Імунобіологічні властивості вакцинних штамів вірусу сказу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет біоресурсів і природокористування України

УДК 619:616.98:578.824.11

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Імунобіологічні властивості вакцинних штамів вірусу сказу

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

Полупан Іван Миколайович

Київ 2011

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сказ - особливо небезпечна зоонозна інфекція, яка має велике як соціальне, так і економічне значення. Відповідно до оцінки ВООЗ (Expert Consultation on Rabies, 2005), сказ входить до п'ятірки найбільш небезпечних хвороб, спільних для людини і тварин, що завдають значні соціально-економічні збитки. Незважаючи на те, що минуло понад 120 років після створення першої антирабічної вакцини, питання специфічної профілактики сказу та імунного захисту як людей, так і тварин має особливе значення (Шестопалов А.М., 2001; Недосеков В.В., 2003).

У сучасній біотехнології виробництва антирабічних препаратів використовують різні вакцинні штами вірусу сказу (Paris Pasteur, Kelev, SAD, ERA, Flury HEP і LEP, Pitman-Moor, Щолково-51, Внуково-32, ТС-80, РБ-71 тощо), які вирощують в первинних (нирка хом'яка, миші, поросяти, собаки) і перещеплюваних (ВНК-21, Vero, CEF, Nil-2, NA-2, НС і ін.) культурах клітин (Ковалев Н.А., 1975; Деметрадзе Л.Г., 1985; Sureau P., 1987; Baer G., 1988; Аксенова Т.А., 1991; Шафеева Р.С., 1994; Волкова А.В., 1997; Иванов В.С., 2001; Недосеков В.В., 2003; Ничик С.А., 2006).

При розробці технології виготовлення ефективних живих та інактивованих антирабічних вакцин важливою умовою є відбір високоімуногенних і безпечних вакцинних штамів вірусу сказу. Вибір штаму і способу його культивування фактично є головними умовами при отриманні безпечних і високоефективних вакцин проти сказу (Селимов М.А., 1978; Балабанов В.А., 1990; Иванов В.С., 2000; Груздев К.Н., 2001; Лаптева О.Г., 2003; Филатова М.А., 2008;).

Вакцинні штами вірусу сказу в наукових дослідженнях та при виробництві антирабічних вакцин проходять велику кількість пасажів, історія ведення яких достеменно невідома. Враховуючи високу мінливість РНК-вмісних вірусів, зокрема вірусу сказу, існує велика ймовірність набуття при тривалому пасажуванні змін в імунобіологічних характеристиках вакцинних штамів вірусу (Dietzschold B., 1988; Kissi B., 1995; Bourhy H., 1999). У зв'язку з цим Комітет експертів ВООЗ у своїх рекомендаціях підкреслює необхідність відбору нових штамів вірусу сказу для виробництва антирабічних вакцин, а також періодичної перевірки антигенної і генетичної ідентичності штамів, які вже використовуються (Expert Consultation on Rabies, 2005).

Однак останнім часом фахівцями приділялось недостатньо уваги вивченню імунобіологічних та молекулярно-генетичних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу, а дослідження в порівняльному аспекті взагалі поодинокі. Не проводилось дослідних робіт, які б науково обґрунтовували використання вакцинних штамів залежно від виду вакцини (жива чи інактивована), а також давали рекомендації біологічній промисловості щодо удосконалення виробництва антирабічних препаратів.

Враховуючи збільшення в останні роки кількості випадків сказу серед тварин на території України (Загороднюк І.В., 2007; Аранчій С.В., 2008; Rabies bulletin Europe, 2007, 2009) і необхідність розробки й застосування високоімуногенних антирабічних вакцин, актуальним завданням є ідентифікація штамів, що використовуються, а також застосування біотехнологічних методів у напрямі підвищення імуногенності і безпечності штамів вірусу сказу. Одним з таких методів є пошук перспективних ліній перещеплюваних культур клітин і адаптація до них вакцинних штамів вірусу сказу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась як самостійний фрагмент планових науково-дослідних робіт лабораторії сказу Інституту ветеринарної медицини УААН «Вивчити особливості епізоотології та удосконалити методи діагностики та профілактики сказу тварин», номер держреєстрації - 0101U000788 (2001-2005 рр.) та «Вивчити молекулярно-генетичні характеристики циркулюючих ізолятів в глобальній системі контролю сказу», номер держреєстрації - 0106U000652 (2006-2010 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення імунобіологічних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу і розробка рекомендацій щодо їх використання.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- визначити чутливість перещеплюваних культур клітин ВНК-21, НС, Vero та ПТП до вірусу сказу вакцинних штамів РБ-71, ТС-80 і Щолково-51 К;

- адаптувати вакцинний штам вірусу сказу Щолково-51 К до культури клітин НС та визначити стабільність його властивостей при пасажуванні;

- теоретично та експериментально обґрунтувати і удосконалити технологію отримання культуральної вірусної сировини;

- оптимізувати умови ліофілізації і зберігання вірусу сказу;

- вивчити патогенні властивості вакцинних штамів вірусу сказу, встановити їх вірулентність для лабораторних тварин і ступінь атенуації за індексом інвазивності;

- визначити антигенні властивості та імуногенність вірусу сказу вакцинних штамів РБ-71 і Щолково-51 К для кролів і морських свинок;

- вивчити молекулярно-генетичні властивості вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К, РБ-71, ТС-80 і референс-штаму СVS;

- розробити безпечний спосіб отримання мозкової суспензії вірусу сказу з високою інфекційною активністю.

Об'єкт дослідження: імунобіологічні властивості вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К, РБ-71 і ТС-80.

Предмет дослідження: вакцинні штами вірусу сказу, перещеплювані лінії культур клітин тварин, культуральні і тканинні суспензії вірусу сказу, сироватки крові лабораторних тварин (кролів, морських свинок).

Методи дослідження. Поставлені в роботі наукові завдання вирішувались експериментально з використанням вірусологічних (біологічна проба, титрування на білих мишах, ідентифікація та культивування в культурі клітин), імунологічних (МФА, ІФА), молекулярно-біологічних (ідентифікація та молекулярно-генетична оцінка штамів вірусу в ЗТ-ПЛР) та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично та експериментально обґрунтовано використання вакцинних штамів вірусу сказу для виготовлення антирабічних вакцин і шляхи їх удосконалення.

Вперше адаптовано вірус сказу вакцинного штаму Щолково-51 К до культури клітин НС, розроблена технологія отримання культуральної вірусовмісної суспензії та удосконалена методика визначення його інфекційної активності шляхом титрування в культурі клітин НС, що дозволило скоротити час при встановленні титру з 14-и до 3-х діб.

Вперше в порівняльному аспекті вивчено патогенні властивості і встановлено ступінь атенуації вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К, РБ-71 і ТС-80, отриманих в культурі клітин НС.

