Участь периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу в регуляції шлункової секреції у щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.112.384+612.817+612.821.8+612.323+612.811.3

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Участь периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу в регуляції шлункової секреції у щурів

03.00.13. -- фізіологія людини і тварин

Головинська Юлія Юріївна

Київ -- 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Навчально-науковому центрі (ННЦ) «Інститут біології» (біологічний факультет) Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Берегова Тетяна Володимирівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач Науково-дослідної лабораторії «Фармакологія і експериментальна патологія» Відділення біологічних і біомедичних технологій ННЦ «Інститут біології».

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Нурищенко Наталія Євгенівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділу «Біофізика» Науково-дослідного інституту фізіології імені академіка Петра Богача ННЦ «Інститут біології»;

доктор медичних наук, професор Скляров Олександр Якович, Львівський медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри біологічної хімії.

Захист відбудеться «21» вересня 2011 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. Глушкова, 2, ННЦ «Інститут біології», ауд. 215).

Поштова адреса: 01601 Київ, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий «10» серпня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Ентеральна нервова система є єдиним відділом периферичної нервової системи, якій притаманна рефлекторна активність. Така активність вимагає наявності великої кількості нервових зв'язків, що вміщують головні аферентні нейрони та інтернейрони, збуджуючі і гальмівні моторні нейрони, що іннервують гладенькі м'язи та залози шлунково-кишкового тракту (ШКТ). Багато різних класів нейротрансміттерів знайдено в нервовій системі ШКТ, більшість з яких представлені також і в центральній нервовій системі (ЦНС) [Furness J.B., 2006].

Глутамат - головний збуджуючий нейротрансміттер у мозку [Tsai et al.,1999, 2004.; Okubo Y, Iino M., 2011], проте не так давно він був знайдений і в нервовій системі ШКТ [Hayashi M., 2003]. В ентеральних нейронах ШКТ знайдена мРНК NMDA (N-метил-D-аспартат)-підтипу глутаматних рецепторів [Burns G.A., 1995]. Фармакологічні дослідження показали, що у регуляції моторної та секреторної функції травного тракту беруть участь іонотропні глутаматні рецептори двох підтипів: каїнатні та NMDA-рецептори [Sivarao DV, Krowicki ZK., 1999.; Tsuchiya S, Horie S., 2001]. Також ряд дослідників імуногістохімічним методом довели наявність NMDA-рецепторів в підслизовому та міжм'язевому сплетінні [Burns G.A., 1995; Liu M.T., 1997; Tsai L.H., 1994]. Проте їх функція в ентеральній нервовій системі ШКТ та їх роль у регуляції секреторної функції шлунку вивчені дуже слабо. Пов'язано це з тим, що відкриті вони в ентеральній нервовій системі були недавно.

Усі роботи, присвячені вивченню ролі глутаматних рецепторів в регуляції шлункової секреції кислоти (ШСК), можна умовно поділити на дві групи. Перша група робіт - це дослідження, в яких вивчали вплив агоністів та антагоністів на ШСК при їх введені в ЦНС [Tache Y., 1993; Yang H., 1993; Kaneko H., 1995; Kaneko H., 1998; Tsuchiya S., 2001; Garcia-Zaragoza E., 2000; Garcia-Zaragoza E., 2003; Кочетков А.М., 1992]. Друга група робіт об'єднує дослідження, проведені in vitro на препаратах ізольованого шлунка, тобто в умовах відсутності впливів з ЦНС, або in vivo на цілісному організмі при системному введенні речовин [Шлыгин Г.К., 1997; Liu M.T., 1997; Tsai L.H., Tsai W., 1994; Tsai L.H., 1999; Tsai L.H. 2001]. За результатами робіт першої групи дослідників можна судити про роль ценстральних, за результатами другої -- периферичних глутаматних рецепторів в регуляції ШСК. Дані відносно ролі периферичних глутаматних рецепторів в регуляції ШСК поодинокі. На ізольованих препаратах шлунка щурів показано, що L-глутамат не впливав на базальну шлункову секрецію, але гальмував оксотреморинову, гістамінову та гастринову секрецію [Tsai L.H. 1994]. В умовах цілісного організму результати були дещо іншими: L-глутамат гальмував гістамінову та оксотреморинову секреції, але не впливав на базальну та пентагастринову секреції кислоти [Tsai, 2001]. За результатами впливу L-глутамату на ШСК не можна судити про роль NMDA-рецепторів, тому що одночасно збуджуються каїнатні та AMPA-рецептори. За даними Шлигіна [1997], мононатрійглутамат при пероральному та внутрішньовенному введеннях викликав сильно виражений потенціюючий ефект, який проявлявся в значному посиленні і пролонгуванні шлункової секреції, стимульованої пентагастрином.

Таким чином, обмеженість даних щодо ролі периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу в реалізації ефектів L-глутамату на ШСК, практичне значення даної проблеми (застосування глутамату натрію як харчової добавки та використання мононатрійглутамату при лікуванні гіпосекреторних станів) послугували основою для формулювання мети та постановки завдань дослідження дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках наукової теми ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Дослідження механізмів функціонування органів травного тракту та розробка методів їх корекції” номер держреєстрації 0106U005755. Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, протокол №5 від 12.11.2008 року.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження ефекту активації та локалізації периферичних іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу на базальну та стимульовану секрецію кислоти у шлунку щурів.

