Збудження-гальмування гладеньких м'язів кишечника при дії клітинно-зв'язаного білка а стафілокока та фактора переносу імунної реактивності до бактеріальних антигенів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Збудження-гальмування гладеньких м'язів кишечника при дії клітинно-зв'язаного білка а стафілокока та фактора переносу імунної реактивності до бактеріальних антигенів

03.00.02 - біофізика

Меленевська Надія Володимирівна

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий керівник : доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

професор кафедри біофізики

Офіційні опоненти: академік НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Веселовський Микола Сергійович,

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу нейрональних мереж

доктор біологічних наук, професор

Романенко Олександр Вікторович

Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця,

завідувач кафедри біології

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гальмівні та збуджувальні неадренергічні нехолінергічні і збуджувальні холінергічні нейрони інтрамуральної нервової системи відіграють важливу роль у контролі моторики шлунково-кишкового тракту (ШКТ). Через систему нейромедіаторів вони задіяні у гальмуванні-розслабленні (пуринергічному [Владимирова, Шуба, 1970; Повстян, 2000; Shuba et. al., 2003; Burnstock, 2006; Филиппов, 2010]? NO-ергічному [Зима, 1996; Yunker, Galligan, 1996; Shuttleworth, 1999], вазоінтестинальний пептид-ергічному [Lefebvre et al., 1995], пітуітарний аденілатциклазою активований пептид-ергічному [Makhlouf, Murthy, 1997], адренергічному [Bennet, Rogers, 1967]) і відповідно, збудженні-скороченні (опосередковано через ацетилхолін (АХ) [Bolton et al., 1999; Zholos et al., 2003], тахікініни [Galligan, 1999]) гладеньких м'язів (ГМ). Інфікування шлунково-кишкового тракту бактеріями золотистого стафілокока призводить до розвитку його патологічних станів різної важкості та ускладнень (діареї, ентерити, ентероколіти, перитоніти, септичний шок та інш.) [Позур зі співавт., 2003; Олешко, Любченко, 2006]. Дослідженнями останніх років [Філіппов зі співавт., 1996, 2000; Костерін зі співав., 2001; Цимбалюк, 2002; Давидовська, 2003; Филиппов, 2010] показано, що мішенню дії токсинів, імуноактивних субстанцій стінки бактерій золотистого стафілокока, зокрема, пептидоглікану, розчинної форми такого суперантигену як білок А є не тільки клітини імунної системи, сполучнотканинний матрикс стінки судин еластичного типу, але й інтестинальні гладеньком'язові клітини (ГМК).

З шести відомих на сьогоднішній день форм стафілококового білка А: розчинної, кон'югованої, сорбованої, модифікованої, корпускулярної, клітинно-зв'язаної (КЗБА), найбільш високоефективним за імунобіологічними властивостями є КЗБА. Він стимулює фагоцитарні та бактерицидні властивості клітин-регуляторів гуморальної імунної відповіді - макрофагів, синтез ними простагландинів групи Е, активує утворення фактора некрозу клітин in vitro, in vivo, підсилює цитотоксичну реакцію природних клітин-кілерів [Холодна, 2001]. КЗБА індукує синтез лейкоцитами високого ступеня антигенспецифічності імуномодулятора - фактора переносу імунної реактивності (ФП) - олігорибонуклеопептиду, пептидний ланцюг якого виконує функцію антигензв'язуючого рецептора. Це спонукало до його застосування у сучасній імунології для попередження та усунення патологічних станів організму, викликаних антигенами бактеріального походження [Любченко, 1999]. Проте, відкритим залишається питання щодо механізмів дії стафілококового клітинно-зв'язаного білка А - з одного боку, а з іншого - індукованого цим же антигеном імуноактивної субстанції лейкоцитів - фактора переносу імунної реактивності на пуринергічне, NO-ергічне, адренергічне гальмування та холінергічне збудження гладеньких м'язів кишечнику. Порушення механізмів регуляції скоротливої активності цих ГМ є причиною розладу та формування патологічних станів ШКТ. Так, відомо [Mizuta et al., 2000], що одним з наслідків пригнічення, наприклад, NO-залежного компонента неадренергічного гальмування в цих м'язах є виникнення колітів.

Для з'ясування загальних закономірностей та принципів, за якими здійснюється вплив ФП незалежно від його антигенспецифічності на гальмівні та збуджувальні ефекти нейромедіаторів в ГМ кишечнику, в даній роботі, крім вирішення сформульованої вище проблеми, особлива увага приділялась також питанню, пов'язаному з дією ФП імунної реактивності до анатоксинів таких вкрай небезпечних для життя людини бактерій, як Corynebacterium diphtheriaе та Clostridium tetani [Matteoli et al.,1996; Finkelstein et al., 2000;].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах наукових тем кафедри біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка: “ Дослідження та моделювання молекулярних і клітинних процесів у збудливих біологічних системах ” реєстраційний номер 0101 U 00 1967 (2001-2005р.р.); “ Дослідження та моделювання молекулярних і клітинних механізмів діяльності нервової системи, внутрішніх органів та рухового апарату організму людини і тварин в нормі та патології ”, реєстраційний номер 0106 U 005751 (2006-2012 р.р.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з'ясувати механізми дії клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока та фактора переносу імунної реактивності до цього антигену, а також дифтерійно-правцевого анатоксину (ДПА) на спонтанну та викликану дією нейромедіаторів збудження та гальмування електричну, скорочувальну активність гладеньких м'язів taenia coli. Відповідно до мети роботи були поставлені наступні завдання:

1. з'ясувати дію КЗБА, ФП до КЗБА, а також до дифтерійно-правцевого анатоксину на вихідний рівень мембранного потенціалу, базальний тонус, а також спонтанну електричну та скорочувальну активність гладеньких м'язів taenia coli;

2. з'ясувати дію цих імуноактивних субстанцій на зміни мембранного потенціалу та скорочення ГМ, викликані гіперкалієвим розчином Кребса, а також активацією М-холінорецепторів мембрани ГМК;

3. виявити особливості екзогенної дії нейромедіаторів гальмування на гладенькі м'язи за умов присутності КЗБА, ФП до КЗБА та дифтерійно-правцевого анатоксину;

4. з'ясувати дію КЗБА на активовані агоністом нікотинових холінорецепторів нікотином механізми вивільнення нейромедіаторів гальмування з інтрамурального нервового сплетення гладеньких м'язів;

5. з'ясувати дію досліджуваних імуноактивних субстанцій на скорочення ГМ, зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію в суспензії ізольованих ГМК taenia coli, викликані дією кофеїну та ацетилхоліну (або карбахоліну);

6. встановити залежність змін АТФ-азної (Мg²⁺,Ca²⁺-; Мg²⁺-; Мg²⁺-(за присутності ЕГТА) активності актоміозину (АМ) гладеньких м'язів від концентрації КЗБА.