Експериментально доведено, що штам РБ-71 не може бути використаний для виготовлення живих вакцин у зв'язку із його високою реактогенністю.

Вперше розроблено безпечний спосіб отримання мозкової суспензії вірусу сказу з високою інфекційною активністю, новизна якого підтверджена патентом України (патент № 47938 від 25.02.2010 р.).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена «Концепція використання вакцинних штамів вірусу сказу», яка затверджена Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини (протокол № 1 від 20.12.2007) і рекомендована до впровадження при виробництві антирабічних вакцин.

Розроблена «Стратегія підвищення імуногенності інактивованих антирабічних вакцин», яка затверджена Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини (протокол № 1 від 23.12.2009) і рекомендована до впровадження в біологічній промисловості України з метою удосконалення технології виготовлення інактивованих антирабічних вакцин.

Розроблені «Методичні рекомендації з визначення імунітету та ефективності вакцинації тварин проти сказу», які затверджені Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини (протокол № 1 від 20.12.2007).

Розроблений спосіб отримання мозкової суспензії вірусу сказу, впровадження якого в лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах дозволить безпечно отримувати вірусовмісну суспензію з високим титром інфекційної активності.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно розроблена програма досліджень, виконані експериментальні дослідження, проведений аналіз і узагальнення матеріалу, формування комп'ютерної бази даних, статистична обробка результатів експериментів, підготовка статей та формулювання висновків за методичної та консультативної допомоги наукового керівника, кандидата ветеринарних наук Л.П. Гришок.

При виконанні ряду експериментальних досліджень науково-консультативну допомогу надавали: доктор ветеринарних наук В.В. Недосєков (Національний університет біоресурсів і природокористування України) і кандидат медичних наук Л.О. Антонова (НДІ інфекційних хвороб МОЗ України), за що здобувач висловлює їм глибоку вдячність.

Апробація результатів дисертації. Матеріали наукових досліджень доповідались та обговорювались на: щорічних засіданнях Вченої ради Інституту ветеринарної медицини НААН України у 2004-2009 роках; ІІІ Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (2005 р., м. Київ); Науково-практичній конференції, присвяченій 75-річчю Новогалещинської біофабрики (2006 р., м. Полтава); засіданні Науково-методичної ради Державного комітету ветеринарної медицини (2007 та 2009 рр., Київ); Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми ветеринарної медицини з питань епізоотології, біотехнології та імунології» (2008 р., м. Полтава); Першій Міжнародній конференції молодих вчених «Біотехнологія - розробка та контроль препаратів - 2009» (2009 р., м. Київ); Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 50-річчю заснування Інституту епізоотології НААН України «Епізоотологічний моніторинг та системи ліквідації хвороб тварин» (2010 р., Рівне).

Публікації. Основні положення дисертації викладено у 17-и наукових працях, з яких 11 опубліковано у наукових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України; 3 науково-практичні рекомендації; 2 тези доповідей на наукових конференціях; отримано деклараційний патент України на корисну модель.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з таких розділів: вступу, огляду літератури, власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, додатків, списку використаних літературних джерел. Робота викладена на 151-й сторінці машинописного тексту, ілюстрована 22 таблицями, 15 рисунками, містить 4 додатки. Бібліографічний список включає 207 джерел, у тому числі 125 зарубіжних.

Основний зміст роботи

Вибір напрямів досліджень, матеріали і методи виконання роботи

Дослідження виконували протягом 2004-2010 років у лабораторії сказу, а окремі дослідження проводили в лабораторії молекулярної біології Інституту ветеринарної медицини НААН України, відділі вірусології Державного науково-дослідного інституту лабораторної діагностики і ветеринарно-санітарної експертизи та дослідному господарстві «Пилиповичі», розташованому у Бородянському районі Київської області.

У роботі використовували вакцинні та стандартні штами вірусу сказу:

· Вірус сказу, вакцинний штам Щолково-51 К, одержаний в лабораторії сказу ІВМ НААН України та задепонований в Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ) 23.05.2002 р. (реєстраційний номер - 206).

· Вірус сказу, вакцинний штам 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ (РБ-71) (наданий Ковальовим Н.А., адаптований до перещеплюваної культури клітин НС Хрипуновим Е.М., Недосєковим В.В., Сливко І.А. та ін.).

· Вірус сказу, вакцинний штам ТС-80 (наданий Недосєковим В.В.).

· Вірус сказу, міжнародний референс-штам CVS, задепонований 25.02.2002 р. у депозитарії ДНКІБШМ під реєстраційним номером - 205.

Вивчення культуральних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу проводили, використовуючи перещеплювані культури клітин: нирки сірійського хом'яка (ВНК-21), нирки зеленої африканської мартишки (лінія Vero), нирки сайги (НС), тестикул поросяти (ПТП).

Культури клітин вирощували в 1,5 дм³, 250 см³ та 50 см³ скляних та пластикових матрасах стаціонарним методом. Інфікування культур клітин вакцинними штамами вірусу сказу проводили двома способами: «в моношар» і «в суспензію».

Інфекційну активність вірусовмісної суспензії in vivo визначали шляхом титрування на білих мишах за методом Н. Koprowski (1975).

Інфекційну активність дослідних штамів визначали in vitro в культурі клітин НС, вирощеній в 96-лункових полістиролових панелях, а репродукцію вірусу сказу - методом прямої імунофлюоресценції, використовуючи інвертований люмінесцентний мікроскоп.

Вивчення патогенних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу здійснювали на білих мишах, кролях і морських свинках шляхом інтрацеребрального, внутрішньом'язового або підшкірного введення різних доз вірусу. Індекси інвазивності дослідних штамів вірусу сказу визначали на білих мишах за різницею титрів інфекційної активності вірусу, встановлених при введенні вірусовмісного матеріалу інтрацеребрально і підшкірно.

Електронну мікроскопію вірусу сказу проводили методом негативного контрастування.

Ліофілізацію штаму Щолково-51 К здійснювали, використовуючи ліофільну сушарку Alpha 1-4 виробництва фірми Martin Christ згідно з регламентом виробника. Для зменшення технологічних втрат інфекційної активності при ліофілізації підібрано 6 стабілізаторів. Контроль біологічної активності ліофілізованих зразків вірусу проводили відразу після висушування, після зберігання при температурі мінус 18±2 0C протягом 6 місяців, а також після прогрівання їх при температурі 37±0,5 0C протягом 7 діб (тест «швидкого старіння»).

Антигенну активність вакцинних штамів вірусу сказу визначали за рівнем і динамікою формування антирабічних антитіл у вакцинованих тварин (кролів і морських свинок). Для дослідження титрів антирабічних антитіл у сироватках крові застосували метод ТФ-ІФА. Імуногенну активність оцінювали при проведенні контрольного зараження вакцинованих кролів вірусом сказу, референс-штамом CVS.

