Роль вторинного хінонового акцептора в індукції альтернативних окисно-відновних реакцій у фотосистемі ІІ

Інгібування комплексу цитохромів b₆/f пригнічує формування трансмембранного протонного градієнта в хлоропластах, блокуючи зв'язування та подальше окиснення PQH₂ з утворенням PQ. Ця реакція є визначальною для регуляторного впливу ДpH на швидкість відновлення кінцевого акцептора в тилакоїдній мембрані з двох причин. По-перше, вона спряжена з вивільненням іонів гідрогену в люмен і її швидкість залежить від рН люмену. По-друге, саме ця реакція за нормальних умов є найповільнішою, лімітуючою стадією нециклічного перенесення електронів у тилакоїдній мембрані.

Використані інгібітори комплексу цитохромів b₆/f NQNO (2-n-ноніл-4-гідроксихінолін-N-оксид) та DNP-INT (2-йодо-6-ізопропіл-3-метил-2',4,4'-тринітродифеніл), які зв'язуються з сайтами Q_i та Q_o комплексу цитохромів b₆/f, відповідно, пригнічують окиснення пластохінолу в Q-циклі (Trebst A., 1980). Насичуюча концентрація обох інгібіторів становила 2 мкМ. При цьому інгібіторна дія NQNO досягала приблизно 96 % за рН 8 і 46 % за рН 5, тоді як DNP-INT пригнічував реакцію на 60 % за рН 8 і 42 % за рН 5. Отже, NQNO діяв більш ефективно з чітко виявленим насиченням та великою різницею за рН 8 і рН 5. Тому при подальшому дослідженні фотохімічних реакцій для функціонального відокремлення ФС ІІ переважно використовували NQNO в концентрації 2 мкМ, що забезпечувала практично повне виключення комплексу цитохромів b₆/f та ФС І з лінійного транспортування електронів. Слід зауважити, що дані інгібітори за цих умов не повністю блокували формування ДpH, причому ефект NQNO (32%) незначно відрізнявся від DNP-INT (26%). Незаінгібоване залишкове транспортування електронів за умов дії цих інгібіторів свідчить про відновлення кінцевого акцептора електронів (оксигену або ФЦ) на рівні ФС ІІ, тобто автономне функціонування останньої (Polishchuk A.V., 2005).

Для того, щоб з'ясувати, чи включає автономне функціонування ФС II відновлення PQ в її QB-зв'язуючому сайті, використали інгібітор 3-(3,4-дихлорфеніл)-1,1-диметилсечовину (ДХМС, діурон), який блокує перенесення електронів між QA та QB у ФС II (Самуилов В. Д. и др., 1997), в концентрації 2 мкМ.

Оскільки ДХМС зменшував внесок автономного функціонування ФС II лише приблизно на 30 % порівняно з NQNO, було зроблено висновок, що за цих умов перенесення електронів на кінцевий акцептор може включати їх перенесення на QB, але переважно відбувається за альтернативним механізмом.

Підвищення щільності потоку квантів діючого світла в діапазоні 400 - 700 нм від 400 до 1300 мкмоль квантів/м2·с збільшувало частку альтернативного автономного функціонування ФС ІІ за рН 5,0 у сумарному транспортуванні електронів у середньому від 33 % до 46 % (рис. 1). Для оцінки внеску автономного функціонування ФС II у перенесення електронів вирахували частку активності поглинання кисню в присутності NQNO від активності в контролі за різної щільності потоку квантів.

Індукція альтернативного нециклічного транспортування електронів у ФС ІІ при збільшенні щільності потоку квантів діючого світла за рН 5,0 пов'язана з додатковим зменшенням рН всередині тилакоїдів та збільшенням частки відновлених компонентів ФС ІІ.

Рис. 1 Відносна залишкова активність відновлення МВ у ФС ІІ за різних значень щільності потоку квантів діючого світла

Примітка. Щільності світлового потоку 400 мкмоль квантів/м2·с за умов експерименту відповідає потік світлового випромінювання 87 Вт/м2, а 1300 мкмоль квантів/м2·с - 283 Вт/м2

Для уточнення інформації про залежність внеску автономного функціонування ФС II у загальне перенесення електронів від рН середовища порівнювали швидкість поглинання кисню в контролі та при дії 2 мкМ NQNO
за ряду значень рН (4,6; 4,7; 4,8; 4,9; 5; 5,1; 5,2; 5,7; 6,5 і 8,0).

