Глікани базидіоміцетів як інгібітори ВТМ-інфекції та індуктори вірусостійкості рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

Глікани базидіоміцетів як інгібітори втм-інфекції та індуктори вірусостійкості рослин

03.00.06 - вірусологія

Поліщук Олена Миколаївна

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі вірусів рослин Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Коваленко Олексій Григорович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу вірусів рослин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук , професор

Поліщук Валерій Петрович,

Київський національний університет ім. Т.Шевченка,

завідувач кафедри вірусології,

доктор сільськогосподарських наук

Мулюкіна Ніна Анатоліївна,

Інститут виноградства і виноробства ім. В.Є. Таїрова НААН України

заступник директора з наукової роботи ННЦ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вірусні хвороби рослин мають широке розповсюдження та значну шкодочинність, що призводить до втрат продукції сільського господарства. Для боротьби з вірусними інфекціями рослин застосовують різноманітні підходи та засоби. Як мішені для сучасних противірусних препаратів розглядаються самі патогени, їх переносників та захисну систему організму, яка атакується інфекційними агентами. Вже відомо досить багато речовин, ефективних щодо фітовірусів, проте проблема ліквідації або обмеження вірусних захворювань у рослин все ще залишається не розв'язаною.

Наразі для захисту рослин від інфекційних хвороб використовують переважно хімічні засоби, які ушкоджують переносників або покращують загальний стан рослин. Проте, хімічні препарати - інсектициди призводять до селекції нових форм патогенів та комах-переносників, до того ж значно ускладнюють проблему охорони довкілля. Одним з ефективних, економічно вигідних та екологічно безпечних способів обмеження вірусних інфекцій рослин є активація їх захисних механізмів індукторами, що мають біологічне походження та легко утилізуються ферментними системами самих рослин та мікроорганізмами. Такими речовинами можуть бути грибні глікани, які мають унікальну структуру та фізико-хімічні властивості. Проте, здатність інгібувати вірусну інфекцію та активувати захисні механізми рослин детально вивчена лише у дріжджових полісахаридів. Глікани ж вищих базидіоміцетів у цьому відношенні не досліджувались. Відомості про механізми індукованої вірусостійкості (ІВС) у рослин, активованої полісахаридами, на сьогодні ще недостатні. Відтак вивчення їх може бути особливо актуальним для сучасної біотехнології рослин, позаяк шляхом клітинної та генної інженерії можна створити нові, стійкі до вірусів форми рослин, які експресують захисні субстанції типу грибних гліканів і, в такий спосіб, можуть протистояти негативному впливу різних патогенів. Знання механізмів та факторів вірусостійкості, обумовлених екзогенними та ендогенними глікополімерами, сприятимуть також створенню нових антифітовірусних препаратів та розробці технологій їх ефективного застосування. basidiomycоtа гриб тютюновий інфекційність

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи виконувалась згідно п'ятирічних планів наукових робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темою «Дослідження ендогенних та екзогенних регуляторів перебігу вірусних інфекцій і розвитку вірусостійкості рослин», реєстраційний номер 0105U00787 (2005-2009), «Взаємовідношення вірусів з клітинами рослин у природних трансформованих та експериментальних системах», реєстраційний номер 0110U001871 (2010-2014), «Розробка технологій одержання та використання екологічно безпечних антивірусних препаратів для сільського господарства» № 4973 УНТЦ від 3.08.2009 р.

Мета і задачі досліджень. Метою дисертаційної роботи було виявити антивірусну активність у гліканів базидіоміцетів, встановити їх вплив на перебіг вірусної інфекції та здатність індукувати вірусостійкість у рослин. Для досягнення поставленої мети виконувалися наступні задачі:

- провести скрінінг штамів грибів відділу Basidiomycоtа щодо їхньої здатності продукувати речовини вуглеводної природи, що пригнічують інфекційність вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ).

- виділити гліканові препарти та вивчити їх склад і фізико-хімічні властивості.

- дослідити характер дії виділених препаратів на захисні функції рослин та виявити залежність їх антивірусної активності від генотипу рослин.

- провести порівняльне вивчення біологічної активності досліджуваних полісахаридних препаратів в рослинах, ізольованих органах та протопластах.

- дослідити наявність у гліканів Basidiomycоtа здатності індукувати у рослин стійкість до ВТМ-інфекції та дослідити механізми, за якими вони активують захисні реакції.

Об'єкти дослідження - вірус тютюнової мозаїки, чутливі та надчутливі до ВТМ рослини родини Solanaceae.

Предмет дослідження - антивірусні властивості полісахаридів Basidiomycetes та активація ними захисних механізмів рослин.

Методи дослідження - вірусологічні, біохімічні, фізико-хімічні, методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. При виконанні дисертаційної роботи автором було вперше встановлено здатність у полісахаридів базидіальних грибів пригнічувати інфекційність і репродукцію ВТМ та індукувати захисні механізми у рослин. Встановлено, що ступінь антивірусної активності та характер дії досліджуваних гліканів залежить від продуцента, способу екстракції та їхньої хімічної будови. На прикладі глюкуроноксиломанану (ГКМ) Tremella mesenterica вперше показано, що поряд з індукцією стійкості рослин до ВТМ de novo, аніонні полісахариди можуть формувати комплекси з віріонами in vitro.

Практичне значення отриманих результатів. Результати вивчення впливу гліканів грибів на перебіг ВТМ-інфекції та функціонування захисних механізмів у тютюну сприятимуть розробці засобів захисту рослин від патогенів на основі використання природної вірусостійкості та її індукторів. Крім того, ці результати можуть бути використані при створенні нових, стійких сортів рослин, у тому числі таких, що експресують антивірусні речовини типу грибних гліканів. Глюкан G. adspersum та глюкуроноксиломанан T. mesenterica можуть бути основою для розробки комплексних екологічно безпечних препаратів, ефективних щодо вірусів поширених на основних сільськогосподарських та декоративних культурах.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором у відділі вірусів рослин Інституту мікробіології і вірусології НАН України особисто. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з тематики досліджень, отримано та узагальнено експериментальні дані, проведено їх статистичну обробку та порівняльний аналіз з літературними даними, а також підготовку матеріалів досліджень до публікації.

