Деякі механізми остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА „ІНСТИТУТ ХАРЧОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ГЕНОМІКИ НАН УКРАЇНИ”

УДК 576.3/.7.086:616.71.004.6

ДЕЯКІ МЕХАНІЗМИ ОСТЕОГЕННОГО ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ МУЛЬТИПОТЕНТНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН IN VITRO

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ОБЕРЕМКО АЛЬОНА ВОЛОДИМИРІВНА

Київ 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державній установі „Інститут невідкладної і відновної хірургії ім. В. К. Гусака НАМН України”.

Науковий керівник: доктор медичних наук, доцент Попандопуло Андрій Геннадійович, Державна установа „Інститут невідкладної і відновної хірургії ім. В. К. Гусака НАМН України”, завідувач лабораторії клітинного та тканинного культивування

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Родіонова Наталя Василівна, Інститут зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України, завідувач відділу цитології та гістогенезу

кандидат медичних наук Кирик Віталій Михайлович, ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України», завідувач лабораторії клітинних і тканинних культур відділу клітинних і тканинних технологій

Захист відбудеться „14” квітня 2011 р. о 12:00 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26.254.01 в ДУ „Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України” за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а. Факс: (044) 434 37 77.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ „Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України” за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а.

Автореферат розісланий „11” березня 2011 року.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

доктор біологічних наук А. І. Ємець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема лікування порушень репаративного остеогенезу є дуже актуальною для індустріально розвинених регіонів України з високим рівнем травматизму. Середній відрізок часу, протягом якого відбувається регенерація перелому, становить 25-100 днів - для здійснення помірного навантаження, та один рік - для повного відновлення кістки [Kale, 2004]. Крім того, розмір дефекту може бути настільки великим (критичним), що перешкоджатиме загоєнню [El-Fayomy, 2003].

Останні дослідження показали, що мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини (МСК) можуть бути успішно застосовані при лікуванні асептичного некрозу головки стегнової кістки [Kawate, 2006], несправжніх суглобів [Goel, 2005], значних кісткових дефектів [Niemeyer, 2008], синдрому ламких кісток [Blanc, 2005]. Проте, не зважаючи на значні досягнення сучасної науки у вивченні стовбурових клітин, залишається невирішеним ряд проблем. В першу чергу, це стосується встановлення оптимальних індукторів остеогенного диференціювання МСК.

Традиційно остеоіндукцію МСК проводять хімічним методом за допомогою дексаметазону [Анохина, 2007; Peng, 2007; Nuttelman, 2006], але при цьому може інгібуватися клітинна проліферація [Wei, 2001], спостерігатися продукція клітинами прозапальних цитокінів ІЛ-6 і ІЛ-8 в значно збільшених концентраціях [Возианов, 2009], що ускладнює клінічне застосування таких клітин. Є дані про те, що використання глюкокортикоїдів, до яких належить і дексаметазон, є найбільш поширеною причиною некрозу головки стегнової кістки нетравматичного походження [Kerahian, 2009; Thakano-Murakami, 2009]. Для стимуляції проліферації МСК при остеоіндукції дексаметазоном запропоновано додавати в культуральне середовище 17в-естрадіол [Honga, 2009].

Також запропоновані альтернативні шляхи спрямованої остеоіндукції МСК кісткового мозку. Є відомості про остеоіндуктивну дію рекомбінантних протеїнів: кісткових морфогенетичних білків, BMP (bone morphogenetic proteins) [Булатов, 2005; Xu, 2007], інсуліноподібних факторів росту, IGF. Суперечливі відомості щодо трансформуючих ростових факторів TGF-Я1, TGF-Я2 - є дані про їх позитивний [Kale, 2004] і негативний [Miyazono, 2003] вплив на процеси остеогенезу. Однак використання цих агентів має деякі недоліки: висока вартість, біодеградація in vivo, швидка деградація в культуральних середовищах, імуногенність через їх значну молекулярну масу [Dhanarai, 2003], велика концентрація, необхідна для досягнення бажаного остеоіндуктивного ефекту [Meijer, 2007]. Відомі остеоіндуктивні властивості демінералізованого кісткового матриксу, ДКМ [Кирилова, 2004; Булатов, 2005], паратиреоїдного гормону, кальцитоніну, ІЛ-6, ІЛ-11, 1,25-дигідрокси-вітаміну D₃, контактування клітин з рекомбінантною ДНК [Kale, 2004]. Була запропонована електромагнітна стимуляція біологічної активності МСК [Connelly, 2006; Simon, 2006]. Однак, групою вчених [Chang, 2004] проведені досліди, які дозволили встановити, що влив імпульсного електромагнітного поля може стимулювати проліферацію, але не впливає на клітинну диференціацію.

В нашій роботі дослідження були спрямовані на розробку технології остеоіндукції МСК, яка б зберігала проліферативну активність клітин після їх індукції за остеогенним шляхом в умовах in vitro.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи лабораторії клітинного та тканинного культивування ДУ „Інститут невідкладної і відновної хірургії ім. В. К. Гусака НАМН України” на тему: "Дослідити деякі механізми остеорепаративних процесів при сповільненій консолідації переломів та дефектів кісток кінцівок за умов використання клітинно-тканинних технологій" (№ держреєстрації 0107U000282), в якій здобувач була співвиконавцем.

Мета роботи - визначити вплив деяких індукторів остеогенного диференціювання на мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини та обґрунтувати найбільш ефективний метод спрямованої остеоіндукції цих клітин in vitro.

Завдання дослідження:

1) Визначити індуктивні властивості губчатого й кортикального демінералізованого кісткового матриксу, колагену I типу.

2) Визначити індуктивні властивості зразків гідроксиапатиту, склокераміки.

3) Вивчити індуктивні властивості кісткових морфогенетичних білків.

4) Вивчити індуктивні властивості мікс-культури клітин строми кісткового мозку і клітин окістя (КО).

5) Оцінити ефективність різних методів остеоіндукції мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин в порівняльному аспекті.