Відповідно до мети перед нами були визначені такі завдання:

2) дослідити вплив N-метил-D-аспартату на базальну та стимульовану гістаміном, пентагастрином, карбахоліном, цитизином, інсуліном та 2-дезокси-Д-глюкозою ШСК у щурів;

3) дослідити вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію кислоти в умовах двобічної стовбурової ваготомії у щурів;

4) дослідити вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію кислоти в умовах блокади нікотинових і мускаринових ацетилхолінових рецепторів;

5) дослідити вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію кислоти в умовах блокади гастринових та гістамінових Н2-типу рецепторів.

Об'єкт дослідження -- механізми регуляції секреторної функції шлунка.

Предмет дослідження -- рівень секреції шлункового соку.

Методи дослідження -- дослідження проводились в умовах гострого експерименту на 429 білих щурах. За 24 години до початку експерименту тварин відсаджували на голод, з вільним доступом до води. ШСК у щурів досліджували методом перфузії ізольованого шлунка за Гхошем та Шільдом [Ghosh M.N., 1958]. Вивчали вплив N-метил-D-аспартату на базальну та стимульовану ШСК у щурів. Для стимуляції шлункової секреції використовували гістамін, пентагастрин, карбахолін, цитизин, інсулін та 2-дезокси-D-глюкозу. Функціональну активність ацетилхолінових рецепторів змінювали шляхом блокади нікотинових ацетилхолінових рецепторів пентаміном, мускаринових ацетилхолінових рецепторів невибірковим блокатором атропіном, мускаринових ацетилхолінових рецепторів М₁-типу гастроцепіном, гастринових рецепторів проглумідом та гістамінових рецепторів H₂-типу ранітідіном. Також досліджували вплив N-метил-D-аспартату на базальну та стимульовану ШСК в умовах хірургічної ваготомії.

Кислотність шлункового соку визначали за допомогою методу автоматичного титрування 0,01N розчином гідроксиду натрію.

Наукова новизна одержаних результатів. Робота розширює уявлення про участь периферичних іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу у процесах регуляції кислої шлункової секреції. Було показано, що активація периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу не викликала змін у показниках базальної ШСК у щурів. Також, вперше встановлено, що активація периферичних іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу не впливала на стимульовану гістаміном, пентагастрином, цитизином, інсуліном та 2-дезокси-D-глюкозою секрецію кислоти в шлунку щурів. Периферичні NMDA-рецептори залучені в регуляцію карбахолінової ШСК. При перерізці пресинаптичних нервових волокон блукаючих нервів за допомогою двобічної стовбурової ваготомії стимулюючий ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК зберігався.

Вперше показано, що блокада гастринових рецепторів проглумідом, гістамінових (Н₂-типу) рецепторів ранітідіном, мускаринових ацетилхолінових рецепторів невибірковим блокатором атропіном усувала посилюючий ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК. Вперше показано, що блокада нікотинових ацетилхолінових рецепторів гангліоблокатором пентаміном усувала посилюючий вплив N-метил-D-аспартату на ШСК, стимульовану карбахоліном, що свідчить про те, що NMDA-рецептор, залучений у даний ефект, локалізований на холінергічному інтернейроні ентеральної нервової системи передача з якого на секреторний мотонейрон опосередковується ацетилхоліном, який впливає на нікотиновий ацетилхоліновий рецептор.

Вперше показано, що блокада мускаринових ацетилхолінових рецепторів М₁-типу гастроцепіном усувала посилюючий вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК, що дозволяє стверджувати про те, що обов'язковою умовою посилюючої дії N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію є деполяризація мембрани інтернейрона, на якій локалізовані NMDA-рецептори та М₁-ацетилхолінові рецептори, що збуджуються карбахоліном.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлена властивість периферичних іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу посилювати стимульовану ШСК відкриває перспективи для створення селективних агоністів даних рецепторів, які не проходять гемато-енцефалічний бар'єр, та використання таких речовин у профілактиці та лікуванні різних патологій, пов'язаних з гіпосекрецією соляної кислоти у шлунку. Також одержані дані дозволяють, у певній мірі, пояснити механізм посилюючої дії NMDA-рецепторів, збуджуваних ендогенним глутаматом, та локалізованих на пресинаптичних мембранах нейронів та інтернейронах, на ШСК при гіпосекреторних станах.

Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес кафедри фізіології людини та тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень у науково-дослідній лабораторії «Фармакологія і експериментальна патологія» відділення біологічних і біомедичних технологій ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, проведено статистичне опрацювання одержаних результатів, самостійно підібрано та проаналізовано наукову літературу за темою дисертації. Планування напрямку досліджень, обговорення їх результатів, формулювання висновків здійснено за участю наукового керівника.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Робота виконана на 429 білих статевозрілих нелінійних щурах, масою 180-250 г., які утримувались в умовах акредитованого віварію ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет) Київського національного університету імені Тараса Шевченка згідно зі "Стандартними правилами по упорядкуванню, устаткуванню та утриманню експериментальних біологічних клінік (віваріїв)" з дотриманням загальних принципів біоетики у відповідності до Хельсінської декларації (Всесвітня медична асамблея, 1964), Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986), Декларації принципів толерантності (28 сесія ЮНЕСКО, 1995), Універсальної декларації по біоетиці та правах людини (ООН, 1997), норм Конвенції про захист прав людини у зв'язку з впровадженням нових біомедичних технологій, прийнятою у 1997 році у м. Ов'єдо (Іспанія) та підписаною Верховною Радою України у 2002 році, Закону України № 3447 ІV “Про захист тварин від жорстокого поводження” [Покровский В. И., 1997; Мальцев В. И., 2001]. Прилади, що використовувалися для наукових досліджень, підлягали метрологічному контролю. Шлункову секрецію у щурів досліджували методом перфузії ізольованого шлунка за Гхошем та Шільдом [Ghosh M.N., 1958]. Протягом доби до початку експерименту тварини не отримували їжі, але мали вільний доступ до води.