Виділення РНК, синтез к-ДНК, ампліфікацію фрагмента гена нуклеопротеїду та аналіз ПЛР-продуктів проводили в лабораторії «Молекулярної біології» ІВМ НААН України. Виділення РНК проводили за допомогою набору «РИБО-золь-А», варіант 100. Синтез кДНК проводили, використовуючи набір «Реверта-L». Для ампліфікації фрагмента ДНК застосовували набір «АмплиСенс-200-1». Результати електрофорезу спостерігали в ультрафіолетовому світлі.

Отримані цифрові значення статистично обробляли за Г.Ф. Лакіним (1990) з використанням програми МS Excel на персональному комп'ютері Intel.

Вивчення культуральних властивостей вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К, ТС-80, РБ-71

Чутливість перещеплюваних культур клітин до вакцинних штамів вірусу сказу. У зв'язку з тим, що дослідні вакцинні штами вірусу сказу адаптовані до різних культур клітин (Щолково-51 К до ВНК-21, РБ-71 та ТС-80 до культури клітин НС), дослідження інфекційної активності отриманих вірусовмісних суспензій проводили на універсальній чутливій лабораторній моделі - білих мишах (табл. 1).

Таблиця 1. Рівень репродукції вакцинних штамів вірусу сказу в різних культурах клітин (М±m, n=3)

Штам вірусу сказу	Паспортні дані	Титр вірусу (lg МЛД50/см3)
	культура клітин	титр вірусу (lg МЛД50/см3)	НС	ВНК-21	Vero	ПТП
Щолково-51 К	ВНК-21	6,0-6,3	5,6±0,1	6,2±0,2	3,1±0,1	н.в.
РБ-71	НС	6,0-6,2	6,3±0,2	5,7±0,3	2,9±0,2	3,0±0,1
ТС-80	НС	6,1-6,5	5,8±0,1	5,7±0,2	н.д.	н.д.

Примітки: н.в. - не виявлено; н.д. - не досліджували.

Проведена оцінка адаптаційно-культуральних властивостей показала, що перещеплювані культури клітин, які використовувались у роботі, мають різну чутливість до вірусу сказу. Встановлено перевагу культур клітин НС та ВНК-21, в яких штам Щолково-51 К репродукувався в титрі 5,6±0,1-6,2±0,2 lg МЛД50/см³, штам РБ-71 - 5,7±0,3-6,3±0,2 lg МЛД50/см³, а штам ТС-80 в титрі 5,7±0,2-5,8±0,1 lg МЛД50/см³.

Враховуючи чутливість культури клітин НС до вірусу сказу вакцинних штамів РБ-71 та ТС-80 і результати тестування інфекційної активності штаму Щолково-51 К у третьому пасажі (титр 5,6±0,1 lg МЛД50/см³) в даній лінії клітин, нами вирішено продовжити його послідовне пасажування в культурі клітин НС (рис. 1).

Рис. 1. Динаміка репродукції вірусу сказу штаму Щолково-51 К у культурі клітин НС у різних пасажах (М±m, n=3)

У процесі пасажування вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К у культурі клітин НС відбувалося послідовне підвищення титру інфекційної активності. Починаючи з 6-го пасажу в лінії клітин НС, інфекційна активність вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К становила в середньому 6,85±0,18 lg МЛД50/см³, а титр у 16-у пасажі був у межах 7,0±0,17 lg МЛД50/см³.

Отже, в процесі адаптації до культури клітин НС показано стабільність (протягом 16 пасажів) накопичення вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К з титром інфекційної активності 6,85±0,18 lg МЛД50/см³. Встановлено принципову можливість отримання вірусовмісного культурального матеріалу штаму Щолково-51 К з використанням перещеплюваної лінії клітин НС. Отриманий вірус сказу отримав робочу назву - штам Сайраб.

Визначення оптимальної множинності зараження культури клітин НС

Метою даного етапу роботи було визначення множинності зараження вірусом сказу культури клітин НС, яка забезпечувала б отримання вірусовмісного матеріалу з високим титром інфекційної активності. Для цього добовий моношар культури клітин НС інфікували вірусом сказу в дозі від 1,0 до 0,001 МЛД50/клітину і інкубували при 370,5 0С протягом 8 діб. Кожну добу з моменту зараження отримували вірусовмісну суспензію і визначали титр інфекційної активності.

Встановлено, що оптимальною множинністю зараження культури клітин НС при культивуванні в стаціонарних умовах є 0,1-0,01 МЛД50/кл. При таких дозах вірус сказу штаму Щолково-51 К репродукувався в максимальній кількості на 4-6 добу в титрі 6,63±0,13-6,85±0,18 lg МЛД50/см³, аналогічно як і вірус сказу штаму РБ-71 (6,42±0,25-6,38±0,13 lg МЛД50/см³). Для штаму ТС-80 аналогічно оптимальна множинність зараження була 0,1-0,01 МЛД50/кл, при якій отримували найвищу інфекційну активність (5,87±0,14-6,01±0,13 lg МЛД50/см³) на 5-7 добу інкубування.

Вивчення репродукції вакцинних штамів вірусу сказу при різних способах інфікування культури клітин

Метою даного етапу роботи було проведення порівняльної оцінки репродукції вірусу сказу штамів Щолково-51 К, РБ-71 та ТС-80 при зараженні свіжоприготовленої для посіву суспензії клітин («в суспензію») та сформованого добового моношару («в моношар») для удосконалення технології отримання вірусовмісного матеріалу (рис. 2).

Рис. 2. Інфекційна активність вакцинних штамів вірусу сказу при різних способах інфікування культури клітин НС (М±m, n=3)

Титр вірусу сказу штаму Щолково-51 К при зараженні «в суспензію» становив 6,84±0,19 lg МЛД50/см³, а при зараженні «в моношар» - 6,65±0,23 lg МЛД50/см³. Титр вірусу штаму РБ-71 при зараженні «в суспензію» становив 6,39±0,19 lg МЛД50/см³, а при зараженні в моношар - 6,13±0,22 lg МЛД50/см³. Інфекційний титр штаму ТС-80 при зараженні «в суспензію» становив 5,83±0,24 lg МЛД50/см³, а при зараженні «в моношар» - 5,88±0,10 lg МЛД50/см³.

Аналізуючи отримані результати, достовірної різниці між інфекційною активністю культуральних суспензій дослідних вакцинних штамів вірусу сказу, отриманих при зараженні «в суспензію» або «в моношар», не виявлено, однак, враховуючи меншу кількість маніпуляцій при зараженні культури клітин НС «в суспензію», цей метод є більш технологічним способом отримання вірусовмісного матеріалу.