Об'єкт дослідження - остеодиференціювання МСК, а саме: зміна продукції лужної фосфатази (ЛФ), морфології, еквіваленту ентропії (ЕЕ) та проліферації культивованих МСК при спрямованій остеогенній індукції in vitro. клітина кістковий матрикс мультипотентний

Предмет дослідження - фактори остеоіндукції МСК in vitro: хімічні (дексаметазон, кальцитонін, BMP, склад носіїв) та біологічні (клітини періосту).

Методи дослідження. Метод клітинного культивування застосовувався для ізоляції та культивування МСК і КО; методи хімічної та біологічної остеоіндукції - для остеогенної індукції МСК; прижиттєве забарвлення плазматичних мембран флуоресцентними барвниками РКН67 Green й РКН26 Red Fluorescent - для поліпшення візуального спостереження за розташуванням клітин на поверхнях носіїв клітинних ліній; розрахунок ЕЕ - для оцінки зміни морфології індукованих клітин; МТТ-аналіз (MTT-Cell Proliferation Assay) - для оцінки кількості життєздатних клітин та їх проліферативної активності; цитохімічний метод з використанням субстрату BCIP/NBT - для детекції ЛФ; методи фазово-контрастної та флуоресцентної мікроскопії - для візуалізації культур клітин; статистичний метод - для обробки отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлені остеоіндуктивні властивості КО (патент № 46095). Вперше встановлено, що при додаванні в культуральне середовище кальцитоніну в концентрації, аналогічній концентрації дексаметазону при остеоіндукції in vitro, відмічається більш інтенсивне забарвлення на ЛФ клітин мікс-культури МСК і КО (p<0,001). Вперше встановлена щільність клітин (4·10⁴ клітин/см²), необхідна для оптимальної біоостеоіндукції МСК. Вперше встановлено, що клітини, отримані в результаті спрямованої остеоіндукції МСК за домопогою BMP і шляхом створення мікс-культури МСК і КО характеризуються меншим ЕЕ (1,7-2,4 ум. од.) і тому більшим остеогенним потенціалом порівняно з клітинами, отриманими при комітуванні за допомогою дексаметазону (3,8±0,11 ум. од.), і на відміну від індукції дексаметазоном, не втрачають проліферативної здатності протягом трьох тижнів остеоіндукції. Вперше розроблена технологія створення тривимірного остеопрогеніторного трансплантату (патент № 45773).

Практичне значення роботи. Розроблена в ході виконання дисертаційної роботи технологія створення тривимірного остеопрогеніторного трансплантату може бути використана при лікуванні пошкоджень та захворювань опорно-рухового апарату, які супроводжуються порушенням остеорепарації або формуванням дефектів кісткової тканини (травматичного та аваскулярного походження). Дані аналізу впливу різних факторів на процес остеорепарації можна буде застосувати для викладання у вищих навчальних закладах. Дані стосовно питомої швидкості росту МСК і КО, впливу щільності клітин на остеодиференціювання можна використати в фундаментальних розробках в області медицини та біології.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено інформаційний пошук, оброблені літературні джерела, проведено дослідження з культивування й остеогенного диференціювання МСК, виявлення продукції ЛФ, МТТ-аналіз, прижиттєве маркування клітин, математична та статистична обробка матеріалу, його аналіз і узагальнення. Розробку структури дисертаційної роботи та формулювання висновків було здійснено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на конференціях: науково-практична конференція за участі міжнародних спеціалістів „Трансплантація органів, тканин і клітин” (Київ, 2008); наукова конференція з міжнародною участю, яка присвячена 90-річчю НАН України і 10-річчю кафедри ЮНЕСКО з кріобіології „Нові кріобіотехнології для розв'язання фундаментальних і прикладних задач медицини” (Харків, 2008); науково-практична конференція з міжнародною участю „Фізологічна та репаративна регенерація кістки: сучасний стан питання” (Євпаторія, 2010); науково-практична конференція з міжнародною участю „Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи” (Київ, 2010); 64 міжнародна науково-практична конференція студентів та молодих вчених „Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2010).

Публікації. Матеріали дисертації знайшли відображення в 17 роботах: опубліковано 5 статей у профільних наукових журналах, 10 тез, отримано 2 патенти України на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 159 сторінках друкарського тексту й складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3-х розділів власних спостережень, узагальнень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Дисертація ілюстрована 7 таблицями та 32 рисунками. У бібліографічному покажчику на 33 сторінках міститься 293 джерела (з них 63 - україно- та російськомовних, 230 - іноземних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. Для експериментальних досліджень були отримані активно проліферуючі клітинні лінії МСК червоного кісткового мозку від 15 пацієнтів (віком 23-46 років) травматолого-ортопедичного профілю з кістковими дефектами, 7 - чоловічої та 8 - жіночої статі. Пацієнти не мали діабетичного анамнезу, не приймали антибіотиків, глюкокортикостероїдів або хіміотерапевтичних препаратів принаймні за два тижні до забору кісткового мозку.

Виділенні МСК при маркуванні антитілами (“BD Biosciences Pharmingen”, США) мали фенотип: CD105⁺, CD73⁺, CD90⁺ (> 95 % позитивних) і CD45^-, CD34^-, CD79a^-, HLA-DR^- (< 2 % позитивних) та були здатні диференціюватись в остео-, адипо- та хондрогенному напрямку при спрямованій індукції in vitro.

Активно проліферуючі культури КО були отримані від 5 пацієнтів віком 23-46 років (3 - жіночої, 2 - чоловічої статі) травматолого-ортопедичного профілю з кістковими дефектами під час планової хірургічної корекції зони перелому. Як джерело КО була обрана малогомілкова кістка, тому що на даній кістці окістя має найбільшу товщину [Кованов, 1963].

Остеоіндукцію за допомогою дексаметазону здійснювали за стандартною традиційною методикою. Ця індукована лінія становила контрольну групу. В даному випадку індуктором є дексаметазон. Аскорбінова кислота та в-гліцерофосфат служать в якості допоміжних факторів для покращення остеогенної диференціації, але самі по собі вони не індукують МСК [Kale, 2004].