Об'єкт досліджень: механізми регуляції збудження та гальмування гладеньких м'язів шлункового-кишкового тракту.

Предмет досліджень: модуляція імуноактивними субстанціями холінергічного збудження, пуринергічного, NO-ергічного, адренергічного гальмування, АТФ-азної активності актоміозину гладеньких м'язів.

Методи досліджень: відведення електричної активності гладеньком'язових смужок (модифікований одинарний “сахарозний місток”); тензометрія; виділення актоміозину з гладеньких м'язів; визначення АТФ-азної активності АМ; виділення ізольованих гладеньком'язових клітин та флуоресцентний метод визначення цитозольної концентрації іонів кальцію в ГМК.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі містяться нові дані про вплив КЗБА золотистого стафілокока та фактора переносу імунної реактивності до цього антигену, а також дифтерійно-правцевого анатоксину на гальмівні та збуджувальні ефекти нейромедіаторів в ГМ taenia coli.

Вперше в дослідах на ізольованих гладеньком'язових смужках (ГМС) taenia coli виявлено модулюючу дію КЗБА золотистого стафілокока на активоване агоністом нікотинових холінорецепторів нікотином вивільнення нейромедіаторів гальмування нейронами інтрамурального нервового сплетення.

Вперше показано, що збудження ГМК, викликане активацією мускаринових холінорецепторів ацетилхоліном посилюється КЗБА. З'ясовано, що ця субстанція посилює, а з часом пригнічує пуринергічне гальмування, а також усуває гальмівну дію екзогенного NO на гладенькі м'язи кишечнику.

Вперше встановлено, що не дивлячись на пригнічення КЗБА гіперполяризації, викликаної нітропрусидом натрію (НПН), аденозинтрифосфат (АТФ), аплікований на її фоні, спричиняє деполяризацію мембрани ГМК.

На суспензії ізольованих ГМК t.coli вперше встановлено, що КЗБА збільшує рівень внутрішньоклітинної концентрації Са²⁺, що вивільнюються з інозитолтрифосфат- та ріанодинчутливого депо саркоплазматичного ретикулуму (СР) у відповідь на дію карбахоліну та кофеїну, відповідно.

Вперше у дослідах виявлено, що ФП до ДПА модулює спонтанну електричну та скорочувальну активність ГМ. За присутності блокатора гуанілатциклази - метиленового синього, ця субстанція викликає тимчасове підвищення м'язового тонусу ГМ, яке переходить у їх розслаблення нижче базального рівня.

Показано вперше, що дія ФП до ДПА на пуринергічне гальмування в цих м'язах супроводжується значним посиленням їх післягальмівного збудження. У міру пригнічення субстанцією NO-залежного гальмування ГМ, відновлюється збуджувальна дія ацетилхоліну, аплікованого на фоні нітропрусиду натрію. За умов преактивації ацетилхоліном мускаринових холінорецепторів гладеньких м'язів, АТФ - індуковане гальмування за присутності ФП до ДПА трансформується у збудження.

Вперше встановлено, що ФП до ДПА трансформує гіперполяризуючу дію норадреналіну на гладеньком'язові клітини у їх деполяризацію. З'ясовано, що фактор переносу імунної реактивності до клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока модулює К⁺-індуковану деполяризацію та відповідно фазний компонент скорочення гладеньких м'язів, пригнічує гіперполяризацію мембрани ГМК, зумовлену екзогенною дією АТФ. Гіперполяризація гладеньком'язових клітин, викликана норадреналіном на фоні ацетилхолінової їх деполяризації, не змінюється при дії КЗБА та ФП до КЗБА.

КЗБА в концентраціях: 10^-6, 10^-5 мг/мл збільшує АТФ-азну (Мg²⁺,Ca²⁺-; Мg²⁺-; Мg²⁺-(за присутності ЕГТА); Mg²⁺,Ca²⁺-ву (при концентрації КЗБА 10^-4 мг/мл) активність актоміозину з гладеньких м'язів шлунку, не змінюючи її при дії цієї субстанції у більших високих концентраціях.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлена властивість КЗБА спричиняти значне посилення дії збуджувальних та пригнічення дії гальмівних нейромедіаторів в гладеньких м'язах кишечнику, може скласти основу для розробки методів адекватної фармакологічної корекції дисфункцій моторики шлунково-кишкового тракту, викликаних його інфікуванням бактеріями золотистого стафілокока.

Встановлену в роботі здатність фактора переносу імунної реактивності до анатоксинів високопатогенних бактерій: Corynebacterium diphtheriae та Clostridium tetani, а також КЗБА St. aureus змінювати як екзогенні, так і ендогенні механізми агоніст-індукованої сигналізації в ГМ кишечнику, бажано враховувати в імунології при формуванні за участі цих субстанцій лейкоцитів антигенспецифічного імунітету, а також біофізиці, фізіології при формуванні уявлень про роль у регуляції функціональної активності гладеньких м'язів кишечнику, індукованих антигенами імуноактивних субстанцій клітин лімфатичної тканини його стінки.

Результати дисертаційного дослідження можуть бути залучені при читанні курсів лекцій: "Біофізика міжклітинних комунікацій", "Біофізика м'язового скорочення", "Електробіофізика", "Загальна імунологія" у Вищих учбових закладах.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено збір та аналіз наукової літератури за темою дисертаційної роботи, експериментальні дослідження із застосуванням методів: відведення електричних потенціалів гладеньких м'язів методом модифікованого одинарного “ сахарозного містка ”, реєстрації їх тензометричних характеристик, a також одержання суспензії ізольованих гладеньком'язових клітин, виділення скоротливих білків з ГМ та визначення їх АТФ-азної активності; статистичний аналіз одержаних результатів та їх узагальнення. Розробку концепції роботи, планування експериментів, обговорення та формування висновків було проведено за участі наукового керівника та співавторів публікацій: акад. НАН України, проф.М.Ф.Шуби, к.б.н., ст.н.с. І.Б.Філіппова (Інститут фізіології НАН України ім.О.О.Богомольця); д.б.н., проф. Л.С.Холодної (одержання на кафедрі мікробіології та загальної імунології ННЦ “Інститут біології” (біологічний факультет) Київського національного університету імені Тараса Шевченка імуноактивних субстанцій, які люб'язно було надано автору дисертації для досліджень); к.б.н. О.Ю.Артеменко - методичне забезпечення спектрофлуориметричних вимірювань.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались та обговорювались на Міжнародній конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004); Х-ій Ювілейній міжнародній конференції “Інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне застосування” (Київ, 2004); 2-ій Інтернаціональній конференції “Нейрогуморальна і клітинна регуляція механізмів процесів травлення” (Київ, 2005); ХVII з'їзді Українського фізіологічного товариства (Чернівці, 2006); Міжнародній конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем” (Львів, 2006); ХІІІ з'їзді Українського фізіологічного товариства (Одеса, 2010); на спільному засіданні кафедри біофізики, кафедри фізіології людини і тварин (біологічний факультет) та відділу біофізики Інституту фізіології імені академіка Петра Богача Навчально-наукового центру `Інститут біології' Київського національного університету імені Тараса Шевченка (2010).