Розробка технології отримання культурального вірусовмісного матеріалу

Було вивчено два методи отримання вакцинного вірусу сказу: разового вирощування та метод періодичної заміни інфікованого середовища.

При разовому вирощуванні титр вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К був у межах 6,73±0,23 lg МЛД50/см³, титр штаму РБ-71 становив 6,33±0,21 lg МЛД50/см³, а інфекційний титр штаму ТС-80 - 5,81±0,25 lg МЛД50/см³.

При застосуванні методу періодичної (одноразової) заміни середовища інфіковану (множинність зараження 0,1 МЛД50/кл) культуру клітин НС культивували 8 діб, проводячи на 5-у добу відбір вірусовмісного середовища і внесення свіжого аналогічного складу. Тобто отримання вірусовмісного матеріалу здійснювали у дві стадії - на 5-у добу при заміні середовища і на 8-у - після закінчення культивування (табл. 2).

Таблиця 2. Інфекційна активність вірусу сказу в культурі клітин НС при одноразовій заміні середовища на 5-у добу культивування (М±m, n=3)

Штам вірусу	Титр вірусу, lg МЛД50/см3
	1 пасаж	2 пасаж	3 пасаж
Щолково-51 К	6,79±0,11	7,17±0,10	7,0±0,19
РБ-71	6,55±0,17	6,34±0,10	6,57±0,09
ТС-80	5,95±0,09	5,84±0,10	6,04±0,03

Титр інфекційної активності отриманих таким чином вірусовмісних матеріалів для штаму ТС-80 становив 5,84-6,04 lg МЛД50/см³, РБ-71 - 6,34-6,57 lg МЛД50/см³ і Щолково-51 К - 6,79-7,17 lg МЛД50/см³.

Застосування методу одноразової заміни інфікованого середовища дало змогу від однієї моношарової культури-продуцента отримати подвійний об'єм вірусовмісного матеріалу за 8 діб, у той час як при стандартній методиці, для отримання аналогічного об'єму культурального вірусовмісного матеріалу, необхідно не менше 10 діб.

Оптимізація титрування вакцинних штамів вірусу сказу

Метою цих досліджень було вивчення в порівняльному аспекті методу визначення інфекційної активності в культурі клітин НС (in vitro) та традиційного методу титрування на мишах (in vivo), із встановленням відповідності титрів інфекційної активності вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К, отриманих обома методами (рис. 3).

Рис. 3. Титрування вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К на білих мишах і в культурі клітин НС (М±m, n=3)

Проведений кореляційний аналіз результатів титрування вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К показав практично лінійну залежність між інфекційною активністю вакцинного вірусу при титруванні на мишах і при використанні методу титрування в культурі клітин НС з вибірковим коефіцієнтом кореляції r=0,927.

Крім того, спосіб визначення інфекційної активності вакцинних штамів вірусу сказу в культурі клітин дозволяє суттєво скоротити час тестування культуральних зразків вакцинного вірусу сказу та отримати результати вже через три доби, в той час як при титруванні на мишах - через 14 діб. Тому цей метод є перспективним для використання в процесі виробництва антирабічних вакцин при технологічному контролі вірусної сировини.

Вивчення стабільності репродукції вакцинних штамів вірусу сказу

Для вивчення цього параметра було проведене пасажування в культурі клітин НС дослідних штамів вірусу сказу з визначенням титру інфекційної активності у різних пасажах (табл. 3).

Таблиця 3. Інфекційна активність вакцинних штамів вірусу сказу у різних пасажах у культурі клітин НС (М±m, n=3)

Пасаж	Титр вірусу, lg МЛД50/см3
	Щолково-51 К	ТС-80	РБ-71
1	-	5,72±0,2	6,42±0,2
5	-	5,87±0,15	6,47±0,28
6	6,85±0,35	5,84±0,21	6,36±0,11
7	6,85±0,35	5,79±0,19	6,31±0,06
10	6,81±0,19	5,85±0,10	6,23±0,16
12	6,78±0,05	5,78±0,19	6,43±0,09
14	6,79±0,11	5,95±0,09	6,55±0,17
16	7,0±0,19	6,04±0,03	6,57±0,09
Середній титр	6,85±0,18	5,86±0,12*	6,42±0,18*

Примітка. * - різниця достовірна відносно до титру штаму Щолково-51 К при р0,01.

Протягом 16-ти пасажів у культурі клітин НС вакцинні штами вірусу сказу не знижували своєї інфекційної активності і репродукувались у високих титрах. Вірус сказу вакцинний штам Щолково-51 К у стаціонарному моношарі культури клітин НС репродукувався з титром інфекційної активності 6,85±0,18 lg МЛД50/см³, штам ТС-80 - 5,86±0,12 lg МЛД50/см³, а штам РБ-71 - 6,42±0,18 lg МЛД50/см³.

Аналізуючи отримані результати, статистично достовірно встановлено, що вірус сказу вакцинного штаму Щолково-51 К у культурі клітин НС накопичувався з вищим титром інфекційної активності, порівняно зі штамами РБ-71 та ТС-80.

Вивчення впливу різних температур на інфекційну активність вакцинних штамів вірусу сказу при зберіганні

З метою встановлення потенційної можливості зберігання вірусу сказу в замороженому (мінус 18±2 0С) або охолодженому (4±2 0С) стані проведено визначення інфекційної активності при зберіганні нативних вірусовмісних суспензій протягом 2-х років.

Дослідження показали, що температури мінус 18±2 0С та 4±2 0С суттєво впливають на збереженість інфекційної активності вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К та РБ-71. Спосіб зберігання культуральних суспензій вірусу сказу при температурі мінус 18±2 0С придатний протягом 3-6-ти місяців, оскільки за цей період відбувається втрата менше 10 % інфекційної активності. Умови холодильної камери (температура 4±2 0С) придатні для нетривалого (до 7-и днів) зберігання вакцинних штамів вірусу сказу, оскільки за цей період відбувається втрата 6-12 % інфекційної активності вірусу.

Ліофілізація вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К

При проведенні досліджень як захисні середовища були використані комплексні стабілізатори: 1) желатоза - 10 %, цукроза - 10 %; 2) желатоза - 8 %, мальтоза - 8 %; 3) желатоза - 8 %, мальтоза - 5 %, сорбіт - 2 %; 4) желатоза - 8 %, цукроза - 8 %, сорбіт - 2 %; 5) желатоза - 8 %, цукроза - 10 %, хлорид натрію - 4 %; 6) желатоза - 8 %, мальтоза - 8 %, сорбіт - 1 %, хлорид натрію - 4 %.

Після висушування інфекційна активність ліофілізованих зразків штаму Щолково-51 К наведена в табл. 4.