Автором особисто проведена екстракція гліканів з культуральної рідини та міцелію різних видів грибів, вивчено їх фізико-хімічні характеристики. Встановлено здатність гліканів грибів пригнічувати розвиток ВТМ-інфекції, індукувати стійкість у надчутливих рослин та досліджено механізми їхньої дії. Самостійно було вивчено вплив гліканів на репродукцію ВТМ у системі рослинних тканин та ізольованих протопластів, а також їх токсичний вплив на рослинні тканини.

Вивчення формування комплексу ГКМ з віріонами ВТМ було здійснено спільно з к.б.н. П.М. Болтовець, гель-хроматографію, аналіз моносахаридного складу гліканів та перйодатне окислення глюкану G.adspersum - з к.б.н. В.М. Васильєвим. Вирощування грибів G.lucidum та G.aplanatum проведено за участю к.б.н. Т. А. Круподерової. Електронно-мікроскопічні дослідження проводились у Центрі колективного користування приладами НАН України на базі Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Планування основних напрямків роботи, обговорення результатів та підготовку публікацій і доповідей проведено спільно з науковим керівником д.б.н. проф. О. Г. Коваленком.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертаційній роботі, були представлені на наукових конференціях-конкурсах молодих вчених ІМВ НАН України (2006 р., 2007 р., 2008 р.), 5-iй Міжнародній конференції «Біоресурси та віруси», (Київ, вересень, 2007 р.), молодіжній конференції «Сучасні проблеми мікробіології та біотехнології» (Одеса, травень, 2007 р.), IV міжрегіональній конференції молодих вчених «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратів, жовтень, 2008 р.), Міжнародній науково-практичній конференції «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, май, 2008 г.), 2-ій міжнародній конференції «Фізичні методи в екології, біології та медицині» (Ворохта, серпень, 2009 р.), XII з'їзді товариства мікробіологів України ім. С.М.Виноградського (Ужгород, травень, 2009 р.), 6-ій міжнародній конференції «Біоресурси та віруси» (Київ, вересень, 2010 р.), 7-ій науковій конференції молодих вчених (Чернігів, вересень, 2010 р.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, із них - 5 статей (3 статті у фахових виданнях) та 9 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 156 сторінках машинописного тексту і містить розділи: вступ, огляд літератури основну частину (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення, аналіз та узагальнення отриманих результатів), висновки та перелік використаних літературних джерел, який містить 197 назв, із яких 145 іноземних. Робота ілюстрована 34 рисунками та 11 таблицями.

РОЗДІЛ 1; 2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з двох розділів. В них розглянуті природні механізми захисту рослин від вірусних інфекцій. Висвітлено типи вірусостійкості рослин, проаналізовано індуктори захисних реакцій рослин різної хімічної природи. Особливу увагу відведено полісахаридам як природним інгібіторам фітовірусної інфекції та індукторам вірусостійкості рослин. Розглянуто сучасний стан досліджень лікувальних властивостей полісахаридів Basidiomicetes та використання їх у медицині.

РОЗДІЛ 3. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Об'єктом досліджень слугував вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus), штам U₁. Вірус накопичували в рослинах тютюну сорту Імунний 580 (Nicotiana tabacum L.), що є дефіцитним по N-гену та реагує на цей вірус системною інфекцією.

В роботі використовувались такі рослини-індикатори: тютюн (N.tabacum L.) сорту Імунний 580, надчутливий до ВТМ, та його чутливий дефектний по N-гену мутант, дикий вид тютюну N. sanderae Hort., а також надчутливі до ВТМ рослини дурману (Datura stramonium L.).

Окрім інтактних рослин в роботі використовували ізольовані листки, диски з листків та протопласти.

Препарати гліканів отримували з культуральної рідини та міцелію грибів порядку Basidiomycota. У дослідженнях використовували: глюкуроноксиломанан (ГКМ) з ліофілізованої культуральної рідини гриба Tremela mesenterica Ritz.: Fr., сумарні полісахаридні препарати з культуральної рідини Ganoderma lucidum [Curt.:Fr.] P.Karst та Ganoderma applanatum [Pirs.:Waller]Pat, глюкан з міцелію Ganoderma adspersum (Schulzer) Donk.

Сумарні полісахаридні препарати G.lucidum та G.applanatum отримували з культуральної рідини, що була відібрана після глибинного культивування міцелію грибів на мінеральному поживному середовищі. Препарати отримували шляхом осадження 2-ма об'ємами етилового спирту.

Препарат глюкуроноксиломанану осаджували з водного розчину культуральної рідини T.mesenterica ацетоном та очищали за методикою (Kakuta, 1979; Vinogradov et. al, 2004) з деякими модифікаціями.

З міцелію G. adspersum, шляхом екстракції водою, лугом та кислотою, отримували три полісахаридні препарати. Для відокремлення низькомолекулярних речовин міцелій відмивали 85% спиртом (3-х кратне кип'ятіння), для очистки від білкових домішок - обробкою сумішшю ізоамілового спирту та хлороформу (1:10).

Вміст вуглеводів в досліджуваних препаратах визначали в реакції з 0,2%-ним розчином антрону в концентрованій H₂SO₄ ( Захарова, Косенко, 1982) та фенол-сірчанокислим методом (Варбанец и др., 2006). Вміст білків в препаратах визначали за методом Bradford ( Bradford, 1976).

Аналіз моносахаридного складу гліканів G.adspersum проводили методом газорідинної хроматографії (ГРХ) ( Варбанец и др, 2006). Компонентний склад даних гліканів досліджували за допомогою гель-фільтрації на колонці (1,7 х 41 см) з гелем Sephadex G-100. Часткову деградацію глюкану проводили за допомогою перйодатного окислення з наступним відновленням боргідридом натрію та гідролізом 0,05 М H₂SO₄.

Очищений препарат ВТМ отримували методом диференційного центрифугування освітлених хлороформом екстрактів з рослин тютюну N.tаbacum мутантного по гену стійкості, які мали характерні вірусні симптоми.

Інфікування рослин здійснювали методом механічної інокуляції. Суспензію вірусу в об'ємі 50-100 мкл наносили на листкову пластинку, яку попередньо посипали абразивним матеріалом, та інокулювали за допомогою скляного шпателя. Як абразив використовували дрібнозернистий карборунд.