Публікації. За матеріалами дисертації у наукових виданнях опубліковано 14 робіт: 6 статей у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України; 8 тез доповідей у збірках матеріалів та тез наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнень результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел з 256 найменувань. Робота викладена на 174 сторінках, ілюстрована 32 рисунками та містить 2 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Досліди проводи на ізольованих препаратах повздовжніх ГМ сліпої кишки (taenia coli) морських свинок вагою 250-300 г незалежно від статі. Відведення спонтанної електричної активності, викликаних екзогенною аплікацією нейромедіаторів збудження та гальмування електричних потенціалів гладеньком'язових смужок, їх зміни під дією КЗБА золотистого стафілокока та ФП імунної реактивності, індукованих КЗБА та дифтерійно-правцевим анатоксином проводили за допомогою методу модифікованого одинарного “сахарозного містка” [Артеменко зі співавт.,1982]. Хлоровані срібні електроди з'єднували з розчинами в камері через містки, заповнені агаром на розчині КCl (2 моль/л). Один з електродів поміщали в ділянку камери, заповнену ізотонічним розчином КCl, а інший - в тест-ділянку. Електричну активність ГМС, що відводилась, подавали на вхідні ланцюги попереднього підсилювача, вихід якого з'єднували з одним з каналів автоматичного самозаписуючого пристрою Н-3021-3. Реєстрацію скорочення ГМС проводили в ізометричному режимі за допомогою електромеханічного перетворювача МХ-1С, включеного за мостовою схемою. Електричні сигнали з МХ-1С подавали на другий канал самозаписуючого пристрою. У дослідах використовували нормальний розчин Кребса (НРК) з концентрацією складових (в ммоль/л): NaCl-120,4; KCl-5,9; NaHCO₃- 15,5; NaH₂PO₄ - 1,2; MgCl₂ - 1,2; СаСl₂ - 2,5; глюкоза - 11,2; (рН 7,4). Номінально безкальцієвий розчин Кребса (НБР) готували шляхом заміни СаCl₂ на еквімолярну кількість NaCl. Гіперкалієвий розчин з концентрацією К⁺ (80ммоль/л) готували шляхом заміни у вихідному розчині Кребса необхідної частини іонів натрію на еквімолярну кількість К⁺. Ізотонічний розчин сахарози (318ммоль/л) готували шляхом розчинення хімічно чистої сахарози в деіонізованій воді. Враховуючи, що АТФ-азна активність актоміозину з ГМ кишечнику [Данілова,1978] та шлунку (власні дані) є величинами одного порядку, а також те, що taenia coli, на якій проводились дослідження, є досить малим об'єктом, виділення та очищення натурального актоміозину проводили з ГМ шлунку свині за методиками Данілової,1978; Бабійчука,1997. Нативність АМ тестували методом аналітичного електрофорезу в поліакриламідному гелі, що містив додецилсульфат натрію. Концентрацію білку визначали за біуретовою реакцією, АТФ-азну активність - за кількістю неорганічного фосфату, відщепленого активними центрами міозинових молекул АМ від АТФ [Fiske, Subbarow, 1925]. Mg²⁺,Ca²⁺-АТФ-азну активність АМ визначали в інкубаційній суміші з концентрацією складових (в ммоль/л): імідазол - 20 (рН 7,5); КСl - 0,08; MgCl₂ - 2,5; СаСl₂ - 0,1; АТФ -1. Інкубаційна суміш для визначення Mg²⁺-АТФ-азної активності актоміозину містила (в ммоль/л): імідазол - 20 (рН 7,5); КСl - 0,08; MgCl₂-2,5; АТФ - 1. Досліджували також Мg²⁺-АТФ-азну активність АМ за присутності ЕГТА в інкубаційній суміші з концентрацією складових (в ммоль/л): імідазол - 20 (рН 7,5); КСl - 0,08; MgCl₂- 2,5; ЕГТА - 1; АТФ-1. Тривалість інкубації становила 5хв, температура - 37^оС. КЗБА вносили в середовище інкубації за 25хв до початку ініціації АТФ-азної реакції. АТФ-азну реакцію зупиняли додаванням до проби трихлороцтової кислоти (2,5%). Для одержання суспензії ізольованих ГМК з taenia coli використовували метод ферментативно-механічної ізоляції [Зима,1996]. Смужки гладеньких м'язів занурювали в безкальцієвий розчин з концентрацією складових (в ммоль/л): NaCl -135; KCl - 5,9; MgCl₂ - 1,2; глюкоза - 5; HEPES - 10 (pH 7,4) і витримували 10хв при 34^оС. Потім смужки переносили у свіжий розчин зазначеного вище складу, але з вмістом 0,2% колагенази (тип ХІ) і бичачого сироваткового альбуміну (БСА)(0,3%). Ферментативну обробку здійснювали при температурі 34^оС впродовж 30-40 хв. Оброблену таким чином тканину, відмивали від ферменту безкальцієвим розчином, після чого її нарізали на фрагменти, які багаторазово пропускали через пастерівську піпетку в номінально безкальцієвому розчині з вмістом БСА (0,1%). Функціональний стан ГМК перевіряли по скоротливій відповіді на аплікацію гіперкалієвого розчину (60 ммоль/л). Одержану суспензію ГМК навантажували індо-1/АМ до кінцевої концентрації 5 мкмоль/л впродовж 30хв при температурі 37^оС з повільним перемішуванням суспензії ГМК обертальним пристроєм, після чого їх тричі відмивали від зовнішнього індо-1/АМ центрифугуванням на центрифузі ОП-4 (225g). В роботі використовували двохвильовий флуоресцентний метод реєстрації кальцієвих сигналів в ГМК [Зима, 2005]. Збуджену флуоресценцію індо-1 (л_зб=350нм) в ГМК реєстрували в кюветі спектрофлуориметра СДЛ-2 при температурі 22^оС. Визначали зміни інтенсивності флуоресценції індо-1 у динаміці на двох довжинах хвиль: І₁ (л₁=410нм) та І₂ (л₂=495нм). З цих двох кінетичних кривих обчислювали двохвильовий флуоресцентний параметр R (R=І₁/І₂). Розрахунки концентрації вільних іонів кальцію в ГМК проводили на ЕОМ за допомогою програми WinMAXC v.1.70.

