Молекулярні та клітині механізми вікових змін функціональних властивостей сполучної тканини

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ В. Н. КАРАЗІНА

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

УДК: 577.12:577.112:577.24

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

МОЛЕКУЛЯРНІ ТА КЛІТИНІ МЕХАНІЗМИ ВІКОВИХ ЗМІН ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ СПОЛУЧНОЇ ТКАНИНИ

ЕЛЬ-ТА'АЛУ АББАС

БУБАКАР

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Клімова Олена Михайлівна, ДУ «Інститут загальної та невідкладної хірургії НАМНУ», м. Харків, завідувач діагностичної лабораторії з імуноферментним аналізом; доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАНУ, м. Харків, завідувач відділу експериментальної кріомедицини

Захист відбудеться « 06 » 07 2011 р. о 15:15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна (61022, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитись в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна (61022, м. Харків, пл. Свободи, 4)

Автореферат розісланий « 06 » 06 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В. М. Дзюба

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сполучна тканина грає суттєву, а часто і визначальну роль у морфогенезі, розвитку і старінні органів і організму в цілому. Специфічна особливість цієї тканини - переважання в її складі високоорганізованого й сильно розвиненого міжклітинного матриксу. Конструкційні біополімери матриксу - колаген, еластин і глікозаміноглікани (ГАГ) визначають функціональні властивості цієї тканини.

Показано, що в онтогенезі всі різновиди сполучної тканини стають більш міцними та жорсткими, а структурна стабільність надмолекулярних комплексів матриксу підвищується. Ці зміни розглядаються як адаптація, яка необхідна для збереження в онтогенезі відповідності між функціональними, в першу чергу механічними, властивостями сполучної тканини та вимогами, що пред'являються до неї в процесі зростання маси і фізичної сили організму (Waller J.M., Maibach H.I., 2006). Основою таких змін функціональних властивостей мають бути структурні перебудови матриксу, що полягають у зміні його компонентного складу, та у можливих змінах властивостей самих молекул конструкційних біополімерів.

Ці структурні перебудови повинні залежати від онтогенетичних особливостей клітинного метаболізму, які є частиною загальної програми вікового розвитку організму. Клітини сполучної тканини, змінюючи інтенсивності синтезу і розпаду конструкційних біополімерів і ферментів їх процесингу, визначають вікові особливості складу матриксу і ступеня його розвитку (Xin X., 2008).

Однак робіт, присвячених віковим змінам структури індивідуальних молекул біополімерів матриксу, його перебудовам на надмолекулярному рівні, зв'язку цих перебудов з клітинним метаболізмом і, як слідство, змінам функціональних властивостей сполучної тканини, практично не існує. Невідомі причини та біологічне значення інверсії вікового підвищення структурної стабільності матриксу в ранньому постнатальному онтогенезі. Не вивчені особливості зв'язку вікових змін метаболізму конструкційних біополімерів в тканині і змін їх метаболізму в індивідуальних клітинах сполучної тканини, які пройшли різну кількість поділень.

Тому доцільним є більш глибоке дослідження причинно-наслідкових зв'язків між віковими змінами інтенсивності синтезу і розпаду колагену, еластину і ГАГ, їх концентрацій, рівнем внутрішньо- та зовнішньоклітинного процесингу колагену, функціональними особливостями його молекул, будовою матриксу і властивостями сполучної тканини. Важливим є і вивчення синтезу колагену і ГАГ фібробластами в залежності від кількості їх поділень. Ці дослідження актуальні для розуміння невідомих ще особливостей морфогенезу органів, вікових змін їх функціональних властивостей, загальних та специфічних причин захворювань сполучної тканини і можуть бути корисні у пошуках нових молекулярних методів їх корекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна в рамках держбюджетних тем «Фізіолого-біохімічні та структурно-функціональні закономірності клітинної адаптації до дії екзо- та ендогенних чинників» (№ державної реєстрації 0106U001584) і «Механізми впливу фізичних факторів і біологічно активних речовин на метаболізм та функціональні властивості клітин сполучної тканини» (№ державної реєстрації 0109U005083)

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - встановлення особливостей зв'язку в постнатальному онтогенезі між: обміном колагену типу І, еластину і ГАГ в шкірі, аорті і хвостових сухожиллях та їх функціональним властивостями (в'язко-пружність, структурна стабільність), процесингом колагену типу І і характером його фібрилоутворення, залежність накопичення колагену і ГАГ в культурі фібробластів від їх віку.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання: вивчити in vitro у щурів віком 1, 3, 12 та 24 місяців -

1) в'язко-пружні властивості (міцність, модуль Юнга, граничну деформацію) шкіри, аорти і хвостових сухожиль;

2) інтенсивність синтезу, розпаду і концентрацію колагену, еластину і ГАГ у шкірі;

3) термостабільність надмолекулярних колагенових структур за кінетикою і вільною енергією Гіббса їх руйнування у шкірі ;

4) ступінь гідроксилювання пролілу (Про), окислювального дезамінування лізилу (Ліз) і гідроксилізилу (Оліз) та вмісту шиффових основ в колагені типу І із шкіри;

5) параметри (довжини і діаметри) колагенових фібрил, які утворюються in vitro з колагену типу І шкіри щурів;

6) залежність накопичення колагену і ГАГ в культурі фібробластів від кількості клітинних поділень у ній.

Об'єкт дослідження - молекулярні і клітинні механізми зв'язку між метаболізмом структурних біополімерів сполучної тканини і її функціональними властивостями в постнатальному онтогенезі.

Предмет дослідження - синтез, розпад і вміст колагену типу І, еластину, ГАГ в сполучній тканині, її в'язко-пружні властивості і термостабільність, процесинг і фібрилоутворення колагену, синтез колагену і ГАГ фібробластами.