В зібраних пробах перфузату визначали загальну кислотність перфузату титраційним методом за допомогою іономіра И-160М. Для цього використовували 0,01N розчин гідроксиду натрію (NaOH). Кількість NaOH, що йшла на титрування перфузату в 10-ти хвилинній пробі, дорівнювала дебіту соляної кислоти, що виділялася у шлунку за даний період часу. Після цього розраховували дебіт кислоти у мкмоль, що виділився в кожній пробі та за весь дослід.

Дослідження проводились на двох групах щурів: перша - з інтактною нервовою системою, тваринам другої групи здійснювали операцію двобічної стовбурової ваготомії з метою виключення центральних холінергічних впливів на обкладові клітини шлунка.

Після завершення досліду тварин умертвляли за допомогою летальної дози уретану (3 г/кг, в/о) [Cao Y., Song G., 2007].

Схема експерименту. Шляхи введення та дози фармакологічних препаратів, застосованих в експерименті. Як селективний агоніст NMDA-рецепторів використовували N-метил-D-аспартат (3 мг/кг; в/о (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA)) [Tsai L.H. 2001]. Вплив агоністу глутаматних рецепторів здійснювали на тлі базальної та стимульованої секреції, а також в умовах блокади гастринових, гістамінових Н₂-типу, мускаринових (М) та нікотинових (Н) ацетилхолінових рецепторів ШСК у щурів.

Базальну секрецію досліджували упродовж 120 хвилин.

При дослідженні впливу N-метил-D-аспартату на стимульовану ШСК використовувалися наступні секретагоги, які вводилися внутрішньоочеревинно (в/о), внутрішньовенно (в/в) і внутрішньодуоденально (в/д) на фоні стабільної секреції соляної кислоти з рН в межах 4,8 - 6,4: 1) гістаміну дигідрохлорид - невибірковий агоніст гістамінових рецепторів в дозі 3 мг/кг, в/в (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA) [Takeuchi K., 1988]; 2) пентагастрин, агоніст гастринових В/ССК_В рецепторів в дозі 0,26 мг/кг, в/о (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA) [Koyama S., 1987; Rafsanjani F.N., 2007]; 3) карбахолін, неселективний агоніст мускаринових та нікотинових ацетилхолінових рецепторів, в дозі 10 мкг/кг, в/о (Об'єднання “Львівфарм”, Львів, Україна) [Beregova T., 2003]; 4) цитизин, агоніст нікотинових ацетилхолінових рецепторів, в дозі 0,34 мг/кг, в/д (Sopharma, Болгарія); 5) нейтральний людський монокомпонентний інсулін АКТРАПІД МС в дозі в дозі 1,2 од/кг, в/в [Axelson J., 1987; Ekelund M., 1982]; 6) 2-дезокси-D-глюкоза в дозі 100 мг/кг і 200 мг/кг, в/в (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA) [Matsumoto J., 1992].

У якості блокаторів ШСК використовувалися наступні речовини: 1) пентамін - блокатор нікотинових ацетилхолінових рецепторів (3,2 мкг/кг; в/о (Дальхимфарм ОАО, Россия)); 2) атропін - невибірковий блокатор мускаринових ацетилхолінових рецепторів (1 г/кг; в/о (ТОВ "Дослідний завод "ГНЦЛС" м. Харків, Україна)); 3) гастроцепін - блокатор мускаринових ацетилхолінових рецепторів М₁-типу (3 мг/кг; в/о («Boehringer Ingelheim», Spain)); 4)проглумід - невибірковий блокатор гастринових рецепторів (10 мг/кг; в/о); 5) ранітідін -- блокатор гістамінових рецепторів Н₂-типу (2 мг/кг; в/о (“GlaxoSmithKline”, Ірландія)).

Стимулятори вводили на фоні базальної секреції через 30-60 хвилин після початку експерименту.

При дослідженні впливу агоністу NMDA-рецепторів на ШСК, стимульовану гістаміном, пентагастрином, цитизином та карбахоліном, N-метил-D-аспартат вводили через 20-40 хв після введення даних стимуляторів. При дослідженні впливу агоністу NMDA-рецепторів на ШСК, стимульовану інсуліном та 2-дезокси-D-глюкозою, препарати вводили через 70-90 хвилин після введення даних стимуляторів, що обумовлено тривалістю латентної дії інсуліну та 2-дезокси-D-глюкози, яка складає в середньому 80 хвилин [Debas H.T., 1987].

Для аналізу ролі глутаматних рецепторів NMDA-підтипу периферичної чи центральної локалізації частина експериментів проводилася на щурах в умовах повної парасимпатичної денервації, яка досягалась шляхом двобічної стовбурової ваготомії. Останню виконували після 30 хвилин спостереження базальної секреції. Секреторну активність шлунка у щурів з двобічною стовбуровою ваготомією викликали в/о введенням карбахоліну в дозі 0,001 мг/кг через 30 хвилин після оперативного втручання.

Усі отримані дані піддавались статистичній обробці. Для перевірки розподілу на нормальність було застосовано W тест Шапіро-Уілксона. Оскільки отримані дані виявилися нормально розподіленими, то розраховували середнє значення (М) та середнє квадратичне відхилення (SD). Порівняння вибірок проводилося за допомогою t-критерію за Стьюдентом. Рівень значущості для наших даних р<0,05 (Гланц, 1999).