Одержані в роботі експериментальні дані за W тестом Шапіро-Вілка перевірено на відповідність нормальному розподілу. Результати статистичного аналізу представлені як середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного для певної кількості (n) вимірів. Розбіжності між групами числових параметрів (контрольними та дослідними вимірами) вважали вірогідними при р<0,05. Комп'ютерною версією методу статистичного аналізу з оцінкою величини t-розподілу Стьюдента було програмне забезпечення Origin 5.

Результати досліджень та їх обговорення

Гальмівні та збуджувальні ефекти нейромедіаторів в гладеньких м'язах taenia coli при дії клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока. В результаті проведених досліджень встановлено, що дія КЗБА (10^-5, 10^-4, 10^-3мг/мл) на гладенькі м'язи t.coli супроводжувалась дозозалежною деполяризацією мембрани ГМК відповідно: (10±0,5) мВ, n=12; (13,4±1) мВ, n=14; (15±1)мВ, n=12, рівень якої стабілізувався на 20-25-ту хв його аплікації, залишаючись постійним впродовж наступних 30-40хв спостережень. Ці зміни не виникали за умов попередньої атропінізації (10^-5моль/л) ГМС.

Роботами Shuba, Vladimirova, 1980, 1981; Shuba et al., 2003, Burnstock 2006 було показано, що в ГМ кишечнику нейромедіатором неадренергічного гальмування є АТФ. В наших дослідах (Рис.1), АТФ (10^-5моль/л) в контролі викликала гіперполяризацію (7±0,3)мВ, n=14 мембрани ГМК, яка з часом переходила у її післягальмівне збудження.

гладеньком'язовий клітина кальцій гіперкалієвий

Рис.1 Дія клітинно-зв'язаного білка А (КЗБА) (10^-4 мг/мл) на викликану АТФ (10^-5 моль/л) (А) та УТФ (10^-5 моль/л) (Б) гіперполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин taenia coli. 1 - контроль; 2,3 - на 5- та 25-ій хв дії КЗБА, відповідно; 4 - на 30-тій хв відмивання нормальним розчином Кребса. Пунктирною лінією позначено вихідний рівень мембранного потенціалу.

Встановлено, що КЗБА (10^-4 мг/мл) підсилював (12±0,6) мВ, n=14, p<0,05, а з часом пригнічував АТФ-викликане гальмування. АТФ є активатором, як іонотропних Р2Х-, так і метаботропних Р2Y-пуринорецепторів, тоді як уридинтрифосфат (УТФ) взаємодіє тільки з останніми [Nicholas,1996]. Встановлено, що КЗБА у зазначеній вище концентрації, у порівнянні з контролем ((10,8±0,6) мВ, n=14) більше, ніж у 2 рази (n=14) полегшував УТФ-викликане гальмування, яке з часом, як і у випадку з АТФ, пригнічувалось. Наведені результати вказують на те, що у посиленні та пригніченні субстанцією пуринергічного гальмування, задіяні механізми активації метаботропних Р2Y-пуринорецепторів ГМК. Крім пуринергічного, в ГМ кишечнику є ефективне NO-ергічне гальмування, яке здійснюється НАНХ-нейронами за участі нехолінергічного медіатора автономної нервової системи - оксиду азоту [Sanders,1992; Зима,1996]. Встановлено, що КЗБА (10^-5,10^-4 мг/мл) усував викликану нітропрусидом натрію гіперполяризацію мембрани ГМК. Відомо [Зима,1996], що результатом дії нітропрусиду натрію на ГМК t.coli є цГМФ-залежне зниження [Ca²⁺]_i та збільшення провідності ВК_Са каналів. В дослідах (Рис.2), АТФ, аплікована на фоні, викликаної НПН гіперполяризації мембрани ГМК спричиняла її не гіпер-, а деполяризацію (18±1) мВ, n=8, величина якої не змінювалась за присутності КЗБА (10^-5 моль/л), не дивлячись на пригнічення ним НПН-викликаної гіперполяризації. З'ясовано, що ця бактеріальна субстанція, аплікована на фоні, викликаної блокатором ВК_Са каналів тетраетиламонієм, деполяризації мембрани ГМК, не змінювала її рівень.

Рис.2 Дія АТФ (10^-5 моль/л) на викликану нітропрусидом натрію (НПН) (10^-4 моль/л) гіперполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин taenia coli (А); Б - за тих же умов, але за участі клітинно-зв'язаного білка А (25-та хв аплікації). Пунктирною лінією позначено вихідний рівень мембранного потенціалу.

Ефекти КЗБА на гальмівні процеси в ГМ t.coli, як показали дослідження, (Рис.3А,Б) пов'язані не тільки з його постсинаптичною дією, але й зі впливом на інтрамуральне нервове сплетення, вивільнення нейромедіаторів гальмування з якого активували екзогенним активатором нікотинових холінорецепторів - нікотином (10^-5 моль/л), який аплікували на тонічному компоненті скорочення ГМС, викликаного гістаміном. Розраховане усереднене значення параметра R (R= (A₁/A₂)?100%; де А₁,А₂ - величини розслаблення та скорочення ГМ, викликані нікотином та гістаміном, відповідно) на початку дії КЗБА, порівняно з контролем, збільшувалось, з часом зменшуючись. З метою виключення можливості спонтанного вивільнення NO з нервових закінчень та гальмівного його впливу на ГМК або на спонтанне вивільнення з нейронів збуджувальних нейромедіаторів [Sanders, Ward,1992], в дослідах блокування NO-синтаз здійснювали за допомогою N^щ-нітро-L-аргініну (10^-5 моль/л). За наявності N^щ-нітро-L-аргініну на початку дії КЗБА відбувалось не збільшення, а навпаки - зменшення нейрогенного розслаблюючого впливу нікотину на активовані гістаміном ГМ. Більш тривала аплікація субстанції призводила до посилення пригнічення розслаблюючої дії нікотину. Відсутність за умов дослідів повного пригнічення нікотинового розслаблення вказує на можливість посилення субстанцією не тільки NO-, але й АТФ-залежних процесів.

Рис.3 Дія клітинно-зв'язаного білка А (КЗБА) (10^-4 мг/мл) на викликане нікотином (10^-5 моль/л) розслаблення, активованої гістаміном (10^-5 моль/л) гладеньком'язової смужки taenia coli. А1 - контроль; А2,3 - на 5-, 25-тій хв дії КЗБА, відповідно. Пунктирною лінією позначено вихідний рівень м'язового тонусу ГМС. Крапками на кривих позначено розслаблення ГМС під дією нікотину. Б - усереднене значення параметра R (пояснення по тексту), в контролі (1); 3,5 - на 5- та 25-тій хв дії КЗБА; 2 - контроль; 4,6 - що і на 3, 5 за присутності N^щ-нітро-L-аргініну.