Мікс-культуру отримували шляхом сумісного культивування МСК і КО у співвідношенні 3:1 (біоостеоіндукція). Культивування проводили: 1) в стандартних умовах; 2) з використанням розробленого нами середовища, яке містило 0,05 мкг/мл кальцитоніну у вигляді препарату «Міакальцик» («Novartis Pharma», Швейцарія). Також здійснювали культивування лише МСК (без КО) в середовищі з кальцитоніном. Були проведені дослідження, в яких остеогенне середовище додавалось в мікс-культуру після досягнення щільного моношару.

При остеогенній індукції за допомогою BMP МСК засівали зі щільністю 60 тис. на лунку в 24-лункові культуральні планшети. Використовувалось культуральне середовище з різним вмістом BMP-2 або BMP-4 («Sigma», США): 5, 10 або 15 нг/мл, а також середовище, що містило BMP-2 і BMP-4 по 5 нг/мл.

З метою вивчення індуктивних властивостей носіїв культивованих МСК були обрані матеріали, сертифіковані в Україні, та такі, що використовуються в клінічній практиці - гідроксиапатит, колаген І типу, зразки склокераміки «Остеоапатит керамічний», зразки ДКМ у вигляді губчато-кортикальних чіпсів «Тутопласт» (“Tutogen Medical GmbH”, Німеччина), а також губчатий і кортикальний ДКМ «Остеоматрикс» («Конектбіофарм», Росія). Частину фрагментів ДКМ після культивування МСК протягом двох тижнів фіксували в 10% розчині формальдегіду, декальцинували й забарвлювали гематоксиліном і еозином.

Для порівняння динаміки росту й проліферації клітинних культур проводили МТТ-аналіз клітинної проліферації (MTT-Cell Proliferation Assay). Для детекції ЛФ використовувався реактив BCIP/NBT Liquid Substrate System («Sigma», США). Процес оцінки ступеня диференціювання МСК проводився в автоматизованій системі визначення функціонального стану клітин [Меркулова, 2005]. Прижиттєве фарбування клітин флуоресцентними барвниками здійснювали за допомогою РКН67(РКН26)-GL cell linker kit (“Sigma”, США).

Для аналізу отриманих даних забарвлення на ЛФ використовували підхід перекладу якісних показників у напівкількісні - бали (інтенсивність забарвлення оцінювалась за п'ятибальною шкалою).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили із застосуванням ліцензійного пакету «MedStat» (версія 3, сер. № MS000027) [Лях, 2006] з використанням адекватних методів біостатистики. При значеннях р<0,05 відмінності вважали достовірними.

Отримані результати та їх обговорення. При остеоіндукції МСК дексаметазоном продукція ЛФ клітинами починалась з 7-ї доби (p<0,05), різко підвищувалась до 10-ї доби та стабілізувалась на одному рівні (табл. 1). На 7-му добу в культурі з'являлись малодиференційовані клітини з наявністю одиничних округлих клітин, які продукували ЛФ (ЛФ+), на 13-16-ту добу індукції майже всі клітини продукували ЛФ і мали округлу форму (рис. 1).

Таблиця 1

Залежність кількості ЛФ+ клітин від часу культивування (±у, n=14, де n - кількість лунок культурального планшету на добу індукції дексаметезоном)

Час остеогенної індукції, доба	4	7	10	13	16
Кількість ЛФ+ клітин, бали	0	0,3±0,2*	4,0±0,5*#	4,3±0,4*#	4,3±0,5*#

Примітка: * - p<0,05 порівняно з 4-ю добою, ^# - p<0,05 порівняно з 7-ю добою.

A Б

Рис. 1 А - веретеноподібні некомітовані МСК 2-го пасажу; Б - малодиференційовані клітини, які активно продукують ЛФ на 13-ту добу остеоіндукції дексаметазоном. Фазово-контрастна мікроскопія. Окуляр х 10, об'єктив х 20

Проліферативна активність МСК в процесі остеогенного диференціювання за допомогою дексаметазону різко знижувалась. При додаванні індукційного середовища с дексаметазоном до культури МСК 50% конфлуентності моношар не утворювався через те, що клітини припиняли ділитися. Якщо продовжувати культивувати МСК до 19-ї доби, відбуваються подальші зміни структури моношару: індуковані МСК утворюють щільні скупчення, що активно секретують ЛФ.

З метою пошуку альтернативних методів остеодиференціювання МСК в якості індукторів були досліджені BMP-2 і BMP-4. Починаючи з перших досліджень BMP [Urist, 1965] на щурах, значна кількість сучасних робіт присвячена вивченню BMP in vivo [Munns, 2009; Desmyter, 2008; Swiontkowski, 2006]. В працях, де досліджувались BMP in vitro, зазвичай не вказується концентрація BMP, необхідна для спрямованої остеогенної індукції МСК [Kale, 2004; Wang, 2010], або використовуються генетичні вектори [Luu, 2007; Tian, 2008]. Також зустрічаються одиничні роботи, де були використані BMP-2 [Wyatt, 2001] і BMP-4 [Miyazono, 2003] у концентрації 50 нг/мл. Тому потрібно було встановити концентрацію BMP, необхідну для остеоіндукції МСК in vitro.

Встановлено (табл. 2), що збільшення вмісту BMP в культуральному середовищі від 5 до 10 нг/мл дозволяє збільшити ступінь диференціювання (р<0,001), тоді, як збільшення до 15 нг/мл суттєво не відрізняється від 10 нг/мл (р>0,05), що може бути пов'язаним з обмеженою кількістю клітинних рецепторів, чутливих до BMP. Також не виявлено взаємодії BMP-2 і BMP-4 при одночасному їх використанні. На 16-ту добу не спостерігали подальшого збільшення інтенсивності забарвлення на ЛФ порівняно з 13-ю добою (р>0,05). МСК не змінювали своєї морфології протягом всього періоду спостережень.