У присутності NQNO швидкість поглинання кисню, забезпеченого автономним функціонуванням ФС II, зростала зі зменшенням значення рН, а в діапазоні значень рН 4,7 - 5,0 спостерігався помітний пік активності. Ці дані дозволяють припустити, що за рН нижче за 5,2 оксиген відновлюється в акцепторному центрі/центрах фотосистеми ІІ, тоді як у діапазоні рН 7,0-9,0 він переважно відновлюється у ФС І.

За результатами експерименту, присутність граміцидину A в ролі роз'єднувача не змінювала швидкість поглинання кисню в діапазоні рН “кислого піку” порівняно з контролем, отже за контрольних умов у цьому діапазоні рН регулюючий вплив був відсутній.

Форма кривої, що відображає залежність відносного внеску автономного функціонування ФС II від значення рН у присутності граміцидину A як каналоформуючого роз'єднувача фотосинтетичного фосфорилювання, наближається до експоненційного спадання, у той час як у контрольних хлоропластах залежність за значень рН вищих за 5,1 відхиляється від попередньої і має пік за рН 6,5 (рис. 2).

Рис. 2 Відносна залишкова активність відновлення МВ у ФС ІІ за різних значень рН. Порівняння інтактних хлоропластів із обробленими 0,5 мкМ граміцидином A

Примітка. Акцептор електронів - метилвіологен

Таким чином, внесок альтернативного функціонування ФС II у загальну активність регулюється не безпосередньо величиною рН середовища, а значенням рН всередині тилакоїдів.

Отже, у рН-залежній регуляції швидкості світлозалежного поглинання кисню в хлоропластах ключову роль відіграє альтернативне автономне функціонування ФС II, внесок якого збільшується із зниженням значення рН всередині тилакоїда. Припускається, що автономне функціонування ФС ІІ супроводжується перенесенням електронів альтернативним шляхом із сайта Q_A на кінцевий акцептор, що викликається пригніченням транспортування електронів по лінійному ланцюгу.

Вплив купруму і цинку на процеси транспортування електронів та протонів у хлоропластах. Катіони важких металів використовували як інгібітори перенесення електронів з ФС ІІ та протонування зв'язаного пластохінону - Q_B. На даний час значний прогрес щодо розуміння процесу протонування пластохінону в Q_B-зв'язуючому сайті бактерійних реакційних центрів (БРЦ) (Дdelroth P., 2000) пов'язаний з використанням іонів кадмію, цинку та купруму, оскільки вони, стехіометрично зв'язуючись з БРЦ, практично повністю (більш ніж у сто разів) пригнічують процес протонування Q_B, через що і стали важливим інструментом досліджень. Разом з тим, їх ефект на транспортування протонів у хлоропластах вищих рослин невідомий.

Досліджено зміни транспортування протонів та електронів за дії купруму та цинку. Фотосинтетичне нециклічне транспортування електронів супроводжується трансмембранним перенесенням протонів і призводить до формування на мембранах тилакоїдів (Merchant S., 2005). Зв'язування протонів на зовнішньому боці тилакоїдної мембрани забезпечується їх транспортуванням разом з електронами в складі PQH₂, у той час як формування відбувається за рахунок вивільнення протонів у порожнину тилакоїда як при окисненні PQH₂, так і при фоторозкладанні молекул води.

Для перевірки можливого інгібіторного впливу Cu²⁺ та Zn²⁺ на відновлення Q_B дослідили процес світлоіндукованого зв'язування протонів у суспензії тилакоїдів, який пригнічувався в середньому на 90 % іонами купруму в концентрації 80 мкМ і на 70 % іонами цинку в концентрації 200 мкМ (рис. 3).

Рис. 3 Світлозалежне зв'язування протонів у суспензії хлоропластів у присутності йонів купруму або цинку

Зроблено висновок про блокування відновлення вторинного хінонового акцептора Q_B цими йонами.

Оскільки на тилакоїдних мембранах у присутності йонів цих металів у вищезазначених концентраціях зберігалося до 80 % величини ?рH у контролі, тоді як поглинання йонів гідрогену із зовнішнього боку мембрани було заблоковане, можна вважати, що градієнт концентрацій іонів гідрогену формувався переважно за рахунок реакції фотоокиснення води, яка забезпечує вивільнення йонів гідрогену у порожнині тилакоїда без їх поглинання ззовні (Полищук А. В., 2007, 2010; Поліщук О. В., 2007).

Також досліджено вплив зазначених іонів на швидкість фотопоглинання кисню в реакції Н₂О - МВ як у контрольних тилакоїдних мембранах, так і в оброблених каналоформуючим роз'єднувачем фотосинтетичного фосфорилювання граміцидином A (0,5 мкМ) (рис. 4).