Дійсно, як було встановлено, на початку дії КЗБА (10^-4 мг/мл), майже, у 2 рази порівняно з контролем статистично достовірно збільшувалась величина викликаного АТФ (10^-5 моль/л) розслаблення ГМС, активованих гістаміном (10^-5 моль/л), тоді як розслаблення, викликане нітропрусидом натрію на цей час, пригнічувалось субстанцією. Пригнічення розслаблення гістамінового скорочення, індукованого, як АТФ, так і нітропрусидом натрію спостерігалось при більш тривалій дії КЗБА. Наведені результати дають підстави говорити про подвійну природу дії КЗБА на процеси гальмування в ГМ t. coli, зокрема, пуринергічного: на початковому етапі - з активацією процесів вивільнення з пуринергічних нейронів екзогенної АТФ або (та) з полегшенням проведення сигналу цього нейромедіатора від Р2Y - пуринорецепторів мембрани ГМК до ефектора. Тривала ж дія КЗБА супроводжується блокуванням обох зазначених вище процесів. Встановлено, що КЗБА (10^-6-10^-3мг/мл) підсилював збуджувальну дію агоніста М-холінорецепторів ацетилхоліну на ГМ t.coli. Так, при дії цієї субстанції в концентрації 10^-6 мг/мл порівняно з контролем (5±0,3)мН, n=11 збільшувався фазний компонент АХ скорочення (8,4±0,3) мН, n=11, p ? 0,05 (25-та хв аплікації КЗБА). При цьому, викликана ацетилхоліном деполяризація (10±0,6) мВ, n=11 ГМК залишалась без змін, не змінювалось також відношення тонічного компонента АХ скорочення до фазного. З'ясовано також, що не змінюючи величину К⁺ (80 ммоль/л)-індукованої деполяризації, КЗБА збільшував фазний компонент гіперкалієвої контрактури ГМС. Відомо [Murthy, Kuemmerle, 1995], що в повздовжніх гладеньких м'язах кишечнику формування фазного компоненту скорочення, викликаного АХ, пов'язане з вивільненням Са²⁺ з інозитолтрифосфат-чутливого депо СР. Дослідження спектрів флуоресценції індо-1 в суспензії ізольованих ГМК t. coli за інкубації в номінально безкальцієвому розчині Кребса у присутності карбахоліну (або кофеїну) показали здатність КЗБА підсилювати вивільнення Са²⁺ як з інозитолтрифосфат-, так і з ріанодин-чутливого депо СР, що може бути причиною його потенціюючого ефекту на фазний компонент ацетилхолінової та гіперкалієвої контрактури. Зазначені висновки підтверджено також в дослідах по вивченню дії КЗБА на викликані кофеїном та ацетилхоліном скорочення ГМС в номінально безкальцієвому розчині Кребса. Встановлено також (Табл.1), що в концентраціях: 10^-6,10^-5 мг/мл ця субстанція збільшувала АТФ-азну (Mg²⁺,Ca²⁺-; Mg²⁺-; Mg²⁺-(за присутності ЕГТА); Mg²⁺,Ca²⁺-ву (при концентрації КЗБА 10^-4 мг/мл) активність актоміозину з ГМ шлунку.

Табл.1

АТФ-азна активність актоміозину з гладеньких м'язів шлунку в контролі та при дії клітинно-зв'язаного білка А (КЗБА) золотистого стафілокока

Примітка: М - середнє арифметичне; m - стандартна похибка середнього арифметичного; * - р<0,05, n=20 (для кожної серії дослідів).

Не виявлено статистично достовірних у порівнянні з контролем змін Mg²⁺-; Mg²⁺-(за присутності ЕГТА) АТФ-азної активності АМ при дії КЗБА в концентраціях: 10^-4, 10^-3 мг/мл, а також Mg²⁺,Ca²⁺-вої при концентрації субстанції 10^-3 мг/мл.

Гальмівні та збуджувальні ефекти нейромедіаторів в гладеньких м'язах taenia coli при дії фактора переносу імунної реактивності, індукованого бактеріальними антигенами.

Фактор переносу імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину. Дослідження (Рис.4 А,Б,В) кумулятивної дії ФП до ДПА (10^-5-10^-3 мг/мл) показало, що ця субстанція (10^-5 мг/мл) збільшує тривалість повільних хвиль деполяризації, кількість ПД, які генеруються на їх плато, не змінюючи рівень мембранного потенціалу та м'язового тонусу ГМ. При цьому, порівняно з контролем, більше, ніж у 2 рази (n=10), зростала величина поодиноких спонтанних скорочень ГМС.

Рис.4 Кумулятивна дія фактора переносу імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину (ФП до ДПА) (А,Б,В) в концентраціях (10^-5, 10^-4, 10^-3 мг/мл) на спонтанну скорочувальну активність (1) та повільні хвилі деполяризації (2) гладеньком'язової смужки (ГМС) taenia coli. Г - спонтанна скорочувальна активність ГМС на фоні метиленового синього (МС) (10^-5 моль/л) (час попередньої аплікації 40 хв) та ФП до ДПА (10^-4 мг/мл); НПН - нітропрусид натрію. Пунктирними лініями позначено вихідний рівень м'язового тонусу та мембранного потенціалу, відповідно.

За присутності КЗБА (10^-4 мг/мл) поодинокі спонтанні скорочення ГМ трансформувались у стійке тонічне скорочення, а повільні хвилі деполяризації - у стійку деполяризацію, величина якої на 10-ту хв аплікації ФП становила (7±0,3)мВ, n=10. За дії ФП до ДПА у концентрації 10^-3 мг/мл, з'являлись флуктуації мембранного потенціалу; величина деполяризації на 10-ту хв дії субстанції становила (12±0,4) мВ, n=10. Досліджували також дію цієї субстанції на спонтанну скорочувальну активність препаратів за наявності блокатора гуанілатциклази - метиленового синього (10^-5 моль/л) (Рис.4Г). За цих умов підвищувався базальний рівень м'язового тонусу, підсилювались поодинокі спонтанні скорочення ГМС. Такі препарати не відповідали розслабленням на дію НПН (10^-5 моль/л). Внесення ФП до ДПА до розчину Кребса з вмістом метиленового синього супроводжувалось швидким скороченням м'язових препаратів, яке переходило у тривале їх розслаблення до рівня нижче базального. Наведені результати вказують на те, що, вірогідно, у підсиленні ФП спонтанних скорочень ГМ, які з часом переходять у тонічне скорочення, задіяні механізми активації пейсмекерної активності та ГЦ/цГМФ - залежних процесів регуляції іонних провідностей мембрани та внутрішньоклітинної концентрації Са²⁺. Досліджували (Рис.5) також вплив ФП до ДПА на гальмування, викликане активацією пуринорецепторів ГМК. В контролі, АТФ (10^-5 моль/л) викликала короткотривалу гіперполяризацію ((7±0,4) мВ, n=10), яка переходила у післягальмівне збудження ((10±0,6) мВ, n=10). Встановлено, що ФП до ДПА (10^-4 мг/мл) на 20-ту хв аплікації не викликав статистично достовірних змін АТФ-індукованої гіперполяризації ГМК, але порівняно з контролем, більше, ніж у 4 рази (р<0,05) збільшував їх післягальмівну деполяризацію (Рис.5).