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив N-метил-D-аспартату на базальну та стимульовану секрецію кислоти. Дослідження розпочинали з контрольних експериментів, в яких упродовж 120 хв (дванадцять 10-ти хвилинних проб) вивчали базальну секрецію без дії будь-яких фармакологічних агентів.

Для того, щоб з'ясувати чи впливає N-метил-D-аспартат на базальну секрецію кислоти, ми вводили препарат в різних дозах 1,5, 3, 6 та 12 мг/кг. У всіх використаних дозах N-метил-D-аспартат не впливав на базальну секрецію кислоти в шлунку у щурів (рис. 1). Отже, периферичні іонотропні рецептори NMDA-підтипу не задіяні в реалізацію базальної секреції кислоти у шлунку щурів.

Рис.1 Дебіт базальної секреції кислоти у шлунку щурів за умов дії N-метил-D-аспартату (М±SD): 1 - базальна секреція; 2 - N-метил-D-аспартат (1,5 мг/кг, в/о); 3 - N-метил-D-аспартат (3 мг/кг, в/о); 4 - N-метил-D-аспартат (6 мг/кг, в/о); 5 - N-метил-D-аспартат (12 мг/кг, в/о).Примітка: n=11 у кожній серії дослідів.

Відсутність ефекту на базальну секрецію кислоти у шлунку щурів не означає, що NMDA-рецептори не залучені у регуляцію стимульованої секреції. Тому в наступних серіях досліджень вивчали вплив N-метил-D-аспартату на ШСК у щурів, стимульовану різними секретагогами: карбахоліном, пентагастрином, гістаміном, інсуліном та 2-дезокси-D-глюкозою. гістамін шлунковий пентагастрин

Дослідження впливу N-метил-D-аспартату на стимульовану ШСК розпочали з шлункової секреції, стимульованої карбохоліном. Карбахолін - неселективний агоніст Н- і М-ацетилхолінових рецепторів. N-метил-D-аспартат збільшував дебіт соляної кислоти шлункового соку, стимульованого карбахоліном з 82,0+3,8 мкмоль/120 хв (n=11) до 107,0+2,4 мкмоль/120 хв, або на 30,5 % (p<0,05) (рис. 2).

Рис.2 Дебіт соляної кислоти стимульованої карбахоліном (0,001 мг/кг, в/о) за умов дії N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) (М±SD). Примітка: * - р < 0,05; ** - p < 0,01 в порівнянні з контролем; v - введення препаратів.

Оскільки N-метил-D-аспартат здатен проникати через гематоенцефалічний бар'єр на 5% [Gutovitz S., 2001], то вирішили провести серію досліджень на щурах зі стовбуровою ваготомією, яка повністю усуває впливи з ЦНС. Введення N-метил-D-аспартату на фоні стимульованої карбахоліном шлункової секреції у ваготомованих тварин посилювало ШСК на 22,2% (p<0,05) (рис. 3), що статистично не відрізнялося від дослідів з інтактною нервовою системою. Тобто, при системному введені N-метил-D-аспартату він діє виключно на периферичні NMDA-рецептори.

Надалі стимулювали ШСК шляхом збудження гістамінових рецепторів Н₂-типу гістаміном і гастринових рецепторів пентагастрином. На фоні даних стимуляторів вводили N-метил-D-аспартат. У результаті проведених експериментів було встановлено, що N-метил-D-аспартат не впливав на стимульовану гістаміном і пентагастрином ШСК (рис. 4).

Потім стимулювали ШСК шляхом збудження Н-ацетилхолінових рецепторів ентеральної нервової системи цитизином, на фоні якого вводили N-метил-D-аспартат. Встановлено, що N-метил-D-аспартат не впливав на стимульовану цитизином ШСК, тобто обов'язковою умовою прояву стимулюючої дії N-метил-D-аспартату на ШСК є збудження мускаринових ацетилхолінових рецепторів.

Рис.3 Вплив N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) на секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном (0,001 мг/кг, в/о) у ваготомованих щурів (М±SD). Примітка: * - р < 0,05; ** - p < 0,01 в порівнянні з контролем; v - введення препаратів.

У подальшому стимулювали ШСК інсуліном і 2-дезокси-D-глюкозою. Інсулін викликає гіпоглікемію, внаслідок чого стимулюється глюкосенситивна зона гіпоталамуса, звідки через ядра солітарного тракту (ЯСТ) збудження передається до ядер блукаючого нерва в довгастому мозку. Далі збудження передається по блукаючих нервах до парієтальних клітин. На відміну від інсуліну, 2-дезокси-D-глюкоза не збуджує глюкосенситивну зону гіпоталамуса, а діє безпосередньо на ядра блукаючих нервів. У обох цих випадках відбувається збудження блукаючих нервів.

Введений N-метил-D-аспартат на фоні стимульованої інсуліном і 2-дезокси-D-глюкозою не проявляв своєї стимулюючої дії. Можливо, не відбулося збільшення секреції кислоти у зв'язку з високою концентрацією використовуваних секретагогів, бо вживані дози викликають секреторну реакцію близьку до максимальної. Зменшити концентрацію інсуліну не можна було, бо для інсулінової секреції необхідна концентрація достатня для збудження глюкосенативної зони гіпоталамуса, що викликає гіпоглікемію. Однак, в ході експерименту зменшили вдвічі дозу 2-дезокси-D-глюкози і на її фоні ввели N-метил-D-аспартат. Але і в цьому випадку N-метил-D-аспартат не виявив своєї стимулюючої дії (рис. 4).

Вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію кислоти в умовах блокади ацетилхолінових, гастринових і гістамінових рецепторів.