Інфекційність вірусу в інокульованих тканинах та протопластах визначали методом половинок шляхом інокуляції рослин-індикаторів (Datura stramonium) отриманими екстрактами. Визначення вмісту вірусного антигену проводили «сендвіч»-варіантом імуноферментного аналізу (Кэти и др., Антитела 2. Методы, 1996).

Відбір препаратів гліканів за антивірусною активністю здійснювали на рослинах D.stramonium. Для цього розчин препарату додавали до суспензії ВТМ (4-10 мкг/мл) та інокулювали ліві половинки листків; праві інокулювали тим же препаратом ВТМ без додавання глікану. Антивірусну активність препаратів визначали, підраховуючи кількість некрозів на дослідній половинці порівняно з такою в контрольній, яку приймали за 100%.

Для виявлення індукторних властивостей препаратів гліканів їх водні розчини вводили у міжклітинний простір лівих половинок листків тютюну N.tаbacum та N.sanderae, в праві половинки вводили воду. Листки інокулювали ВТМ через 1, 3, 5, 7 діб після введення досліджуваного препарату. Величину ІВС визначали за кількістю та розміром некрозів, як вказано вище.

Механізм ІВС вивчали, застосовуючи інгібітор ДНК-залежної-РНК-полімерази актиноміцин Д (АМД) та гаптени лектиноподібних рецепторів клітин (-метил-D-глікозиди). АМД вводили в міжклітинний простір листків одночасно з досліджуваним полісахаридом або через певний інтервал часу після введення останнього. -Метил-D-глікозиди додавали до суміші ВТМ-полісахарид та інокулювали ліві половинки листків дурману; праві інокулювали вірусом з моносахаридом без досліджуваного глікану.

Вплив полісахаридів на репродукцію ВТМ вивчали на ізольованих дисках та листках тютюну, що реагує на вірус системною інфекцією. Препарати вводили у міжклітинний простір листків до або після інфікування ВТМ. Диски та листки інкубували протягом 3-х діб, після чого визначали інфекційність екстрактів з них (1:10) на рослинах-індикаторах. Вплив гліканових препаратів на перебіг інфекційного процесу вивчали на протопластах, отриманих з системно інфікованих рослин тютюну.

Для дослідження можливості ГКМ формувати комплекс з ВТМ суміш вірус-полісахарид інкубували різний інтервал часу та визначали її інфекційність на рослинах дурману. Для підтвердження комплексоутворення використовували метод поверхневого плазмонного резонансу, який дозволяє дослідити динаміку взаємодії вірусу та полісахариду. Вірус (100 мкг/мл) інкубували з полісахаридом (300 мкг/мл) протягом 30 хв, після чого до суміші додавали антитіла, й інкубували ще 30 хв. В залежності від здатності ГКМ формувати комплекс з віріоном відбувається зменшення вірусних сайтів для зв'язування антитіл. У контрольних варіантах досліду для дотримання відповідного співвідношення між компонентами реакційної суміші замість полісахариду додавали воду. В роботі застосовували поліклональну кролячу антисироватку (Інститут сільськогосподарської мікробіології УНААН) (розведення від 1:25 до 1:1600) і білок А Staphylococcus aureus (Sigma) (50 мкг/мл), які були розчинені у сольовому фосфатному буфері (ФСБ pH 7.4) та водний розчин ГКМ. Суміш ВТМ-ГКМ інкубували 30 хв та центрифугували в градієнті густини сахарози. Вірус, отриманий з опалесціювальної зони градієнту досліджували в електронному мікроскопі JEM 1400.

РОЗДІЛ 4. СКРИНІНГ ГРИБІВ BASIDIOMICETES НА ЇХНЮ ЗДАТНІСТЬ ПРОДУКУВАТИ АНТИВІРУСНІ РЕЧОВИНИ

Відомо, що гриби відділу Basidiomicоtа продукують широкий спектр біологічно активних гліканів та глікопротеїнів, які мають різноманітну структуру і, відповідно, різні типи активності (Даниляк, Решетніков 1996; Lindequist et al, 2005; Wasser et al, 2005). В наш час інтенсивно вивчається їхній оздоровчий вплив на організм людини. Зокрема, досліджують імуностимулювальні, антивірусні, антибактеріальні властивості гліканів, а також здатність їх підтримувати гомеостаз організму. З літературних даних відомо, що полісахариди, отримані з деяких бактерій та грибів, мають антифітовірусну активність (Коваленко, 1983; Kovalenko A.G., 1987).

Нами було проведено дослідження штамів базидільних грибів на їхню здатність продукувати полісахариди з антифітовірусною активністю. В результаті проведених досліджень виокремлено по одному штаму кожного виду, які мали найвищу активність як продуценти антивірусних речовин, а саме: 623 з T. mesenterica, 1900 з G. Lucidum, 920 - G. applanatum, II - G. adspersum.

ГКМ, отриманий з різних штамів, не відрізнявся за здатністю інгібувати ВТМ-інфекцію і був активним лише за застосування у високих концентраціях, що характерно для полісахаридів з аніонними властивостями (Kovalenko et al, 1993). Глікани G.adspersum активно інгібували ВТМ навіть за концентрації 100 мкг/мл і дана активність збільшувалась з підвищенням концентрації препарату. Характерно, що серед глюканів G.adspersum найбільша здатність інгібувати ВТМ виявлена у препарату екстрагованого водою, хоча «кислотний» та «лужий» препарати також мали високу антивірусну активність.

РОЗДІЛ 5. ХІМІЧНИЙ СКЛАД ТА АНТИВІРУСНІ ВЛАСТИВОСТІ ПОЛІСАХАРИДІВ ПРОДУКОВАНИХ BASIDIOMICETES

Відомо, що основними активними компонентами продуктів метаболізму вищих грибів Basidiomicetes є глікани, мономерами яких є, переважно, глюкоза, рідше - маноза (Marchessalt et al, 1977; Gorin, Barreto-Berger, 1983; Оводов, 1997). Серед них зустрічаються також глікопротеїни, які містять білкову частину (Оводов, 1997). Біологічна активність гліканів може залежати не лише від первинної структури, молекулярної маси, ступеня розгалуженості ланцюга, розчинності у воді, але й від джерела їх отримання (міцелій, культуральна рідина або плодові тіла) та середовища культивування (Пучкова, 2004). З огляду на літературні дані, нам необхідно було спочатку вивчити основні фізичні характеристики антивірусних речовин зокрема, їх термостабільність та здатність затримуватися целюлозною мембраною в процесі діалізу.