Таблиця 4. Вплив різних захисних середовищ на збереження інфекційної активності вірусу сказу штаму Щолково-51 К при ліофілізації (М±m, n=3)

Захисне середовище	Титр вірусу, lg МЛД50/см3.
	до висушування	після висушування	через 6 місяців при мінус 18±2 0С	тест «швидкого старіння»
1	6,42±0,06	5,19±0,2	5,11±0,1	3,62±0,2
2		4,42±0,2	н.д.	н.д.
3		5,02±0,2	4,73±0,1	3,42±0,2
4		4,62±0,2	н.д.	н.д.
5		5,22±0,2	5,26±0,1	4,19±0,2
6		4,02±0,2	н.д.	н.д.

Примітка. н.д. - не досліджували.

Захисні середовища № 1, 3 і 5 забезпечили умови, при яких титр вірусу знизився з 6,42±0,06 до 5,02-5,22 lg МЛД50/см³. Тобто, після висушування з використанням даних середовищ технологічні втрати становили в межах 1,2-1,4 lg МЛД50/см³. Через 6 місяців зберігання при температурі мінус 18±2 0С встановлено інфекційну активність зразка № 1 на рівні 5,11±0,1 lg МЛД50/см³, зразка № 3 - 4,73±0,1 lg МЛД50/см³, а зразка № 5 - 5,26±0,1 lg МЛД50/см³. Отримані результати свідчать про стабільність інфекційної активності ліофілізованого матеріалу штаму Щолково-51 К при зберіганні за температури мінус 18±2 0С протягом 6-ти місяців.

Для прискореного аналізу стабільності інфекційної активності ліофілізованих матеріалів штаму Щолково-51 К застосовано тест «швидкого старіння», який полягає в прогріванні дослідних зразків при 37 0С протягом 7-и діб. Встановлено, що найкращі протективні властивості мало середовище № 5 (желатоза, цукроза, хлорид натрію), при якому титр вірусу при умові тесту «швидкого старіння» знизився на 1,03 lg МЛД50/см³ і становив 4,19±0,2 lg МЛД50/см³.

Отже, отримані результати показали, що найкращі протективні властивості мало захисне середовище № 5 (8 % желатози, 10 % цукрози, 4 % хлориду натрію), при застосуванні якого досягнуто мінімальних втрат титру інфекційної активності в межах 1,2±0,1 lg МЛД50/см³.

Вивчення патогенних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу

Дослідження проводили, використовуючи класичні лабораторні моделі - безпородні білі миші, морські свинки та кролі. Ступінь атенуації дослідних штамів вірусу сказу визначали при зараженні лабораторних тварин різними шляхами та оцінювали за тривалістю інкубаційного періоду і захворювання, клінічними ознаками та летальністю (табл. 5).

Таблиця 5. Вірулентність вакцинних штамів вірусу сказу для лабораторних тварин при різних способах введення

Вірус	Спосіб введення	Білі миші	Кролі	Морські свинки
		інфікуюча доза, МЛД50/гол	летальність, %	інфікуюча доза, МЛД50/гол.	летальність, %	інфікуюча доза, МЛД50/гол.	летальність, %
Щолково-51 К	і/ц	102,3	100	105,0	50	104,0	100,0
	в/м	105,3	90	106,0	0	106,0	11,1
	п/ш	105,3	60	106,0	0	106,8	0
РБ-71	і/ц	102,3	100	103,0	100	н.д.	н.д.
	в/м	105,3	80	106,5	25	106,2	60,0
	п/ш	105,3	60	106,5	0	106,5	0
ТС-80	і/ц	102,3	100	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.
	в/м	105,3	0	н.д.	н.д.	105,5	0
	п/ш	105,3	0	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.

Примітка. н.д. - не досліджували

Незалежно від використаного вакцинного штаму вірусу сказу, при інтрацеребральному (і/ц) інфікуванні білих мишей в дозі 102,3 МЛД50/гол. встановлена 100 % летальність. Внутрішньом'язове (в/м) і підшкірне (п/ш) введення культурального матеріалу вірусу сказу вакцинних штамів РБ-71 та Щолково-51 К у дозі 105,3 МЛД50/гол. показало летальність на рівні 60-90 %. При в/м та п/ш введенні вірусовмісного матеріалу штаму ТС-80 в аналогічній інфікуючій дозі специфічної загибелі мишей не виявлено, що свідчить про високий ступінь його атенуації.

При в/м та п/ш зараженні кролів вірусом сказу, вакцинним штамом Щолково-51 К, специфічних клінічних проявів захворювання не виявлено, тварини залишались клінічно здоровими протягом усього терміну спостереження (60 діб). З 4-х кролів, заражених і/ц цим штамом вірусу сказу, два на 7-8-у добу загинули, тобто летальність становила 50 %.

І/ц введення вірусу сказу штаму РБ-71 в дозі 103,0 МЛД50 викликало 100 % загибель кролів. При в/м введенні кролям цього штаму вірусу в дозі 106,5 МЛД50/гол відмічено 25 % летальність, а при п/ш введенні аналогічної дози вірусу всі тварини залишалися клінічно здоровими протягом усього терміну спостереження (45 діб).

Після в/м введення морським свинкам вірусу сказу штаму Щолково-51 К встановлена летальність на рівні 11,1 %, а в/м введення вірусу штаму РБ-71 показало летальність 60 %. В/м інокуляція морським свинкам вірусовмісної суспензії штаму ТС-80 в дозі 105,5 МЛД50 не викликала загибелі у піддослідних тварин. Після п/ш введення вірусу сказу штамів Щолково-51 К і РБ-71 в дозі 106,8 та 106,5 МЛД50 відповідно, усі морські свинки залишались клінічно здоровими протягом терміну спостереження (45 діб).

Ступінь патогенності дослідних вакцинних штамів вірусу сказу виражали в числовому значенні, використовуючи індекс інвазивності. Отримані нами результати дозволили віднести вірус сказу вакцинного штаму ТС-80, за різницею у титрах інфекційної активності при п/ш та і/ц введеннях, до групи слабовірулентних (індекс інвазивності ? 5,0), а вакцинні штами Щолково-51 К та РБ-71 з індексом інвазивності 4,9 і 4,5 - відповідно, до групи середньовірулентних (індекс інвазивності 3-5).

За сукупністю показників імунобіологічних властивостей, встановлених при вивченні патогенності вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К - зниженій нейропатогенності, індексу інвазивності (належить до групи середньовірулентних штамів), результатах п/ш введення морським свинкам, і/ц, в/м і п/ш введення кролям - штам Щолково-51 К, отриманий в лінії клітин НС, відповідає вимогам, які ставляться до вакцинних штамів вірусу сказу.