Відсутність ефекту N-метил-D-аспартату на ШСК, стимульовану 2-дезокси-D-глюкозою, за умов дії якої деполяризується постсинаптична мембрана мотонейронів ентеральної нервової системи, свідчить про те, що NMDA- рецептори пресинаптичної мембрани та NMDA-рецептори, локалізовані на постсинаптичній мембрані мотонейронів, не залучені в стимулюючий ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК. І лише збудження NMDA-рецепторів інтернейрона справляє посилюючий вплив на карбахолінову ШСК через посилення виділення ацетилхоліну.

Рис. 4 Стимульована шлункова секреція кислоти за умов введення N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) (M+SD): 1 - стимулятор; 2 - стимулятор + N-метил-D-аспартат. А - Гістамін (3 мг/кг, в/в); Б - Пентагастрин (16 мкг/кг, в/о); В - Цитизин (0,336 мг/кг, в/д); Г - Інсулін (1,2 од, в/в); Д - 2-дезокси-D-глюкоза (200 мг/кг, в/в); Е - 2-дезокси-D-глюкоза (100 мг/кг, в/в).

Для перевірки даного твердження провели дослідження впливу N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК в умовах блокади нікотинових та мускаринових ацетилхолінових рецепторів різної локалізації, а також в умовах блокади гастринових та гістамінових рецепторів.

Спочатку заблокували передачу в периферичних гангліях за допомогою гангліоблокатора пентаміну і на фоні цієї блокади ввели карбахолін. Карбахолінова секреція кислоти зменшилася на 56% (p<0,01). N-метил-D-аспартат, введений на фоні блокади Н-ацетилхолінових рецепторів пентаміном, не змінював дебіт соляної кислоти карбахолінової секреції у порівнянні з дією одного пентаміну на карбахолінову ШСК (рис. 5).

Рис. 5 Дебіт соляної кислоти стимульованої карбахоліном (0,001 мг/кг, в/о) на фоні дії N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) за умов блокади пентаміном (3,2 мг/кг, в/о) (М±SD): 1 - базальна секреція; 2 - карбахолін; 3 - карбахолін+пентамін; 4 - карбахолін+пентамін+N-метил-D-аспартат. Примітка: * - р < 0,05; ** - p < 0,01 в порівнянні з контролем; n=11 в кожній серії дослідів.

Одержані дані дозволили припустити, що NMDA-рецептор, збудження якого посилює карбахолінову ШСК, локалізований на інтернейроні, збудження з якого на мотонейрон передається за допомогою ацетилхоліну, який діє на нікотиновий ацетилхоліновий рецептор.

У наступній серії досліджували блокаду мускаринових ацетилхолінових рецепторів. Для цього застосовували атропін, який є неселективним блокатором мускаринових ацетилхолінових рецепторів. Атропін зменшував карбахолінову ШСК на 30% (p<0,01), усував стимулюючу дію N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК (рис. 6). Таким чином, обов'язковою умовою прояву стимулюючої дії N-метил-D-аспартату є збудження як Н- , так і М-ацетилхолінових рецепторів.

Через те, що М₁-ацетилхолінові рецептори локалізовані в ентеральній нервовій системі, було заблоковано дію М₁-ацетилхолінових рецепторів. Для цього використали гастроцепін - блокатор мускаринових ацетилхолінових рецепторів М₁-типу, локалізованих на пресинаптичних мембранах та інтернейронах, збудження яких карбахоліном викликає деполяризацію мембрани інтернейрона. Препарат зменшував карбахолінову ШСК на 37% (p<0,01). Гастроцепін усував стимулюючу дію N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію кислоти у щурів (рис. 7).

Рис. 6 Дебіт соляної кислоти стимульованої карбахоліном (0,001 мг/кг, в/о) на фоні дії атропіну (1 г/кг, в/о) на шлункову секрецію кислоти, за умов введення N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) (М±SD): 1 - базальна секреція; 2 - карбахолін; 3 - карбахолін+атропін; 4 - карбахолін+атропін+N-метил-D-аспартат. Примітка: * - р < 0,05; ** - p < 0,01 в порівнянні з контролем; n=11 в кожній серії дослідів.

Відомо, що в ЦНС NMDA-рецептори активуються лише після деполяризації постсинаптичної мембрани, яку спричиняє стимуляція глутаматних рецепторів AMPA-підтипу [Войцех Даниш, 1999]. Карбахолін є неселективним агоністом Н- і М-ацетилхолінових рецепторів. Взаємодія карбахоліну з Н-ацетилхоліновими рецепторами викликає деполяризацію постсинаптичної мембрани мотонейронів підслизового плетива ентеральної нервової системи. Взаємодія карбахоліну з М₁-ацетилхоліновими рецепторами спричиняє деполяризацію постсинаптичної мембрани мотонейронів, мембрани інтернейронів ентеральної нервової системи, на яких локалізовані мускаринові ацетилхолінові рецептори [Покровский В.М., 1997]. Через те, що N-метил-D-аспартат діяв лише на карбахолінову ШСК і його ефект усувався гастроцепіном, дійшли висновку, що стимулюючий вплив N-метил-D-аспартату на ШСК можливий лише за умов деполяризації карбахоліном мембрани, на якій локалізовані NMDA-рецептори та М₁-ацетилхолінові рецептори. За даними літератури, такою мембраною є мембрана інтернейронів [Burns et al., 1994; Burns and Stephens, 1995; Liu et al., 1997].