Для цієї мети ми використовували ліофілізовану культуральну рідину G. lucidum та G. applanatum. В результаті встановлено, що продукти, які обумовлюють антивірусну активність культуральної рідини G. lucidum, стійкі до підвищених температур (100°С, 10 хв) та не проникають крізь целюлозну мембрану. Подібна обробка речовин з G. applanatum призводила до зниження антивірусної активності.

Отримані з культуральної рідини полісахаридні препарати мали незначний вміст білків (0,2%) та не містили домішок нуклеїнових кислот і мали антивірусну активність. Це свідчить про те, що основна роль у антивірусній активності препаратів з культуральних рідин належить полісахаридам.

Тобто антивірусну активність культуральної рідини з G. lucidum обумовлюють полімери, що мають молекулярну масу вище за 7-10 кДа та стійкі до підвищених температур. У культуральній рідині G. applanatum, очевидно, окрім полісахаридів, присутні також антивірусні речовини, що є термолабільними, можливо глікопротеїни.

Препарати, отримані з міцелію G.adspersum за водної, кислотної та лужної екстракції містять, переважно, вуглеводи (32-61%) (Табл.1). Домішки білків у них не перевищували 1-3%.

Таблиця 1

Вихід препаратів, екстрагованих з міцелію G. adspersum та вміст у них вуглеводів та білків

Препарат	Вихід препарату	Вуглеводи	Білки
Водна екстракція	8,4	44,0	2,0
Кислотна екстракція	4,4	61,3	3,3
Лужна екстракція	11,5	31,5	1,4

ГРХ гідролізатів (2 М H₂SO₄) гліканових препаратів дозволила встановити, що основною складовою частиною їх є глюкоза (Рис. 1), вміст якої у «кислотному» препараті становив 81,6%, «лужному» - 56,9%, водному - 75,7%. Як мінорні компоненти в препаратах присутні маноза, рамноза та галактоза. Ґрунтуючись на отриманих даних, можна зробити висновок, що антивірусні речовини G.adspersum представлені глюканами.

Рис 1. Моносахаридний склад полісахаридних препаратів, отриманих з міцелію G.adspersum за водної, кислотної та лужної екстракції

В результаті гель-фільтрації препаратів на колонці з гелем Sephadex G-100 було встановлено, що глюкани, екстраговані кислотою та лугом гомогенні. Молекулярна маса даних полімерів становить 70 та 48 кДа, відповідно. Глюкановий препарат, отриманий водною екстракцією, містить декілька складових компонентів, що різняться за своєю молекулярною масою. Головний компонент, який виходив одразу після вільного об'єму колонки, є полімером, молекулярна маса якого рівна 95 кДа. Молекулярна маса компонентів, що присутні в препараті в незначній кількості, становить відповідно 48 та 20 кДа. Дослідження антивірусної активності хроматографічних фракцій показало, що всі вони мають здатність інгібувати інфекційність вірусу, проте активність високомолекулярних компонентів вища, порівняно з низькомолекулярним (Рис. 2).

Для вивчення ролі окремих глікозидних зв'язків у антивірусній активності глюкану G.adspersum було проведене його перйодатне окислення та отримані відновлені й частково фрагментовані похідні полімеру й випробувана їх активність щодо ВТМ. При окисненні перйодатом відбувається розщеплення глюкози, зв'язаної 1>2-, 1>4- та 1>6-зв'язками, тоді як 1>3-зв'язки при цьому залишаються інтактними (Кочетков, 1967).

Встановлено, що під дією перйодату окиснюється лише 24,6% глюкану, тоді як 76,4% залишається інтактним. Отримані дані вказують на те, що досліджуваний глюкан представлений, скоріш за все, полімером, залишки глюкози в якому сполучені 1>3-зв'язками, які й формують, очевидно, головний ланцюг, тоді як інші (24,6%) типи зв'язків ( можливо, 1-6-зв'язки) представлені у бічних відгалуженнях ланцюга. Перевірка антивірусної активності похідних глюкану дозволила встановити, що за перйодатного окислення та наступного відновлення й гідролізу здатність інгібувати ними ВТМ на рослинах дурману знижується на 50-60%, порівняно з нативним глюканом (Рис. 3).



Рис. 2. Гель-хроматографія полісахаридного препарату екстрагованого водою з міцелію G.adspersum, на колонці з Сефадексом G-100 та його антивірусна активність

Рис. 3. Вплив перйодату на антивірусну активність глюкану G.adspersum

А - нативний препарат, Б - окиснений з наступним відновленням та гідролізом (В)

Отже, отримані результати вказують на те, що у антивірусній активності глюкану екстрагованого водою з міцелію G. adspersum, важливе місце мають всі типи глікозидних зв'язків, а також розгалуженість молекули за наявністю бічних ланцюгів, в яких, можливо, присутні 1>2-, 1>4- або 1>6-зв'язки. Той факт, що 1>3-зв'язаний головний ланцюг також може інгібувати розвиток ВТМ-інфекції, хоч і меншою мірою ніж нативний глюкан, свідчить про неабияку роль його 1>3-зв'язків в реалізації біологічної активності полісахариду.

Оскільки найбільш активним інгібітором вірусної інфекції був «водний» глюкан, ми використовували його в подальших дослідженнях. Нами було встановлено, що даний полісахарид здатен пригнічувати вірусну інфекцію в чутливих і надчутливих до ВТМ рослинах тютюну (Табл. 2). Причому, ступінь пригнічення інфекційності вірусу не залежав від виду рослини-хазяїна, позаяк активність його відмічена як у рослни, в яких присутній N-ген, що детермінує надчутливу реакцію в рослин, так і в рослин,у яких даний ген відсутній.

Таблиця 2

Активність глюкану, виділеного з міцелію G. adspersum, щодо інфекційності ВТМ на рослинах тютюну різного генотипу

Концентрація глюкану, мкг/мл	Кількість некрозів/лист	Пригнічення, %
	Дослід	Контроль
N. sanderae
500	0,7	32,7	97,9+++
1000	1,0	16,2	93,8+++
N. tabacum
500	13,9	138,6	90,0+++
1000	2,6	20,0	87,0+++

Примітка: ⁺⁺⁺) Р?0,1%

Глюкуроноксиломанан T. mesenterica являє собою полімер б-(1>3)-зв'язаної манози, що гліколізований в-(1>2)(1>4)-зв'язаними олігосахаридами ксилози та глюкуронової кислоти, яка надає йому властивостей поліаніону (Vinogradov et.al, 2004). В наших дослідах ГКМ інгібував розвиток ВТМ-інфекції не лише на рослинах тютюну N. tаbacum, але й на рослинах N. sanderae, які не локалізують вірусну інфекцію в первинних некрозах (Ковалено, Кириченко, 2004) (Табл. 3).