Антигенна активність вакцинних штамів вірусу сказу

Для проведення цих досліджень кролям в/м інокулювали вірус сказу вакцинного штаму Щолково-51 К в дозі 106,8 МЛД50/гол. Кролям іншої групи в/м вводили вірусовмісний матеріал штаму РБ-71 в дозі 106,0 МЛД50/гол.

Після інокуляції вірусу на 7-у, 21-у та 60-у добу проводили відбір проб крові, отримували сироватки, в яких визначали рівень антирабічних антитіл методом ТФ-ІФА (табл. 6).

Таблиця 6. Антигенна активність вакцинних штамів вірусу сказу

Штам вірус сказу	Титр антитіл, МО/см3
	7 доба	21 доба	60 доба
Щолково-51 К	0,23±0,10	0,94±0,55*	2,41±1,38**
РБ-71	0,18±0,03	1,13±0,41*	1,86±0,59

Примітки: * - різниця достовірна відносно дослідження на 7-у добу при р0,025;

** - різниця достовірна відносно дослідження на 21-у добу при р0,01

Антирабічні антитіла у тварин вже були виявлені на 7-у добу з моменту інокуляції вірусовмісних суспензій вакцинних штамів вірусу сказу. На 21-у добу у 100 % імунізованих тварин спостерігалася індукція антирабічних антитіл із середнім титром 0,94±0,55 МО/см³ (Щолково-51 К) та 1,13±0,41 МО/см³ (РБ-71). Встановлено, що максимальний вміст антирабічних антитіл у сироватках крові кролів був на 60-у добу: після введення вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К на рівні 2,41±1,38 МО/см³ (від 0,75 до 5,0 МО/см³), а штаму РБ-71 - 1,86±0,59 МО/см³ (від 1,3 до 2,8 МО/см³).

На 60-у добу після імунізації проведено гострий дослід з інфікування кролів летальною дозою (104,0 МЛД50/гол.) вірусу сказу референс-штаму CVS. Проведені дослідження показали стійкість 100 % тварин обох дослідних груп до і/ц введення летальної дози вірусу сказу референс-штаму CVS.

З метою проведення досліджень з вивчення антигенної активності інактивованого вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К підібрано як ад'юванти гідроокис алюмінію (Al (OH)3) - 0,6 % в кінцевій концентрації і мінеральне масло Montanide ISA-25 - 20 %. Інактивацію вірусу сказу здійснювали в-пропіолактоном (Serva, Німеччина) в концентрації 1:10000, при температурі 4 0С протягом 24 год. (табл. 7).

вакцинний штам вірус сказ

Таблиця 7. Антирабічна активність сироваток крові морських свинок, імунізованих антигеном вірусу сказу штаму Щолково-51 К в комплексі з ад'ювантами

Речовина	Титр антитіл, МО/см3
	10 доба	20 доба	30 доба
Антиген + Montanide ISA-25	1,09±0,24	2,20±0,38*	2,03±0,40
Антиген + Гідроокис алюмінію (Al (OH)3)	1,90±1,08	4,26±2,61*	3,96±2,37
Антиген	0,53±0,27	0,96±0,47	0,94±0,51

Примітка. * - різниця достовірна відносно дослідження на 10-у добу при р0,025

Отже, при порівняльному аналізі титрів антирабічних антитіл статистично достовірно встановлено, що їх рівень був найвищим у сироватках крові тварин, яким вводили антиген вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К разом із гідроокисом алюмінію.

Характеризуючи імунну відповідь у морських свинок після введення антигену разом з гідроокисом алюмінію, слід відмітити неоднорідність титрів антирабічних антитіл у сироватках крові (на 10-у добу 0,52-4,6 МО/см³, на 20-у добу 0,65-11,4 МО/см³, на 30-у добу 0,52-10,2 МО/см³), що свідчить про гетерогенну чутливість тварин до вакцинного штаму Щолково-51 К.

Вивчення молекулярно-генетичних властивостей вірусу сказу вакцинних штамів ТС-80, РБ-71, Щолково-51 К та референс-штаму CVS

Спільно із О.М. Дерябіним на базі лабораторії «Молекулярної біології» ІВМ НААН України були проведені дослідження з вивчення молекулярно-генетичних властивостей вірусу сказу вакцинних штамів ТС-80, РБ-71, Щолково-51 К та референс-штаму CVS.

Для постановки ЗТ-ПЛР з метою ідентифікації вірусу сказу використовували пару праймерів, комплементарну до консервативної ділянки початку гена нуклеопротеїду (пара Est). Проведений аналіз ПЛР-продуктів консервативної ділянки гена нуклеопротеїду дослідних штамів вірусу сказу показав їх належність до першого генотипу.

Для постановки ЗТ-ПЛР з метою встановлення відмінностей між різними вакцинними штамами вірусу сказу використовували пару праймерів #509 і #304, комплементарну до варіабельної ділянки 3'кінця гена нуклеопротеїду.

Рис. 4. Електрофореграма полінуклеотидів варіабельної ділянки гену нуклеопротеїду, отриманих методом ЗТ-ПЛР. Примітки: М - маркер «100 bp (Fermentas)», 1 - ТС-80, 2 - CVS, 3 - негативний контроль, 4 - Щолково-51 К, 5 - РБ-71

З використанням обраних праймерів проведено ампліфікацію фрагмента гена нуклеопротеїду вірусу сказу вакцинних штамів ТС-80, РБ-71, Щолково-51 К і референс-штаму CVS (рис. 4).

Таким чином, гомологічність отриманих фрагментів варіабельної ділянки вказує на відсутність відмінностей в даній частині гена нуклеопротеїду між дослідними штамами вірусу сказу, незважаючи на те, що штам ТС-80 похідний штаму SAD, а Щолково-51 К, CVS та РБ-71 - деривати оригінального пастерівського штаму PV.

Висновки

У дисертації на підставі експериментальних досліджень в порівняльному аспекті викладені імунобіологічні характеристики вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К, РБ-71 і ТС-80, розроблена технологія отримання і зберігання вірусовмісних суспензій з високою інфекційною активністю та визначені напрями їх використання в біологічній промисловості.

1. Проведено оцінку чутливості перещеплюваних ліній культур клітин BHK-21, НС, Vero і ПТП до дослідних вакцинних штамів вірусу сказу та встановлено, що найвищу вірусрепродукуючу активність мали культури клітин НС і ВНК-21, в яких вірус сказу вакцинний штам Щолково-51 К накопичувався в титрі 5,6±0,1-6,2±0,2 lg МЛД50/см³, штам РБ-71 - 5,7±0,3-6,3±0,2 lg МЛД50/см³, а штам ТС-80 - 5,7±0,2 - 5,8±0,1 lg МЛД50/см³.

