Размещено на http://www.allbest.ru/

1

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

УДК 576.34:576.311.34:582.282.23

Функціональна роль білків, що беруть участь у пексофагії у дріжджів

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

НАЗАРКО ВОЛОДИМИР ЮРІЙОВИЧ

Львів 2011

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України, професор Сибірний Андрій Андрійович, Інститут біології клітини НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної генетики та біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Гончар Михайло Васильович, Інститут біології клітини НАН України, завідувач відділу аналітичної біотехнології;

кандидат біологічних наук, доцент Черник Ярослава Іванівна, Львівський національний університет імені Івана Франка, біологічний факультет, кафедра генетики та біотехнології.

Захист дисертації відбудеться “13” липня 2011 р. о 15⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розіслано “10” червня 2011 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Д.В. Федорович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження механізмів автофагії, а саме її ранніх стадій, як наприклад, розпізнавання глюкози для автофагійної деградації пероксисом та встановлення нових компонентів у цьому багатостадійному процесі, нових Atg білків, є актуальною проблемою сучасної клітинної біології. Доцільність таких досліджень обумовлена важливістю функцій, які властиві автофагії, а це і підтримання гомеостазу клітин та органел, і адаптація клітин до нових, сприятливих та несприятливих умов навколишнього середовища. Крім того, автофагія необхідна також для процесів клітинної диференціації, тканинної перебудови, контролю за ростом клітин, захисту клітин від бактерійних та вірусних інфекцій. Зміни в автофагії є обов'язковим атрибутом старіння. Нещодавно показано, що автофагія задіяна в онкологічних захворюваннях, нейродегенерації. Цікаво, що однією із виявлених функцій автофагії у супресії злоякісних пухлин є усунення пошкоджених і продукуючих реактивні сполуки кисню органел (мітохондрій), що спричиняють стрес. Консервативність автофагійних шляхів в еукаріот дозволяє використовувати дріжджі як модельну систему для вивчення молекулярних механізмів автофагії та пексофагії (автофагійної деградації пероксисом). Таким чином, дослідження молекулярних механізмів деградації пероксисом у дріжджів створює теоретичне підґрунтя для з'ясування першопричин виникнення цілого ряду патологій, викликаних нестачею чи надлишком автофагійної активності у тварин і людини та накопичує знання для пошуку шляхів їх лікування у майбутньому.

На сьогодні ідентифіковано 35 генів, продукти яких беруть участь в автофагійних шляхах (ATG гени), а також багато інших генів, задіяних, крім автофагії, в інших споріднених процесах. Однак, багато генів, що необхідні для пексофагії, залишаються невідомими, а молекулярні механізми пексофагії - маловивченими. І взагалі нічого невідомо про ранні етапи пексофагії, а саме, розпізнавання глюкози для ініціації пексофагії. Тому, одна частина дисертаційної роботи полягала у дослідженні ранніх етапів пексофагії у дріжджів, а саме розпізнавання глюкози, що запускає каскад подій, які ведуть до усунення непотрібних у глюкозному середовищі органел, необхідних для утилізації метанолу чи олеату. Другою частиною дисертаційної роботи була ідентифікація нових автофагійних білків, які взаємодіють у дріжджовій дигібридній системі із білком Atg28 Pichia pastoris.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України за темою “Молекулярні механізми регуляції гомеостазу пероксисом, біосинтезу флавінів і гетерологічних білків та захист від стресу у неконвенційних дріжджів” (шифр теми 2.28.2.6, номер державної реєстрації 0102U000613, 2002-2005 роки) та темою “Молекулярні механізми клітинної сигналізації, гомеостазу пероксисом, синтезу флавінів, етанолу та глутатіону у дріжджів” (шифр теми 2.28.2.6, номер державної реєстрації 0106U002600, 2006-2010 роки). Автор дисертаційної роботи є одним із виконавців вищеназваних проектів. Ці дослідження були також підтримані грантом CRDF UB1-2447-LV-02 “Селективна автофагійна деградація пероксисом у дріжджів” (2002-2004 роки), індивідуальним грантом для молодих науковців в межах гранту CRDF UB1-2447-LV-02 “Пошук нових білків, задіяних в автофагійній деградації пероксисом за використання дріжджової дигібридної системи” (2004 рік) та індивідуальним грантом INTAS YSF №04-83-3342 “Ідентифікація та характеристика нових автофагійних білків у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris” (2005-2006 роки).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було ідентифікувати нові гени, задіяні у пексофагії у Pichia pastoris, та дослідити роль для пексофагії деяких білкових компонентів розпізнавання глюкози у дріжджів Saccharomyces cerevisiae і Pichia pastoris.

Для досягнення поставленої у роботі мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1) дослідити роль генів компонентів цАМФ-ПКА (Gpr1) сигнального шляху, рецептора G-білка, GPR1 і G-білка, GPA2 у розпізнаванні глюкози для пексофагії у дріжджів S. cerevisiae і P. pastoris;

2) дослідити роль гена високоафінного глюкозного сенсора SNF3 та гена низькоафінного глюкозного сенсора RGT2 для пексофагії у S. cerevisiae;

3) здійснити пошук білків, які у дріжджовій дигібридній системі взаємодіють із білком Atg28 P. pastoris;

4) встановити функцію нових білків, які взаємодіють із Atg28 P. pastoris у дріжджовій дигібридній системі.

Об'єкт дослідження. Об'єктом дослідження дисертаційної роботи був молекулярний механізм деградації пероксисом в пекарських дріжджів S. cerevisiae і метилотрофних дріжджів P. pastoris.

