультрафільтрації [Брок Т.Д., 1987] з використанням мембранного модуля фірми "Sartorius" (Німеччина). Після ультрафільтрації низькомолекулярну фракцію кордової крові КРС (ФКК) ліофілізували й зберігали при - 80^оС [Абакумова О.С., 2009]. Перед використанням ФКК розчиняли у фізіологічному розчині в необхідній концентрації. Препаратом для порівняння використовували комерційний препарат "Actovegin"^® (40 мг/мл) фірми Nicomed (Австрія).

Дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів проводили за методом [Подопригора Г.И. и др., 1976; Розанова О.Е. и др., 1989]. Об'єктом фагоцитозу була інактивована добова культура Staphylococcus aureus штам №209 на фізіологічному розчині в концентрації 2 млрд клітин/мл. Фагоцитарну суспензію інкубували в повітряному термостаті при температурі 37^оС протягом 45 і 120 хв Мазки фіксували розчином еозин-метиленовим синім (за Май-Грюнвальдом), забарвлювали розчином азур-еозину (за Романовським). Визначали відсоток нейтрофілів/моноцитів, які фагоцитують, - фагоцитарний індекс (ФІ) і середню кількість мікробних тіл на один нейтрофіл/моноцит - фагоцитарне число (ФЧ) після 45 і 120 хв інкубації, а також індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ) - відношення фагоцитарного числа після 45 хв інкубації до фагоцитарного числа через 120 хв інкубації, що характеризує процес переварювання у нейтрофілів/моноцитів (в нормі > 1).

Здатність лейкоцитів до генерації активних форм кисню визначали за допомогою реакції відновлення нітросинього тетразолію при стимуляції клітин стафілококом - індукований НСТ-тест [Герасимов И.Г. и др., 2000]. Визначали

відсоток диформазан-позитивних нейтрофілів/моноцитів з використанням світлового мікроскопа PZO-Warszava (Польща) під імерсією (ок.8, об.100).

Для дослідження впливу ФКК й препарату "Актовегін" на функціональну активність лейкоцитів низькомолекулярну фракцію кордової крові і препарат порівняння вносили в суспензію клітин перед додаванням стафілокока до кінцевої концентрації 0,05 - 3,00 мг/мл. У контрольні проби додавали фізіологічний розчин. Для пояснення механізму впливу ФКК й препарату "Актовегін" на показники фагоцитарної активності нейтрофілів досліджували фагоцитарну реакцію в присутності інгібіторів: колхіцину ("Sigma-Aldrich", США) у кінцевій концентрації 100 мкМ [Tsai M. A. et al., 1998] або йодоацетату натрію ("Serva", Німеччина) у кінцевій концентрації 1 мМ [D`Onofrio C. et al., 1977].

Рівень секреції ФНП- лейкоцитами після інкубації суспензії клітин із ФКК і препаратом "Актовегін" визначали в зразках супернатанту методом імуноферментного аналізу [Швыдченко И.Н. и др., 2005] з використанням набору реагентів для визначення ФНП-б ЗАТ " Вектор-Бест" (Росія) на планшетному імуноферментному аналізаторі Stat Fax.

Статистичний аналіз експериментальних даних проводили за допомогою комп'ютерної обробки з використанням програмного пакету "STATGRAPHIC plus for Windows" версії 2.1 за непараметричним критерієм Манна-Уітні. Кількість повторів у кожній серії експериментів було не менш 5-6. Експериментальні дані наведені як середнє арифметичне ± середнє квадратичне відхилення. Ступінь вірогідності становив 0,05.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби на функціональну активність лейкоцитів донорської крові. З отриманих результатів встановлено, що інкубація лейкоконцентрату з ФКК або препаратом "Актовегін" впливала на поглинання мікробних тіл нейтрофілами. При цьому був установлений дозозалежний ефект обох препаратів. Так, після інкубації концентрату лейкоцитів із ФКК у концентрації 0,15 мг/мл було відзначено достовірне збільшення фагоцитарного числа (ФЧ) нейтрофілів до 22,421,66 абс. од. у порівнянні з контролем (15,371,32 абс. од.). Підвищення концентрації низькомолекулярної фракції до 3,00 мг/мл у середовищі до збільшення ФЧ нейтрофілів не приводило. Необхідно відзначити, що посилення поглинальної функції нейтрофілів при додаванні ФКК у концентрації 0,15 мг/мл характерно тільки для 45-хвилинної інкубації. Після 120 хв інкубації лейкоцитів із ФКК (0,15 мг/мл) відзначено істотне зниження даного показника в порівнянні із ФЧ після 45 хв інкубації, що, імовірно, є наслідком інтенсивного переварювання стафілококів.