2. Вперше адаптовано вірус сказу вакцинний штам Щолково-51 К до культури клітин НС і показано стабільність його репродукції в цій культурі клітин з титром інфекційної активності 6,85±0,18 lg МЛД50/см³ протягом 16-и пасажів (термін спостереження).

3. Вивчені культуральні характеристики вакцинних штамів вірусу сказу у перещеплюваній культурі клітин НС, та удосконалена технологія отримання вірусовмісного матеріалу шляхом інфікування культури клітин НС «в суспензію» з множинністю зараження 0,1-0,01 МЛД50/кл і двостадійним відбором вірусу, що дозволило одержати вірусовмісну суспензію з високою інфекційною активністю (штаму Щолково-51 К до 7,17±0,10 lg МЛД50/см³, штаму РБ-71 до 6,57±0,09 lg МЛД50/см³, а штаму ТС-80 до 6,04±0,03 lg МЛД50/см³).

4. Удосконалена методика визначення інфекційної активності вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К шляхом титрування в культурі клітин НС і показаний високий ступінь кореляції (r=0,927) між титрами інфекційної активності, отриманими на мишах і в культурі клітин НС. Застосування цього методу дозволило скоротити час при визначенні титру вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К з 14-и до 3-х діб, що є перспективним для використання у процесі виробництва антирабічних вакцин при технологічному контролі вірусної сировини.

5. Розроблений спосіб отримання мозкової суспензії вірусу сказу, який гарантує безпечність роботи і отримання вільної від сторонньої мікрофлори суспензії з високим інфекційним титром.

6. Вивчені умови зберігання вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К і РБ-71 при різних температурах та підібране оптимальне сахарозо-желатозове середовище на гіпертонічному (4 %) розчині натрію хлориду для ліофільного висушування культуральної вірусовмісної суспензії, при застосуванні якого досягнуто мінімальних втрат титру інфекційної активності на рівні 1,2±0,1 lg МЛД50/см³.

7. Встановлена належність штамів Щолково-51 К і РБ-71 до групи середньовірулентних, а штаму ТС-80 - до групи слабовірулентних штамів за результатами експериментальних досліджень патогенних та нейроінвазивних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу для лабораторних тварин (мишей, морських свинок, кролів).

8. При внутрішньом'язовому введенні кролям вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К і РБ-71 виявлена індукція антирабічних антитіл у високих титрах (2,41±1,38 МО/см³ та 1,86±0,59 МО/см³ відповідно) та захист від інтрацеребрального зараження летальною дозою (104,0 МЛД50/гол.) вірусу сказу референс-штаму CVS, що свідчить про їх високу антигенну та імуногенну активність.

9. Встановлена методом ЗТ-ПЛР належність дослідних вакцинних штамів вірусу сказу до першого генотипу, а також показана відсутність відмінностей між штамами у фрагменті варіабельної ділянки гена нуклеопротеїду, незалежно від походження штамів (ТС-80 - похідний штаму SAD, а Щолково-51 К, CVS та РБ-71 - деривати штаму PV).

Пропозиції виробництву

З метою вирішення проблеми сказу на території України пропонується:

1. Застосовувати положення «Концепції використання вакцинних штамів вірусу сказу» при виборі штамів для виробництва антирабічних вакцин.

2. Удосконалити технологічні процеси виробництва інактивованих антирабічних вакцин для підвищення їх імуногенності згідно з положеннями «Стратегії підвищення імуногенності інактивованих антирабічних вакцин».

3. Використовувати «Спосіб отримання мозкової суспензії вірусу сказу» з метою підвищення безпеки при роботі з вірусом сказу в лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах.

4. Керуватись «Методичними рекомендаціями з визначення імунітету та ефективності вакцинації тварин проти сказу» при встановленні титру антирабічних антитіл у сироватках крові домашніх та диких тварин.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Недосєков В.В. Методичні рекомендації «Концепція використання вакцинних штамів вірусу сказу» / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, М.Ю. Іванов. - Затв. Державним комітетом ветеринарної медицини України, протокол № 1 від 20.12.2007 р. - К.: Вид-во «Центр ІТ», 2010. - 24 с. (Здобувачем проведено експериментальні дослідження, аналіз результатів і написання рекомендацій).

2. Недосєков В.В. Методичні рекомендації «Стратегія підвищення імуногенності інактивованих антирабічних вакцин» / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, М.Ю. Іванов, О.М. Цвіліховський. - Затв. Державним комітетом ветеринарної медицини України, протокол № 1 від 23.12.2009 р. - К.: Вид-во «Центр ІТ», 2010. - 17 с. (Здобувач брав участь у проведенні досліджень і написанні рекомендацій).

3. Недосєков В.В. Методичні рекомендації з визначення імунітету та ефективності вакцинації тварин проти сказу / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, З.Р. Троценко, Ж.М. Дрожже. - Затв. Державним комітетом ветеринарної медицини України, протокол № 1 від 20.12.2007 р. - К.: Вид-во «Центр ІТ», 2010. - 13 с. (Здобувач брав участь у проведенні досліджень, узагальненні результатів і написанні рекомендацій).

4. Гришок Л.П. Стан профілактики та контролю сказу в Україні та завдання на перспективу / Л.П. Гришок, В.В. Недосєков, О.В. Падалка, І.М. Полупан // Ветеринарна медицина України. - 2005. - № 11. - С. 7-10. (Здобувачем особисто проаналізовано засоби специфічної профілактики сказу, які застосовуються в Україні).

5. Гришок Л.П. Серологічний моніторинг популяційного імунітету вакцинованих проти сказу тварин та людей / Л.П. Гришок, В.В. Недосєков, О.В. Падалка, І.М. Полупан, Є.В. Щербань, О.М. Сахнюк // Бюлетень ІВМ УААН «Ветеринарна біотехнологія». - 2007. - № 10. - С. 22-30. (Здобувачем проведені дослідження сироваток крові тварин, вакцинованих різними вакцинами, на наявність антирабічних антитіл).

6. Недосєков В.В. Антирабічні вакцини в ветеринарній медицині / В.В. Недосєков, І.М. Полупан, Л.П. Гришок, М.Ю. Іванов // Бюлетень ІВМ УААН «Ветеринарна біотехнологія». - 2007. - № 11. - С. 141-150. (Здобувачем проаналізовані антирабічні вакцини в розрізі штамів, які використовуються при їх виробництві).

7. Недосєков В.В. Концепція використання вакцинних штамів вірусу сказу / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, М.Ю. Іванов // Вісник Полтавської державної аграрної академії. - 2008. - № 1. - С. 133-137. (Здобувачем проведені експерименти та подано обґрунтування доцільності використання штамів вірусу сказу залежно від виду вакцини).

8. Полупан І.М. Отримання та характеристика імунобіологічних властивостей штаму вірусу сказу Сайраб / І.М. Полупан // Вісник Полтавської державної аграрної академії. - 2008. - № 1. - С. 153-156.