Таблиця 3

Вплив ГКМ на інфекційність ВТМ на рослинах N. sanderae

Концентрація ГКМ, мкг/мл	Кількість некрозів/лист	Пригнічення, %
	Дослід	Контроль
1000	7,0	10,5	330
2500	1,75	6,0	71+

Примітка: Р⁰ >5%; ⁺) 1%<Р?5%;

Тобто, поряд з активацією надчутливої реакції, для даного глікану можуть бути притаманними й інші механізми обмеження вірусної інфекції, а саме інгібування ранніх етапів інфекції, які пов'язані з проникненням віріонів в клітини та депротеїнізацією РНК, що не залежать від функціонування геному клітини.

РОЗДІЛ 6. ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ГЛІКАНІВ BASIDIOMYCETES НА СПРИЙНЯТЛИВІСТЬ РОСЛИН ДО ВТМ-ІНФЕКЦІЇ

При дослідженні індукторних властивостей гліканів Basidiomicоtа нами було встановлено, що ГКМ (1000 та 2500 мкг/мл) підвищує вірусостійкість рослин тютюну сорту Імунний 580 (Рис. 4). Стійкість, індукована ГКМ, зберігалась протягом 7 діб.

Рис. 4. Вплив різних концентрацій ГКМ (1000 та 2500 мкг/мл) на сприйнятливість тютюну сорту Імунний 580 до ВТМ

Подібний ефект ГКМ було виявлено нами і у чутливих до ВТМ рослин N.sanderae. Однак дія його у цьому виді тютюну менш виражена і недовготривала.

Встановлено, що глікани G.lucidum та G.applanatum (концентрація 1000 та 2500 мкг/мл) індукували незначний рівень стійкості, яка на 5 добу майже не відмічалась, а обробка препаратами рослин N.sanderae не спричиняла зниження їх чутливості до ВТМ.

При вивченні індукторних властивостей глюкану G.adspersum було встановлено, що найбільш оптимальною концентрацією, в якій препарат захищав рослини від ВТМ-інфекції, була 500 мкг/мл. Рівень індукованої ним стійкості становив 37-65% (Рис. 5).

Подібна обробка цим препаратом рослин N. sanderae не призводила до інгібування вірусної інфекції.

РОЗДІЛ 7. ВПЛИВ ПОЛІСАХАРИДНИХ ПРЕПАРАТІВ НА РЕПРОДУКЦІЮ ВТМ ЗА СИСТЕМНОЇ ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ

Встановлено, що ГКМ T. mesenterica та глюкан G. adspersum інгібували репродукцію ВТМ у чутливих до даного вірусу рослинах тютюну (Рис. 6).

А

Б

Активність даних препаратів мала місце за їхнього застосування як до, так і після інфікування рослин.

Отже, антивірусна активність гліканів Basidiomycota може базуватись також на порушенні проникнення віріонів до клітини, інгібуванні ранніх стадій транскрипції вірусної РНК та/або на безпосередньому впливі на ВТМ, можливо, завдяки депротеїнізації віріонів.

РОЗДІЛ 8. МОЖЛИВІ МЕХАНІЗМИ АНТИВІРУСНОЇ ДІЇ ПОЛІСАХАРИДНИХ ПРЕПАРАТІВ

Відомо, що полісахариди можуть індукувати вірусостійкість рослин за рахунок їх впливу на геном, що характеризується активацією процесів транскрипції та трансляції і, відповідно, синтезом нових речовин, які мають здатність локалізувати інфекцію (Коваленко та ін., 2000). З іншого боку, можливий прояв їх активності на конформаціному рівні за рахунок білок-вуглеводної взаємодії, що не потребує нових синтезів у клітині (Коваленко, 1993). Перший механізм дії характерний для аніонних полісахаридів другий - для нейтральних.

Застосування актиноміцину Д, який блокує синтез клітинних РНК але не впливає на репродукцію вірусу дозволило встановити, що індукторні властивості обох препаратів були пригніченими (Рис. 7). Тобто, одним з механізмів їх антивірусної активності є активація процесів вірусостійкості, що базуються на синтезі клітинних РНК та білків de novo.

Рис. 7. Вплив АМД на стійкість рослин тютюну сорту Імунний 580 індуковану ГКМ (1000 мкг/мл) до ВТМ-інфекції

1 - ГКМ; 2 - суміш ГКМ та АМД (10 мкг/мл); 3 - АМД (10 мкг/мл), введений через 2 доби після ГКМ; 4 - АМД (10 мкг/мл) без полісахариду.

Додавання до досліджуваних препаратів заміщених моносахаридів, які можуть конкурувати з ними за лектиноподібні рецептори клітини (Коваленко, 1993) і, таким чином, зменшувати кількість сайтів їхнього впливу на захисні механізми клітин, знижувало антивірусну активність гліканів (Рис. 8.).

Тобто, полісахариди можуть взаємодіяти з рецепторами клітин, що ініціюють реакцію надчутливості, та характеризують захисні механізми за рахунок білок-вуглеводної взаємодії.

Рис. 8. Вплив -метил-D-глюкозиду та -метил-D-манозиду на антивірусну активність глюкану в рослинах дурману

Досліджувані глікани в ефективних концентраціях не мають токсичного впливу на рослинні тканини. Отже, в антивірусній активності препаратів не беруть участі механізми, що спричиняють загибель уражених клітин.

Кислий полісахарид ГКМ може взаємодіяти з віріонами ВТМ і пригнічувати їх проникнення до клітин. Додавання вірусу до суспензії ГКМ та інкубація різний період часу призводило до зниження інфекційності ВТМ (Рис.9). Інактивація вірусу відбувається протягом 10 с, що вказує на ймовірність швидкої агрегації ВТМ під впливом полісахариду.