Додавання в середовище інкубації препарату порівняння "Актовегін" також сприяло збільшенню поглинальної здатності лейкоцитів, але в значно більшій концентрації (1,50 мг/мл) у порівнянні із ФКК (0,15 мг/мл), що може бути пов'язано з більшою концентрацією в низькомолекулярній фракції кордової крові речовин, які активують метаболізм клітин. На таку можливість вказують відмінності в хроматографічних профілях, вивчених раніше [Абакумова О.С., 2009]. Кількість поглинених стафілококів лейкоцитами після 45 хв інкубації з "Актовегіном" у концентрації 1,50 мг/мл достовірно (р0,05) підвищувалася до 20,981,53 абс. од. відносно ФЧ у контролі (15,371,32 абс. од.). При цьому показник ФЧ після 120 хв інкубації в тих же умовах був на рівні контролю.

Для більш повної характеристики функціонального стану нейтрофілів донорської крові визначали показник переварюючої активності клітин - індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ) (рис.1). Достовірне (р<0,05) збільшення переварюючої активності нейтрофілів (1,880,06 відн. од.) у порівнянні з контрольним значенням (1,300,03 відн. од) було відмічено при додаванні в середовище інкубації ФКК в концентрації 0,15 мг/мл. Збільшення концентрації препарату призводило до інгібування переварювання мікробних тіл фагоцитами. Так, при максимальній концентрації ФКК (3,00 мг/мл) в середовищі інкубації показник ІЗФ знижувався на 20% у порівнянні з контролем (р<0,05). При включенні до складу інкубаційного середовища препарату "Актовегін" стимулююча дія на переварюючу активність нейтрофілів спостерігалася при концентрації 1,50 мг/мл (рис.1). Так, показник ІЗФ достовірно (р<0,05) підвищувався в 1,2 рази порівняно з контрольним значенням.

Рис.1. Вплив ФКК (А) та препарату "Актовегін" (Б) на переварюючу активність (ІЗФ) нейтрофілів концентрату лейкоцитів з донорської крові (К - контроль); n=6

Примітка. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем (р<0,05).

У той же час встановлено, що інкубація лейкоцитів з ФКК або препаратом "Актовегін" незалежно від їх концентрації не призводила до збільшення кількості нейтрофілів, які фагоцитували (ФІ). Результати оцінки функціонального стану нейтрофілів в НСТ-тесті показали, що після інкубації лейкоконцентрату з ФКК або препаратом "Актовегін" у присутності стафілокока кількість НСТ-позитивних клітин не змінювалася.

При дослідженні фагоцитарної активності моноцитів після інкубації лейкоцитів з ФКК та "Актовегіном" встановлено схожий характер впливу фракції та препарату на поглинальну та переварюючу здатність мононуклеарних фагоцитів. При цьому ФКК також проявляє максимальну біологічну активність при вмісті в середовищі приблизно в 10 разів менше, ніж препарат "Актовегін".

Таким чином, отримані дані дозволили встановити, що низькомолекулярна фракція (до 5 кДа) кордової крові, як і препарат порівняння "Актовегін", надають стимулюючий ефект на показники фагоцитарної активності фагоцитів, а саме на поглинальну і переварюючу здатність. Крім того, в наших дослідженнях було встановлено, що ФКК проявляє максимальну біологічну активність при вмісті в середовищі приблизно в 10 разів менше, ніж "Актовегін", що може свідчити про більш виражену біологічну активність фракції.

Для з'ясування механізму впливу низькомолекулярної (до 5 кДа) фракції кордової крові і препарату "Актовегін" на нейтрофіли донорської крові in vitro в наступній серії експериментів досліджували фагоцитарну активність нейтрофілів у присутності інгібіторів фагоцитозу - колхіцину (100 мкМ), пригноблюючого полімеризацію білків цитоскелета [Tsai M. A. et al., 1998], і йодоацетату натрію (1мМ), що інгібірує фермент гліколізу ГАФ-ДГ [D`Onofrio C. et al., 1977].