Методи дослідження - радіоізотопний аналіз, аналітичне визначення альдегідних та е-аміногруп і флуориметричне визначення шиффових основ в колагені, іонообмінна хроматографія ГАГ, механічні виміри в'язко-пружних властивостей тканин, виміри кінетики і енергетики їх гідротермічного скорочення, гель-електрофорез, культивування фібробластів, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено кількісну оцінку зв'язку між віковими особливостями синтезу, розпаду і вмісту колагену, еластину і ГАГ, а також процесингу колагену у шкірі, аорті та хвостових сухожиллях, як моделі немінералізованої сполучної тканини, та їх функціональними властивостями - в'язко-пружністю, структурною стабільністю і питомим вкладом енергій в'язкої течії та гуківської пружності в тканині, яка деформується. Показано, що інверсія напрямку вікових змін цих властивостей в ранньому постнатальному онтогенезі визначається зміною співвідношення інтенсивностей синтезу цих біополімерів на тлі підвищення інтенсивностей розпаду кожного з них, а також переважним розвитком у колагені внутрішньомолекулярних зшивок. Біологічне значення цього явища міститься в тому, що в цей період відбувається інтенсивний ріст організму і міжклітинні комплекси з великою структурною стабільністю і жорсткістю не сприяють клітинній диференціації, переміщенню клітин і успішному морфогенезу. Вперше продемонстровано, що вікові зміни фібрилогенезу і розмірів колагенових волокон у тканині визначаються змінами інтенсивності окислювального дезамінування Ліз і Оліз при внутрішньоклітинному, а утворення міжмолекулярних зшивок типу шиффових основ - при позаклітинному процесингу. Вперше встановлено, що в основі вікового зменшення накопичення конструкційних біополімерів в тканині лежить зниження інтенсивності їх синтезу фібробластами з ростом кількості клітинних поділень.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють сучасні уявлення про молекулярні та клітинні механізми морфогенезу органів, розвитку та вікових змін властивостей їх сполучної тканини у нормі та патології. Виявлені особливості дії цих механізмів в постнатальному онтогенезі можуть бути застосовані в педіатрії, геронтології, спортивній медицині, хірургії, ортопедії, при лікуванні захворювань сполучної тканини.

Окремі положення роботи та методи дослідження використовуються у навчальному процесі в спецкурсах «Структура та функції білків» і «Медична біохімія» та лабораторно-практичних заняттях «Методи дослідження вуглеводів» на кафедрі біохімії Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, постановка мети і задач, вибір об'єктів та методів досліджень, обговорення та інтерпретація одержаних експериментальних результатів і формулювання висновків було здійснено разом з науковим керівником.

Автор особисто опрацював фахову літературу за темою дисертації, виконав експериментальні дослідження, прийняв активну участь у написанні і підготовці до публікації всіх статей і тез за темою дисертаційної роботи та провів статистичний аналіз одержаних результатів. В дисертації не використані ідеї або розробки, які належать співавторам опублікованих наукових робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені і обговорені на: II та IV Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології», Львів, 2007, 2009; ІІ, IV та V Міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери», Харків, 2007, 2009, 2010; Всеукраїнській науковій конференції «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии», Дніпропетровьск, 2008; VIІІ та IX Міжнародному симпозіумі «Биологические механизмы старения, 2008, 2010; XVIII з'їзді Українського фізіологічного товариства, Одеса, 2010; Х Українському біохімічному з'їзді, Одеса, 2010.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 19 робіт, які повністю відбивають основний зміст дисертації, у тому числі 6 статей, з них 5 - у фахових наукових журналах, та 13 - в матеріалах і тезах з'їздів, конференцій, симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків. Список використаних літературних джерел містить 277 найменувань. Робота ілюстрована 26 рисунками і 16 таблицями.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Дослідження проведені на шкірі, аорті і хвостових сухожиллях щурів-самців лінії Вістар віком 1, 3, 12 і 24 місяці, а також на культурі фібробластів з лімбальної області рогівки ока кролів - самців віком 1,5 місяці. В експериментах дотримувались рекомендацій Європейської конвенції «Про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985) та Закону України «Про захист від жорстокого поводження» (Київ, 2006).

Тварин декапітували під тіопенталовим наркозом.

Метаболізм біополімерів in vitro вивчали на очищених зразках шкіри масою ~800 мг, цілій аорті і хвостових сухожиллях масою ~400 мг. Зразки інкубували у розчині Рінгера-Кребса 6 годин при t = 360 С у присутності 3Н- або 14С-Про (0,4 МБк/г тканини), 14С-Ала (0,4 МБк/г тканини), 14С-глюкози (0,5 МБк/г тканини); розтирали в рідкому азоті до порошкоподібного стану. Колаген I типу екстрагували з порошків 1 М NaCl і 2,5 % розчином пепсину в 0,5 М СН3СООН (Verzijl N. еt al., 2000; Sitthipong N., 2007 відповідно). Еластин екстрагували з порошків після вилучення з них колагену типу І 0,1 N розчином NaOH (Mecham R. P., 2008). Обидва білки вилучали з екстрактів діалізом (Freudenberg U., 2007) і концентрацію кожного розраховували за вмістом Опро (Mecham R. P., 2008) .

Для виділення ГАГ порошки тканин гідролізували колагеназою і осаджували ГАГ 2 % хлоридом цетилпіридинію (Nagai N. еt al., 2004). Фракціонування виділених ГАГ проводили іонообмінною хроматографією на Dowex 1Ч2 (Меркурьева Р. В. и др., 1974; Osmers R., 1993). Вміст дерматансульфату визначали за L-ідуроновою кислотою (Huang W. C., 2007), інших ГАГ - за D-глюкуроновою кислотою (Termeer C. C., 2000).

Інтенсивність синтезу колагену, еластину та ГАГ оцінювали за питомими радіоактивностями 3Н- або 14С-Опро, 14С-Ала і 14С-глюкози відповідно. Інтенсивність розпаду колагену оцінювали за вмістом радіоактивного Опро в інкубаційному середовищі, а еластину - за радіоактивністю пептиднопов'язаного 14С-Ала, який виділяли з нього на сефадексі G-250. Радіоактивність проб вимірювали на лічильнику Beckman LC 7800.