Рис. 9. Пригнічення інфекційності ВТМ, залежно від часу інкубації його з ГКМ на рослинах D. stramonium та фізіологічного стану листя

Взаємодія ВТМ та ГКМ була підтвердженою методом поверхневого плазмонного резонансу, який дозволяє дослідити динаміку їх зв'язування, що відображається у зміні кута ППР. При додаванні до суспензії ВТМ полісахариду ГКМ, зменшується кількість сайтів для зв'язування антитіл та відмічається зміщення кута ППР порівняно з контролем, а також знижується його величина (Рис. 10).

Рис. 10. Залежність величини резонансного кута від концентрації специфічних до ВТМ антитіл у суміші за відсутності і наявності ГКМ. Відносні одиниці - абсолютне значення відгуку на вірус : абсолютне значення відгуку на буфер

Для перевірки комплексоутворення між ГКМ та ВТМ ми застосували також метод центрифугування у градієнті густини сахарози, який дозволяє розділити компоненти в залежності від їхніх молекулярних мас. Нами було встановлено, що як у контрольному варіанті, де замість полісахариду додавали фосфатний буфер, так і в досліді опалесціювальна зона вірусу мала однакове положення. Тобто, за даних умов неможливо виділити комплекс ВТМ з ГКМ в градієнті густини сахарози, очевидно, внаслідок того, що молекулярна маса вірусу і комплексу його з полісахаридом різниться мало або ж можливий комплекс руйнується під впливом відцентрових сил.

При дослідженні вірусу, відібраного з опалесціювальних зон досліду (ВТМ+ГКМ) та контролю (ВТМ+буфер) була відмічена агрегація вібріонів бік-в-бік та кінець-в-кінець, що підтверджує гіпотезу про безпосередній вплив ГКМ на віріони ВТМ in vitro (Рис. 11). Даний ефект у цілому може відігравати важливу роль у біологічній активності даного полісахариду.

Надчутлива реакція і природна стійкість, що обумовлена генотипом рослини, притаманна лише інтактним тканинам і не реалізується в системі ізольованих протопластів (Коваленко та ін., 1999). Тому нами було застосовано дану систему для перевірки здатності гліканів інгібувати процеси репродукції ВТМ, які відбуваються у клітинах незалежно від їх інтеграції в тканини. З цією метою використовували протопласти, що отримані з інфікованих рослин тютюну, які культивували в середовищі у присутності гліканів у таких концентраціях: ГКМ - 200, 500 мкг/мл; глюкан - 100, 500 мкг/мл.

А Б В

Рис. 11. Електронна мікроскопія ВТМ, отриманого з опалесціювальної зони, що формувалась після центрифугування в градієнті густини сахарози: А -вірус після центрифугування без ГКМ, Б, В - вірус після центрифугування у присутності ГКМ. (Розмір лінійки: А - 500 нм, Б - 100 нм, В - 200 нм)

Встановлено, що ГКМ T. mesenterica, у всіх досліджуваних концентраціях, та глюкан G. adspersum, в концентрації 500 мкг/мл, на другу годину після введення препарату знижували титр антигену ВТМ порівняно з контролем. Даний ефект нетривалий і, вже на 6 годину інкубації, інгібування вірусної репродукції нами не було відмічено. Через 24 години інкубації ми спостерігали, що у всіх варіантах відмічалось зниження титру вірусу порівняно з контролем

Вивчення інфекційності ВТМ, екстрагованого з протопластів, показало, що глюкан інгібував репродукцію вірусу на 10-15 % у всіх досліджуваних концентраціях, тоді як ГКМ має здатність інгібувати репродукцію ВТМ лише в концентрації 500 мкг/мл через 24 години після введення препарату.

Отже, досліджувані препарати в системі ізольованих протопластів мають незначний вплив на репродукцію вірусу, порівняно з їх активністю у системі рослинних тканин. Тобто, інгібування досліджуваними препаратами вірусної інфекції у рослин відбувається переважно за рахунок впливу їх на механізми стійкості, для активації яких необхідна наявність інтеграції клітин та можливості транспорту речовин, і мало впливають на процеси репродукції ВТМ, що відбуваються у рослинній клітині.

ВИСНОВКИ

На моделі вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) вперше продемонстрована здатність гліканів вищих грибів відділу Basidiomycota пригнічувати біологічну активність фітовірусів та індукувати стійкість рослин до вірусної інфекції. Вивчено характер антивірусної та індукторної дії полісахаридів, диференційовано механізми, за якими вони можуть впливати на перебіг ВТМ-інфекції у чутливих і надчутливих рослин.

1. Гриби Tremella mesenterica, Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum та Ganoderma adspersum продукують речовини, які здатні пригнічувати інфекційність та репродукцію ВТМ у рослинах тютюну та дурману.

2. Антифітовірусно активні препарати, екстраговані з культуральної рідини та міцелію базидіальних грибів, є термостабільними, не дифундують через целюлозну мембрану в процесі діалізу та представлені гліканами з незначним вмістом білків.

3. Полісахаридні препарати, вилучені з культуральних рідин Ganoderma lucidum та Ganoderma аpplanatum, у рослин тютюну не впливають на захисні механізми, детерміновані N-геном, тоді як кислий глюкуроноксиломаннан (ГКМ) T.mesenterica та глюкан G. adspersum можуть активувати їх.

4. Інгібітор ДНК-залежної РНК-полімерази актиноміцин Д пригнічує стійкість, індуковану ГКМ T.mesenterica та глюканом G. adspersum, що вказує на участь в її формуванні клітинного геному, зокрема, синтезу РНК на матриці клітинних ДНК de novo.

5. Антивірусна активність ГКМ T.mesenterica та глюкану G. adspersum у надчутливих до ВТМ рослинах дурману частково блокується гаптеном манозоспецифічних лектинів -метил-D-манозидом. Це може свідчить про те, що дані гліколімери можуть, також, втручатись в ініціальні стадії надчутливої реакції, що базуються на конфірмаційній білок-вуглеводній взаємодії.

6. ГКМ T.mesenterica та глюкан G.adspersum пригнічують ранні стадії репродукції ВТМ в чутливих рослинах тютюну за профілактичного та терапевтичного застосування, що свідчить про можливий вплив цих гліканів на внутрішньоклітинні процеси, пов'язані з репродукцією вірусу.