Рис. 7 Дебіт соляної кислоти стимульованої карбахоліном (10 мкг/кг, в/о) на фоні дії N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) за умов блокади гастроцепіном (3 мг/кг, в/о) (М±SD): 1 - базальна секреція; 2 - карбахолін; 3 - карбахолін+гастроцепін; 4 - карбахолін+гастроцепін+N-метил-D-аспартат. Примітка: * - р < 0,05; ** - p < 0,01 у порівнянні з контролем; n=11 у кожній серії дослідів.

У наступній серії досліджень були заблоковані гастринові рецептори на парієтальних клітинах проглумідом на фоні стимульованої карбахоліном ШСК. Блокатор гастринових рецепторів зменшував стимульовану секрецію кислоти на 40% (p<0,01). Проглумід усував стимулюючу дію N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК (рис. 8).

Також дослідили дію N-метил-D-аспартату на фоні заблокованих гістамінових рецепторів Н₂-типу ранітідіном в умовах стимуляції карбахоліном ШСК. Блокатор гістамінових рецепторів зменшував стимульовану карбахоліном секрецію кислоти на 47,2% (p<0,01) (рис. 8). Ранітідін також усував стимулюючу дію N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК.

Таким чином, вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК залежить від функціонального стану парієтальних клітин.

Отже, периферичні іонотропні глутаматні рецептори NMDA-підтипу не залучені у реалізацію базальної секреції кислоти та, на противагу карбахоліновій ШСК, не беруть участі в регуляції стимульованої гістаміном, пентагастрином, цитизином, інсуліном та 2-дезокси-Д-глюкозою ШСК. При перерізці пресинаптичних нервових волокон блукаючих нервів за допомогою двобічної стовбурової ваготомії стимулюючий ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК зберігався. І ми не побачили статистично вірогідної різниці в ефектах N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК до та після ваготомії.

Рис. 8 Дебіт соляної кислоти стимульованої карбахоліном (10 мкг/кг, в/о) на фоні дії N-метил-D-аспартату (3 мг/кг, в/о) за умов блокади проглумідом (10 мг/кг, в/о) (А) та ранітідіном (2 мг/кг, в/о) (Б) (М±SD): А: 1 - базальна секреція; 2 - карбахолін; 3 - карбахолін+проглумід; 4 - карбахолін+проглумід+N-метил-D-аспартат. Б: 1 - карбахолін+ранітідін; 2 - карбахолін+ранітідін+N-метил-D-аспартат. Примітка: * - р < 0,05; ** - p < 0,01 у порівнянні з контролем; n=11 у кожній серії дослідів.

Схематично залучення NMDA-рецепторів в регуляцію ШСК наведено на рисунку 9. За основу взята схема Фурнес і Коста [Furness J.B., Costa M., 1987], яку і на сьогодні найбільше цитують та доповнюють. Червоним кольором наведені наші доповнення, вони стосуються локалізації NMDA- та М₁-рецепторів. На особливу увагу заслуговує їх локалізація на інтернейронах. Збудження М₁-ацетилхолінових рецепторів карбахоліном (в природних умовах ацетилхоліном) приводить до деполяризації мембрани, після чого проявляється дія N-метил-D-аспартату.

Таким чином, посилюючий вплив N-метил-D-аспартату на шлункову секрецію, стимульовану карбахоліном можливий лише за умов одночасного збудження як Н- так і М-АХр (М₁ і М₃-типів).

Рис. 9. Гіпотетична схема регуляції шлункової секреції за участю периферичних NMDA-рецепторів: А -- за Фурнесом та Костою з доповненнями що стосуються локалізації NMDA та М₁-рецепторів; Б -- за Фурнесом та Костою [Furness J.B., Costa M., 1987].

Висновки

У дисертації, відповідно до поставленої мети, вирішене актуальне наукове завдання, що стосується участі периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу у регуляції базальної та стимульованої секреції кислоти в шлунку щурів:

1. N-метил-D-аспартат не впливає на базальну секрецію кислоти в шлунку.

2. N-метил-D-аспартат посилює карбахолінову шлункову секрецію кислоти. Двобічна стовбурова ваготомія не усуває ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову шлункову секрецію кислоти.

3. N-метил-D-аспартат не впливає на стимульовану гістаміном, пентагастрином, цитизином, інсуліном та 2-дезокси-D-глюкозою шлункову секрецію кислоти.

4. Блокада гастринових та гістамінових (Н₂-типу) рецепторів усуває посилюючий ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову секрецію кислоти в шлунку.

5. Блокада нікотинових ацетилхолінових рецепторів гангліоблокатором пентаміном усуває посилюючий вплив N-метил-D-аспартату на шлункову секрецію кислоти, стимульовану карбахоліном, що свідчить про те, що NMDA-рецептор, залучений в даний ефект, локалізований на холінергічному інтернейроні. Медіатором передачі з даного інтернейрону на секреторний мотонейрон є ацетилхолін, який впливає на нікотиновий ацетилхоліновий рецептор.

6. Блокада мускаринових ацетилхолінових рецепторів М₁-типу гастроцепіном усуває посилюючий вплив N-метил-D-аспартату на карбахолінову шлункову секрецію кислоти, що дозволяє стверджувати про те, що обов'язковою умовою посилюючої дії N-метил-D-аспартату на карбахолінову шлункову секрецію кислоти є деполяризація карбахоліном мембрани інтернейрона, на якій локалізований NMDA-рецептор.