У колагені типу І ступінь гідроксилювання Про розрначали ряли за методами () і () відповідно.аховували за відношенням {3Н-Опро /(3Н-Про+3Н-Опро)}Ч100% після розподілу радіоактивних Про та Опро (Berg R. A. еt al., 1993). Ступінь окислювального дезамінування Ліз та Оліз) оцінювали за вмістом вільних е-аміно- та альдегідних груп (Дубинина Е. Е., 2000; та Sims T. J., 2000 відповідно). Визначали шиффові основи у розчинах колагену в 1 М NaCl (концентрація білка 0,1 % - 0,25 %) на спектрофлюориметрі MPF-4 при л збудження і емісії флюоресценції 360 нм і 430 нм відповідно (Rice-Evans C. A. еt al., 1991).

В'язко-пружні властивості шкіри, аорти і хвостових сухожиль розраховували за кривими напруга-деформація для зразків цих тканин в фізіологічному розчині для теплокровних на установці, яка записує в автоматичному режимі залежність абсолютного подовження зразка від прикладеної напруги. Питомі долі енергій в'язкої течії і пружної деформації розраховували за відповідними площинами областей під кривою напруга - деформація (Никитин В. Н. и др., 1977).

Подвійне променезаломлення колагенових волокон хвостових сухожиль вимірювали на поляризаційному мікроскопі МП-2 з компенсатором Берека (Ринне Ф., Берек М., 1987).

Термостабільність надмолекулярних колагенових структур оцінювали за кінетикою їх руйнування при прогріві шкіри в дистильованій воді (600 С) і подальшим розрахунком енергії активації Гіббса цього процесу (Клотц И., 1970).

Питомий вміст часток зруйнованих молекул колагену різного ступеня полімеризації визначали за їх електрофорезом в поліакриламідному гелі і виражали у відсотках від загальної концентрації колагену (Kubо K., Takagi T., 1984).

Штучні фібрили отримували шляхом їх самозбирання в розчинах колагену типу І (Fessler J. H., Yuan L., 2004; Veis A., 2004). Їх утворення контролювали мікрофотографічно на поляризаційному мікроскопі МП-2.

Отримували первинну культуру фібробластів та проводили субкультивування при 370 С, 95 % вологості і 5 % СО2 у повноцінному середовищі Дюльбеко з високим вмістом глюкози і 10% ембріональної сироватки. Фібробласти сформованого моношару використовували для подальшого посіву. Для пересіву брали клітини на початку стаціонарної фази росту культури. Концентрацію колагену і ГАГ у культуральному середовищі визначали аналітично за вмістом в ньому Опро і D-глюкуронової кислоти відповідно.

Для статистичної обробки результатів використовували критерії вірогідності Ст'юдента та Манна-Уітні. Вірогідними вважали результати з р < 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження зв'язку між віковими змінами в'язко-пружних властивостей і метаболізмом структурних біополімерів у шкіри, аорті і хвостових сухожиллях щурів. Вікові зміни в'язко-пружних властивостей шкіри, аорти та хвостових сухожиль (табл. 1) якісно однакові в усіх трьох досліджених різновидах сполучної тканини. Міцність тканин безперервно підвищується з віком, а їх модуль Юнга в області пружної деформації і енергія пружної деформації та максимальне відносне подовження і енергія в'язкої течії у 3-місячному віці мають, відповідно, максимальне та мінімальне значення. Таким чином, в період з 1 до 3 місяців розтяжність тканин збільшується, а їх жорсткість зменшується. Далі вікова динаміка цих показників стає протилежною.

Найбільш важливу роль у визначенні абсолютних чисельних значень кожної з в'язко-пружних властивостей конкретної тканини грають питомі вмісти біополімерів, які визначають різні сторони її пружності і в'язкості як цілого. Оскільки на протязі вивченого періоду вікові зміни механічних властивостей в трьох досліджених різновидах тканин якісно однакові, подальші експерименти проведено тільки на шкірі. Лише окремі експерименти проводили на хвостових сухожиллях.

Таблиця 1 Вікові зміни міцності (ур, МН/м2), модуля Юнга (E, МН/м2), максимального відносного подовження (ер, %), відносного вкладу енергій пружної деформації

Показник	Вік тварин, міс.
	1	3	12	24
Шкіра
ур, МН/м2	2,40 ± 0,19	4,21 ± 0,44*	5,22 ± 0,37*,**	7,58 ± 0,43*,**
E, МН/м2	9,46 ± 0,79	5,73 ± 0,91*	8,32 ± 0,87*,**	12,15 ± 1,10*,**
ер, %	10,43 ± 0,58	13,58 ± 1,24*	12,15 ± 1,06*	10,00 ± 0,77**
Ев.т.	25,3 ± 2,2	33,6 ± 2,6*	20,1 ± 2,1*	13,8 ±1,4*
Е п.д.	74,8 ± 4,0	66,4 ± 3,5*	79,9 ± 5,6*	86,2 ± 7,3*
Аорта
ур, МН/м2	1,43 ± 0,12	3,65 ± 0,26*	5,35 ± 0,34*,**	6,41 ± 0,24*,**
E, МН/м2	5,32 ± 0,21	3,77 ± 0,31*	5,01 ± 0,29*,**	8,13 ± 0,27*,**
ер, %	35,06 ± 1,18	54,31 ± 1,27*	47,75 ± 1,21*,**	45,84 ± 1,09*
Ев.т.	47,2 ± 2,7	54,1 ± 3,1*	43,5 ± 2,8*,**	39,3 ± 2,1*
Еп.д.	52,7 ± 3,3	46,0 ± 3,2*	56,3 ± 3,6*,**	60,8 ± 3,3*,**
Хвостові сухожилля
ур, МН/м2	1,64 ± 0,16	3,92 ± 0,20*	5,38 ± 0,25*,**	6,14 ± 0,31*,**
E, МН/м2	19,93 ± 1,12	20,21 ± 1,14	30,22 ± 1,22*,**	39,36 ± 1,20*,**
ер, %	8,23 ± 0,31	19,40 ± 0,44*	17,81 ± 0,37*,**	15, 60 ± 0,49*,**
Ев.т.	21,8 ± 1,9	28,6 ± 2,4*	20,9 ± 2,3*,**	15,1 ± 1,8*,**
Е п.д.	78,2 ± 4,7	71,5 ± 4,5	79,0 ± 4,4	85,0 ± 5,1
(na - no) Ч10-3	2,78±0,22 2,78±0,22	3,65±0,25 *	4,32±0,26*,**	4,67±0,31*

Примітка. * - вірогідно (р < 0,05) відносно контролю (1 або 3 міс.); ** - вірогідно (р < 0,05) відносно попереднього значення показника.