Предмет дослідження. Предметом дослідження були гени і білки, що необхідні для деградації пероксисом у P. pastoris і розпізнавання глюкози для пексофагії у S. cerevisiae і P. pastoris.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті виконання завдань дисертаційної роботи було запропоновано ряд нових наукових положень, основні з яких такі: білок пексофагія дріжджі глюкоза

1) показано, що продукти генів GPR1 і GPA2 беруть участь у розпізнаванні глюкози для пексофагії у дріжджів S. cerevisiae;

2) ідентифіковано потенційні ортологи генів ScGPR1 і ScGPA2 у P. pastoris. Показано, що продукти генів PpGPR1 і PpGPA2 не беруть участі ні в неспецифічній макроавтофагії, ні в автофагії олеат- чи метанол-індукованих пероксиcом;

3) встановлено, що продукти генів SNF3 і RGT2 задіяні в індукованій глюкозою пексофагії у дріжджів S. cerevisiae;

4) показано, що продукт гена ATG28 P. pastoris є частково необхідний для мікро- і макропексофагії;

5) проведено пошук білків, які взаємодіють у дріжджовій дигібридній системі із Atg28 P. pastoris, та ідентифіковано новий автофагійний білок, названий Atg35;

6) встановлено, що продукт гена ATG35 P. pastoris, як і ATG28, бере участь у мікропексофагії, а саме, утворенні MIPA, але на відміну від ATG28, не бере участі у макропексофагії, Сvt-шляху і неспецифічній макроавтофагії у цього виду дріжджів.

Практичне значення одержаних результатів. Дріжджі S. cerevisiae і P. pastoris є зручними модельними об'єктами для вивчення молекулярних механізмів автофагії та пексофагії. Дослідження селективної деградації пероксисом може забезпечити нові підходи для лікування нейродегенеративних захворювань, таких як хвороби Гантінгтона і Альцгеймера, які обумовлюються білковими агрегатами, що нагромаджуються в клітинах внаслідок дефектів автофагії. Вивчення автофагії важливе також для розуміння механізмів старіння, яке обумовлюється реактивними сполуками кисню через дефект функції пероксисом чи мітохондрій, і терапії певних видів раку (може спричинятися ефектом пошкоджених органел, таких як мітохондрії). Створена колекція мутантів може бути застосована як для подальшого дослідження пексофагії, так і інших процесів, розширюючи наші уявлення про значення автофагії у клітині. Такі знання також можуть бути корисні у біотехнології, наприклад, для продукції гетерологічних білків у дріжджів, оскільки пероксисоми можуть бути зручним компартментом для внутрішньоклітинного зберігання токсичних рекомбінантних білків. Крім того, результати наших досліджень можуть бути використані для подальшого вивчення деградації пероксисом у пекарських дріжджів S. сerevisiae і метилотрофних дріжджів P. pastoris, оскільки:

1) розпізнавання глюкози для пексофагії відрізняється у пекарських дріжджів S. cerevisiae і метилотрофних дріжджів P. pastoris, що важливо для встановлення видоспецифічних відмінностей в молекулярному механізмі автофагії;

2) як показано нами, дріжджова дигібридна система може бути використана для пошуку нових автофагійних білків по взаємодії із вже відомими;

3) ідентифіковано новий ген ATG35, який є задіяний у мікропексофагії, зокрема в утворенні MIPA, і може слугувати для встановлення молекулярного механізму утворення цієї структури і ефективного протікання мікропексофагії.

Отримані знання можуть бути використані і з педагогічною метою як в лекційному курсі, так і на практичних заняттях з мікробіології, цитології, клітинної біології та генетичної інженерії.

Особистий внесок здобувача. Здобувач спільно з науковим керівником розробив завдання та вибрав усі необхідні методи дослідження відповідно до мети дисертаційної роботи. Здобувач особисто проаналізував наукову літературу за темою дисертації та спільно з науковим керівником аналізував та обговорював результати досліджень. Практично вся експериментальна частина дисертаційної роботи була виконана здобувачем особисто, за винятком деяких експериментів, що проводилися спільно із к.б.н. Стасиком Олегом (Інститут біології клітини, м. Львів, Україна), доктором Дірком Варнеке (Інститут ботаніки Гамбурзького університету, м. Гамбург, Німеччина), проф. Станіславом Улашевським (Інститут генетики і мікробіології Вроцлавського університету, м. Вроцлав, Польща), проф. Джеймсом Крегом (Інститут вищих студій Кека, м. Клармонт, США), та у співпраці із проф. Йоганом Тевелейном (Інститут ботаніки і мікробіології, м. Лювен, Бельгія), к.б.н. Тарасом Назарком (Каліфорнійський університет, м. Сан Дієго, США) і проф. Сурешом Субрамані (Каліфорнійський університет, м. Сан Дієго, США). Підготовку публікацій у профільних наукових журналах та збірниках тез конференцій за результатами дисертаційної роботи здобувач здійснював разом із співавторами.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладені у дисертації, оприлюднено у вигляді тез, стендових та усних доповідей на: Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (м. Львів, Україна, 2004 рік), 2-ому з'їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (м. Київ, Україна, 2007 рік), 12-ому Міжнародному конгресі по дріжджах (м. Київ, Україна, 2008 рік), Конференції із міжнародною участю “Досягнення у клітинній біології і біотехнології” (м. Львів, Україна, 2008 рік), EMBO-конференції по автофагії: клітинна біологія, фізіологія і патологія (м. Аскона, Швейцарія, 2009), Конференції із міжнародною участю “Цитокіни і лікарські препарати у регуляції функціонування клітини” (м. Львів, Україна, 2010), Конференції із міжнародною участю “Досягнення у клітинній біології” (м. Львів, Україна, 2010).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях та 8 тез доповідей у збірниках тез конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, розділу, у якому викладено отримані результати, обговорення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 121 сторінці. Вона містить 54 рисунки та 4 таблиці. Список використаної літератури охоплює 151 джерело.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури. Пексофагія, або деградація пероксисом, є прикладом селективної автофагії. Вона полягає у вакуолярній деградації зайвих пероксисом, що може індукуватися змінами джерел вуглецевого живлення у дріжджів. У цьому розділі подано відомості про автофагію, як неселективну, так і селективну, а саме, шлях транспорту від цитозолю до вакуолі (Cvt-шлях) і пексофагію. Розглянуто ранні етапи у передачі сигналу від глюкози сигнальними шляхами Gpr1 та Snf3/Rgt2. Наведено поточні дані про регуляцію автофагії сигнальним шляхом Gpr1.