Таблиця 2

Залежність кількості ЛФ+ клітин від часу культивування і концентрації BMP (±у, n=10, де n - кількість лунок кожної концентрації на добу остеоіндукції)

Індуктор	Концентрація, нг/мл	Кількість ЛФ+ клітин, бали
		4 доба	7 доба	10 доба	13 доба	16 доба
BMP-2	5	0,2±0,1	2,0±0,1*	2,3±0,3*	2,4±0,1*	2,3±0,1*
	10	0,3±0,1	2,5±0,2*	3,0±0,2*	4,5±0,3*	4,6±0,2*
	15	0,3±0,1	2,6±0,2*	3,4±0,2*	4,7±0,1*	4,8±0,1*
BMP-4	5	0,2±0,1	2,1±0,1*	2,0±0,1*	3,1±0,1*	3,0±0,1*
	10	0,3±0,1	2,2±0,2*	2,7±0,3*	4,3±0,2*	4,4±0,4*
	15	0,3±0,1	2,3±0,1*	3,8±0,1*	4,9±0,1	5,0±0,1*
BMP-2 і BMP-4	5	0,2±0,1	2,0±0,2*	2,3±0,1*	3,1±0,1*	3,1±0,2*
-	-	0,1±0,1	0,1±0,1	0,1±0,1	0,2±0,1	0,2±0,1

Примітка: * - р<0,001 порівняно з забарвленням МСК без індуктора.

Не зважаючи на недоліки використання BMP [Dhanaraj, 2003; Meijer, 2007], індукція за допомогою цього агенту дозволяє отримати остеогенне диференціювання МСК (p<0,001, починаючи з 7-ї доби індукції) без втрати здатності клітин прикріплюватися до поверхні культуральних флаконів і ділитися (протягом трьох тижнів). Значить, такий індуктивний вплив може розглядатися в якості альтернативи індукції дексаметазоном.

В результаті досліджень індуктивних властивостей клітинних носіїв (табл. 3) було виявлено, що на гідроксиапатиті МСК і КО прикріплялись до поверхні носія, але не розпластувались на ньому. Не зважаючи на те, що алогенний гідроксиапатит отримують із кісткової тканини і він містить органічний компонент, а також мікроелементи у тому ж складі й кількості, в якому вони містяться в кістці, протягом всього періоду спостережень проліферації та міграції клітин не відмічалося. Починаючи з 2-го тижня культивування, клітини поступово гинули і відкріплювались в культуральне середовище, утворюючи клітинний детрит.

Таблиця 3

Динаміка зміни кількості клітин на різних носіях (± у, n = 10, де n - кількість зразків для кожного виду носія)

Вид носія	Вид клітин	Кількість клітин/см2
		7 доба	14 доба	21 доба
Гідроксиапатит	МСК	175±35	77±21*	14±7**
	КО	161±35	91±21*	21±7**
Колаген І типу	МСК	?	?	?
	КО	?	?	?
„Тутопласт”	МСК	224±56	259±49	203±49
	КО	203±49	243±42	231±63
Губчатий „Остеоматрикс”	МСК	189±42	2035±378*	?
	КО	315±63	2454±343*	?
Кортикальний „Остеоматрикс”	МСК	203±56	1385±278*	?
	КО	252±49	3224±671*	?
Склокераміка	МСК	0	0	0
	КО	0	0	0

Примітка: * - p<0,05 порівняно з 7-ю добою; ** - p<0,05 порівняно з 14-ю добою; ? - все поле зору

Отримані результати досліджень щодо гідроксиапатиту відрізняються від позитивних літературних [Olivera, 2009; Васильева, 2001] і свідчать про те, що наявність у носіїв з цього матеріалу індуктивних властивостей вельми сумнівна. Можливо, це пояснюється тим, що в вище згаданих роботах не досліджувалась зміна кількості клітин в динаміці in vitro. Останні дослідження [Чиссов, 2008] також показали, що гідроксиапатит володіє недостатньою швидкістю біорезорбції, в результаті чого через рік його залишки в місці дефекту опиняються замурованими в кісткову тканину.

Незадовільні дані щодо гідроксиапатиту можуть говорити про те, що для забезпечення адгезії, проліферації та наступної диференціації клітинних ліній необхідно використовувати носії, які б окрім неорганічних сполук (апатиту) містили ще й органічні речовини (наприклад, колаген). Загальновідомо, що остеобласти активно секретують немінералізований кістковий матрикс (остеоїд), який згодом повністю кальцифікується. Остеобласти, які оточуються екстрацелюлярним матриксом (ЕЦМ) під час формування кістки і опиняються в спеціальній лакуні всередині мінералізованого кісткового матриксу, перетворюються в остеоцити. Тому було б неправильно розміщати культивовані in vitro клітини на носії лише мінерального складу. В такому випадку необхідні остеокласти, які здатні за допомогою гідролітичних ферментів розчинити мінеральний матрикс і забезпечити сприятливі умови для функціонування остеогенних прекурсорів. Це також обумовлює необхідність обирати носій з відповідною пористістю, для того, щоб попередники остеобластів могли адгезувати та проростати вглибину носія, згодом створюючи власний ЕЦМ.

Колаген І типу є головною складовою ЕЦМ кісткової тканини, тому клітинні лінії добре адгезували до поверхонь культуральних флаконів або чашок Петрі, вкритих колагеном I типу, та активно проліферували. Але колаген, без використання додаткового індуктору, сам по собі не призводить до диференціювання МСК, про що свідчить негативне забарвлення на ЛФ або забарвлення одиничних клітин, які при довготривалому культивуванні (21 доба) без пасажування починали спонтанно продукувати ЛФ.

З початку культивування культур на «Тутопласті» проліферативна активність клітин була незначною, і до кінця 2-го тижня ними було вкрито менше 1/3 площі зразків, протягом 3-го тижня проліферації не спостерігалось зовсім. Вірогідніше за все, це пов'язано з технологічними особливостями виготовлення даного носія, в результаті чого він при культивуванні виділяє в культуральне середовище якісь речовини, котрі гальмують в клітинах процеси мітозу.

Найбільш активно проліферативні процеси відбувались на „Остеоматриксі”. Кількість клітин до кінця 2-го тижня на ньому збільшувалась практично на порядок (р<0,001), а наприкінці 3-го тижня клітини займали все поле зору. МТТ-аналіз показав, що кількість МСК при цьому збільшується в 3,5 рази, що в 2 рази менше, якщо б вони культивувались на плоскій поверхні за умови постійного пасажування. Крім того, через три тижні культивування спостерігали позитивне забарвлення на ЛФ одиничних клітин.