9. Недосєков В.В. Порівняльна характеристика імуно- і молекулярно-біологічних властивостей вакцинних штамів вірусу сказу / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, М.Ю. Іванов // Бюлетень ІВМ УААН «Ветеринарна біотехнологія». - 2008. - № 12. - С. 135-147. (Здобувач провів дослідження з вивчення культуральних, патогенних та антигенних властивостей різних вакцинних штамів вірусу сказу).

10. Недосєков В.В. Оздоровлення території України від сказу - невідкладні завдання науки і практики / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, М.Ю. Іванов // Ветеринарна медицина України. - 2009. - № 2. - С. 12-13. (Здобувачем проведені дослідження та визначені перспективні антирабічні вакцини для застосування в Україні).

11. Гришок Л.П. Проблеми специфічної профілактики сказу домашніх тварин в Україні / Л.П. Гришок, В.В. Недосєков, І.М. Полупан, Ж.М. Дрожже, О.М. Цвіліховський // Ветеринарна медицина України. - 2009. - № 7. - С. 11-13. (Здобувачем проведенні дослідження антигенної активності антирабічних вакцин).

12. Полупан І.М. Антигенна активність вакцинного штаму Сайраб вірусу сказу / І.М. Полупан // Бюлетень ІВМ УААН «Ветеринарна біотехнологія». - 2009. - № 15. - С. 297-302.

13. Недосєков В.В. Стратегія підвищення імуногенності інактивованих антирабічних вакцин / В.В. Недосєков, Л.П. Гришок, І.М. Полупан, М.Ю. Іванов // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин і Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок. - 2009. - Вип.10. - № 4. - С. 180-188. (Здобувачем проведені дослідження впливу ад'ювантів на антигенні властивості інактивованих рабічних вірусовмісних матеріалів).

14. Гришок Л.П. Вивчення молекулярно-генетичних варіантів вуличного вірусу сказу на території України / Л.П. Гришок, М.Ю. Іванов, О.М. Дерябін, В.В. Недосєков, І.М. Полупан // Ветеринарна медицина України. - 2010. - № 2. - С. 17-20. (Здобувачем проведені молекулярно-генетичні дослідження трьох вакцинних штамів і референс-штаму вірусу сказу).

15. Пат. № 47938 Україна, МПК А61К 39/205. Спосіб отримання мозкової суспензії вірусу сказу / Недосєков В.В., Гришок Л.П., Полупан І.М., Іванов М.Ю., Щербань Ю.П.; заявник і патентовласник Інститут ветеринарної медицини НААН України - № u200910290; заявл. 09.10.2009; опубл. 25.02.20104, бюл. № 4. (Здобувачем проведені експериментальні дослідження та оформлено заявку на патент).

16. Полупан І.М. Проблема сказу котів в Україні / І.М. Полупан // В кн.: Матеріали ІІІ Міжнародного конгресу спеціалістів ветеринарної медицини. - Тези доп. - 4-7 жовтня 2005 р., НАУ, Київ, Україна. - 2005. - С. 193-195.

17. Гришок Л.П. Особливості епізоотології та проблема контролю сказу в Україні / Л.П. Гришок, В.В. Недосєков, О.В. Падалка, І.М. Полупан // В кн.: Збірник наукових статей Науково-практичної конференції, присвяченій 75-річчю Новогалещенської біофабрики. - Полтава. - 2006. - С. 9-19. (Здобувачем визначені характерні епізоотологічні особливості сказу в останнє десятиліття).

Анотація

Полупан І.М. Імунобіологічні властивості вакцинних штамів вірусу сказу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. - Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ, 2011.

У дисертації наведені результати дослідження імунобіологічних властивостей вірусу сказу вакцинних штамів Щолково-51 К, РБ-71 та ТС-80.

Показана принципова можливість культивування вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К у культурі клітин НС.

Запропонована удосконалена науково-обґрунтована технологія отримання культуральної суспензії вірусу сказу шляхом інфікування культури клітин НС «в суспензію» із двостадійним відбором вірусу, яка дає можливість отримувати вірусовмісний матеріал з високим титром інфекційної активності.

Вивчені умови зберігання нативних культуральних суспензій вірусу сказу при температурах мінус 18±2 0С та 4±2 0С, а також підібране оптимальне сахарозо-желатозове середовище для ліофільного висушування вірусу сказу.

Удосконалена методика визначення інфекційної активності вірусу сказу вакцинного штаму Щолково-51 К шляхом титрування в культурі клітин НС, що дозволило скоротити час при встановленні титру з 14-и до 3-х діб.

Вивчені патогенні та антигенні властивості вакцинних штамів вірусу сказу. Отримані результати стали основою для розробки науково-обґрунтованої «Концепції використання вакцинних штамів вірусу сказу».

За допомогою ЗТ-ПЛР показана відсутність відмінностей між штамами у фрагменті варіабельної ділянки гена нуклеопротеїду, незважаючи на те, що штам ТС-80 - похідний штаму SAD, а Щолково-51 К, CVS та РБ-71 - деривати штаму PV.

Ключові слова: вакцинні штами вірусу сказу, перещеплювані культури клітин, патогенність, індекс інвазивності, антигенні властивості, імуногенність.

Аннотация

Полупан И.Н. Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов вируса бешенства. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология, эпизоотология, инфекционные болезни и иммунология. - Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев, 2011.

В диссертации представлены результаты исследования иммунобиологических свойств вируса бешенства вакцинных штаммов Щелково-51 К, РБ-71 и ТС-80.

Проведена оценка чувствительности перевиваемых культур клеток BHK-21, ПС, Vero, ПТП к вирусу бешенства вакцинным штаммам Щелково-51 К, РБ-71, ТС-80 и установлено, что лучшими вирусрепродуцирующими свойствами обладают культуры клеток ПС и ВНК-21.

Адаптировано вирус бешенства вакцинного штамма Щелково-51 К к репродукции в культуре клеток ПС. Изучены культуральные свойства исследуемых вакцинных штаммов вируса бешенства, полученных в культуре клеток ПС, которые стали основой для усовершенствования технологии получения культурального сырья вакцинного вируса бешенства путем инфицирования культуры клеток ПС «в суспензию» с множественностью заражения 0,1-0,01 МЛД50/кл при применении методики однократной замены инфицированной среды с двукратным отбором вируса, что дало возможность получить вируссодержащий материал с высокой инфекционной активностью. Кроме того, метод однократной замены инфицированной среды позволил от одной монослойной культуры-продуцента получить двукратный объем вируссодержащего материала за 8 суток, в то время как при стандартной методике для получения аналогичного объема вирусного материала, необходимо 10-12 суток.

...