Рис. 4 Світлозалежне поглинання кисню в реакції Мелера в присутності йонів купруму або цинку

Дія роз'єднувача на транспортування електронів зменшувалася із зростанням концентрації йонів цинку, і за концентрації 500 мкМ швидкість відновлення метилвіологену не залежала від стану спряження хлоропластів. У той же час, іони купруму, навіть у концентрації 500 мкМ, зменшували вплив роз'єднувача на 80 %. Таким чином, інгібуюча дія йонів купруму та цинку на фотосинтетичне транспортування електронів під час поглинання кисню хлоропластами значно зростала в присутності граміцидину A (рис. 4). В оброблених граміцидином A хлоропластах (ДрН=0) відновлення екзогенного акцептора відбувається виключно у ФС І, і має повністю блокуватися йонами важкого металу, у той час як у хлоропластах з високим рівнем ДрН забезпечується часткове функціонування ФС ІІ в автономному режимі (Поліщук О. В. та ін., 2006), який не включає протонування Q_B. Це може пояснити більш виявлену дію йонів купруму та цинку у концентрації 500 мкМ на світлозалежне відновлення метилвіологену в оброблених роз'єднувачем хлоропластах.

Іншим можливим поясненням є те, що в контрольних хлоропластах швидкість нециклічного транспортування електронів лімітована повільним окисненням пластохінолу. У цьому випадку, для того, щоб проявилась інгібуюча дія йонів цинку, потрібно, щоб реакція на тій ділянці, яку вони інгібують, стала ще повільнішою і, отже, лімітуючою, чого можна досягти, збільшуючи концентрацію йонів цинку. З іншого боку, висока чутливість реакції поглинання кисню до йонів цинку в даній роботі привертає увагу і потребує подальшого дослідження.

Встановлено можливість підтримання ДрH за умов пригнічення поглинання хлоропластами йонів гідрогену з зовнішньої фази. Внесок кожного з двох фотохімічних процесів, відповідальних за формування трансмембранного протонного градієнта, у присутності йонів цинку можна відокремити і вивчити на модельних системах. Ситуація, коли рівень ДрH високий, а поглинання йонів гідрогену повністю заблоковане, є підтвердженням припущення про існування сайта альтернативного відновлення МВ у ФС ІІ. За цих умов відбувається фотоокиснення води без відновлення пластохінону в Q_B-зв'язуючому сайті.

Вивчення впливу йонів важких металів на відносний вміст Q_B-невідновлюючих центрів ФС ІІ. При визначенні відносного вмісту Q_B-невідновлюючих центрів ФС ІІ ([ФСII-Q_B-невідновл.]_відн.) будь-яке пригнічення транспортування електронів між Q_A^- та Q_B викликає підвищення рівня F_pl (див. “Матеріали та методи досліджень”), на відміну від рівнів F_o та F_m. Таким чином, будь-яке збільшення рівня [ФСII-Q_B-невідновл.]_відн. пов'язане з інгібуванням транспортування електронів на акцепторному боці ФС ІІ. Визначення [ФСII-Q_B-невідновл.]_відн. за цим методом є цілком адекватним для оцінки змін у ФС ІІ, викликаних різними факторами.

Величина [ФСII-Q_B-невідновл.]_відн. у контролі варіювала в досить широких межах - від 20 до 45 % (Полищук А. В. и др., 2009). Cu²⁺, Hg²⁺ та Cd²⁺ викликали незначне зростання [ФСII-Q_B-невідновл.]_відн., у той час як Zn²⁺ та Pb²⁺ призводили до підвищення цієї величини більше ніж на 25 % (рис. 5).

Рис. 5 Зміни відносного вмісту Q_B-невідновлюючих центрів фотосистеми ІІ в присутності йонів важких металів

Можна припустити, що ступінь пригнічення транспортування електронів при додаванні Cu²⁺ та Cd²⁺ був недостатнім для збільшення [ФСII-Q_B-невідновл.]_відн., іони цих металів своєю дією не викликали помітного пошкодження ФС ІІ. У той же час, Hg²⁺ міг викликати значне неспецифічне пошкодження ФС ІІ, а Zn²⁺ - візуально помітну агрегацію хлоропластів, яка супроводжувалася значним гасінням флуоресценції хлорофілу (Полищук А. В., 2009). Варто зазначити, що обробка хлоропластів іонами купруму та меркурію викликала одночасне зниження як F_m, так і F_pl, що вказує на акцептування електронів цими йонами. У зв'язку з цим, визначений рівень [ФСII-Q_B-невідновл.]_відн. залишався практично незмінним.

