Генетично–молекулярні основи синдрому іхтіозу і передчасного народження та ізольованої дисплазії нігтів

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

“НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

УДК 575.224.4 : 616.596

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ГЕНЕТИЧНО-МОЛЕКУЛЯРНІ ОСНОВИ СИНДРОМУ ІХТІОЗУ І ПЕРЕДЧАСНОГО НАРОДЖЕННЯ ТА ІЗОЛЬОВАНОЇ ДИСПЛАЗІЇ НІГТІВ

03.00.15 - генетика

СОБОЛЬ МАРІЯ ВІТАЛІЇВНА

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі загальної та молекулярної генетики навчально-наукового центру «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Демидов Сергій Вікторович, ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри загальної та молекулярної генетики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ст.н.с. Карпова Ірина Сергіївна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу генетики людини;

доктор медичних наук, професор Тимченко Ольга Іванівна, Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзєєва НАМН України, завідувач лабораторії генетичної епідеміології.

Захист відбудеться «15» грудня 2011р. о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 ДУ «Науковий центр радіаційної медицини НАМН України» за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Науковий центр радіаційної медицини НАМН України» за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий «9» листопада 2011р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.В. Стефанович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дослідження генетичних основ захворювань людини є одним з пріоритетних напрямків біології та медицини. Ці дослідження тривають десятки років і сотні груп науковців в усьому світі займаються пошуком кореляцій між фенотипом хворих та структурно-функціональними особливостями їхнього генома.

Генетично обумовлена патологія має широкий спектр за своїми проявами, частота вроджених вад розвитку для, наприклад, української популяції оцінюється приблизно у 3-5% від загальної кількості новонароджених [Н.А. Удовіка, 2009]. Пренатальна та постнатальна діагностика хромосомної патології та загалом вроджених вад розвитку в Україні достатньо організована та ефективно впроваджується [О.В. Линчак, 2009; С.Б. Арбузова, 2010; И.И. Гуленко, 2010]. Багато вітчизняних науковців та лабораторій займаються проблемами діагностики та профілактики хромосомної патології [Л.В. Тавокина, 2006; В.О. Галаган, 2010]. Але гострим залишається питання молекулярної діагностики генетичних захворювань серед українських пацієнтів - лише кілька медико-генетичних центрів та дослідницьких лабораторій в Україні надають таку можливість [Н.Г. Горовенко, 2006; О.О. Соловйов, 2009; Л.В. Тавокина, 2010]. Однак, спектр захворювань, що діагностуються на молекулярному рівні, дуже вузький і велика частка генетичної патології залишається недіагностованою.

Особливу групу серед генетично обумовлених патологій складають рідкісні аутосомно-рецесивні генетичні захворювання, частота яких в популяції є невисокою та відповідно зустрічаються вони в лікарській практиці рідко. Як правило, вони мало досліджені та недостатньо описані в спеціалізованій літературі. При появі пацієнта з таким захворюванням можуть виникати труднощі зі встановленням диференційованого клінічного та лабораторного діагнозу. Тому докладне вивчення та опис рідкісних генетичних захворювань є не менш важливим, ніж дослідження широко розповсюджених синдромів.

Молекулярно-генетичні дослідження спадкових захворювань перш за все дають можливість впровадження ефективної діагностики. По-друге, такі дослідження дозволяють встановити патофізіологічні механізми розвитку захворювань та запропонувати нові ефективні стратегії їхнього лікування. Крім того, в процесі досліджень ефектів порушення функціонування тих чи інших генів, як правило, з'ясовуються нові механізми регуляції фізіологічних процесів.