Підсумовуючи огляд літератури, зроблено висновок, що фізіологічний стан клітини та сигнали ззовні регулюють біогенез преавтофагосомної структури та обумовлюють певні зміни у складі її білкових комплексів, що і визначає рівень селективності обраного клітиною автофагійного процесу. Однак, багато генів, специфічних для пексофагії, залишаються ще досі невідомими, а молекулярні механізми пексофагії, особливо її ранніх етапів (передавання сигналу від глюкози для запуску пексофагії) - маловивченими.

Матеріали та методи. У матеріалах досліджень дисертаційної роботи описано: 1 штам E. coli, 9 штамів S. cerevisiae і 23 штами P. pastoris, 9 з яких було отримано у даній роботі; склад багатьох поживних середовищ для дріжджів; 40 олігонуклеотидних праймерів для ампліфікації різних фрагментів ДНК, дизайн 38 з яких розроблено у цій роботі; 18 плазмід, 5 з яких сконструйовано у цій роботі.

У методах дослідження описана Li-ацетатна трансформація дріжджів, швидкий метод виділення геномної ДНК із дріжджів, приготування безклітинних екстрактів дріжджів за допомогою трихлороцтової кислоти, конструювання штама Saccharomyces cerevisiae, що синтезує гібридний білок LexA-PpAtg28, визначення активності в-галактозидази в колоніях на фільтрах, створення специфічної для дигібридної системи бібліотеки геномної ДНК P. pastoris, пошук білків-партнерів по взаємодії із білком Atg28 Pichia pastoris у дріжджовій дигібридній системі, конструювання касет для делеції генів PpATG35, PpGPR1 і PpGPA2, пошук делеційних мутантів за допомогою ПЛР з колоній. Детально описано методи дослідження неспецифічної макроавтофагії, Сvt-шляху та пексофагії у P. pastoris. Розкрито методику дослідження пексофагії і у пекарських дріжджів S. cerevisiae. Представлено також дослідження пексофагії у P. pastoris за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Також зосереджено увагу на кількісному аналізі утворення MIPA та пексофагосом.

Результати досліджень та їх обговорення.

Білки Gpr1 і Gpa2 беруть участь в індукованій глюкозою пексофагії у дріжджів S. cerevisiae. Протягом росту дріжджів S. cerevisiae у мінімальному середовищі з олеїновою кислотою як єдиним джерелом вуглецю і енергії відбувається індукція біогенезу пероксисом (Hutchins et al., 1999). Коли культуру переносять у мінімальне середовище з глюкозою без джерела азоту, клітини дріжджів адаптуються до нових умов середовища, деградуючи непотрібні пероксисоми в процесі, відомому як автофагійна деградація пероксисом чи пексофагія. Щоби з'ясувати, чи розпізнавання глюкози у процесі пексофагії відбувається за участю сигнального шляху Gpr1, нами досліджено кінетику деградації пероксисомного матриксного білка, тіолази Fox3 (THI), при адаптації клітин, вирощених на олеаті, до мінімального середовища із глюкозою без джерела азоту. В експерименті було використано клітини дикого типу, а також мутанти Дgpr1 (дефектний по рецептору G-білка, GPCR), Дgpa2 (дефектний по G-білку, який взаємодіє із GPCR) і Дgpr1 Дgpa2 (Kraakman et al., 1999). Клітини спочатку інкубували у середовищі YNO (Ole) з олеатом протягом 23 год (h), після чого переносили у SD-N (Glc) з глюкозою без джерела азоту для адаптації протягом 20 годин (рис. 1).

Після 0, 10, 15 і 20 год адаптації до глюкози готували білкові екстракти і здійснювали імуноблот аналіз, використовуючи кролячі антитіла проти тіолази S. cerevisiae. Після перенесення у мінімальне середовище з глюкозою кількість білка тіолази знижувалась у клітинах дикого типу, тоді як цей процес був дуже сповільнений у мутантів Дgpr1, Дgpa2 і подвійного мутанта Дgpr1 Дgpa2.

Отже, ці дані однозначно свідчать, що рецептор Gpr1 разом із G-білком Gpa2 є важливими компонентами розпізнавання глюкози при специфічній автофагійній деградації пероксисом (пексофагії).