Рис.5 Дія фактора переносу (ФП) імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину (10^-4 мг/мл) на гіперполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин taenia coli, викликану АТФ (А) та УТФ (Б), 1 - контроль; 2- за присутності ФП (20-та хв аплікації). Пунктирною лінією позначено вихідний рівень мембранного потенціалу.

З'ясовано, що, майже, у 3 рази ((37±2) мВ, n=10, p<0,05) порівняно з контролем ((12±0,6)мВ, n=10) збільшувалась при дії ФП до ДПА післягальмівна деполяризація ГМК, викликана УТФ (10^-5 моль/л), що, як і у випадку з АТФ, з урахуванням даних Ralevic, Burnstock (1998), вірогідно, пов'язане з впливом цієї субстанції на АТФ (УТФ)-залежні механізми вивільнення з інтрамурального нервового сплетення ГМС нейромедіаторів збудження.

Встановлено, що за умов преактивації ГМС ацетилхоліном (10^-5 моль/л), АТФ (10^-5 моль/л)-викликане розслаблення, пов'язане, як відомо [Филиппов,2010], з активацією ІР₃-залежного шляху вивільнення Са²⁺ з внутрішньоклітинних запасників, трансформувалось фактором перносу до ДПА (10^-4мг/мл) у скорочення. Дослідження дії цієї субстанції (10^-6-10^-4 мг/мл) на АХ (10^-5моль/л) скорочення м'язових препаратів в номінально безкальцієвому розчині показало чіткий її пригнічувальний характер. Враховуючи [Зима,1999; Bolton et al., 1999; Zholos et al., 2004], що спільними ключовими ланками сигнальних каскадів NO-викликаного розслаблення та холінергічного збудження в ГМ кишечнику є механізми: відповідно пригнічення (активації) Са²⁺ каналів L-типу та пригнічення (мобілізації) цих катіонів з саркоплазматичного ретикулума, досліджували дію ФП до ДПА (10^-6-10^-4 мг/мл) на модульоване ацетилхоліном (5·10^-5 моль/л) НПН-викликане розслаблення. Встановлено, що ФП до ДПА дозозалежно пригнічує гальмування, викликане нітропрусидом натрію, відновлюючи збуджувальну дію ацетилхоліну. Дослідження дії цієї субстанції на гальмування ГМ, яке пов'язане з активацією адренорецепторів, показало, що ця субстанція усуває викликану норадреналіном (10^-5моль/л) гіперполяризацію мембрани ГМК, трансформуючи її у деполяризацію, на плато якої генерувались потенціали дії (Рис.6).

Рис.6 Вплив фактора переносу (ФП) імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину (10^-5 мг/мл) на гіперполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин taenia coli, викликану дією норадреналіну (10^-5 моль/л) на фоні ацетилхолінової (10^-5 моль/л) її деполяризації. Пунктирною лінією позначено вихідний рівень мембранного потенціалу.

Фактор переносу імунної реактивності до клітинно-зв'язаного білка А.

Встановлено, що фактор переносу до КЗБА (10^-5 мг/мл) викликав тимчасову деполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин, яка з часом переходила у її гіперполяризацію, величина якої зростала зі збільшенням концентрації субстанції. Ці зміни супроводжувались зниженням базального тонусу. З'ясовано, що фактор переносу до КЗБА (10^-5 мг/мл) на 20-ту хв аплікації порівняно з контролем ((12,5±0,7) мВ, n=10) збільшував К⁺-індуковану деполяризацію ГМК, величина якої становила (20±0,8) мВ, n=10, р ? 0,05. Порівняно з контролем ((6,8±0,4) мН, n=10) на вказаний час відбувалось також підсилення фазного компонента гіперкалієвої контрактури ГМ, величина якої становила (12,5±0,7) мН, n=10, p ? 0,05. Не виявлено статистично достовірних змін як К⁺-індукованої деполяризації, так і відповідно скорочення гладеньких м'язів за дії ФП до КЗБА в концентрації 10^-4 мг/мл. З'ясовано, що на фоні гіперполяризації мембрани ГМК, викликаної цією субстанцією відбувалось зменшення, а зі збільшенням її концентрації з 10^-5 до 10^-4 мг/мл - пригнічення АТФ-індукованої гіперполяризації. Встановлено, що механізми адренергічного гальмування в гладеньких м'язах taenia coli нечутливі до дії цього фактора переносу.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що клітинно-зв'язаний білок А золотистого стафілокока дозозалежно деполяризує мембрану гладеньком'язових клітин taenia coli. Ці зміни не виникають за присутності атропіну. Клітинно-зв'язаний білок А підсилює, а з часом - пригнічує гальмівну дію агоністів: іонотропних Р2Х- та метаботропних Р2Y-пуринорецепторів - АТФ, а також метаботропних Р2Y-пуринорецепторів -УТФ на гладенькі м'язи, усуває гіперполяризуючу дію нітропрусиду натрію. Деполяризація мембрани гладеньком'язових клітин, викликана тетраетиламоніем, АТФ - на фоні гіперполяризації, зумовленої нітропрусидом натрію, нечутлива до дії цієї субстанції.

2. N^щ-нітро-L-аргінін пригнічує потенціюючу дію клітинно-зв'язаного білка А на нікотин-індуковане розслаблення, активованих гістаміном гладеньких м'язів, яка з часом переходить у гальмуючу. Ця бактеріальна субстанція пригнічує гальмівну дію АТФ (або нітропрусиду натрію) на гістамінове скорочення гладеньких м'язів, але підсилює їх холінергічне збудження.

3. В номінально безкальцієвому розчині Кребса клітинно-зв'язаний білок А підсилює, викликані кофеїном та карбахоліном зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію в ізольованих гладеньком'язових клітинах taenia coli. В концентраціях: 10^-6,10^-5мг/мл клітинно-зв'язаний білок А збільшує АТФ-азну (Mg²⁺, Ca²⁺-; Mg²⁺-; Mg²⁺- (за присутності ЕГТА), Мg²⁺, Ca²⁺-ву при концентрації клітинно-зв'язаного білка А (10^-4 мг/мл) активність актоміозину з гладеньких м'язів шлунку, не змінюючи її при дії цієї субстанції у більш високих концентраціях.