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Фалалєєва Т.М. Дослідження ефекту збудження периферичних глутаматних рецепторів NMDA-типу на шлункову секрецію у щурів, стимульовану карбахоліном/ Фалалєєва Т.М., Берегова Т.В., Степанова Ю.Ю. // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збірник наукових праць. - 2004. - Випуск 10(63). - С.29-34 (Здобувач - проведення експерименту; Фалалєєва Т.М. - допомога під час проведення експериментів та підготовка матеріалу до друку; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

2. Степанова Ю.Ю. Вплив збудження периферичних глутаматних рецепторів NMDA-типу на шлункову секрецію у щурів / Степанова Ю.Ю., Берегова Т.В. // Вісник проблем біології і медицини. - 2008. - Випуск 1. - С. 56-58 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Берегова Т.В. - інтерпретація і узагальнення результатів, загальне редагування).

3. Головинська Ю.Ю. Дослідження ролі периферичних іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу у регуляції шлункової секреції щурів/ Головинська Ю.Ю., Фалалєєва Т.М., Берегова Т.В. // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохомія. - 2010. - № 2. - С. 30-34 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Фалалєєва Т.М. - інтерпретація і узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

4. Фалалєєва Т.М. Дослідження ефекту збудження периферичних глутаматних рецепторів NMDA-типу на шлункову секрецію у щурів, стимульовану карбахоліном / Фалалєєва Т.М. Степанова Ю.Ю., Берегова Т.В. // Матеріали міжнародної конференції «Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи» приуроченої до 80-ліття з дня народження проф. Шостаковської І.В. - 2004. - С. 72 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Фалалєєва Т.М. - допомога під час проведення експериментів та узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

5. Степанова Ю.Ю. Нові дані про роль периферичних глутаматних рецепторів NMDA-типу в регуляції шлункової секреції / Степанова Ю.Ю., Берегова Т.В., Фалалєєва Т.М. // Матеріали V Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів «Біологічні дослідження молодих учених в україні» - 2005. - С.93-94 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Фалалєєва Т.М. - узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

6. Степанова Ю.Ю. Дослідження ефекту збудження периферичних глутаматних рецепторів NMDA-типу на базальну та стимульовану гістаміном шлункову секрецію у щурів / Степанова Ю.Ю., Берегова Т.В., Фалалєєва Т.М. // Тези доповідей Першої Міжнародної конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» - 2005. - С. 212 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Фалалєєва Т.М. - узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

7. Степанова Ю.Ю. Дослідження участі глутаматних рецепторів NMDA-типу в регуляції шлункової секреції у щурів, стимульованої карбахоліном/ Степанова Ю.Ю., Штанова Л.Я., Берегова Т.В. // Матеріали ХІІ Міжнародної конференції «Інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне застосування» - 2006. - С. 20 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Штанова Л.Я. - допомога в проведенні експерименту та узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

8. Степанова Ю.Ю. Фармакологічний і хірургічний аналіз локалізації периферичних глутаматних рецепторів NMDA-типу, залучених у регуляцію шлункової секреції у щурів/ Степанова Ю.Ю., Штанова Л.Я., Берегова Т.В. // Матеріали міжнародної науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених «Шевченківська весна» - 2007. - Випуск V. Частина 1. - С.67-68 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Штанова Л.Я. - допомога в проведенні експерименту та узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

9. Степанова Ю.Ю. Фармакологический и хирургический анализ локализации периферических глутаматных рецепторов NMDA-типа, участвующих в регуляции желудочной секреции у крыс / Степанова Ю.Ю., Штанова Л.Я., Береговая Т.В. // Материалы 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007» «Гастроэнтерология Санкт-Петербурга» - 2007. - № 1-2. - С. 105 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Штанова Л.Я. - узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

10. Головинська Ю.Ю. Дослідження впливу N-метил-D-аспартату на шлункову секрецію у щурів / Головинська Ю.Ю., Берегова Т.В. // Матеріали «Ювілейного Х з'їзду ВУЛТ (Всеукраїнського Лікарського Товариства)» - 2009. - С. 127 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Берегова Т.В. - узагальнення результатів, загальне редагування).

11. Головинська Ю.Ю. Вплив N-метил-D-аспартату на базальну секрецію кислоти в шлунку щурів в умовах стимуляції м-ацетилхолінових рецепторів/ Головинська Ю.Ю., Фалалєєва Т.М., Берегова Т.В. // Збірник тез VII Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» - 2011. - С. 368-369 (Здобувач - проведення експерименту та підготовка матеріалу до друку; Фалалєєва Т.М. -узагальнення результатів; Берегова Т.В. - ідея дослідження, загальне редагування).

Анотація

Головинська Ю.Ю. Участь периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу в регуляції шлункової секреції у щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 -- фізіологія людини і тварин. -- Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2011.

Дисертація присвячена вивченню участі периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу в регуляції шлункової секреції кислоти (ШСК) у щурів. Встановлено, що активація периферичних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу N-метил-D-аспартатом не впливала на базальну та стимульовану гістаміном, пентагастрином, цитизином, інсуліном, 2-дезокси-D-глюкозою, проте посилювала карбахолінову ШСК. Після стовбурової ваготомії даний ефект зберігався. Блокада гастринових рецепторів проглумідом, гістамінових рецепторів Н₂-типу ранітідіном, нікотинових холінорецепторів гангліоблокатором пентаміном, мускаринових холінорецепторів невибірковим блокатором атропіном, мускаринових холінорецепторів М₁-типу гастроцепіном усувала посилюючий ефект N-метил-D-аспартату на карбахолінову ШСК. Зроблено висновок, що NMDA-рецептор, залучений у регуляцію карбахолінової ШСК, локалізується на мембрані холінергічного інтернейрону, передача з якого на мотонейрон здійснюється за допомогою ацетилхоліну, який діє на нікотиновий ацетилхоліновий рецептор. Обов'язковою умовою для прояву дії N-метил-D-аспартату є деполяризація мембрани інтернейрона, яка виникає внаслідок збудження М₁-ацетилхолінових рецепторів карбахоліном.