Пошук ортологів генів ScGPR1 і ScGPA2 у P. pastoris.У метилотрофних дріжджів P. pastoris глюкоза індукує мікропексофагію, тоді як етанол спричиняє макропексофагію. Нічого невідомо про розпізнавання глюкози для індукції пексофагії. Після того, як було показано, що GPR1 і GPA2 беруть участь у розпізнаванні глюкози для пексофагії у S. cerevisiae, ми вирішили дослідити, чи ортологи відповідних генів беруть участь у розпізнаванні глюкози для пексофагії у P. pastoris. Використовуючи базу даних P. pastoris (див. http://ergo.integratedgenomics.com/ERGO/) було ідентифіковано один потенційний ортолог гена GPR1(RPPA11208), що кодує білок Gpr1, довжиною 692 а.з. і один - гена GPA2 (RPPA04637), що кодує білок Gpa2, довжиною 437 а.з. Подібність між білками PpGpr1 і ScGpr1 становить приблизно 60 % на ділянці білка PpGpr1: 19-211 а.з. і 337-434 а.з., а подібність по всій довжині білка - приблизно 40 %. Подібність між білками PpGpa2 і ScGpa2 становить приблизно 65% на ділянці білка PpGpa2: 176-437 а.з. і 38-111 а.з., а подібність по всій довжині білка - 41 %.

Gpr1 і Gpa2 не задіяні у пексофагії олеат- і метанол-індукованих пероксиcом у P. pastoris. Отримані делеційні мутанти P. pastoris Дgpr1, Дgpa2 і Дgpr1 Дgpa2 тестували на пексофагію. Проводили два типи експериментів. В одному з них ми досліджували деградацію пероксисомної тіолази після інкубації клітин у мінімальному середовищі YNO (Ole) з олеатом протягом 23 год і перенесення у середовище SD-N (Glc) з глюкозою без джерела азоту та адаптації протягом 0, 15 та 20 год, тобто такі самі умови, які були використані для S. cerevisiae (рис. 2).

У другому типі експериментів клітини із YPD переносили на YNM (2 доби інкубації). Метанол-індуковані штами із YNM переносили на YNE (19 год адаптації) і YND (14 год адаптації). У цьому випадку ми аналізували активність ключового пероксисомного фермента алкогольоксидази in situ (рис. 3).

Було показано, що делеція ймовірних ортологів генів GPR1 і GPA2 у P. pastoris не має впливу як на деградацію пероксисомної тіолази (рис. 2), так і на інактивацію пероксисомної алкогольоксидази (рис. 3).

Gpr1 і Gpa2 не беруть участі у неспецифічній макроавтофагії у P. pastoris. Дослідження неспецифічної макроавтофагії здійснювали за умов голодування по джерелу азоту на чашках із флоксином Б. Штами переносили із YPD на SD-N+Phl B та інкубували 3 дні. В умовах голодування за джерелом азоту клітини контрольного штама із дефектами вакуолярних протеаз pep4 prb1 і таким чином, дефектні по всіх автофагійних шляхах, швидко втрачають життєздатність і на середовищі із флоксином Б забарвлюються у темно-рожевий колір. Клітини дикого типу, у якого не пошкоджена неспецифічна макроавтофагія, залишаються на цей період часу життєздатними і не забарвлюються. Порівнюючи інтенсивність забарвлення клітин досліджуваних штамів із контролями, було показано, що мутанти Дgpr1, Дgpa2 і Дgpr1 Дgpa2 не забарвлюються у темно-рожевий колір (рис. 3, флоксин Б). Отже, гени GPR1 і GPA2 у P. pastoris не мають, очевидно, впливу на неспецифічну макроавтофагію у цього виду дріжджів.

Snf3 і Rgt2 задіяні в індукованій глюкозою пексофагії у дріжджів S. cerevisiae. Попередньо ми показали, що мутанти пекарських дріжджів S. cerevisiae по компонентах сигнального шляху Gpr1 Дgpr1 і Дgpa2 після перенесення олеатних клітин у середовище з глюкозою є дефектними по деградації пероксисомного матриксного білка тіолази, фермента в-окислення жирних кислот (рис. 1). Однак відомо (Цzcan et al., 1996; Gancedo, 2008), що глюкоза розпізнається у S. cerevisiae також і альтернативними системами, які включають мембранний високоафінний Snf3 і низькоафінний Rgt2 глюкозні сенсори. Роль цих сенсорів в індукованій глюкозою пексофагії залишалася невідомою.

Ми показали, що у S. cerevisiae делеція гена високоафінного глюкозного сенсора SNF3 чи гена низькоафінного глюкозного сенсора RGT2, на відміну від делеції гена GPCR сенсора GPR1 незначно впливає на деградацію пероксисомної тіолази після інкубації клітин в середовищі YNO (Ole) з олеатом протягом 23 год (h) та перенесення у середовище SD(-N) з глюкозою без джерела азоту для адаптації протягом 0, 15 і 25 год при концентрації глюкози 2%, яка розпізнається низькоафінним глюкозним сенсором Rgt2. Однак, делеція генів обох сенсорів, SNF3 і RGT2 суттєво пригнічує деградацію тіолази (рис. 4).

Atg28 P. pastoris необхідний для мікро- і макропексофагії. Попередньо було показано, що у мутанта Дatg28 P. pastoris пошкоджена мікропексофагія і макропексофагія після перенесення метанольних клітин у глюкозне чи етанольне середовище відповідно (Stasyk et al., 2006).

Однак, результати наших досліджень клітин мутанта Дatg28 в умовах пексофагії показали, що деградація пероксисом в делеційного мутанта не є повністю заблокована. У вирощених на метанолі клітинах Дatg28 із пероксисомами, міченими за допомогою зеленого флуоресцентного білка GFP, що транспортувався у пероксисоми за допомогою сигналу доставки Ser-Lys-Leu (SKL), ми спостерігали, що після додавання глюкози або етанолу невелика кількість клітин містила пероксисоми на стадії деградації.