При вивченні гістопрепаратів було відмічено, що на „Тутопласті” клітини розташовувалися в один шар, а на „Остеоматриксі” - формували багатошарову (4-6 клітин) структуру, проникали в товщу носія і відкладали власний ЕЦМ.

Згідно даних літератури також відомо, що ДКМ здатні індукувати проліферацію та остеогенне диференціювання МСК in vitro [Kumaran, 2010]. В експериментах на тваринах було показано, що імплантація МСК на ДКМ призводила до відновлення кісткових дефектів та сприяла формуванню власної кістки [Wang, 2006; Krugliakov, 2005]. Індуктивні властивості ДКМ можуть бути пов'язані зі збереженими після декальцинації специфічними BMP [Булатов, 2005]. Крім того, „Остеоматрикс”, згідно з даними виробника, зберігає природну архітектоніку кісткового матриксу, його колагеновий і мінеральний компонент, містить кісткові сульфатовані глікозаміноглікани (хондроїтин-4- и хондроїтин-6-сульфати, дерматан-сульфат і кератан-сульфат), характерні для зрілої кісткової тканини. Відмічена різниця швидкості проліферації клітинних ліній на „Остеоматриксу” пов'язана з тим, що культури МСК і КО мають різні показники питомої швидкості росту in vitro.

На 2-4-ту добу після засіву на три види зразків склокераміки з різним вмістом біогенного гідроксиапатиту (30-68 %) клітини відкріплялись в культуральне середовище, тому що вже за дві години знаходження склокераміки в культуральному середовищі, незалежно від зразка, показник рН достовірно (р<0,001) перевищував оптимальний діапазон кислотності (рН=7,2-7,4), необхідний для культивування клітин. Протягом доби рН продовжував зростати і перевищував оптимальний рівень в 1,3-1,6 разу. Ці дані свідчать про те, що причиною загибелі клітинних культур є високі значення рН культурального середовища зі зразками склокераміки.

Для створення мікс-культури МСК і КО (рис. 2-А) необхідно було з'ясувати, через який час культивування можна одержати достатню кількість клітин, яка максимальна їх теоретично досяжна кількість, і як довго можна культивувати клітинну лінію МСК або КО. Досліджуючи проліферативний потенціал різних клітинних ліній МСК (n=15) і КО (n=5), встановлено, що для культури КО питома швидкість росту в 2 рази більша (е=0,1980,015 ум. од.), ніж для МСК (е=0,10,01 ум. од.), при відносно невеликій початковій кількості клітин КО (x₀=758275) порівняно з МСК (x₀=4,82,0 млн.). Можливо, це обумовлено умовами in vitro: при меншій щільності посіву КО діляться швидше.

A Б В Г

Рис. 2 Мікс-культура: А - МСК (звичайні стрілки) і КО (пунктирні стрілки), 3-я доба культивування; Б - острівець остеогенезу, 10-а доба культивування; В - у середовищі з кальцитоніном, 28-а доба культивування; Г - у середовищі з кальцитоніном при високій щільності клітин, 13-а доба культивування. Забарвлення PKH26 і PKH67 (А) й на ЛФ (В, Г). Фазово-контрастна (Б, В, Г) і флуоресцентна мікроскопія (А), окуляр х 10, об'єктив х 10 (А, Б), х 20 (В) і х 4 (Г)

На підставі розрахованих даних було отримано рівняння проліферації для КО: x(t) = 758·e^0.198t і МСК: x(t) = 4,8·10⁶e^0.1t, де x(t) - кількість клітин в залежності від часу (t), е - основа натуральних логарифмів (е = 2,7...). Значення питомої швидкості росту і початкової кількості клітин дозволяють прогнозувати проліферативну активність клітин до 4 - 6 пасажу, після чого спостерігається поступове зниження питомої швидкості росту до нуля. Для отримання достатньої кількості КО потрібно більше часу, ніж для МСК.

У роботі [Wagner, 2008] було показано, що загальне число подвоєнь популяції МСК варіює від 6 до 16, а також додатково від 7 до 9 подвоєнь під час початкового колонієутворення. Якщо прийняти ліміт Хейфліка рівним 16, то максимально можлива кількість МСК: 312,9·10⁶ - 3,2·10¹¹, КО: 48510 - 49,68·10⁶; період проліферації для МСК: 1,4 - 3,7 міс., для КО: 0,7 - 1,9 міс.

При створенні мікс-культури співвідношення МСК і КО становило 3:1, а протягом 1-го тижня культивування - в середньому, 2:1 - через те, що КО швидше ділились. Починаючи з 10-ї доби культивування, в мікс-культурі формувались острівці скупчення клітин (рис. 2-Б) по всій поверхні культурального посуду, утворені переважно КО. На кінець 4-ї доби культивування спостерігались одиничні ЛФ+ клітини (? 7 % від загальної кількості клітин мікс-культури). Починаючи з 14-ї доби культивування, кількість ЛФ+ клітин значно зростала (p<0,001) та складала, в середньому, 45 %.

Кількість ЛФ+ клітин, на 7-му добу культивування була меншою, ніж КО (p<0,001), а на 14-ту добу, навпаки, кількість ЛФ+ клітин перевищувала кількість КО більш ніж в 1,5 разу (табл. 4). Це свідчить на користь того, що поряд з КО ЛФ починали продукувати й остеоіндуковані МСК. Важливо відмітити, що в процесі остеоіндукції клітини мікс-культури, в тому числі МСК, зберігали свою проліферативну активність протягом всього періоду спостережень (три тижні).

