Активность кальцийзависимых протеиназ в мозге крыс с экспериментальной нейропатологией

Полученные данные отличаются новизной, дополняют имеющиеся в литературе сведения о протеолитических ферментах млекопитающих. Результаты актуальны как в области фундаментального естествознания для изучения основных компонентов протеолитического аппарата клетки и понимания базовых основ его функционирования в норме и патологии, так и в прикладном аспекте (биомедицина, фармацевтика) поиска подходов к регуляции протеолитических процессов, лежащих в основе патологических перестроек в тканях.

Сделан вывод о перспективности выбранного направления исследований, адекватности методических приемов для решения поставленных задач и о необходимости дальнейших исследований сложного баланса строго регулируемой физиологической и персистентной патологической активности кальпаинов, нарушение которого лежит в основе патофизиологии многих нейродегенеративных заболеваний.

Заключение

кальцийзависимый протеолитический кальпастатин биохимический

В ходе проведенного эксперимента по моделированию БА у крыс путем интрацеребрального введения пептида Ав1-40 было изучено участие белков кальпаин / кальпастатиновой протеолитической системы в развитии нейропатологии. Об их селективной регуляции в данных условиях судили по уровню протеолитической активности основных форм кальпаинов - м- и m-кальпаинов. Указанные кальпаины синтезируются во всех тканях и количественно превосходят другие формы фермента (в ЦНС - кальпаины 3, 5, 10) на порядки (Wu et al., 2007). м-Кальпаин in vitro активируется ионами Ca2+ при микромолярных, а m-кальпаин - при миллимолярных концентрациях (Mellgen, 1980).

Вместе с тем, учитывая особую роль мембранных фосфолипидов для активации этих протеиназ (Goll et al., 2003), наиболее важным показателем представляется их активность, ассоциированная с мембранными фракциями (грубой митохондриальной, микросомной, миелиновой), которая составила 9% от общей. Такое распределение пула кальпаинов между растворимой и мембраносвязанной фракциями клетки в разной степени сходно для большинства тканей млекопитающих (Goll et al., 2003; Kolchinskaya, Malysheva, 2004). Мы обнаружили, что в присутствии амилоидогенного пептида кальпаиновая система в коре больших полушарий активируется почти в 2 раза. При этом наблюдается увеличение активности мембраносвязанной фракции кальпаинов до 16% от общего пула. В наших исследованиях (Рендаков и др., 2014) было показано, что уровень общей активности кальпаинов коррелирует с интенсивностью гибели клеток нервной ткани у крыс экспериментальных групп.

Поскольку активность кальпаинов в ткани зависит от интенсивности аутокаталитической реакции (Goll et al.,2003) , с помощью метода казеиновой зимографии было качественно оценено соотношение полноразмерных и аутолизированных м- и m-кальпаинов. Выраженная активация кальпаинов, особенно m-кальпаина (на зимограмме - белковая полоса с молекулярной массой 120 кДа), и их аутокаталитических фрагментов с молекулярной массой 118 кДа у животных с экспериментальной БА является наиболее достоверным свидетельством активации кальпаиновой системы in vivo. Характерно, что в целом невысокая активность м-кальпаина (123 кДа) в нервной ткани, составляющая в норме менее 10% от уровня активности m-кальпаина, почти полностью утрачивается у крыс с экспериментальной нейродегенерацией (рис. 2), что указывает на селективную регуляцию разных форм кальпаина при развитии патологии.

Большинство нейропатологий, включая нейродегенерацию, ишемию, травмы мозга, а также нормальное старение, сопряжено с нарушением динамического равновесия внутриклеточного Са2+ (Bezprozvanny, 2009). Обычно общее содержание свободного Са2+ в цитоплазме поддерживается в диапазоне от 100 нМ до 1 мкМ (в покое и при стимуляции, соответственно). При БА концентрация внутриклеточного Са2+ достигает величины сотен мкМ, а локально, например в области Са2+-каналов, еще на порядок выше, что достаточно для персистентной активации не только м-, но и m-кальпаина, которую мы наблюдаем на зимограмме. Обнаруженная нами избирательная активация m-кальпаина, которому требуется нефизиологично высокая концентрация Са2+ для активации и аутолиза, по всей видимости, объясняется избытком кальция в цитоплазме и отражает “патологическую” активацию кальпаиновой системы, аналогичную той, что наблюдается при дегенеративных процессах и в других тканях (кардиомиопатии, макулодистрофии, кахексии, миодистрофиях, ототоксичности) (Goll et al.,2003; Немова и др.,2010).