Важливо, що цей процес був значно сповільнений порівняно із диким типом і пероксисоми залишались присутніми в деяких клітинах Дatg28 навіть на пізніх етапах адаптації (рис. 5).

Цей висновок був підтверджений погодинним статистичним аналізом кількості пероксисом на клітину (рис. 6).

Цей результат є аналогічним до описаних для інших atg мутантів із нечітким фенотипом (Stromhaug et al., 2001; Guan et al, 2001).

Ідентифікація білка PpAtg35, що взаємодіє із білком Atg28 дріжджів P. pastoris. На сьогодні відомо 35 Atg білків, що відіграють певну роль в автофагії. Багато із них діють разом і утворюють мережу білків, що взаємодіють. Ми вирішили ідентифікувати партнери по взаємодії білка Atg28 P. pastoris, компонента базового автофагійного механізму, задіяного у всіх Atg шляхах і особливо, у мікропексофагії (Stasyk et al., 2006; Nazarko et al., 2009).

Для пошуку білків, які взаємодіють у YTH системі із білком Atg28 P. pastoris, ми використали спеціально сконструйовану з цією метою геномну бібліотеку ДНК P. pastoris для цього типу YTH системи. Як позитивнй контроль на взаємодію, ми використали пару білків HsRas і HsRaf1 (Д а.з. 1-56), які, як було показано, взаємодіють один з одним (Serebriiskii et al., 1999). Секвенування вставок із бібліотеки генів у плазмідній ДНК, виділеній із двох позитивних клонів, і аналіз їх білкових послідовностей дали змогу виявити гіпотетичний білок CAY67399 (a.з. 204-463) та Rdi1 CAY67682 (a.з. 1-96), задіяний у локалізації і регуляції Cdc42 (рис. 7).

В подальшому білок CAY67399 позначено як Atg35. Atg35 складається з 463 амінокислотних залишків (а.з.) і має два ймовірні функціональні домени: RING-finger (a.з. 5-47) і PHD-finger (a.з. 88-128). Цікаво, що Atg35 взаємодіє із Atg28 через свої С-кінцеві 260 a.з.

Найближчими гомологами Atg35 є гіпотетичні білки Pichia stipitis (PICST_60919), Pichia guilliermondii (PGUG_03993) і Clavispora lusitaniae (CLUG_01611).

Atg35 не задіяний у неспецифічній макроавтофагії і Cvt шляху у P. pastoris. Ми дослідили роль білка Atg35 у неспецифічній макроавтофагії на чашках з мінімальним середовищем без джерела азоту із флоксином Б і показали, що ген ATG35 не має чіткого впливу на неспецифічну макроавтофагію у P. pastoris.

Отриманий результат був підтверджений більш детально дослідженням процесингу гібридного білка GFP-Atg8 у вакуолях з утворенням вільного GFP шляхом імуноблот-аналізу з антитілами проти GFP (Shintani and Klionsky, 2004) (рис. 8 А).

Ми порівняли кінетику утворення вільного GFP в сконструйованого нами Дatg35 та дикого типу і відомого автофагійного мутанта Дatg1 після їх перенесеня у мінімальне середовище без джерела азоту. Було показано, що процесинг GFP-Atg8 в Дatg35 не відрізняється від такого у дикого типу, на відміну від Дatg1, де він заблокований. Ці результати були підтверджені також і дослідженням дозрівання Ape1.

Вакуолярний процесинг попередника Ape1 (prApe1) до зрілих форм (mApe1) відбувається, коли функціонують Cvt-шлях чи неспецифічна макроавтофагія за умов вегетативного росту чи голодування відповідно (Farrй et al,. 2007). У мутанта Дatg35 було нормальне дозрівання prApe1 за умов голодування, на відміну від мутанта Дatg1, у якого цей процес був заблокований (рис. 8 Б). Отже, ген ATG35 не задіяний у неспецифічній макроавтофагії у P. pastoris.

Відсутність гена ATG35 не мала впливу і на Cvt-шлях, оскільки дозрівання prApe1 було нормальним в мутанта Дatg35 за умов росту, але заблоковане у мутанта Дatg1 (рис. 8 Б, порівняйте 0 год для WT, Дatg35 і Дatg1). Разом ці дані свідчать, що ген ATG35 не бере участі у Cvt-шляху і неспецифічній макроавтофагії.

PpAtg35 необхідний для мікропексофагії, але не макропексофагії. Ми також вивчали наявність пексофагії у мутанта Дatg35 P. pastoris, спочатку за допомогою тестування активності AOX на чашках. У штама дикого типу не було залишкової активності AOX ні на етанольних, ні на глюкозних чашках внаслідок селективної деградації пероксисом шляхом макро- і мікропексофагії, відповідно. Однак, було виявлено значну залишкову активність AOX в мутанта Дatg35 на глюкозі, але не на етанолі. На противагу, мутанти Дatg28 і pep4 prb1 (дефектний по вакуолярних протеазах А і В) мали високу залишкову активність AOX як на глюкозних, так і на етанольних чашках, як і очікувалося.

Ці результати засвідчують, що ATG35 є необхідний для мікропексофагії, але не макропексофагії. Пошкодження мікропексофагії було підтверджене шляхом імуноблот-аналізу з антитілами проти AOX. При адаптації метанольних клітин до етанолу не було суттєвої різниці в деградації AOX між диким типом і Дatg35 (рис. 9). Однак, при адаптації до глюкози рівень AOX у мутанта Дatg35 знижувався в меншій мірі, ніж у дикого типу. Ген ATG35 комплементував дефект мікропексофагії в мутанта Дatg35. Мутант із пошкодженою пексофагією pep4 prb1 характеризувався стабільним рівнем білка AOX упродовж адаптації до глюкози (рис. 10). Як мікро-, так і макропексофагія були повністю заблоковані у мутанта pep4 prb1.