При додаванні в середовище інкубації лейкоконцентрату колхіцину відбувалося достовірне (р0,05) зниження всіх фагоцитарних показників нейтрофілів. Одночасна інкубація клітин з колхіцином і ФКК (0,15 мг/мл) або препаратом "Актовегін" (1,50 мг/мл) не впливала як на кількість активованих нейтрофілів, так і на їх поглинальну і переварюючу здатність (рис.2).

При інкубації з йодоацетатом натрію спостерігався інший характер дії. Додавання інгібітора також достовірно знижувало показники фагоцитарної активності нейтрофілів. Проте вже після 45 хв інкубації лейкоцитів з йодоацетатом натрію і ФКК (0,15 мг/мл) відмічалося збільшення в 1,24 рази кількості клітин, які фагоцитували, а показника фагоцитарного числа - в 2,33 рази.

Переварююча активність нейтрофілів в аналогічних умовах інкубації підвищувалася в 2,14 рази по відношенню до варіанта інкубації клітин тільки з інгібітором (рис.2). Препарат "Актовегін" (1,50 мг/мл) у присутності йодоацетату натрію чинив схожу дію. Можливо, даний ефект зумовлений безпосередньою участю низькомолекулярних компонентів ФКК та препарату "Актовегін" в реакціях енергетичного метаболізму клітини, що відображається в поліпшенні її енергетичного статусу та, як наслідок, функціональної активності.

Встановлено, що одним із важливих проявів функціональної активності фагоцитів є здатність до синтезу та секреції запальних цитокінів, основним з яких є фактор некрозу пухлини-альфа (ФНП-б) [Щепеткин И.А. и др., 1994; Ярилин А.А., 1999; Швыдченко И.Н. и др., 2005]. Тому цікаво було дослідити вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові і препарату "Актовегін" на здатність лейкоцитів секретувати ФНП-б при стимулюванні стафілококом. У результаті проведених досліджень не виявлено достовірних відмінностей у характері секреції ФНП-б при додаванні ФКК або препарату "Актовегін" в суспензію лейкоцитів протягом інкубації з об'єктом фагоцитозу.

Рис.2. Вплив ФКК (А) і препарату "Актовегін" (Б) у присутності колхіцину (100 мкМ) та йодоацетату натрія (1 мМ) на переварюючу активність (ІЗФ) нейтрофілів концентрату лейкоцитів з донорської крові (К - контроль, Колх - колхіцин, ЙАН - йодоацетат натрія, Акт - "Актовегін"); n=5

Примітки:

1. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем (р<0,05);

2. ** - відмінності достовірні в порівнянні з варіантом інкубації лейкоцитів з інгібітором (р<0,05).

Вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби на функціональну активність лейкоцитів донорської крові після гіпотермічного зберігання. Вплив ФКК і препарату "Актовегін" на функціональну активність фагоцитів після гіпотермічного зберігання протягом 24 годин вивчали за даними фагоцитарної реакції та індукованого НСТ-тесту. Як видно з даних табл.1, практично всі показники фагоцитарної активності нейтрофілів після гіпотермічного зберігання достовірно (р<0,05) знижуються в порівнянні з показниками нативних лейкоцитів, що узгоджується з даними літератури [Glasser L., 1977; Glasser L. et al., 1979; Маянский А.Н. и др., 1983].

Після інкубації лейкоцитів з ФКК або препаратом "Актовегін" у концентрації 0,15 і 1,50 мг/мл відповідно показники функціональної активності нейтрофілів (ФЧ і ІЗФ) достовірно збільшувалися в порівнянні з контролем. Зокрема інкубація лейкоцитів з ФКК (0,15 мг/мл) протягом 45 хв підвищувала поглинальну активність клітин після гіпотермічного зберігання в 1,7 рази в порівнянні з контролем. При цьому ФЧ після 120 хв інкубації нейтрофілів з ФКК залишалося на рівні значень нативного лейкоконцентрату. Індекс завершеності фагоцитозу нейтрофілів після інкубації з ФКК при оптимальній концентрації збільшувався в 1,8 разів (рис.3).

Таблиця 1

Фагоцитарні показники нейтрофілів після зберігання концентрату лейкоцитів в умовах гіпотермії (4^оС) протягом 24 годин

Примітка. * - відмінності достовірні в порівнянні зі значенням відповідного показника до зберігання концентрату лейкоцитів (р<0,05).