Помимо чувствительности к Са2+, изучаемые ферменты различаются субклеточной локализацией: m-кальпаин дисперсно растворен в цитозоле и ассоциирован с мембранами эндоплазматического ретикулума, а м-кальпаин преимущественно локализован на поверхности везикул аппарата Гольджи и в небольших количествах обнаруживается в митохондриях(Goll et al., 2003; Немова и др., 2010; Hood et al., 2010). Вероятно, это и определяет отмеченные нами различия в отклике ферментов на приток Са2+, который, как теперь известно, оказывает специфичные эффекты в зависимости от источника поступления. Концепция избирательности источников дополнительного Са2+ для индукции клеточной гибели была выдвинута Майклом Тымянски (Tymianski et al.,1993); позже было показано, что она справедлива и для активации кальпаинов: обратный ток Са2+ через Na+/Ca2+-обменник приводит к активации кальпаинов, а приток Са2+ по другим путям, например через потенциал-зависимые Са2+-каналы, - нет (Araujo et al., 2007). Преимущественная активация m-кальпаина при изучаемом воздействии, вероятно, объясняется солокализацией ионообменника и m-кальпаина, которая увеличивает вероятность активации последнего.

Полученные результаты согласуются с рядом наблюдений. У пациентов с БА была описана аномальная активация м-кальпаина, сконцентрированного в синаптических терминалях (Saiti et al., 1993). Избыток активной формы m-кальпаина был обнаружен в посмертных образцах префронтальной коры мозга больных деменцией альцгеймеровского типа, причем во всех специфично поражаемых болезнью зонах мозга пациентов с БА наблюдалось снижение уровня их эндогенного ингибитора, кальпастатина (Saito et al., 1993; Nixon et al., 1994). Активация кальпаинов на фоне дефицита кальпастатина также была выявлена в мозге трансгенных мышей Tg2576, несущих мутантный вариант гена АРР человека (Vaisid et al., 2007).

Следует отметить, что у крыс, которым вводили в мозг в-амилоидный пептид, отмечалось значительное ухудшение результатов поведенческого теста (водного лабиринта Морриса). В аналогичных условиях были отмечены изменения и в других протеолитических путях, например, лизосомальной аутофагии (Рендаков и др., 2014).

Литература

1) Бондарева Л.А., Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И. Внутриклеточная Са2+-зависимая протеолитическая система животных. М.: Наука, 2006. 304с.

2) Немова Н.Н., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Протеазы семейства кальпаинов. Структура и функции. Отногенез. 2010. Т. 41. (5): 381-389.

3) Алтаева Э.Г., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Немова Н.Н., Шенкман Б.С. // Докл. АН. 2010. Т. 433. № 1. С. 138-141.

4) Atherton J., Kurbatskaya K., Bondulich M., Croft C.L., Garwood C.J., Chhabra R., Wray S., Jeromin A., Hanger D.P., Noble W. // Aging Cell. 2014. V. 13. P. 49-59.

5) Abele K., Yang J. // Acta Physiologica Sinica. 2012. V. 64(5). P. 504-514.

6) Carrell R.W., Lomas D.A. Conformation disease// Lancet. 1997. V. 350. P. 134-138.

7) Hardy J. // J. Neurochem. 2009. V. 110. P. 1129-1134.

8) Grundke-Iqbal I., Iqbal K., Tung Y.C., Quinlan M., Wisniewski H.M., Binder L.I. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 4913-4917.

9) La Ferla F. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3. P. 862-872

10) Tydlacka S., Wang C.E., Wang X., Li S., Li X.J. Differential activities of the ubiquitin-proteasome system in neurons versus glia may account for the preferential accumulation of misfolded proteins in neurons // J. Neurosci. 2008. V. 28. P. 13285-13295.

11) Danysz W., Parsons C.G. // Brit. J. Pharmacol. 2012. V. 167. P. 324-352.

Размещено на Allbest.ru