Флуоресцентна мікроскопія із пероксисомним GFP-SKL і розміщеним у вакуолярній мембрані FM4-64 забезпечила додатковий доказ специфічної ролі ATG35 у мікропексофагії. Після 6 год адаптації до етанолу клітини як дикого типу, так і мутанта Дatg35 містили більшу частину GFP-SKL у вакуолях. Після 6 год адаптації до глюкози клітини дикого типу виявляли в основному вакуолярне розташування GFP-SKL. Однак, мутант Дatg35 також мав поодинокі інтактні пероксисоми в цитозолі, часто оточені септуваннями вакуолі (VSM) (рис. 11).

Результати біохімічних і мікроскопічних експериментів чітко свідчать, що ATG35 частково необхідний для мікропексофагії метанольних пероксисом.

Щоб пересвідчитись, що ATG35 є насправді непотрібний для макропексофагії незалежно від природи індуктора пероксисом, ми дослідили макропексофагію олеатних пероксисом після перенесення олеатних клітин у глюкозне середовище (Nazarko et al., 2007). Рівні пероксисомної тіолази (THI) знижувались подібним чином як у штама дикого типу, так і в мутанта Дatg35. На противагу, THI не деградувала у мутанта pep4 prb1, як і очікувалося (рис. 12).

Таким чином, ATG35 непотрібний для макропексофагії і є дійсно специфічний лише для мікропексофагії.

PpATG28 і PpATG35 ко-експресуються і їхні продукти необхідні для утворення MIPA. Експресію генів ATG28 і ATG35 порівнювали за умов проліферації і деградації пероксисом. Штами дикого типу, які експресують Atg28-GFP і Atg35-eCFP з власних промоторів, підрощували протягом ночі у середовищі з глюкозою, етанолом і метанолом. Глюкозні, етанольні і метанольні клітини обох штамів мали таку ж саму кількість F1в (контроль нанесення) і зростаючі рівні Pex12 (контроль джерела вуглецю). Однак, вони мали незвичну експресію Atg28 і Atg35: найнижчий рівень обох білків на етанолі, середній рівень на глюкозі і найвищий рівень на метанолі (рис. 13).

Ко-експресія Atg28 і Atg35 на метанолі і глюкозі узгоджується з їх взаємодією і потребою для мікропексофагії.

Далі ми досліджували роль Atg28 і Atg35 у мікропексофагії. При мікропексофагії утворюються VSM і MIPA (Farrй et al., 2009). Попередньо ми показали, що утворення VSM є непошкоджене у штама Дatg35 (рис. 11).

Ми порівняли утворення MIPA у дикого типу і мутантів за допомогою флуоресцентної мікроскопії, використовуючи: (i) гібридний білок GFP-Atg8, експресований з-під ATG8 промотора, як маркер MIPA; (іі) BFP-SKL, експресований з-під AOX1 промотора, щоб помітити пероксисоми і (ііі) FM4-64 для мічення VSM. Метанольні клітини переносили у глюкозне середовище на 1 год, щоби проіндукувати мікропексофагію. MIPA знаходили у клітинах дикого типу і менш часто у клітинах atg35 (рис. 14).

Цікаво, що у мутанта atg28 було повністю заблоковане утворення MIPA, так само як і в мутанта atg1.

Результати цих досліджень були підтверджені кількісно за допомогою підрахунку кількості клітин із MIPA на 2D проекціях Z-стопок зображень GFP-Atg8 після накладання. В середньому, 17,6% клітин дикого типу і 11,5% клітин мутанта atg35 містили MIPA, на противагу до 0,8% і 0,6% клітин мутантів Дatg28 і Дatg1, відповідно.

На початок наших досліджень були відомі два білки, задіяні у мікро-, але не макропексофагії: б-субодиниця фосфофруктокінази Pfk1 і білок вакуолярної мембрани Vac8. Однак, Pfk1 бере участь у передачі сигналу від глюкози, а Vac8 - в утворенні VSM (не MIPA) і гомотиповому злитті VSM (Yuan et al., 1997; Fry et al., 2006; Oku et al., 2006). Vac8 також необхідний для Cvt-шляху у дріжджів (Wang et al., 1998; Farrй et al., 2007). Тому, Atg28 і Atg35 є єдиними відомими компонентами автофагійного механізму зі специфічною роллю у подовженні PAS з утворенням MIPA.

Більшу потребу в Atg28 порівняно із Atg35 в утворенні MIPA можна пояснити вторинною роллю Atg28 в організації PAS в усіх Atg-шляхах. Дійсно, (і) крім важливої ролі у мікропексофагії, Atg28 також частково необхідний для макропексофагії, Cvt-шляху і неспецифічної макроавтофагії (Stasyk et al., 2006; Nazarko et al., 2009); (ii) Atg28 взаємодіє з Atg17, який разом з Atg11 і Atg30 утворює специфічний пексофагійний PAS (Farrй et al., 2008; Nazarko et al., 2009) і (ііі) Atg29 і Atg31, ортологи білка Atg28 у S. cerevisiae, взаємодіють із Atg17, і разом із Atg1 і Atg13 утворюють спеціальний PAS для неспецифічної макроавтофагії (Kawamata et al., 2005; Kabeya et al., 2007; Kawamata et al., 2008; Cheong et al., 2008; Cao et al., 2008). Тому, ми припускаємо, що Atg17 залучає Atg28 в організацію PAS, а Atg28 залучає Atg35 в утворення MIPA. За умов мікропексофагії Atg28 є залучений одночасно у дві функції і стає необхідним. Ця модель є об'єктом наших подальших досліджень.