4. Фактор переносу імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину модулює повільні хвилі деполяризації, спонтанну скорочувальну активність гладеньких м'язів taenia colі. За присутності блокатора гуанілатциклази - метиленового синього, ця субстанція викликає тимчасове підвищення м'язового тонусу гладеньких м'язів, яке переходить у їх розслаблення нижче базального рівня.

5. Фактор переносу імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину підсилює викликану АТФ та УТФ післягальмівну деполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин. За умов преактивації ацетилхоліном мускаринових холінорецепторів гладеньких м'язів, АТФ-індуковане їх розслаблення за присутності фактора переносу до дифтерійно-правцевого анатоксину трансформується у збудження. Ця субстанція усуває гальмівну дію на гладенькі м'язи нітропрусиду натрію та норадреналіну; в номінально безкальцієвому розчині збільшує кофеїн-викликані, але пригнічує ацетилхолінові скорочення.

6. Фактор переносу імунної реактивності до клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока змінює рівень мембранного потенціалу гладеньких м'язів taenia coli. В концентрації 10^-5 мг/мл потенціює, не змінюючи при більших, викликану гіперкалієвим розчином деполяризацію мембрани гладеньком'язових клітин та відповідно фазний компонент гіперкалієвої контрактури, пригнічує пуринергічне гальмування. Механізми адренергічного гальмування нечутливі до дії клітинно-зв'язаного білка А, а також фактора переносу імунної реактивності до цього антигену.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Меленевська Н.В. Модуляція механізмів молекулярної сигналізації у збудливих клітинах токсинами та бактеріальними субстанціями / Н.В.Меленевська, М.С.Мірошниченко, М.Ф.Шуба // Український біохімічний журнал. - 2005. - Т.77, №3. - с.27-34. (Здобувач - підбір, упорядкування даних літературних джерел за темою оглядової статті, їх узагальнення, опис, підготовка статті до друку).

2. Меленевська Н.В. Дія клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока на гальмівні ефекти аденозинтрифосфату та оксиду азоту в гладеньких м'язах / Н.В. Меленевська, М.С.Мірошниченко, І.Б.Філіппов, Л.С.Холодна, М.Ф. Шуба // Фізіологічний журнал. - 2006. - Т.52,№1. - С.22-29. (Здобувач - опрацювання літератури, проведення експериментів та статистичний аналіз масивів одержаних даних, узагальнення, підготовка статті до друку).

3. Меленевська Н.В. Дія клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока на рівень внутрішньоклітинних іонів кальцію та АТФ-азну активність актоміозину гладеньких м'язів / Н.В.Меленевська, М.С.Мірошниченко, І.Б.Філіппов, О.Ю.Артеменко, М.Ф.Шуба // Український біохімічний журнал. - 2006. - Т.78, №1. - С.107-116. (Здобувач - опрацювання літератури, виділення ізольованих гладеньком'язових клітин, виділення та очистка актоміозину з гладеньких м'язів, визначення його АТФ-азної активності, одержання методом модифікованого одинарного “ сахарозного містка ” масивів експериментальних даних та їх статистичний аналіз, узагальнення, підготовка статті до друку).

4. Шуба М.Ф. Молекулярні механізми рецептор-залежної сигналізації у клітинах повздовжніх та кільцевих гладеньких м'язів кишечнику/ М.Ф.Шуба, Н.В.Меленевська, І.Б.Філіппов, М.С. Мірошниченко // Український біохімічний журнал. - 2006. - Т.78, №6. - С.15-21. (Здобувач - опрацювання літератури за рубриками: «Ефекторні ензими та вивільнення кальцію з інозитол-1,4,5-трифосфатчутливого пулу СР м'язових клітин», «Роль арахідонової кислоти в розвитку фазного компонента скорочення ГМ», узагальнення, підготовка статті до друку).

5. Меленевська Н.В. Фактор переносу імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину модулює дію нейромедіаторів на гладенькі м'язи кишечника/ Н.В. Меленевська, М.С. Мірошниченко, І.Б. Філіппов, Л.С. Холодна, М.Ф. Шуба // Фізіологічний журнал. - 2007. - т.53, №1. - С.24-32. (Здобувач - опрацювання літератури, проведення експериментів та статистичний аналіз масивів одержаних даних, узагальнення, підготовка статті до друку).

6. Меленевська Н.В. Фактор переносу імунної реактивності до клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока. Дія на електро-механічні властивості гладеньких м'язів товстого кишечника/ Н.В. Меленевська, М.С. Мірошниченко, Л.С. Холодна // Фізика живого. - 2008. - т.16, №2 - С.99-104. ( Здобувач - опрацювання літератури, проведення експериментів, статистичний аналіз масивів одержаних даних, узагальнення, підготовка статті до друку).

7. Меленевська Н.В. Імуноактивна субстанція золотистого стафілокока - клітинно-зв'язаний білок А у гладеньких м'язах кишечнику змінює гіперполяризуючі ефекти нейромедіаторів гальмування/ Н.В.Меленевська, М.С.Мірошниченко, М.Ф. Шуба// Матеріали Міжнародної конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”. - Львів. - 2004. -С.52.

8. Melenevska N.V. The action of Staphylococcus aureus cell-bound protein A on actomyosin ATP-ase activity in swine gastric smooth muscles / N.V.Melenevska, M.S.Miroshnichenko, L.S.Kholodna // Х Ювілейна Міжнародна конференція “Інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне застосування ”. - Київ. - 2004. - С.56-57.

9. Меленевська Н.В. Карбахолін, кофеїн-викликані скорочення та Са²⁺ сигнали гладеньком'язових клітин taenia coli. Модуляція клітинно-зв'язаним білком А золотистого стафілокока / Н.В.Меленевська, М.С.Мірошниченко, О.Ю.Артеменко, М.Ф.Шуба // Матеріали Міжнародної конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”. - Львів. - 2004.- С.51.

10. Melenevska N.V. Antigenic substance of Staphylococcus aureus modulates endogenous neurotransmitters released from neurons of intramural nervous interlacement in smooth muscles/ N.V.Melenevska, M.S.Miroshnichenko, I.B.Phylippov, M.F.Shuba// 2-nd International conference “Neuronal-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestions processes”. - Kyiv. - 2005. - Р.10.

11. Меленевська Н.В. Дія імуноактивної субстанції клітинно-зв'язаного білка А золотистого стафілокока на збудження та гальмування в гладеньких м'язах/ Н.В.Меленевська, М.С.Мірошниченко, І.Б.Філіппов, Л.С.Холодна, М.Ф Шуба// Матеріали ХVII з'їзду Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю. - Чернівці. - Фізіологічний журнал - 2006. - Т.52, №2. - С.14.