Захворювання, що розглядаються в даній роботі, а саме, синдром іхтіозу і передчасного народження та ізольована дисплазія нігтів, мало досліджені як на території України, так і загалом в світі. Їх детальний клінічний опис та визначення генетичних причин виникнення відкривають можливості для подальшого впровадження диференційної клінічної та лабораторної діагностики цих хвороб, пошуку та вибору найбільш оптимальних стратегій лікування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано на базі Київського національного університету імені Тараса Шевченка та Уппсальського Університету. Дана робота виконана в межах програми “Здоров'я людини”, тема №06БФ036-01 “Визначення біохімічних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції” та теми №11БФ036-01 “Механізми реалізації адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов розвитку різних патологій”.

Співпраця автора з науковою групою професора Нікласа Даля з Уппсальського Університету стала можливою завдяки індивідуальному гранту, наданому авторові державною організацією Шведський Інститут Королівства Швеції в рамках програми Вісбі (Visby Program) (реєстраційний номер гранту 382/00779/2009/Ukraine).

Мета: виявити мутації, асоційовані з синдромом іхтіозу і передчасного народження та ізольованою дисплазією нігтів, для оптимізації діагностики, з'ясування впливу мутацій на функціонування клітин та уточнення патогенезу захворювань.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

1. Прослідкувати особливості успадкування захворювань в межах родин пацієнтів.

2. Дослідити нуклеотидні послідовності гена FATP4 у пацієнтів з синдромом іхтіозу та передчасного народження.

3. Визначити ген-кандидат, асоційований з ізольованою дисплазією нігтів, та дослідити його нуклеотидні послідовності у пацієнтів та членів їх родин.

4. Дослідити вплив мутацій на метаболізм клітин та прогнозувати внесок мутацій в патогенез досліджуваних захворювань.

Об'єкт дослідження: рідкісні аутосомно-рецесивні ектодермальні захворювання (синдром іхтіозу та передчасного народження, ізольована дисплазія нігтів).

Предмет дослідження: зміни послідовності ДНК хворих; функціональні ефекти мутацій генів, асоційованих з генетичними захворюваннями.

Методи дослідження:

-- теоретичні - аналіз та узагальнення даних наукової літератури з питань виникнення та розвитку досліджуваних захворювань; аналіз та узагальнення даних наукової літератури з питань структури та функцій генів, пов'язаних з досліджуваними хворобами;

-- клініко-фізіологічні - огляд пацієнтів та збір анамнезу захворювань; оцінка розвитку та формування досліджуваних ознак у мишей;

-- генетичні - аналіз успадкування захворювань та груп зчеплення в межах родин пацієнтів; аналіз успадкування патологічних ознак у мишей;

-- молекулярні - специфікація, встановлення та аналіз структури послідовностей ДНК пацієнтів; моделювання ефектів мутацій; експресія мутантних білків в клітинних моделях та оцінка їх впливу на метаболічні процеси клітин;

-- статистичні - методи варіаційної статистики

Наукова новизна роботи полягає в тому, що розширено спектр мутацій, асоційованих з синдромом іхтіозу та передчасного народження.

Вперше показано наявність нонсенс-мутації p.G35X та міссенс-мутацій p.V477D та p.R504H серед пацієнтів з даним синдромом.

Вперше визначено генетичні основи виникнення та розвитку ізольованої дисплазії нігтів з аутосомно-рецесивним успадкуванням. Виявлено два типи мутацій гена FZD6, що асоційовані з ізольованою дисплазією нігтів. Показано, що нонсенс-мутація p.E584X викликає тяжкі прояви захворювання, міссенс-мутація p.R511C викликає помірну дисплазію нігтів.

Показано, що мутований білок FZD6 втрачає свою функцію в канонічних та неканонічних WNT-сигнальних шляхах, що призводить до порушення функціонування клітин.

Вперше показано патерни експресії гена FZD6 під час ембріонального розвитку нігтів.

Практичне значення роботи полягає в тому, що отримані результати можуть бути застосовані при медико-генетичному консультуванні хворих на синдром іхтіозу і передчасного народження та ізольовану дисплазію нігтів в процесі диференційної діагностики.