В табл. 2 наведені дані про вікові зміни вмісту в шкірі колагену, еластину і ГАГ, які входять до складу протеогліканів матриксу і до основної речовини дерми. Концентрація всіх цих біополімерів в шкірі безперервно підвищується в онтогенезі.

Підвищення концентрацій, особливо колагену, призводить до вікового росту міцності тканини. Суттєву роль грає також упорядкування колагенових волокон, про що свідчить підвищення в них з віком подвійного променезаломлення (табл.1).

Як відомо (Viidik А., 1985), колаген визначає гуківську, еластин - гумоподібну пружність матриксу шкіри, а ГАГ- її в'язкі властивості. Тому динаміки модуля Юнга, максимального відносного подовження, а також енергій в'язкої течії і пружної деформації мають залежати від вікових динамік питомого вмісту структурних біополімерів. Це можна оцінити за співвідношенями колаген/еластин і колаген/УГАГ (табл. 2).

Таблиця 2 Вікові зміни вмісту колагену, еластину і ГАГ (мг/г сирої тканини) та відношень колаген/еластин і колаген/УГАГ у шкірі щурів

Показник	Вік тварин, міс.
	1	3	12	24
Колаген	9,40 ± 1,63	12,62 ± 0,95*	23,30 ± 1,4*,**	31,73 ± 2,8*,**
Еластин	0,79 ± 0,18	1,53 ± 0,25*	2,31 ± 0,41*	2,40 ± 0,43*
Гіалуронова кислота	3,77± 0,28	5,07± 0,37*	7,84 0,67*,**	8,60 ± 0,74*
Гепарансульфат	3,02 ± 0,23	3,73± 0, 33	7,19 0,58*,**	11,14±1,21*,**
Хондроітинсульфати	4,83 ± 0,50	5,34± 0, 55	7,80 0,72*,**	12,81 1,45*,**
Дерматансульфат	1,64 ± 0,17	3,53± 0,29*	5,57±0,63*,**	6,38± 0,82*
Кератансульфат	1,14 ± 0,15	3,67± 0,24*	5,57±0,74*,**	9,43 ± 1,57*,**
Сума ГАГ	14,40 ± 2,73	21,63 ± 4,05*	33,97±6,27*,**	48,36±9,11*,**
колаген/еластин	11,90	8,25	10,10	13,20
колаген/У ГАГ	0,65	0,58	0,61	0,66

Примітка. *,** - те ж, що в табл.1.

В 3-місячному віці вони мають мінімальні значення. Саме тому для величин модуля Юнга, максимального відносного подовження, питомих доль енергій в'язкої течії і пружної деформації в шкірі тварин після 3-місячного віку cпостерігається інверсія їх вікової спрямованості (табл. 2). Це підтверджується високим ступенем позитивної і негативної кореляцій між модулем Юнга і максимальним відносним подовженням та відношеннями колаген/еластин і колаген/У ГАГ відповідно в шкірі щурів (табл. 3).

Таблиця 3. Коефіцієнти лінійної кореляції між модулем Юнга та максимальним відносним подовженням і відношеннями колаген/еластин і колаген/УГАГ в шкірі щурів

Показник	колаген/еластин	колаген/У ГАГ
E	rE = 0,978*	rE = 0,706**
е	rе = - 0,868**	rе = - 0,727**

Примітка. * - р < 0,05; ** - р < 0,1

Природно, що вікові особливості динамік концентрацій кожного з досліджених біополімерів в шкірі залежать від характеру інтенсивності їх обміну на різних етапах онтогенезу. Це добре видно на прикладі колагену і еластину.

Дані щодо радіоактивностей свіжосинтезованих колагену і еластину та продуктів розпаду обох білків в шкірі щурів різного віку (табл. 4) свідчать, що інтенсивності синтезу обох білків в шкірі постійно знижуються з віком тварин. Таку ж динаміку мають і інтенсивності їх розпаду.

Так, до 3 місяців синтез колагену в шкірі знижується до 61% його рівня в 1 місяць, а еластину - до 74%. Розпад колагену у 3-місячному віці складає 56% 1-місячного рівня, а еластину - 48% (табл. 4). Більш різке зниження синтезу і підвищення розпаду колагену у порівнянні з еластином від 1 до 3 місяців призводить до більшого накопичення останнього в шкірі, і відношення колаген/еластин в ній в З-місячному віці стає меншим, ніж в 1 місяць (табл. 4).

Таблиця 4 Вікові зміни питомої радіоактивності 3Н-Опро {(імп./хв)/мг колагену}Ч102 та 14С-Ала {(імп./хв)/мг еластину}Ч102 в процесах синтезу і розпаду колагену і еластину в шкірі щурів

Білок	Стадія обміну	Вік тварин, міс.
		1	3	12	24
Колаген	Синтез	980 ± 51	601 ± 58*	413 ± 39*,**	310 ± 33*,**
	Розпад	463 ± 45	257 ± 33*	160 ± 26*,**	103 ± 19*,**
Еластин	Синтез	674 ± 56	499 ± 48*	261 ± 37*,**	142 ± 36*
	Розпад	391 ± 40	186 ± 28*	171 ± 26*,**	155 ± 22*

Примітка. *,** - те ж, що в табл. 1.

Після 3-місячного віку взаємовідношення між обміном колагену і еластину обертається. У 24 місяці синтез колагену зменшується до 52%, а еластину - до 28% 1-місячного рівня. Аналогічні значення для розпаду цих білків становлять 40% і 83%. Тому від 3- до 24-місячного віку накопичення колагену в шкірі перевищує накопичення еластину, а відношення колаген/еластин постійно зростає (табл. 3).