Таблиця 4

Динаміка зміни кількості МСК, КО і ЛФ+ клітин і загальної кількості клітин в мікс-культурі ( у, n = 14, де n - кількість лунок культурального планшету на добу остеоіндукції)

Мікс-культура	Тривалість культивування, доба
	4	7	14	21
Загальна кількість клітин, клітин/см2	36 5	116 13*	901 105*	все поле зору
ЛФ+ клітини, клітин/см2	5 3#	8 3#	441 33*#	1/2 поля зору
МСК, клітин/см2	25 5	81 16*	614 91*	2/3 поля зору
КО, клітин/см2	11 3#	35 10*#	280 53*#	1/3 поля зору

Примітка: * - p<0,001 порівняно з 4-ю добою культивування; # - статистично значущі розрізнення між кількістю КО і ЛФ+ клітин (p<0,001)

Культивуючи МСК і КО в середовищі з кальцитоніном, відмічали більш швидше формування острівців скупчення клітин (7-а доба) і більш інтенсивне забарвлення на ЛФ - 60 % (p<0,001), при цьому забарвлення на ЛФ було сильнішим для мікс-культури, ніж для чистої культури МСК (p<0,001). Спонтанне диференціювання МСК, без спрямованої індукції, не виявлялось впродовж всього періоду спостережень.

При довготривалому культивуванні мікс-культури в середовищі з кальцитоніном спостерігали подальшу зміну морфології клітин, які ставали більш розпластаними та з відростками (рис. 2-В). В цьому випадку відбувалась індукція МСК не лише з боку КО, а також за рахунок стимулюючого впливу кальцитоніну.

Відомо, що процес формування кістки може залежати від щільності клітин [Кale, 2004] in vivo. При проведенні експериментальних досліджень, в яких здійснювали сумісне культивування МСК і КО в стандартному середовищі до утворення щільного моношару (4·10⁴ клітин/см²), подальше культивування проводили в середовищі з кальцитоніном. Було виявлено, що за розташуванням у просторі мікс-культура нагадує культуру КО. На 7-му добу індукції відмічали наявність структур, за розташуванням у просторі подібних до остеонів (рис. 2-Г), чого не спостерігалось при меншій (8·10³ клітин/см²) щільності клітин, тобто, щільність клітин впливає на їх остеодиференціювання in vitro.

Експериментальні дані дозволяють стверджувати, що після спільного культивування КО й МСК відбувається диференціювання МСК в клітини, що мають високу проліферативну активність і розвинутий синтетичний апарат. В мікс-культурі КО грають роль ініціаторів початку процесу остеогенезу, визначаючи розташування у просторі МСК, характерне для культури КО, і можуть створювати певне мікрооточення за рахунок синтезу специфічних речовин (наприклад, ЛФ), які є продуктами їх життєдіяльності. В результаті отримуємо не просто однорідну культуру остеогенних клітин, а таку, що дає початок формуванню in vitro кісткової тканини.

При переміщенні спрямованих на остеогенний шлях розвитку клітин мікс-культури in vivo, вони повинні зазнати впливу цілого комплексу факторів, необхідних для подальшого їх остеодиференціювання, тому що розвиток кісткової тканини потребує гармонічної активності цілого ряду сигналів мікрооточення: цитокінів, ростових факторів, молекул ЕЦМ і клітин (міжклітинної взаємодії). Більш того, ці регуляторні сигнали повинні підпорядковуватись відповідному часовому і просторовому порядку черговості.

При оцінці функціонального стану комітованих за остеогенним шляхом диференціювання МСК на підставі розрахунку ЕЕ (еквівалент термодинамічної ентропії, міри безладу), спочатку для всіх МСК спостерігали приблизно однакові значення ЕЕ: 1,5±0,2 ум. од., а для мікс-культури - трохи більший (p<0,05): 1,7±0,18 ум. од. Цей факт може бути пов'язаний з тим, що мікс-культура вже містить детерміновані клітини, в якості яких виступають КО. ЕЕ диференційованих за допомогою BMP клітин практично не змінювався в процесі культивування. При обчисленні ЕЕ враховувались параметри будови (зовнішні характеристики), але не функції клітин, а при індукції BMP МСК зберігали характерну веретеноподібну форму, тому для МСК, комітованих за допомогою BMP, не було виявлено зміни ЕЕ. В МСК, диференційованих за допомогою дексаметазону, навпаки, ЕЕ збільшувався до 3,8±0,11 ум. од., а в клітин мікс-культури спостерігали незначне збільшення ЕЕ (2,1±0,21 ум. од.). В цілому, ентропія при диференціюванні клітин зменшується, якщо врахувати синтез протеїнів і елементів ЕЦМ, який відбувається зі зменшенням ентропії. Закономірність зміни ЕЕ залежно від функціонального стану клітин узгоджується з динамікою диференціювання (окрім індукції BMP), оціненою прямим методом за допомогою фарбування розчином BCIP/NBT.

Встановлена позитивна реакція на ЛФ у всіх фрагментів „Остеоматриксу”, культивованих з клітинами мікс-культури (р<0,001 порівняно з контролем), на 14-ту добу культивування. На відміну від прототипу технології створення тривимірного остеопрогеніторного трансплантату, клітини проростають в носій на глибину до 40-50 мкм, що повинно сприяти збереженню більшої частки клітин у реципієнтному ложі, формуванню зв'язків трансплантованих клітин з клітинами кісткової тканини реципієнтного ложа та формуванню кісткової тканини de novo у місці трансплантації.

На підставі аналізу літературних джерел та з результатів власних досліджень можна виділити фактори, що сприяють диференціюванню остеопрогеніторів: 1) стероїдні гормони (дексаметазон, прогестерон, дигідроксивітамін D₃), 2) тиреоїдні гормони (кальцитонін), паратиреоїдний гормон, 3) фактори росту (ВМР, IGF, епідермальний ростовий фактор), 4) протеїни ЕЦМ та 5) остеогенно детерміновані клітини. Механізм впливу остеогенно детермінованих клітин на остеодиференціювання МСК, можливо, полягає в тому, що під впливом цих клітин змінюються фізичні, хімічні та біологічні параметри мікрооточення (рис. 3).