Інкубація лейкоцитів з препаратом "Актовегін" також стимулювала поглинальну і переварюючу здатність нейтрофілів, але в значно більшій концентрації препарату (0,30 мг/мл і 1,50 мг/мл відповідно) в порівнянні з ФКК (0,15мг/мл). Зокрема, після інкубації лейкоцитів з препаратом "Актовегін" в концентрації 0,30 мг/мл протягом 45 хв показник ФЧ збільшувався (р<0,05) до 18,55±1,13 абс. од. в порівнянні з контролем (11,49±0,71 абс. од.). Проте стимулювання процесів переварювання відмічено не було. Про це свідчить показник ФЧ після 120 хв інкубації суспензії з "Актовегіном", який був на рівні значення ФЧ через 45 хв інкубації і достовірно (р<0,05) вище за значення контролю.

Поглинальна активність нейтрофілів після 45 хв інкубації суспензії з "Актовегіном" у концентрації 1,50 мг/мл достовірно (р<0,05) не підвищувалася в порівнянні з контрольним значенням. Проте за даних умов інкубації спостерігався стимулюючий вплив препарату на переварюючу активність фагоцитів (рис.3). Індекс завершеності фагоцитозу нейтрофілів після інкубації лейкоцитів з препаратом "Актовегін" підвищувався в 1,5 рази у порівнянні з контролем.

Дослідження впливу ФКК і "Актовегіну" на кількість нейтрофілів, які фагоцитують, не виявило достовірних (р<0,05) змін показника ФІ в порівнянні з контролем протягом 120 хв інкубації.

Рис.3. Вплив ФКК (А) та препарату "Актовегін" (Б) на переварюючу активність (ІЗФ) нейтрофілів концентрату лейкоцитів після гіпотермічного зберігання (К - контроль); n=6

Примітки:

1. - показник ІЗФ нейтрофілів у нативному концентраті лейкоцитів;

2. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем (р<0,05).

У наступній серії експериментів досліджували вплив ФКК і препарату "Актовегін" на здатність нейтрофілів лейкоконцентрату, підданого гіпотермічному зберіганню, до генерації активних форм кисню (АФК). Результати наших досліджень показали, що після гіпотермічного зберігання лейкоцитів показник НСТ-тесту достовірно (р<0,05) не відрізнявся від відповідного показника нативних клітин. Так, кількість нейтрофілів, які містять диформазан, після інкубації концентрату лейкоцитів з індикатором респіраторного вибуху - НСТ (нітросиній тетразолій) у присутності стафілокока складала 71,96±3, 20% порівняно з аналогічним показником нативних клітин за тих же умов 80,18±2,67%.

Значення показника НСТ-тесту після інкубації лейкоцитів, підданих гіпотермічному зберіганню, з ФКК істотно відрізнялося від контролю (табл.2). Кількість диформазан-позитивних клітин після інкубації лейкоцитів з ФКК у концентрації 0,15 мг/мл складала 85,36±1,56%, що достовірно (р<0,05) перевищувало контрольні значення (71,96±3, 20%). При збільшенні концентрації низькомолекулярної фракції в середовищі також відмічено достовірне (р<0,05) підвищення досліджуваного показника (табл.2).

При внесенні в середовище інкубації препарату порівняння "Актовегіну" достовірного (р<0,05) збільшення кількості НСТ-позитивних нейтрофілів у порівнянні з контролем і відповідними значеннями після інкубації з ФКК відмічено не було (див. табл.). Можливо, це пов'язано з більшою концентрацією у низькомолекулярній фракції кордової крові речовин, які активують метаболізм клітин, ніж в препараті "Актовегін".

Таблиця 2

Вплив ФКК та препарату "Актовегін" на кількість НСТ-позитивних нейтрофілів концентрату лейкоцитів після зберігання в умовах гіпотермії (4^оС) протягом 24 годин

Примітки:

1. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем (р<0,05);

2. # - відмінності достовірні в порівнянні з варіантом інкубації з "Актовегіном" у відповідній концентрації (р<0,05).

Вивчення функціональної активності моноцитів дозволило встановити, що після 24-годинного гіпотермічного зберігання показники фагоцитарної реакції та індукованого НСТ-тесту достовірно (р<0,05) не змінюються порівняно зі значеннями нативного лейкоконцентрату. Інкубація клітин з ФКК або "Актовегіном" стимулювала поглинальну та переварюючу здатність моноцитів.