Таким чином, важливою причиною вікових змін питомого вмісту різних типів конструкційних біополімерів в сполучній тканині, і, як наслідок, вікових змін її в'язко-пружних властивостей є особливості взаємовідносин між синтезом і розпадом цих біополімерів на різних етапах онтогенезу.

Дослідження зв'язку між віковими змінами термостабільності надмолекулярних комплексів матриксу і процесингу колагену типу І з шкіри щурів. В табл. 5 наведені дані про кінетичні параметри і розраховані за ними величини вільної енергії Гіббса теплового руйнування колагену типу І в надмолекулярних комплексах матриксу шкіри щурів.

Таблиця 5 Вікові зміни кінетичних параметрів та вільної енергії Гіббса руйнування колагену типу І в надмолекулярних комплексах матриксу при гідротермічній обробці шкіри щурів

Показник	1 етап руйнування	2 етап руйнування
	Вік тварин, міс.
	1	3	12	24	1	3	12	24
Час, хв	20,3± 0,5	18,0± 0,4*	23,4± 0,5*,**	27,2± 0,7*,**	102,6± 0,83	100,0± 0,75*	97,1± 0,68*,**	93,6± 0,66*,**
Ступінь, %	45,5 ± 2,1	59,0 ± 4,0*	53,5 ± 3,2*	З9,5 ± 1,9*,**	61,5 ± 3,2	73,5 ± З,9*	68,0 ± 3,8*	56,0 ± 2,8*,**
Константа швидкості, с-1	3,5 ± 0,6	5,3 ± 1,1*	З,9 ± 0,9*	2,0 ± 0,4*,**	0,119 ± 0,014	0,112 ± 0,008	0,115 ± 0,012	0,123 ± 0,016
Вільна енергія Гіббса, кДж/моль	89,7 ± 0,8	87,3 ± 0,7*	91,2 ± 1,0*,**	93,8 ± 1,2*,**	99,0 ± 1,6	98,8 ± 1,6	99,0 ± 1,6	98,9 ± 1,6

Примітка. *, **- те ж, що в табл. 1.

Як видно, процес руйнування складається з двох стадій. На першій швидкість руйнування колагенових структур в усіх вікових групах суттєво більша, ніж на другій. При цьому тривалість першої стадії з віком збільшується, а другої - зменшується. Вільна енергія Гіббса руйнування вища на другій стаді процесу. Очевидно, на першій стадії з надмолекулярних структур виходять частки зруйнованих молекул колагену, слабко пов'язаних в цих структурах, а на другій відбувається руйнування сильно зшитого полімеру. Оскільки, незалежно від віку тварин, структура такого полімеру одна й та ж, енергетичні параметри його руйнування на цій стадії не змінюються в онтогенезі.

В той же час швидкість і ступінь руйнування колагенових структур на обох стадіях підвищуються від 1 до 3 місяців, після чого починають знижуватися. Динаміка ж вільної енергії Гіббса на першій стадії має протилежну спрямованість, і значення цього показника мінімальне у 3-місячному віці.

Таким чином, термостабільність колагенових надмолекулярних утворень знижується в період від 1 до 3 місяців, і лише після цього починає безперервно збільшуватись до 24-місячного віку.

Для з'ясування причин цього явища були досліджені структурні особливості продуктів руйнування колагенових надмолекулярних утворень матриксу шкіри тварин різного віку. В табл. 6 наведені отримані електрофорезом дані про питомий вміст в зруйнованому колагені б-часток (індивідуальних поліпептидних ланцюгів молекул колагену), в-часток (попарно об'єднаних поліпептидних ланцюгів однієї або різних молекул) і більш високомолекулярних комплексів поліпептидних ланцюгів, об'єднаних міжмолекулярними зв'язками.

Таблиця 6 Вікові зміни вмісту часток різного ступеня полімерізації, які вийшли в розчин після гідротермичної обробки шкіри щурів, %

Тип часток	Вік тварин, міс.
	1	3	12	24
б-частки	65,4 ± 5,9	75,4 ± 7,2	49,1 ± 5,0*,**	23,0 ± 2,2*,**
в-частки	26,7 ± 3,4	13,9 ± 2,5*	28,7 ± 3,9*,**	40,5 ± 5,0*,**
Високополімерні	7,8 ± 1,7	10,8 ± 2,6	21,9 ± 3,3*,**	36,5 ± 4,8*,**

Примітка. *, ** - те ж, що в табл. 1.

Від 1 до 3 місяців питомий вміст б-часток має велику тенденцію до збільшення, в-часток - збільшується вірогідно, а вміст високополімерних часток практично не змінюється. Лише після 3-місячного віку починається постійне зменшення питомого вмісту б-часток і збільшення вмісту в- і високополімерних часток. Це означає, що з 1 до 3 місяців питомий сумарний вміст внутрішньомолекулярних і міжмолекулярних зв'язків, тобто загальний рівень поперечного ковалентного зв'язування в колагенових структурах, зменшується. Тільки після 3-місячного віку йде паралельне утворення зв'язків обох типів. При цьому в період від 3 до 24 місяців кількість в-часток підвищується в 2,9, а високополімерних - у 3,4 рази (табл. 6). Це може свідчити про більш інтенсивне міжмолекулярне, ніж внутрішньомолекулярне зв'язування на цьому етапі онтогенезу.

Утворення поперечних ковалентних зв'язків в колагенових структурах є результатом посттрансляційного окислювального дезамінування е-NH2-груп Ліз та Оліз в поліпептидних ланцюгах колагену в альдегідні групи аллізилу (Алліз) і гідроксиаллізилу (Оалліз), яке каталізується лізилоксидазою. В подальшому утворюються або міжмолекулярні альдімінні зв'язки - шиффові основи - при взаємодії е-NH2-груп з СОН-групами сусідніх молекул, або - при взаємодії двох СОН-груп - альдолі, які можуть бути і внутрішньо-, і міжмолекулярними (Yamauchi M., Masashi M., 2008).

Результати вимірювання вільних е-NH2- і СОН-груп в колагені тварин різного віку надані в табл. 7.