Отже, іони цинку і плюмбуму інгібують транспортування електронів у ФС ІІ значно більшою мірою, ніж іони купруму, меркурію та кадмію, що підтверджується наведеними нижче результатами аналізу релаксації флуоресценції.

Дослідження впливу йонів важких металів на електронний транспорт на акцепторному боці ФС ІІ за кінетикою релаксації флуоресценції хлорофілу. Після тривалого (600 мс) спалаху світла пластохіноновий пул встигає відновитися, і темнове окиснення первинного хінонового акцептора Q^-_A контролюється змінами редокс-стану Q_B і пластохінону (Bukhov N. G., 1992). Електрони з Q^-_A рухаються за двома основними шляхами: прямо, продовжуючи свій рух аж до кінцевого акцептора; у зворотному напрямку, забезпечуючи рекомбінацію між Q^-_A і водоокиснюючим комплексом ФС ІІ у стані S₂. Залежно від “провідності” електрон-транспортного ланцюга, що залежить від максимальної швидкості лімітуючої реакції, та доступності акцептора (Фд/НАДФ, О₂), частка електронів, які рухаються за першим або другим напрямком, значно варіює. Після дії світла тривалістю більше 500 мс спостерігається чотири фази окиснення Q^?_A, кожна з яких має свій період напівспаду. Відносна амплітуда кожної з фаз залежить не від початкового стану ФС ІІ на момент вимкнення світла, але від здатності ФС І і, ймовірно, ФС ІІ акцептувати електрони, а також редокс-стану наступних за вторинним хіноновим акцептором Q_B переносників зарядів. Швидка фаза, яка триває декілька мілісекунд після вимкнення світла, прискорюється світлом у діапазоні хвиль 700 - 750 нм, що поглинається переважно у ФС І, а також МВ - високоефективним акцептором електронів у ФС І (Bukhov N. G., 1992, 2001). Аналіз екпериментальних даних за допомогою програми Origin виявляв три фази спаду (Полищук А. В. и др., 2009). Додавання до реакційного середовища йонів важких металів, які інгібують перенесення електронів на рівні Q_А-Fe, спричинює значні зміни всіх трьох фаз спаду флуоресценції: швидкої, середньої і повільної (рис. 6 і 7).

Оскільки вплив використаних у дослідженні йонів на кінетику релаксації флуоресценції відрізнявся, їх можна поділити на дві групи: до першої групи належать Cu²⁺ і Hg²⁺, а до другої - Zn²⁺, Pb²⁺ та Cd²⁺.

Рис. 6 Зміни часових констант трьох компонент спаду флуоресценції (t1, t2 і t3) відносно контролю в присутності йонів важких металів. Контроль - 100%

Примітка. збільшення часу спаду флуоресценції за певною компонентою відображає сповільнене окиснення Q_A^- за одним із шляхів, і навпаки, значення менше 100% свідчить про прискорене окиснення Q_A^-

Рис. 7 Відносні зміни амплітуд трьох компонент спаду флуоресценції (a1, a2 і a3) в присутності йонів важких металів. Контроль - 100%

Дія йонів з першої групи характеризується майже подвійним прискоренням як швидкої, так і середньої фази спаду флуоресценції, що супроводжується збільшенням амплітуди швидкої фази за рахунок середньої і повільної фаз спаду флуоресценції. Іони другої групи викликали збільшення амплітуди повільної фази і сповільнення середньої та повільної фаз. Ефект іонів з першої групи не може бути пояснений лише інгібуванням перенесення електронів від первинного хінонового акцептора ФС ІІ Q^-_A до вторинного хінонового акцептора Q_B, проте вони, ймовірно, є акцепторами електронів у ФС ІІ, що узгоджується з даними інших авторів. Так, було показано, що електрохімічний потенціал Q_A може варіювати в широких межах під дією гербіцидів різної природи (Krieger-Liszkay A., 1998). Cu²⁺ за умов зв'язування у Fe²⁺-сайті (між Q_A^- та Q_B) підвищують свій електрохімічний потенціал і набувають здатності окиснювати Q_A^- (Jegerschцld C., 1999).

Таким чином, виявлено два принципово різні впливи йонів важких металів. Йони з від'ємним стандартним окисно-відновним потенціалом (): Zn²⁺ ( = -0,76 В), Cd²⁺ ( = -0,403 В) та Pb²⁺ ( = -0,13 В), інгібують електронний транспорт, тоді як іони з додатним : Cu²⁺ ( = +0,153 В) та Hg²⁺ ( = +0,46 В), стимулюють його. Отже, Cu²⁺ Hg²⁺ можуть акцептувати електрони за умов пригнічення електронного транспорту між Q_A^- та Q_B.