У результаті проведених нами досліджень встановлено, що інкубація лейкоцитів, підданих гіпотермічному зберіганню, з ФКК або препаратом порівняння "Актовегін" при певних концентраціях виявляє достовірну стимулюючу дію на фагоцитарну активність фагоцитів. Важливо відзначити, що ФКК надає стимулюючий ефект в значно меншій концентрації (0,15 мг/мл) порівняно з концентрацією "Актовегіну" (1,50 мг/мл). Окрім цього, введення ФКК у середовище інкубації на відміну від препарату "Актовегін" активує генерацію АФК нейтрофілами.

Таким чином, отримані результати обґрунтовують перспективу включення низькомолекулярної фракції кордової крові і препарату "Актовегін" до складу відновлюючих середовищ після гіпотермічного зберігання лейкоцитів для підвищення їх фагоцитарної активності.

Вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові великої рогатої худоби на функціональну активність лейкоцитів донорської крові, підданих кріоконсервуванню. У наступній серії експериментів досліджували вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові ВРХ та препарату порівняння "Актовегін" в складі середовища інкубації по відношенню до лейкоцитів після кріоконсервування в середовищі, яке містить 7,5% ДМСО, за даними тесту фагоцитарної реакції та індукованого НСТ-тесту. Кількість життєздатних лейкоцитів за даними тесту з суправітальним барвником трипановим синім після фракціонування крові до кріоконсервування складала 95,67±1,78%. Життєздатність лейкоцитів після кріоконсервування і видалення кріопротектора була на рівні 69,06±2,63%. Дослідження життєздатності клітин у суспензії за даними проточної цитофлуориметрії (FACS Calibur, Becton Dickinson, США) з використанням флуоресцентного ДНК барвника 7-ААD виявило, що після розморожування вона складала 43,23±4,06%. Зниження кількості життєздатних лейкоцитів, яке спостерігалось, обумовлено значною втратою клітин гранулоцитарного ряду (22,22±1,80% клітин, які не забарвлені 7-AAD, від загальної кількості гранулоцитів).

Всі фагоцитарні показники нейтрофілів та моноцитів після кріоконсервування порівнювали з аналогічними показниками нативних клітин, що знаходяться в середовищі для деконсервованих лейкоцитів. Фагоцитарний індекс нейтрофілів, підданих низькотемпературному консервуванню, знижувався в порівнянні з нативними клітинами в 1,5 і 1,3 рази після інкубації протягом 45 і 120 хв відповідно. Інкубація деконсервованих і нативних лейкоцитів у реабілітуючому середовищі з ФКК (0,15 мг/мл) і препаратом "Актовегін" (1,50 мг/мл) протягом 45 і 120 хв достовірно не впливала на значення досліджуваного показника.

Для дослідження поглинальної здатності деконсервованих нейтрофілів вивчали показник ФЧ за тих же умов інкубації. Фагоцитарне число деконсервованих нейтрофілів після 45 хв і 120 хв інкубації було знижене в 2 і 1,4 рази відповідно у порівнянні з ФЧ нативних клітин (рис.4). Інкубація протягом 45 хв деконсервованих нейтрофілів у реабілітуючому середовищі, що містить ФКК і препарат "Актовегін", призводила до достовірного (р<0,05) збільшення поглинальної активності. Так, показник ФЧ нейтрофілів у середовищі, яке містить ФКК, був в 1,21 рази вище в порівнянні з контролем. Поглинальна здатність нейтрофілів в реабілітуючому середовищі, що містить "Актовегін", збільшувалася в 1,18 рази. Після 120 хв інкубації деконсервованих лейкоцитів з ФКК або препаратом "Актовегін" було відмічено істотне зниження даного показника, що, ймовірно, є наслідком інтенсивного переварювання стафілококів.

Встановлено (рис.5), що після низькотемпературного впливу переварююча функція нейтрофілів знижується нижче за критичний рівень - 1 (коли переварююча здатність нижча швидкості поглинання [Розанова О.Е. и др., 1989]), про що свідчать значення ІЗФ деконсервованих нейтрофілів (0,88±0,04 відн. од.) в порівнянні з даними нативних клітин (1,24±0,05 відн. од.).