Atg35, на відміну від Atg28, не бере участі в утворенні пексофагосом у P. pastoris. Ми досліджували локалізацію гібридного білка GFP-Atg8 за умов адаптації метанольних клітин до етанолу. При макропексофагії утворюються пексофагосоми (Farrй et al., 2009). Попередньо ми показали, що макропексофагія є непошкодженою у штаму Дatg35. Ми порівняли утворення пексофагосом у дикого типу і мутантів за допомогою флуоресцентної мікроскопії і показали, що пексофагосоми формувалися і у клітинах дикого типу і у клітинах atg35 (рис. 15).

Варто додати, що у мутанта atg28 утворення пексофагосом не було пошкоджене, як і в atg35, на відміну від мутанта atg1, у якого цей процес є дефектним.

ВИСНОВКИ

В результаті виконання дисертаційної роботи встановлено, що розпізнавання глюкози в процесі пексофагії відрізняється у пекарських дріжджів S. cerevisiae і метилотрофних дріжджів P. pastoris. Ідентифіковано і охарактеризовано новий автофагійний білок Atg35, задіяний у мікропексофагії, а саме, у формуванні MIPA у P. pastoris.

Головні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Показано, що компоненти цАМФ-ПКА сигнального шляху, рецептор G-білка Gpr1 і G-білок Gpa2, задіяні у розпізнаванні глюкози в процесі пексофагії у пекарських дріжджів S. cerevisiae, але не у метилотрофних дріжджів P. pastoris.

2. Встановлено, що делеція гена високоафінного глюкозного сенсора SNF3 або гена низькоафінного глюкозного сенсора RGT2, на відміну від делеції гена GPCR сенсора GPR1, незначно впливає на деградацію пероксисом у S. cerevisiae. Однак, делеція генів обох сенсорів SNF3 і RGT2 суттєво сповільнює пексофагію.

3. Проведено пошук білків, які у дріжджовій дигібридній системі взаємодіють із білком Atg28 P. pastoris, та ідентифіковано новий автофагійний білок, названий Atg35.

4. Встановлено, що білок Atg35 P. pastoris, як і Atg28, бере участь у мікропексофагії, а саме, утворенні MIPA, але, на відміну від Atg28, не бере участі у макропексофагії, Сvt-шляху і неспецифічній макроавтофагії.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Atg28, a novel coiled-coil protein involved in autophagic degradation of peroxisomes in the methylotrophic yeast Pichia pastoris / O.V. Stasyk, O.G. Stasyk, R.D. Mathewson, J.C. Farrй, V.Y. Nazarko, O.S. Krasovska, S. Subramani, J.M. Cregg, A.A. Sibirny // Autophagy. 2006. Vol. 2, №1. P. 30-38 (дисертант сконструював мутант Дatg28, що містить GFP-SKL для флуоресцентного мічення пероксисом, провів дослідження пексофагії у мутанта Дatg28 шляхом флуоресцентної мікроскопії, здійснив статистичний аналіз кількості пероксисом на клітину в клітинах мутанта Дatg28 протягом пексофагії, брав участь у написанні статті).

2. Nazarko V.Y. G-protein-coupled receptor Gpr1 and G-protein Gpa2 of cAMP-dependent signaling pathway are involved in glucose-induced pexophagy in the yeast Saccharomyces cerevisiae / V.Y. Nazarko, J.M. Thevelein, A.A. Sibirny // Cell. Biol. Int. 2008. Vol. 32, №5. P. 502-504 (дисертант здійснив аналіз пексофагії у мутантів S. cerevisiae по генах GPR1 і GPA2, проаналізував отримані дані. Стаття була написана здобувачем спільно з науковим керівником).

3. Differences in glucose sensing and signaling for pexophagy between the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and the methylotrophic yeast Pichia pastoris / V.Y. Nazarko, K.O. Futej, J.M. Thevelein, A.A. Sibirny // Autophagy. 2008. Vol. 4, №3. P. 381-384 (дисертант здійснив пошук ортологів генів S. cerevisiae GPR1 і GPA2 у P. pastoris, сконструював делеційні мутанти по генах GPR1 і GPA2 P. pastoris, здійснив аналіз пексофагії у мутантів P. pastoris по генах GPR1 і GPA2, S. cerevisiae SNF3 і RGT2 та проаналізував отримані дані. Стаття була написана здобувачем спільно з науковим керівником).

4. Atg35, a micropexophagy-specific protein that regulates micropexophagic apparatus formation in Pichia pastoris / V.Y. Nazarko, T.Y. Nazarko, J.C. Farrй, O.V. Stasyk, D. Warnecke, S. Ulaszewski, J.M. Cregg, A.A. Sibirny, S. Subramani // Autophagy. 2011. Vol. 7, №4. P. 375-385 (дисертант здійснив пошук білків P. pastoris, що взаємодіють у дріжджовій дигібридній системі із білком Atg28 P. pastoris, здійснив аналіз отриманих даних, сконструював делеційний мутант по гену ATG35 P. pastoris, проаналізував пексофагію та неспецифічну макроавтофагію в мутанта Дatg35 P. pastoris. Брав активну участь у написанні статті).