7. ГКМ T.mesenterica та глюкан G.adspersum в ефективних концентраціях не мають токсичного впливу на рослинні тканини і протопласти, що виключає фітотоксичність гліканів як один з механізмів пригнічення ВТМ-інфекції.

8. ГКМ T.mesenterica може формувати нетривкий комплекс з віріонами ВТМ in vitro, який обумовлений екрануванням та агрегацією віріонів; комплекс руйнується при розведенні взаємодіючих компонентів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Screening of metabolites produced by strains of Gaderma lucidum [Curt.:Fr.] and G.applanatum [Pirs.:Waller] Pat. for their activity against tobacco mosaic virus / O.G. Kovalenko, О.М. Polishchuк, Т.А. Кrupoderova [еt al].// Вісник КНУ.- 2008.- Вип. 51. - С. 32-34. (Здобувачем проведено скрінінг штамів грибів Ganoderma lucidum та Ganoderma applanatum на їх здатність продукувати полісахариди, що мають антивірусні властивості та вивчено фізичні властивості препаратів).

2. Kovalenko O.G. Virus resistance induced by glucuronoxylomannan isolated from submerged cultivated yeast-like cell biomass of medicinal yellow brain mushroom Tremella mesenterica Ritz.: Fr. (Heterobasidiomycetes) in hypersensitive host plants / O.G. Kovalenko, O.М. Polishchuk, S.P. Wasser // Int. J. Medicinal Mushrooms. - 2009. - V. 11 - P. 199-205. (Здобувачем було перевірено антивірусну активність полісахаридних препаратів екстрагованих з культуральної рідини Tremella mesenterica та здатність глюкуроноксиломанану індукувати стійкість рослин до вірусної інфекції).

3. Коваленко О.Г. Вплив глюкороноксиломанану Tremella mesenterica Ritz.: Fr. (Basidiomycota) на стійкість рослин до вірусу тютюнової мозаїки / О.Г. Коваленко, О.М. Поліщук // Мікробіол. журн. - 2009. - 71, № 1. - С. 50-56. (Здобувачем було перевірено антивірусну активність глюкуроноксиломанану та його здатність пригнічувати репродукцію вірусу тютюнової мозаїки).

4. Поліщук О.М. Біологічна активність глікополімерів базидіальних грибів / О.М. Поліщук, О.Г. Коваленко // Біополімери і клітина. - 2009. - Т.25, №3. - С. 181-193. (Здобувачем здійснено аналіз літературних даних щодо біологічних властивостей продуктів метаболізму базидіальних грибів).

5. Коваленко О.Г. Глікани вищого базидіального гриба Ganoderma adspersum (Schulzer) Donk: отримання та антифітовірусна активність / О.Г. Коваленко, О.М. Поліщук, С.П. Вассер // Біотехнологія. - 2010. - Т.3. - №5. - С.83-91. (Здобувачем отримано полісахаридні препарати з ліофілізованого міцелію трьох штамів гриба Ganoderma adspersum та проведено порівняння їх антивірусної активності. Досліджено здатність глікану отриманого водною екстракцією індукувати вірусостійкість надчутливих рослин тютюну та інгібувати репродукцію вірусу тютюнової мозаїки в чутливих рослинах).

6. Kovalenko O.G. Antiviral activity of glucuronoxylomannan Tremella mesenterica Ritz. Er. / O.G. Kovalenko, E. N. Polishchuk // Modern problems of microbioilogy and biotechnology : the young scientists and students intern. scient. conf., 28-31 May, 2007 : book of abstracts. - Odesa, 2007. - P.186.

7. Screening of strains Gaderma lucidum [Curt.:Fr.] and G.applanatum [Pirs.:Waller] Pat. to the activity their metabolites to TMV / О.М. Polishchuк Т.А. Кrupoderova, O.G. Kovalenko [et al] // «Bioresourses and Viruses» : 5th internat. conf., 10-13 September, 2007 : book of abstracts. - Kyiv, 2007.

8. Коваленко А.Г. Функционирование вирус-индуцированных защитных механизмов у растений табака и дурмана в присутствии гликанов базидиомицетов / А.Г. Коваленко, Е.Н. Полищук // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой : IV межрегиональная конференция молодых учених, 14-16 октября 2008 г. : тезисы докладов. - Саратов, 2008 г. - С.24.

9. Полищук Е.Н. Влияние глюкуроноксиломанана Tremella mesenterica на репродукцию вируса табачной мозаики в изолированных листьях табака / Е.Н. Полищук, А.Г. Коваленко // Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития : международная научно-практическая конференция, 19-21 мая 2008 г. : тезисы докладов. - Алматы, 2008.

10. Investigation of multicomponent virus contain - ING mixtures by the surface plasmon resonance / P.M. Boltovets, O.М. Polishchuk, O.G. Kovalenko [еt al] // Physical methods in ecology, biology and medicine : 2^nd International сonference, 2-6 September 2009. : program and abstracts. - Lviv-Vorokhta, 2009. - P.54.

11. . Коваленко О.Г. Виділення та антивірусна активність полісахаридних препаратів із міцелію гриба Ganоderma adspersum (Schulzer) donk / О.Г. Коваленко, О.М. Поліщук, С.П. Вассер // XII з'їзд товариства мікробіологів України ім. С.М.Виноградського, 25-30 травня 2009 р. : тези доповідей. - Ужгород. - С. 458.

12. Исследования биосинтетической активности штаммов Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) PAT и G.lucidum (Curt.: Fr.) P. Сarst. из коллекции шляпочных грибов института ботаники им. Н.Холодного НАН Украины / Т.А. Круподерова, Н.А. Бисько, Б.Ф. Васильева, Е.Н. Полищук [и др.] // Иммунология, аллергология, инфекцитология. - 2009. - № 4. - С. 187.

13. Глікани Ganоderma adspersum (Schulzer) donk : отримання, фізико-хімічна характеристика, антивірусна активність/ О.Г. Коваленко, О.М. Поліщук, В.М. Васильєв [та ін.] // Тези доповідей 6-ї міжнародної конференції «Біоресурси та віруси». - 14-17 вересня, 2010.- Київ, Україна.-С.156-157.

14. Поліщук О.М. Токсикологічна характеристика та антивірусна активність гліканів у системі ізольованих протопластів / О.М. Поліщук // Мікробіологія в сучасному сільськогосподарському виробництві : 7-a наукова конференція молодих вчених, - 21-24 вересеня 2010 р. : тези доповідей. - Чернігів, 2010 р. - С.59-61.