Рис. 4. Вплив ФКК та препарату "Актовегін" на поглинальну активність (ФЧ) нейтрофілів концентрату лейкоцитів, підданого кріоконсер-вуванню з 7,5% ДМСО (К - контроль, Акт - "Актовегін"); n=6

Примітки:

1. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем до кріоконсер-вування після 45 хв інкубації (р<0,05);

2. # - відмінності достовірні в порівнянні з контролем до кріоконсервування після 120 хв інкубації (р<0,05);

3. ** - відмінності достовірні в порівнянні з контролем після кріоконсервування через 45 хв інкубації (р<0,05);

4. ## - відмінності достовірні в порівнянні з контролем після кріоконсервування через 120 хв інкубації (р<0,05).

Рис. 5. Вплив ФКК та препарату "Актовегін" на переварюючу активність (ІЗФ) нейтрофілів концентрату лейкоцитів, підданого кріоконсервуванню з 7,5% ДМСО (К - контроль, Акт - "Актовегін"); n=6

Примітки:

1. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем до кріоконсервування (р<0,05);

2. ** - відмінності достовірні в порівнянні з контролем після кріоконсервування (р<0,05).

Після інкубації деконсервованих лейкоцитів у реабілітуючому середовищі, яке містить ФКК, ІЗФ підвищувався в 1,7 рази в порівнянні з контролем. При внесенні до інкубаційного середовища препарату "Актовегін" теж виявлялася стимулююча дія на даний показник. Індекс завершеності фагоцитозу при цьому підвищувався до значень нативних нейтрофілів (1,26±0,03 відн. од.). Отже, інкубація деконсервованих лейкоцитів з ФКК і препаратом "Актовегін" призводить до помітного збільшення резервних можливостей фагоцитів, ймовірно, у результаті стабілізації енергетичного потенціалу клітин [Румянцева С.А., 2002].

Дослідження впливу кріоконсервування на здатність нейтрофілів до генерації АФК проводили за допомогою індукованого НСТ-тесту (рис.6). Відсоток активованих нейтрофілів, які містять диформазан, достовірно (р0,05) зменшувався після розморожування. Так, у нативному лейкоконцентраті відсоток НСТ-позитивних клітин був у 1,8 рази вище, ніж у деконсервованих клітин.

Рис. 6. Вплив ФКК та препарату "Актовегін" на кількість НСТ-позитивних нейтрофілів концентрату лейкоцитів, підданого кріоконсерву-ванню з 7,5% ДМСО (К - контроль, Акт - "Актовегін"); n=6

Примітки:

1. * - відмінності достовірні в порівнянні з контролем до кріоконсервування (р<0,05);

2. ** - відмінності достовірні в порівнянні з контролем після кріоконсервування (р<0,05).

Після інкубації деконсервованих лейкоцитів у реабілітуючому середовищі, що містить ФКК, відносна кількість активованих фагоцитів збільшувалася на 20,56% в порівнянні з контролем (рис.6). Активація генерації АФК нейтрофілами після низькотемпературного зберігання була відмічена і після інкубації лейкоцитів у реабілітуючому середовищі з препаратом порівняння "Актовегін". У даному випадку кількість НСТ-позитивних клітин підвищувалася на 19,59%. При цьому в нативному лейкоконцентраті ФКК і препарат "Актовегін" не впливали на кількість активованих нейтрофілів у порівнянні з контрольною пробою.

На відміну від нейтрофілів моноцити крові більш стійкі до дії факторів кріоконсервування. Після розморожування та видалення кріопротектору виявлено достовірне (р<0,05) зниження тільки показника ФІ після 45 хв інкубації лейкоконцентрату. У той же час інкубація лейкоцитів з ФКК або препаратом "Актовегін" не призводила до його збільшення, а стимулювала поглинальну та переварюючу здатність моноцитів.

У результаті проведених нами досліджень було встановлено, що ФКК і препарат порівняння "Актовегін" при певних концентраціях виявляють стимулюючий ефект на поглинальну і переварюючу активність деконсервованих нейтрофілів і моноцитів у реабілітуючому середовищі. Після інкубації деконсервованих лейкоцитів у середовищі, яке містить низькомолекулярну фракцію кордової крові ВРХ або препарат "Актовегін", кількість НСТ-позитивних нейтрофілів достовірно збільшувалася в порівнянні з контролем. Таке збільшення може свідчити про активацію кисневозалежного метаболізму клітин [Маянский А.Н. и др., 1983; Герасимов И.Г. и др., 2000].

Висновки