5. Pdg2 is a unique coil-coiled protein involved in autophagic degradation of peroxisomes in the methylotrophic yeast Pichia pastoris / O.G. Stasyk, O.V. Stasyk, V.Y. Nazarko, J.M. Cregg, A.A. Sibirny // Proc. 1^st (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology with international representatives. Lviv (Ukraine), 2004. P. 321.

6. Nazarko V.Y. Identification and characterization of the novel autophagy-related proteins in Pichia pastoris / V.Y. Nazarko, A.A. Sibirny // Proc. 2^nd Ukrainian Congress for Cell Biology with international representatives. Kyiv (Ukraine), 2007. P. 269.

7. Glucose sensing and signaling for pexophagy: differences between the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and the methylotrophic yeast Pichia pastoris / K.O. Futej, V.Y. Nazarko, J.M. Thevelein, A.A. Sibirny // Proc. 12^th International Congress on Yeasts. Kyiv (Ukraine), 2008. P. 215.

8. The novel microautophagy-related genes ATG32 and ATG33 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris: identification and characterization / V.Y. Nazarko, T.Y. Nazarko, O.V. Stasyk, D. Warnecke, S. Ulaszewski, J.M. Cregg, S. Subramani, A.A. Sibirny // Proc. 12^th International Congress on Yeasts. Kyiv (Ukraine), 2008. P. 213.

9. ATG32 and ATG33, the novel micropexophagy-specific genes in the methylotrophic yeast Pichia pastoris / V.Y. Nazarko, T.Y. Nazarko, O.V. Stasyk, D. Warnecke, S. Ulaszewski, J.M. Cregg, S. Subramani, A.A. Sibirny // Proc. International Conference “Advances in Cell Biology and Biotechnology”. Lviv (Ukraine), 2008. P. 8.

10. ATG32, the novel microautophagy-related gene in the yeast Pichia pastoris: identification and characterization / V.Y. Nazarko, T.Y. Nazarko, O.V. Stasyk, D. Warnecke, S. Ulaszewski, J.M. Cregg, S. Subramani, A.A. Sibirny // Proc. EMBO Conference Series “Autophagy: Cell Biology, Physiology and Pathology”. Askona (Switzerland), 2009. P. 155.

11. Cell signaling in autophagic peroxisome degradation / V. Nazarko, K. Futej, J. Thevelein, A. Sibirny // Proc. conference “Cytokines and drugs in regulation of cell functioning”. Lviv (Ukraine), 2010. P. 18.

12. Atg35, a micropexophagy-specific protein that regulates micropexophagic apparatus formation in Pichia pastoris / V.Y. Nazarko, T.Y. Nazarko, J.C. Farrй, O.V. Stasyk, D. Warnecke, S. Ulaszewski, J.M. Cregg, A.A. Sibirny, S. Subramani // Proc. conference “Advances in Cell Biology”. Lviv (Ukraine), 2010. P. 28.

АНОТАЦІЯ

Назарко В. Ю. Функціональна роль білків, що беруть участь у пексофагії у дріжджів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2011.

У дисертації показано, що компоненти цАМФ-ПКА сигнального шляху, рецептор G-білка Gpr1 і G-білок Gpa2, задіяні у розпізнаванні глюкози для пексофагії у пекарських дріжджів S. cerevisiae, але не у метилотрофних дріжджів P. pastoris. Встановлено, що делеція гена високоафінного глюкозного сенсора SNF3 чи гена низькоафінного глюкозного сенсора RGT2, на відміну від делеції гена GPCR сенсора GPR1, незначно впливає на деградацію пероксисом у S. cerevisiae. Однак, делеція генів обох сенсорів SNF3 і RGT2 суттєво сповільнює пексофагію.

Проведено пошук білків, які у дріжджовій дигібридній системі взаємодіють із білком Atg28 P. pastoris, та ідентифіковано новий автофагійний білок, названий Atg35. Встановлено, що білок Atg35 P. pastoris, як і Atg28, бере участь у мікропексофагії, а саме, утворенні MIPA, але, на відміну від Atg28, не бере участі у макропексофагії, Сvt-шляху і неспецифічній макроавтофагії.

Ключові слова: пексофагія, Atg білок, MIPA, дріжджі, цАМФ-ПКА сигнальний шлях, розпізнавання глюкози.

АННОТАЦИЯ

Назарко В. Ю. Функциональная роль белков, что участвуют в пексофагии у дрожжей. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2011.

В диссертации показано, что компоненты цАМФ-ПКА сигнального пути, рецептор G-белка Gpr1 и G-белок Gpa2, задействованы в распознавании глюкозы при пексофагии в пекарских дрожжей S. сerevisiae, но не в метилотрофных дрожжей P. pastoris. Доказано, что делеция гена высокоафинного глюкозного сенсора SNF3 или гена низкоафинного глюкозного сенсора RGT2, в отличие от делеции гена GPCR сенсора GPR1, незначительно влияет на деградацию пероксисом в S. cerevisiae. Однако, делеция генов обоих сенсоров SNF3 і RGT2 существенно замедляет пексофагию.

Проведен поиск белков, которые в дрожжевой дигибридной системе взаимодействуют с белком Atg28 P. pastoris, и идентифицировано новый автофагийный белок, названный Atg35. Показано, что белок Atg35 P. pastoris как и Atg28, вовлечен в микропексофагию, а именно, образовании MIPA, но, в отличие от Atg28, не участвует в макропексофагии, Сvt-пути и неспецифической макроавтофагии.

Ключевые слова: пексофагия, Atg белок, MIPA, дрожжи, цАМФ-ПКА сигнальный путь, распознавание глюкозы.