МСК		Остеогенно детерміновані клітини
Зміни фізичних, хімічних і біологічних параметрів мікрооточення
Активація рецепторів факторів росту та гормонів
Активація експресії остеобласт-специфічних генів
Збільшення транскрипції іРНК, що кодують ЛФ і остеопонтин
Остеобласт

Рис. 3 Механізм впливу остеогенно детермінованих клітин на остеогенне диференціювання МСК, розроблений на основі аналізу літературних джерел та з результатів власних досліджень

Таким чином, механізми впливу індукційних факторів на остеогенне диференціювання МСК різноманітні. В умовах in vitro забезпечити існування всіх факторів, результатом впливу яких є спрямування МСК в остеогенному напрямку розвитку, дуже складно, тому в роботі були виділені деякі механізми, що підходять для використання з метою заміщення кісткових дефектів in vivo, тобто такі механізми, які поєднували б у собі ефекти остеодиференціювання та збереження проліферативної активності індукованих клітин. На нашу думку, в якості індукторів запуску вищезазначених механізмів можуть бути використані остеогенно детерміновані клітини (КО) і носії з ДКМ.

ВИСНОВКИ

1. В дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове рішення актуальної наукової проблеми, що стосується встановлення оптимальних індукторів остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro. Результати проведених досліджень свідчать про доцільність використання методу остеоіндукції, який включає в себе культивування мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин спільно з остеогенно детермінованими клітинами (клітинами окістя) на біоматеріалі „Остеоматрикс”.

2. Виявлено достовірне збільшення кількості клітин на „Остеоматриксі” і колагені І типу, а також проростання клітин в товщу „Остеоматриксу” на глибину до 40-50 мкм. Це свідчить про те, що губчатий і кортикальний демінералізований кістковий матрикс у вигляді біоматеріалу «Остеоматрикс» і колаген І типу мають індуктивні властивості, що сприяють процесам адгезії й проліферації клітин. Клітинні культури при культивуванні на губчато-кортикальних чіпсах «Тутопласт» зберігають свою життєздатність, але проліферації у них в різні строки культивування не відмічається, тобто «Тутопласт» не сприяє процесам проліферації клітин. За результатами забарвлення на лужну фосфатазу «Остеоматрикс» і колаген І типу сприяють остеогенному диференціюванню мезенхімальних стовбурових клітин.

3. При культивуванні клітин на гідроксиапатиті кількість клітин, прикріплених до носія, постійно зменшується протягом всього періоду спостережень. Для зразків склокераміки виявлена відсутність клітинного росту і повна загибель клітин на 7-му добу культивування. Тобто зразки склокераміки та гідроксиапатиту не володіють остеоіндуктивними властивостями в умовах in vitro.

4. Встановлено, що з 7-ї до 14-ї доби спрямованої остеоіндукції кістковими морфогенетичними білками спостерігається підвищення секреції лужної фосфатази мезенхімальними стовбуровими клітинами, після чого відбувається стабілізація синтезу лужної фосфатази на одному рівні. Збільшення вмісту кісткових морфогенетичних білків 2-го чи 4-го типів від 5 до 10 нг/мл дозволяє збільшити ступінь диференціювання, тоді, як збільшення до 15 нг/мл достовірно не відрізняється від 10 нг/мл. Також не виявлено взаємодії кісткових морфогенетичних білків 2-го чи 4-го типів при одночасному їх додаванні.

5. Встановлено, що мезенхімальні стовбурові клітини починають продукувати лужну фосфатазу з 14-ї доби остеоіндукції за допомогою клітин окістя. При додаванні в культуральне середовище кальцитоніну в концентрації, аналогічній концентрації дексаметазону при остеоіндукції in vitro, відмічається більш інтенсивне забарвлення на ЛФ клітин мікс-культури мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин і клітин окістя. Встановлена щільність клітин (4·10⁴ клітин/см²), необхідна для оптимальної остеоіндукції мезенхімальних стовбурових клітин за допомогою клітин окістя.

6. Клітини, отримані в результаті індукції за допомогою кісткових морфогенетичних білків і клітин окістя, характеризуються меншим ентропійним еквівалентом (1,7-2,4 ум. од.) порівняно з клітинами, отриманими при комітуванні за допомогою дексаметазону (3,8±0,11 ум. од.), і на відміну від індукції дексаметазоном, не втрачають проліферативної здатності протягом трьох тижнів остеоіндукції.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro рекомендована остеоіндукція за допомогою клітин окістя.

2. Для оптимальної остеоіндукції мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин за допомогою клітин окістя in vitro рекомендована щільність клітин, яка дорівнює 4·10⁴ клітин/см².

3. Для покращення остеоіндукції мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин за допомогою клітин окістя in vitro рекомендовано використання кальцитоніну.

4. Для створення трансплантату для заміщення кісткових дефектів рекомендовано використання кістковомозкових мезенхімальних стовбурових клітин, індукованих за допомогою клітин окістя та культивованих на біоматеріалі «Остеоматрикс».

5. Для викладання у вищих навчальних закладах рекомендовано використати отримані в ході виконання дисертаційної роботи результати.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Попандопуло А. Г. Використання біоматеріалу „Остеоматрикс” для створення остеопрогеніторного трансплантата / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Український морфологічний альманах. 2010. - Т. 8, № 3. С. 111-113 (Особисто здобувачем виконані експериментальні дослідження, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу, формулювання висновків, літературне оформлення).

2. Влияние механизма травмы на состояние периостальных источников репарации / В. Г. Климовицкий, В. М. Оксимец, В. Ю. Черныш, А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко // Травма. 2008. Т. 9, № 4. С. 390-395 (Особисто здобувачем виконано експериментальну частину роботи).

3. Індуктивні властивості різних носіїв культивованих клітинних ліній / В. К. Гринь, В. Н. Казаков, А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Трансплантология. 2008. Т. 10, № 1. С. 96-99 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування клітин, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу, формулювання висновків, літературне оформлення).

4. Оберемко А. В. Оценка пролиферативного потенциала мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и прогениторных клеток надкостницы / А. В. Оберемко // Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2009. Т. 10, № 4. С. 443-445 (Роботу виконано самостійно).

5. Оберемко А. В. Носії мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин для заміщення кісткових дефектів / А. В. Оберемко // Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2010. Т. 11, № 2. С. 267-269 (Роботу виконано самостійно).