Ключові слова: шлункова секреція кислоти, NMDA-рецептори, N-метил-D-аспартат, глутаматергічна нервова система.

Аннотация

Головинская Ю.Ю. Участие периферических глутаматных рецепторов NMDA-подтипа в регуляции желудочной секреции у крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 -- физиология человека и животных. -- Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2011.

Диссертация посвящена изучению участия периферических ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-подтипа в процессах регуляции желудочной секреции кислоты (ЖСК) у крыс. Активация периферических глутаматных рецепторов NMDA-подтипа не вызывала изменений в показателях базальной ЖСК у крыс. Также, активация периферических ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-подтипа не влияла на стимулированную гистамином, пентагастрином, цитизином, инсулином и 2-дезокси-D-глюкозой ЖСК у крыс. Было установлено, что N-метил-D-аспартат усиливает карбахолиновую секрецию на 30,5% (p<0,01). Таким образом, периферические NMDA-рецепторы включены в регуляцию карбахолиновой секреции. При перерезке пресинаптических нервных волокон блуждающих нервов с помощью двусторонней стволовой ваготомии стимулирующий эффект N-метил-D-аспартата на карбахолиновую ЖСК сохранялся, усиливался на 22,2% (p<0,01). И не наблюдалось стически достоверной разницы в эффектах N-метил-D-аспартата на карбахолиновую ЖСК до и после ваготомии. Приведенные данные позволяют предположить, что после ваготомии возрастает модулирующее стимулирующее действие NМDА-рецепторов, которые возбуждаются эндогенным глутаматом и, локализированы на холинергических интернейронах.

Для того, чтоб отдифференцировать роль NMDA-рецепторов пре-, постсинаптической и ненейрональной локализации проведены исследования по изучению влияния N-метил-D-аспартата на карбахолиновую желудочную секрецию в условиях блокады никотиновых и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов разной локализации, а также в условиях блокады гастриновых и гистаминовых рецепторов.

Блокада гастриновых рецепторов проглумидом снижала карбахолиновую секрецию на 39,5% (p<0,01). N-метил-D-аспартат не изменял показатели до и после введения. Боакада гистаминовых (Н₂-типа) рецепторов ранитидином снижала карбахолиновую секрецию на 47,2% (p<0,01), а также устраняла усиливающий эффект N-метил-D-аспартата на карбахолиновую секрецию. Блокада никотиновых ацетилхолиновых рецепторов ганглиоблокатором пентамином снижала секрецию кислоты в желудке у крыс на 56,2% (p<0,01), и в дальнейших исследованиях устраняла усиливающее влияние N-метил-D-аспартата на ЖСК стимулированную карбахолином, что свидетельствует о том, что NMDA-рецептор, задействован в данный эффект, локализированный на холинергическом интернейроне передача с которого на секреторный мотонейрон осуществляется через никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

Блокада мускариновых рецепторов неизберательным блокатором атропином снижала желудочную секрецию на 30% (p<0,01) Атропин снимал стимулируущее действие N-метил-D-аспартата на ЖСК стимулированую карбахолином. Блокада мускариновых ацетилхолиновых рецепторов М₁-типа гастроцепином снижала карбахолиновую секрецию на 38% (p<0,01). Гастроцепин снимал усиливающее эффект N-метил-D-аспартата на карбахолиновую ЖСК, что позволяет утверждать про то, что обязательным условием усиливающего действия N-метил-D-аспартата на карбахолиновую секрецию является деполяризация карбахолином мембраны интернейрона, на котором локализирован NMDA-рецептор.

Ключевые слова: желудочная секреция кислоты, NMDA-рецепторы, N-метил-D-аспартат, глутаматергическая нервная система.

Annotation

Golovinska J. The role of peripheral glutamate receptors of NMDA-subtype in regulation of gastric acid secretion in rats. - Manuscript.

Dissertation for scientific degree of candidate the biological sciences 03.00.13 - physiology of man and animals. - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2011.

Dissertation is devoted to study the participation of peripheral glutamate NMDA- receptors in the regulation of gastric acid secretion in rats. It is found that activation of peripheral NMDA-receptors N-methyl-D-aspartate do not affect the basal and stimulated by histamine, pentagastrin, cytisine, insulin, 2-deoxy-D-glucose secretion of stomach acid, but intensified carbacholine gastric acid secretion. After vagotomy stem this effect persisted. Gastrin receptor blockade by proglumide, gistamine Н₂-type receptors by ranitidine, nicotinic choline receptors by ganglionic blocking agent pentamin, muscarinic choline receptors by indiscriminate blocker atropine, muscarinic choline receptors М₁-type by gastrozepin eliminated enhancing effect of N-methyl-D-aspartate on carbacholinum gastric acid secretion. It is concluded that NMDA-receptor involved in regulation of the carbacholine gastric acid secretion, localized on the cholinergic interneuron membrane. Transfer from the cholinergic interneuron to motoneurone is carried out by acetylcholine, which acts on nicotinic acetylcholine receptors. An obligatory condition for the manifestation of the N-methyl-D-aspartate is depolarization of the interneurons membrane due to stimulation of М₁-acetylcholine receptors by carbacholine.

Key words: gastric acid secretion, NMDA-receptors, N-methyl-D-aspartate, glutamate nervous system.

Размещено на Allbest.ru