Таблиця 7 Вікові зміни вмісту вільних е-NH2 - груп Ліз і Оліз, альдегідних СОН-груп Алліз і Оалліз (мг/г колагену), шиффових основ (мкМ/г колагену) та ступеня гідроксилювання Про(%) у свіжосинтезованому колагені типу І з шкіри щурів

Показник	Вік тварин, міс.
	1	3	12	24
е-NH2 - групи	11,66 ± 0,7	24,69 ± 2,2*	28, 13 ± 2,8*	30,80 ± 3,5*
СОН - групи	50,98 ± 6,8	41,39 ± 6,3	33,93 ± 2,1*	28,67 ± 3,9*,**
Шиффові основи	0,0039 ± 0,0008	0,0051 ± 0,0010	0,0120 ± 0,0015*	0,0158 ± 0,0018*,**
{3Н-Опро / (3Н-Про+3Н-Опро)}Ч100%	52,4 ± 1,8	51,3 ± 1,6	46,4 ± 1,5*,**	44,2 ± 1,3*

Примітка. *, **- те ж, що в табл. 1.

Згідно з ними активність лізилоксидази з віком істотно знижується: в 1-місячному віці вміст СОН-груп Алліз і Оалліз в колагені майже в 5 разів більший вмісту е-NH2 -груп Ліз і Оліз. В подальшому ця різниця зменшується, і в 24 місяці кількість амінних і альдегідних груп стає однаковою.

Незважаючи на велику кількість СОН-груп, поперечне зв'язування між 1 та 3 місяцями в колагенових структурах не збільшується (табл. 6). Можливо, це пов'язано з інтенсивним синтезом і накопиченням колагену в шкірі в цей період. Після ж 3-місячного віку, в результаті зниження активності лізилоксидази і збільшення питомого вмісту е-NH2-груп Ліз і Оліз в колагені і їх взаємодії з СОН-групами, починають інтенсивно утворюватися міжмолекулярні зв'язки альдімінного типу. Це підтверджуються суттєвим зростанням питомого вмісту шиффових основ в колагені (табл. 7).

Важливим фактором, що визначає термостабільність колагену, є також питомий вміст в ньому Опро, що утворюється під дією пролілгідроксилази (Berg R. A., Prockop D.J., 1987; Nishi Y. еt al., 2005). Як видно з табл. 7, ступінь гідроксилювання Про в колагені зменшується з віком, що свідчить про зниження активності пролілгідроксилази протягом всього дослідженого періоду онтогенезу. Можливо, в період від 1 до 3 місяців зниження вмісту Опро в колагені вносить вклад у зменшення інтегральної термостабільності його надмолекулярних утворень в шкірі. Але після 3-місячного віку подальше зниження термостабільності колагену за рахунок зменшення вмісту Опро перекривається ефектом міжмолекулярного поперечного ковалентного зв'язування.

Таким чином, інверсія напрямку змін термостабільності колагенових надмолекулярних утворень після 3-місячного віку залежить від особливостей взаємодії активностей ферментів процесингу на різних етапах онтогенезу.

Дослідження зв'язку між віковими змінами фібрилоутворення колагену типу І з шкіри щурів і характеру його поперечного зв'язування. В процесі спонтанного фібрилоутворення в розчинах колагену виникають групи фібрил, які мають гаусівське розподілення довжин і діаметрів і групуються біля їх різних середніх величин. З часом питомий вміст розподілень з меншими довжинами і діаметрами знижується, а розподілень з більшими їх значеннями - зростає.

В табл. 8 наведені дані про вікові зміни розмірів і питомого вмісту фібрил у групах з найменшими (розподілення І), середніми (розподілення II) і найбільшими (розподілення III) довжинами і діаметрами на 3, 10 і 22 добу фібрилоутворення. аорта еластин шкіра клітинний

Таблиця 8 Вікові зміни довжини (нм), діаметру (нм) і питомої долі фібрил різного розміру (%), що утворюються in vitro з колагену типу І шкіри щурів.

Показник	Вік тварин, міс.
	1	3	12	24
3 доба, І розпо- ділення	Дов- жина	Межі	200-1400	200-1400	200-1400	200-1300
		Середня	700 ±47	650 ±39	680 ±44	700 ±56
		Питома доля	100,0±12,2	65,8±5,5*	59,8±4,8*	49,7±4,3*,**
	Діа- метр	Межі	5-45	5-50	5-50	5-55
		Середній	19,5±1,6	18,7±1,8	18,4±1,7	20±2,0
10 доба, ІІ розпо- ділення	Дов- жина	Межі	800-1900	800-1900	800-2200	800-2400
		Середня	1300±63	1350±65	1380±70	1420±86*
		Питома доля	54,0±4,1	67,8±6,2*	68,2±7,0*	68,5±6,3*
	Діа- метр	Межі	5-55	5-55	5-55	5-55
		Середній	23,7±2,4	25,4±2,6	32,0±3,1*,**	34,6±3,5*
22 доба, ІІІ розпо- ділення	Дов- жина	Межі	1400-3200	1600-3200	1600-4400	1600-5200
		Середня	1800±121	1950±140	2400±218*	2800±309*
		Питома доля	34,0±3,8	18,5±2,0*	28,0±2,6*	31,2±2,7*
	Діа- метр	Межі	5-55	5-55	5-55	10-60
		СереднійСередній Середній	35,0±3,3	35,0±3,7	35,2±3,5	36,3±3,7

Примітка. *,** - те ж, що в табл. 1.

Як видно, з віком тварин діаметр фібрил збільшується. Росте з віком і довжина фібрилярних агрегатів в кожному розподіленні. Але динаміка змін морфології фібрил в період від 1 до 3 місяців має особливості. К 3 місяцям інтенсивність формування найбільш довгих фібрил (розподілення III) суттєво зменшується, про що свідчить зниження питомого вмісту цього розподілення. Тільки після 3-місячного віку зростання фібрилярних агрегатів в довжину починає інтенсифікуватись.

Цей ефект можна пояснити таким чином. В латеральному напрямку початкова агрегація і збільшення діаметра фібрил, що ростуть, відбуваються за рахунок взаємодії гідрофобних і полярних областей молекул, розташованих пліч-о-пліч. В процесі визрівання розташовані в фібрилах поруч у паралельних рядах молекули зв'язуються ще і міжмолекулярними альдольними зв'язками шляхом взаємодіі СОН-груп Алліз і Оалліз.