6. Пат. 46095 Україна, МПК С12N 5/00. Спосіб біологічної стимуляції остеогенного диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин / Гринь В. К., Климовицький В. Г., Попандопуло А. Г., Оксимець В. М., Оберемко А. В., Буше В. В., заявник і патентовласник ДУ „ІНВХ ім. В. К. Гусака АМНУ”. заявл. 09.06.09; опубл. 10.12.09, Бюл. № 23 46 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, формулювання висновків, оформлення патенту).

7. Пат. 45773 Україна, МПК С12N 5/00. Спосіб отримання тримірного остеопрогеніторного трансплантата / Гринь В. К., Климовицький В. Г., Попандопуло А. Г., Оксимець В. М., Оберемко А. В., Буше В. В.; заявник і патентовласник ДУ „ІНВХ ім. В. К. Гусака АМНУ”. заявл. 09.06.09; опубл. 25.11.09, Бюл. № 22 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, формулювання висновків, оформлення патенту).

8. Попандопуло А. Г. Метод индукции стволовых клеток стромы костного мозга по остеогенному пути / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, № 2. С. 254 (Особисто здобувачем виконано експериментальне дослідження, літературне оформлення).

9. Некоторые аспекты эффективности роллерного культивирования / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец, А. А. Штутин // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, №2, С. 193 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування клітин, МТТ-аналіз, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу).

10. Попандопуло А. Г. Направленная биоостеоиндукция мезенхимальных клеток костного мозга / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследдования: Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодёжи, 21-26 сентября 2009 г. М., 2009. С. 45-46 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу, літературне оформлення).

11. Попандопуло А. Использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для замещения дефектов костной ткани / А. Попандопуло, А. Оберемко // XIV міжнар. мед. конгрес студентів та молодих вчених, 13-15 квітня 2010 р.: тезисы докл. Тернопіль, 2010. С. 240 (Особисто здобувачем виконано аналіз літератури та отриманих результатів, літературне оформлення статті).

12. Сравнительный анализ функционального состояния остеорепаративных клеточных пулов при механической травме трубчатых костей / А. Г. Попандопуло, В. В. Буше, В. М. Оксимец, А. В. Оберемко // Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи: наук.-практ. конф. з між нар. участю, 14-15 жов. 2010 р.: тези доп. К., 2010. С. 152. (Особисто здобувачем виконано аналіз отриманих результатів).

13. Попандопуло А. Г. Дослідження проліферативного потенціалу культивованих клітин / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко // Молодь -- медицині майбутнього: міжнар. наук. конф. студентів та молодих вчених, присвячена 200-річчю з дня народження М. І. Пирогова, 22-23 квітня 2010 р: тези доп. Одеса, 2010. С. 34 (Особисто здобувачем виконано експериментальне дослідження, аналіз літератури та отриманих результатів, літературне оформлення).

14. Биологическая остеогенная индукция мезенхимальных стволовых клеток и создание трёхмерного остеопрогениторного трансплантата / В. Г. Климовицкий, В. М. Оксимец, А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, А. М. Гребенюк, А. Ю. Магомедов, С. А. Винокуров // Сборник научных трудов XV съезда ортопедов-травматологов Украины. 2010. С. 8 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу).

15. Оберемко А. В. Хімічна та біологічна остеоіндукція мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro / А. В. Оберемко // Український науково-медичний молодіжний журнал. 2010. Спец. вип. № 4. С. 537 (Роботу виконано самостійно).

16. Інженерінг тривимірної преостеогенної тканини / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимець, В. В. Буше // Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи: наук.-практ. конф. з між нар. участю, 14-15 жов. 2010 р.: тези доп. К., 2010. С. 153 (Особисто здобувачем виконано експериментальну частину роботи, аналіз отриманих результатів і літературних джерел, статистичну обробку матеріалу).

17. Получение остеопрогениторного трансплантата in vitro / А. Г. Попандопуло, В. М. Оксимец, А. В. Оберемко, Ю. А. Магомедов // Актуальне вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: IV Всероссийский симпозиум с международным участием, 21-22 апреля 2010 г.: тезисы докл. Санкт-Петербург, 2010. С. 108 (Особисто здобувачем виконано експериментальну частину роботи, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу).

Анотація

Оберемко А. В. „Деякі механізми остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Державна установа «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України», Київ, 2011.

В дисертації наведене теоретичне узагальнення та нове рішення актуальної наукової проблеми, що стосується встановлення оптимальних індукторів остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (МСК) in vitro. Результати проведених досліджень свідчать про доцільність використання методу остеоіндукції, який включає в себе культивування МСК спільно з остеогенно детермінованими клітинами (клітинами окістя) на біоматеріалі „Остеоматрикс”. Це дозволяє зберігати проліферативну активність клітин після індукції за остеогенним шляхом в умовах in vitro, а також сприяє їх проростанню в товщу носія.

Ключові слова: культура клітин, остеогенне диференціювання, мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини, остеорепарація.

Аннотация

Оберемко А. В. «Некоторые механизмы остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro». - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - Государственное учреждение «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины», Киев, 2011.

В работе изучен эффект различных остеоиндукторов мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) на остеогенную дифференцировку и пролиферацию МСК с целью обоснования наиболее эффективного метода направленной остеоиндукции МСК in vitro. В качестве индукторов были рассмотрены: гидроксиапатит, коллаген I типа, деминерализованный костный матрикс, образцы стеклокерамики, костные морфогенетические белки, кальцитонин, а также клетки надкостницы.

Установлено, что губчатый и кортикальный деминерализованный костный матрикс в виде биоматериала «Остеоматрикс» и коллаген І типа обладают индуктивными свойствами, способствующими процессам адгезии, пролиферации и остеогенной дифференцировки МСК. Кроме того, МСК способны проникать в толщу «Остеоматрикса» на глубину 40-50 мкм. Губчато-кортикальные чипсы «Тутопласт», образцы стеклокерамики и гидроксиапатит, напротив, не обладают индуктивными свойствами.

...