АНОТАЦІЯ

Поліщук О.М. «Глікани базидіоміцетів як інгібітори ВТМ-інфекції та індуктори вірусостійкості рослин». - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2011.

Дисертація присвячена дослідженню гліканів базидіоміцетів як інгібіторів ВТМ-інфекції та індукторів вірусостійкості рослин.

На моделі вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) вперше продемонстрована здатність гліканів вищих грибів відділу Basidiomycota пригнічувати біологічну активність фітовірусів та індукувати стійкість рослин до вірусної інфекції. Вивчено характер інгібіторної та індукторної дії полісахаридів, диференційовано механізми, за якими вони можуть впливати на перебіг ВТМ-інфекції у чутливих і надчутливих рослин.

Показано, що гриби Tremella mesenterica, Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum та Ganoderma adspersum продукують речовини, які здатні пригнічувати інфекційність та репродукцію ВТМ у рослинах тютюну та дурману. Антивірусно активні речовини, екстраговані з культуральної рідини та міцелію базидіальних грибів за різних способів екстракції представлені гліканами. З міцелію G.adspersum можна отримати глюкани з різною молекулярною масою: глюкан, екстрагований кислотою, має молекулярну масу 48 кДа, лугом - 70 кДа; препарат, екстрагований водою, містить декілька глюканів з різною молекулярною масою - 95, 48 та 20 кДа.

Полісахаридні препарати, вилучені з культуральних рідин Ganoderma lucidum та Ganoderma аpplanatum, у рослин тютюну не впливають на захисні механізми, детерміновані N-геном, тоді як кислий глюкуроноксиломаннан (ГКМ) T.mesenterica та глюкан G. adspersum можуть активувати їх.

Показано, що стійкість, індукована ГКМ T.mesenterica та глюканом G. adspersum, формується за участю клітинного геному, зокрема, за рахунок синтезу РНК на матриці клітинних ДНК de novo. Крім того встановлено, що ці гліколімери можуть втручатись в ініціальні стадії надчутливої реакції, які базуються на конфірмаційній білок-вуглеводній взаємодії молекул, про що свідчить часткове зниження антивірусної активності препаратів у присутності гаптену манозоспецифічних лектинів -метил-D-манозиду.

ГКМ T.mesenterica та глюкан G.adspersum пригнічують ранні стадії репродукції ВТМ в чутливих рослинах тютюну. У ефективних концентраціях вони не мають токсичного впливу на рослинні тканини і протопласти, що виключає фітотоксичність гліканів як один з механізмів пригнічення ВТМ-інфекції.

Одним із способів дії ГКМ T.mesenterica є формування комплексу з віріонами ВТМ in vitro, що обумовлює агрегацію віріонів та екранування антигенних детермінант. Комплекс нестійкий і руйнується при розведенні взаємодіючих компонентів.

Ключові слова: Basidiomycota, глікани, антивірусна активність, вірус тютюнової мозаїки, вірусостійкість рослин

Полищук Е.Н. «Гликаны базидиомицетов как ингибиторы ВТМ-инфекции и индукторы вирусоустойчивости растений». - Рукопись.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2011.

Диссертация посвящена исследованию гликанов базидиомицетов как ингибиторов ВТМ-инфекции и индукторов вирусоустойчивости растений.

На модели вируса табачной мозаїки (ВТМ) впервые продемонстрировано способность гликанов высших грибов отдела Basidiomycota ингибировать биологическую активность фитовирусов и индуцировать устойчивость растений Solanaceae к вирусной инфекции.

Был проведен скрининг разных штамов Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum, Ganoderma adspersum, Tremella mesenterica на их способность продуцировать полисахариды с антифитовирусной активностю. С каждого вида выделено по одному штаму, которые имели наиболее высокую активность как продуценты антивирусных веществ.

Установлено, что степень ингибирования ВТМ на дурмане полисахаридными препаратами с культуральной жидкости G. lucidum и G. applanatum, была невысокой, а индуцированная ими устойчивость не превышала 60%. Устойчивость, индуцированная даными полимерами, была кратковременной и на 5-е сутки после обработки растений исчезала.

Показано, что глюкуроноксиломаннан (ГКМ), полученный с культуральной жидкости гриба T. mesenterica, умеренно ингибировал инфекционность ВТМ на дурмане, а в концентрации 1 мг/мл индуцировал высокий уровень устойчивости сверхчувствительных растений табака к этому вирусу.

С мицелия G. adspersum, разными типами экстракции было получено три фракции полисахаридов: водную, кислотную и щелочную. Установлено, что наиболее активным, по отношению к инфекционности ВТМ, был гликан экстрагированный водой. Методом газожидкостной хроматографии установлено, что полученные препараты представлены глюканами с различным молекулярным весом. Глюканы, екстрагированные кислотой и щелочью, гомогенные и имеют молекулярный вес 48 и 70 кДа, соответственно. Глюкан экстрагированный водой - гетерогенный и состоит с основного компонента (95 кДа), минорных (40 и 20 кДа), а также низкомолекулярных примесей. Анализ антивирусной активности хроматографических фракций глюкана «водного» показал, что все высокомолекулярные фракции интенсивно ингибируют ВТМ, тогда как низкомолекулярная фракция была малоактивной.

Методом перъйодатного окисления установлено, что исследуемый глюкан представлен полимером, в котором остатки глюкозы соединены на 76% 1>3-связями, которые формируют главную цепь, в то время как другие типы связей (24%) представлены, очевидно, в боковых цепях гликополимера.

Проверка антивирусной активности производных глюкана позволила установить, что при перъйодатном окислении и последующем восстановлении й гидролизе способность полимера ингибировать инфекционность ВТМ, по сравнению с нативным препаратом, меньше на 50-60%. Полученные результаты указывают на то, что в антивирусной активности глюкана важное место имеют все типы гликозидных связей, а также разветвленность молекулы.

ГКМ T.mesenterica и глюкан G.adspersum индуцируют вирусоустойчивость у сверхчувствительных растений и ингибируют ранние стадии репродукции ВТМ у чувствительных растений табака. В эффективных концентрациях они не имеют токсического влияния на растительные ткани и протопласты, что исключает фитотоксичность гликанов как один из механизмов ингибирования ВТМ-инфекции.

...