У повздожньому ж напрямку фібрили ростуть за рахунок утворення міжмолекулярних зв'язків між е-NH2-групами Ліз і Оліз та СОН- групами Алліз і Оалліз в N- і С- кінцевих ділянках молекул колагену, які розташовані послідовно і лежать у сусідніх рядах (Николаева Т. И. и др., 2000; Falini G. et al., 2004).

Як показано у попередньому розділі, від 1 до 3 місяців рівень поперечного ковалентного зв'язування, як внутрішньо-, так і міжмолекулярного, в колагенових надмолекулярних структурах зменшується. Зменшення кількості міжмолекулярних зв'язків альдімінного типу, які об'єднують молекули колагену в фібрилах «початок з кінцем», є важливою причиною зниження питомої долі фібрил з великою довжиною, що утворюються в цей період. Після 3-місячного віку, коли переважно починають утворюватися такі міжмолекулярні зв'язки, кількість довгих фібрил починає збільшуватися. Безперервне збільшення діаметру фібрил на протязі всього дослідженого періоду онтогенезу визначається, насамперед, гідрофобними та електростатичними взаємодіями відповідних амінокислотних залишків.

Таким чином, виявлені особливості динаміки утворення надмолекулярних колагенових комплексів - фібрил, на різних етапах онтогенезу, є результатом вікових змін характеру поперечного зв'язування колагену, що, в свою чергу, залежить від особливостей його процесингу.

Біологічне значення інверсії структурної стабільності та функціональних властивостей надмолекулярних комплексів сполучної тканини в ранньому постнатальному онтогенезі. Інверсія структурної стабільності і динаміки утворення надмолекулярних комплексів сполучної тканини у ранньому постнатальному онтогенезі потребує пояснення біологічного значення цього явища.

У досліджених тварин найбільший приріст маси (15,4 г/тиждень), відбувається саме від 1 до 3 місяців. Від 3 до 12 місяців він становить 3,3 г/тиждень, а у другій половині онтогенезу, з 12 до 24 місяців, маса тіла тварин навіть знижується - її приріст стає негативним (- 0,8 г/тиждень).

Очевидно, біологічне значення явища інверсії вищезгаданих показників полягає в тому, що на початку постнатального онтогенезу, коли відбувається інтенсивний ріст організму, міжклітинні комплекси з високою структурною стабільністю, жорсткістю і великими розмірами несприятливі для клітинного диференціювання, руху клітин і успішного морфогенезу.

Таким чином, зниження жорсткості і збільшення розтяжності м'яких різновидів сполучної тканини, а також зменшення розмірів надмолекулярних комплексів її матриксу, що формуються і їх структурної стабільності в період від 1 до 3 місяців може бути процесом адаптації до підсиленого росту організму на початку постнатального онтогенезу. Це явище, очевидно, є результатом запрограмованої суперпозиції різних вікових динамік синтезу, розпаду і процесингу колагену.

Дослідження впливу стадії росту культури фібробластів і кількості їх клітинних поділень на накопичення колагену і ГАГ. Досліджені фібробласти мали стандартні для цих клітин властивості. Після посіву клітин ріст культури був якісно подібним у всіх пасажах. Кількість пасажів становила 5, число клітинних поділень у одному пасажі - 3. Таким чином, всього фібробласти культури зробили до 15 поділень, що співпадає з літературними даними для фібробластів кроля (Hayflick L., Moorhead P.S., 1961; Хэйфлик Л., 1969).

З табл. 9 видно, що синтез і накопичення обох полімерів у 3 та 5 пасажах починається у фазі П росту культури (розпластування клітин), досягає максимуму в

Таблиця 9 Вміст колагену і глікозаміногліканів в у культуральному середовищі в залежності від кількості поділень фібробластів

Фаза куль- тиву- вання

Час куль- тиву- вання, години

Вміст колагену

Вміст ГАГ

Колаген/ ГАГ

3 пасаж

5 пасаж

3 пасаж

5 пасаж

мкг /мл

на 1 клі- тину, пг

мкг /мл

на 1 клі- тину, пг

мкг /мл

на 1 клі- тину, пг

мкг /мл

на 1 клі- тину, пг

3 пасаж

5 пасаж

І

12

0

0

0

0

0

0

0

0

-

-

24

0

0

0

0

0

0

0

0

-

-

ІІ

48

0

0

0

0

16,7 ± 2,4

0,066 ± 0,010

11,5 ± 1,3

0,046 ± 0,008

-

-

72

21,0 ± 3,6

0,035 ± 0,007

31,3 ± 4,1

0,053 ± 0,009

39,6 ± 4,6

0,065 ± 0,013

42,8 ± 4,9

0,072 ± 0,018

0,538 ± 0,063

0,731 ± 0,080

ІІІ

96

61,2 ± 5,8

0,093 ± 0,022

55,0 ± 5,3

0,087 ± 0,020

83,7 ± 7,4

0,127 ± 0,031

88,3 ± 8,0

0,140 ± 0,040

0,732 ± 0,081

0,621 ± 0,072

120

73,6 ± 6,1

0,114 ± 0,028

58,1 ± 5,9

0,090 ± 0,021

137,2 ± 10,3

0,214 ± 0,042

115,5 ± 8,6

0,179 ± 0,31

0,532 ± 0,060

0,502 ± 0,053

144

76,2 ± 6,5

0,117 ± 0,026

56,2 ± 4,9

0,088 ± 0,021

163,4 ± 13,3

0,250 ± 0,046

119 ± 9,2

0,187 ± 0,36

0,468 ± 0,51

0,470 ± 0,48

168

43,4 ± 4,2

0,074 ± 0,050

43,0 ± 4,2

0,074 ± 0.052

122,4 ± 10,3

0,209 ± 0,038

93,8 ± 7,1

0,161 ± 0,041

0,354 ± 0,049

0,459 ± 0,044

стаціонарній фазі ІІІ (утворення моношару), після чого починає знижуватися. Зміни вмісту біополімерів в культурі виразно залежать від віку фібробластів - номера пасажу і числа клітинних поділень.