12. Меленевська Н.В. Влив фактора переносу імунної реактивності до анатоксинів Cor. diphtheriae, Cl. tetani та антигенної субстанції St.aureus на електрогенез та скорочення гладеньких м'язів/ Н.В. Меленевська, М.С. Мірошниченко, І.Б. Філіппов, Л.С. Холодна, М.Ф. Шуба // Матеріали Міжнародної наукової конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, приуроченої до 60-річчя новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету імені Івана Франка - Львів. - 2006. - С.101-102.

13. Melenevska N.V. Bacterial and antigen-specific substances action on membrane and cell mechanisms of agonist-induced activation and inhibition in smooth muscle cells / N.V. Melenevska, M.S. Miroshnichenko, I.B. Phylippov // 5^th International Symposium on Cell / Tissue Injury and Cytoprotection/Organoprotection. - Yalta. - Фізіологічний журнал. - 2009. - Т.55, №1. - С.91.

14. Меленевська Н.В. Модуляція клітинно-зв'язаним білком А золотистого стафілокока та фактором переносу до бактеріальних антигенів електричної, скорочувальної активності гладеньких м'язів кишечника / Н.В. Меленевська, М.С. Мірошниченко, І.Б. Філіппов, Л.С. Холодна // Матеріали ХVІІI з'їзду Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю. - Одеса. - Фізіологічний журнал. - 2010. - Т. 56,№2. - С.151-152.

АНОТАЦІЯ

Меленевська Н.В. Збудження - гальмування гладеньких м'язів кишечника при дії клітинно-зв'язаного білка А стафілокока та фактора переносу імунної реактивності до бактеріальних антигенів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2011.

Встановлено, що клітинно-зв'язаний білок А (КЗБА) St.aureus деполяризує мембрану гладеньком'язових клітин (ГМК) taenia coli. КЗБА усуває гіперполяризуючу дію нітропрусиду натрію, підсилює, а з часом - пригнічує гіперполяризацію, викликану АТФ та УТФ. N^щ-нітро-L-аргінін пригнічує потенціюючу дію КЗБА на нікотин-зумовлене розслаблення, активованих гістаміном гладеньких м'язів. КЗБА пригнічує гальмівну дію АТФ та нітропрусиду натрію на гістамінове скорочення гладеньких м'язів (ГМ), підсилює їх холінергічне збудження. Не змінюючи К⁺-індуковану деполяризацію, КЗБА збільшує гіперкалієву контрактуру гладеньком'язових смужок. КЗБА змінює АТФ-азну активність актоміозину ГМ. Встановлено, що фактор переносу (ФП) імунної реактивності до дифтерійно-правцевого анатоксину (ДПА) модулює спонтанну електричну та скорочувальну активність ГМ. Ця субстанція підсилює зумовлену АТФ або УТФ післягальмівну деполяризацію ГМК. За умов преактивації гладеньких м'язів ацетилхоліном, АТФ за присутності ФП до ДПА викликає їх збудження. У міру пригнічення субстанцією розслаблення, зумовленого нітропрусидом натрію, відновлюється скорочення ГМ, викликане ацетилхоліном на фоні дії цієї речовини. Показано, що ФП до дифтерійно-правцевого анатоксину трансформує гіперполяризуючу дію норадреналіну на ГМК у деполяризуючу, підсилює індуковане кофеїном та пригнічує скорочення, викликане ацетилхоліном в номінально безкальцієвому розчині Кребса. ФП до КЗБА в малих концентраціях потенціює, не змінюючи при більших К⁺-індуковану деполяризацію ГМК, пригнічує пуринергічне гальмування.

Ключові слова: taenia coli, гладеньком'язові клітини, нейромедіатори, електричний потенціал, скорочення-розслаблення, актоміозин, індо-1, клітинно-зв'язаний білок А, фактор переносу, дифтерійно-правцевий анатоксин.

Меленевская Н.В. Возбуждение-торможение гладких мышц кишечника при действии клеточно-связанного белка А стафилококка и фактора переноса имунной реактивности к бактериальным антигенам. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2011.

Диссертация посвящена исследованию действия клеточно-связанного белка А (КСБА) золотистого стафилококка и фактора переноса иммунной реактивности к бактериальным антигенам на тормозные и возбуждающие эффекты нейромедиаторов в гладких мышцах (ГМ) taenia coli. Установлено, что клеточно-связанный белок А дозозависимо деполяризует гладкомышечные клетки кишечника. Эти изменения не возникали в присутствии атропина. Гиперполяризация гладких мышц, вызванная нитропруссидом натрия, не возникала при действии этой субстанции. КСБА усиливал, а со временем - угнетал гиперполяризацию, вызванную экзогенной АТФ или УТФ. Деполяризация гладкомышечных клеток, вызванная тетраэтиламмонием, АТФ на фоне гиперполяризации, обусловленной нитропруссидом натрия, нечувствительны к действию этой субстанции. Потенциирующее действие клеточно-связанного белка А на никотин-вызванное расслабление, активированных гистамином ГМ переходило в тормозящее. N^щ-нитро-L-аргинин угнетал, указанный выше потенцирующий эффект этой субстанции. КСБА угнетал действие АТФ (или нитропруссида натрия) на гистаминовое сокращение ГМ, но усиливал их холинергическое возбуждение. Не изменяя К⁺-индуцированную деполяризацию, КСБА усиливает гиперкалиевую котрактуру ГМ. При действии этой субстанции увеличивается сокращение гладких мышц, вызванное кофеином (или ацетилхолином) в номинально безкальциевом растворе Кребса. Установлено, что фактор переноса (ФП) иммунной реактивности к дифтерийно-столбнячному анатоксину модулирует спонтанную электрическую, сократительную активность ГМ; в присутствии метиленового синего вызывает кратковременное повышение мышечного тонуса, которое переходит в их расслабление ниже базального уровня. ФП к ДСА усиливает послетормозную деполяризацию ГМ, вызванную АТФ (УТФ). В условиях преактивации ГМ ацетилхолином, АТФ в присутствии ФП к ДСА оказывает возбуждающее действие. По мере угнетения субстанцией расслабления, вызванного нитропруссидом натрия, восстанавливается сокращение ГМ, вызванное ацетилхолином на фоне действия этого вещества. ФП к ДCА трансформирует гиперполяризирующее действие норадреналина на ГМК в их деполяризацию, усиливает, вызванное кофеином, но угнетает ацетилхолиновое сокращение ГМ в номинально безкальциевом растворе Кребса. Установлено, что ФП к КСБА в малых концентрациях потенциирует, не изменяя в больших, К⁺-индуцированную деполяризацию, угнетает пуринергическое торможение в гладких мышцах. Механизмы адренергического торможения в гладких мышцах нечувствительны к действию КСБА, а также фактора переноса иммунной реактивности к этому антигену.