Альтернативні окисно-відновні реакції у ФС ІІ включають перенесення електронів із відновленого первинного хінонового акцептора Q_A^- на екзогенний кінцевий акцептор (рис. 8, виділено сірим фоном).

Рис. 8 Гіпотетична схема організації альтернативного транспортування електронів у фотосистемі ІІ

Серед штучних акцепторів це ФЦ, МВ та Cu²⁺, а з природних - О₂ або фередоксин. Не виключається також можливість перенесення електронів із відновленої низькопотенціальної форми цитохрому b₅₅₉ на оксиген або ФЦ (Поліщук О. В., 2009).

Таким чином, на підставі проведених досліджень можна зробити висновок, що альтернативні окисно-відновні реакції у ФС ІІ індукуються за умов повного відновлення компонентів електрон-транспортного ланцюга, які виникають за пригнічення транспортування електронів від ФС ІІ до ФС І внаслідок закислення порожнини тилакоїдів до рН<5,0 та зв'язування у ФС ІІ йонів важких металів. Підвищена від 400 до 1300 мкмоль/м²·с щільність потоку квантів світла в діапазоні 400 - 700 нм також індукує перенесення електронів із ФС ІІ на альтернативний акцептор за рахунок збільшення частки її відновлених компонентів. Індукція перенесення електронів із ФС ІІ на кінцевий акцептор за умов збільшення ступеня відновленості пулу ФС ІІ, викликаного високим трансмембранним градієнтом електрохімічних потенціалів іонів гідрогену в тилакоїді, відіграє захисну роль, запобігаючи фотопошкодженню ФС ІІ.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що за високого рівня градієнту електрохімічних потенціалів іонів гідрогену, внаслідок збільшення ступеня протонування пулу мембранного рухливого переносника електронів і протонів пластохінону та пригнічення лінійного перенесення електронів у фотосинтетичному електрон-транспортному ланцюгу, індукується альтернативне перенесення електронів із ФС ІІ безпосередньо на кінцевий акцептор, що є одним зі шляхів зменшення фотопошкодження ФС ІІ.

2. Індукція альтернативного шляху перенесення електронів пов'язана зі збільшенням ступеня відновленості пулу компонентів ФС ІІ.

3. Доведено, що залежність швидкості реакцій Хілла та Мелера від рН має немонотонний характер з двома максимумами - за рН 8,0 і рН 5,0, які відрізняються чутливістю до інгібіторів комплексу цитохромів b₆/f. Шляхом інгібіторного аналізу показано, що внесок автономного функціонування ФС ІІ в загальне транспортування електронів в 9 разів більший за значення рН 4,5, порівняно з рН 8,0, а в оброблених граміцидином А хлоропластах - в 5 разів.

4. Визначено, що внесок автономного функціонування ФС ІІ в загальне транспортування електронів залежить від потоку світлового випромінювання в діапазоні 400-700 нм і збільшується в середньому від 33 % до 46 % за його підвищення від 87 до 283 Вт/м².

5. Показано, що в присутності йонів купруму та цинку індукується альтернативне перенесення електронів із ФС ІІ на кінцевий акцептор. Про це свідчить пригнічення світлозалежного поглинання йонів гідрогену, повязаного з відновленням вторинного хінонового акцептора у ФС ІІ, при збереженні світлозалежного відновлення метилвіологену.

6. Встановлено, що інгібування йонами купруму, цинку, кадмію та плюмбуму в концентраціях до 200 мкМ та меркурію в концентраціях до 20 мкМ реакції темнового окиснення первинного хінонового акцептора у ФС ІІ не перевищує 30 %, що пов'язано з індукцією альтернативного перенесення електронів із ФС ІІ за умов пригнічення відновлення пластохінону в ФС ІІ.

7. Показано, що важкі метали, залежно від їх редокс-потенціалу, або інгібують окиснення первинного хінонового акцептора у ФС ІІ (Zn²⁺, Cd²⁺ та Pb²⁺ ( < 0 В)), або стимулюють його (Cu²⁺ та Hg²⁺ ( > 0 В)).

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Поліщук О. В. Шляхи перенесення електронів у фотосистемі II / О. В. Поліщук // Фізіологія рослин: проблеми та перспективи розвитку: у 2 т. Київ, 2009. Т. 1. C. 138--149.