Динаміка накопичення колагену і ГАГ в культуральному середовищі неоднакова. В обох пасажах накопичення ГАГ починається вже на 48 годині культивування, а колагену - тільки на 72. В обох пасажах максимуми вмісту біополімерів відзначаються у період між 120 и 144 годиною культивування. Однак абсолютні величини цих максимумів в 3 і 5 пасажах різні. У 3 пасажі (6 поділень) максимуми вмісту колагену і ГАГ вищі за максимуми у 5 пасажі (12 поділень) на 35,7% и 37% відповідно (табл. 9). Очевидно, фібробласти синтезують ГАГ більш інтенсивно, ніж колаген. Про це свідчить і більший питомий вміст ГАГ у розрахунку на 1 клітину, і відношення колаген/ГАГ, менше за одиницю. Аналогічні взаємовідношення між вмістом колагену і ГАГ мають місце і в м'яких різновидах сполучної тканини (Galambos J.T., 1977; Schefer T., Roux M., 1966), зокрема, в шкірі (табл. 3).

Цілком імовірно, що ці взаємовідношення, які в значній мірі визначають функціональні властивості тканин, запрограмовані в фібробластах.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що в період від 1 до 24 місяців міцність на розрив шкіри, аорти та хвостових сухожиль щурів безперервно підвищується за рахунок постійного росту в них колагену і еластину. Модуль Юнга тканин в області пружної деформації і енергія пружної деформації знижуються від 1 до 3 місяців, і далі знову підвищуються, а максимальне відносне подовження в момент розриву і енергія в'язкої течії тканин, підвищившись від 1 до 3 місяців, в подальшому безперервно знижуються.

2. Встановлено, що в основі цього явища лежать різні вікові відношення змін інтенсивностей синтезу і розпаду колагену, еластину і ГАГ. Вони призводять до підвищення у 3-місячному віці відношення вмісту колагену, який визначає гуківську пружність і жорсткість тканини, як до вмісту еластину, що визначає її гумоподібіні пружність і розтяжність, так і до вмісту ГАГ, від яких значною мірою залежать в'язкі властивості тканини.

3. Показано, що структурна стабільність надмолекулярних утворень матриксу шкіри щурів, згідно з кінетичними параметрами і вільною енергією Гіббса процесу руйнування їх колагенового компоненту при гідротермічній обробці, знижується від 1 до 3 місяців, після чого знову підвищується.

4. Встановлено, що цей ефект визначається віковою специфікою інтенсивності внутрішньоклітинного окислювального дезамінування е-NH2-груп Ліз і Оліз, в результаті чого до 3-місячного віку утворення внутрішньо- та міжмолекулярних зв'язків уповільнюється, а після 3-місячного віку утворюються переважно міжмолекулярні поперечні ковалентні зшивки. Вплив на термостабільність вікового зменшення гідроксилювання Про не виявляє себе на фоні вікових змін окислювального дезамінування е-NH2 -груп Ліз і Оліз.

5. В модельних експериментах продемонстровано, що фібрили, які утворюються шляхом самозбирання з колагену типу І молодих тварин, мають менші довжини і діаметри, ніж утворені з колагену старих тварин. При цьому інтенсивність утворення довгих фібрил знижується у період від 1 до 3-місячного віку тварин. Це явище теж визначається переважним утворенням у перших внутрішньо- та міжмолекулярних зшивок альдольної природи, а у других - міжмолекулярних зшивок типу шиффових основ.

6. Біологічне значення цієї інверсії спрямованості вікових змін утворення надмолекулярних колагенових структур і функціональних властивостей сполучної тканини - в'язкопружності і структурної стабільності - в ранньому постнатальному онтогенезі полягає в тому, що в період до 3 місяців спостерігається інтенсивний ріст новонародженого організму, і міжклітинні комплекси з високою структурною стабільністю і жорсткістю несприятливі для клітинної диференціації, руху клітин і успішного морфогенезу.

7. Встановлено залежність накопичення колагену і ГАГ та відношення їх вмісту в культурі фібробластів від її віку і кількості клітинних поділень, яка свідчить про те, що вікові особливості метаболізму і вмісту конструкційних біополімерів в сполучній тканині запрограмовані в цих клітинах.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Changes in the polysaccharide composition of rats' skin in response to mechanical stress / Ju. G. Kot., T. V. Zhukova, A. N. Ponomarenko, A. B. El-ta'alu // Annals Maria Curie-Sklodowska. - 2008. - Vol. XXI, № 1, 43. section DDD, DO1:2478/v 10080-008-0043-8. - Poland: Lublin. - P. 243 -246. (Дисертант вивчив літературу з теми дослідження і провів вимірювання вмісту ГАГ в зразках шкіри).

2. Age-ratios in the concentration of collagen, elastin and glycosaminoglycans in the skin and aorta of rats / A. B. El-ta'alu, Yu. G. Kot, K. V. Falchenko, Ye. E. Persky, A. N. Ponomarenko // Вісник Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна. - 2009. - № 814. - Сер. Біологія. - Вип. 7. - С. 26-29. (Дисертант дослідив вікові зміни вмісту колагену, еластину і ГАГ в тканинах, прийняв участь у підготовці матеріалу до друку).

3. Вікові особливості зв'язку між окислювальним дезамінуванням і термостабільністю колагену шкіри / A. Б. Ель-тa'aлу, М. В. Гоенага, Є. Е. Перський, A. М. Пoнoмaрeнкo // Вісник Одеського національного університету.- 2010. - Т. 15. - Сер. Біологія. - Вип. 17.- С. 22-28. (Дисертант виміряв вміст е-NH2 - і СОН-груп в колагені і провів електрофорез продуктів його денатурації).

4. Связь между возрастными изменениями белково-полисахаридного состава и биомеханическими свойствами кожи / А. Б. Эль та'алу, Ю. Г. Кот, Е. Э. Перский, А. Н. Пономаренко // Вісник Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна. - 2010. - № 905. - Сер. Біологія. - Вип. 11. - С. 37 - 42. (Дисертант виміряв в'язко-пружні властивості зразків ш...