Співставлення позицій нових мутацій гена FATP4 з їх впливом на клінічні прояви синдрому іхітіозу та передчасного народження може бути використане при дослідженні функціонального значення білка FATP4 та його окремих структурних доменів.

Отримані знання щодо патологічних ефектів мутацій гена FZD6 можуть бути використані для подальшого дослідження участі білка FZD6 в різних WNT-сигнальних шляхах, а також для виявлення значення цих шляхів в процесі формування та розвитку нігтів.

Знання про функціональні ефекти мутацій можуть бути використані для пошуку ефективних підходів та шляхів лікування досліджуваних захворювань.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи особисто проаналізована вітчизняна та зарубіжна наукова література з питань молекулярно-генетичних досліджень спадкових захворювань. Автор приймав активну участь в плануванні даних досліджень. Представлені в роботі експериментальні результати отримані та проаналізовані автором особисто. В обговоренні результатів приймали участь співавтори робіт, опублікованих за темою дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на: міжнародній конференції «Європейська конференція генетики людини» (м. Амстердам, 2011) та IV міжнародній ІМБГ конференції молодих вчених «Молекулярна біологія: успіхи та перспективи» (м. Київ, 2011).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 наукових робіт, в тому числі три статті у наукових фахових виданнях, дві статті у зарубіжних спеціалізованих медико-біологічних виданнях та двоє тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 120 сторінках, складається зі вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 25 рисунками та 6 таблицями. Бібліографія викладена на 18 сторінках і включає 162 джерела, з яких 144 - закордонної літератури.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для вирішення поставлених у роботі завдань було використано алгоритм генетично-молекулярних досліджень для пошуку кореляцій фенотип-генотип та виявлення нових мутацій, пов'язаних з певною патологією. Також застосовано типові підходи молекулярних досліджень функціональних ефектів мутацій на рівні клітин з подальшою екстраполяцією на патогенез захворювання.

Відповідно до плану досліджень було сформовано дві групи обстежених, що різнились за наявністю двох різних спадкових захворювань (синдрому іхтіозу і передчасного народження та ізольованої дисплазії нігтів). Загальна кількість обстежених осіб представлена в табл. 1.

Таблиця 1. Загальна кількість обстежених осіб

Номер групи	Захворювання	Кількість обстежених родин	Кількість обстежених осіб
			Хворі	Здорові	Контрольна група
1	СІПН	5	6	9	100
2	ІДН	2	8	14	94 + 110

До першої групи належали пацієнти з типовими проявами синдрому іхтіозу та передчасного народження (СІПН) та члени їх родин, що не мали проявів захворювання. У всіх уражених осіб спостерігалась типова тріада симптомів СІПН: передчасне народження, щільний казеозний сквамозний епітелій та неонатальна асфіксія. Типовими також були результати гістологічних досліджень. Так, у всіх пацієнтів спостерігалось суттєве потовщення та ущільнення епідермісу, згладження кордонів між різними його шарами. Зразки крові були отримані від пацієнтів (пробандів), їх здорових батьків та сибсів в трьох сім'ях з країн скандинавського регіону (Данія, Норвегія та Ісландія). Було обстежено ще два пацієнта з СІПН, однак в цих випадках інформація про фенотипи батьків чи сибсів та зразки їх ДНК для молекулярних досліджень були відсутні. До контрольної групи увійшли 100 здорових осіб скандинавського походження (табл. 1).

Друга група осіб була сформована пацієнтами з ізольованою дисплазією нігтів (ІДН) та членами їх родин. У всіх хворих спостерігалась різна ступінь оніхауксиса (гіпертрофії нігтів) та оніхоліза (відшарування нігтьової пластинки від нігтьового ложа) на нігтях рук та ніг. Нігті рук мали кігтьоподібні утворення. Ніяких інших розладів та аномалій ектодермальних органів та похідних ектодермальних тканин (наприклад, волосся, зубів, потових залоз або шкіри) у пацієнтів не було виявлено. Особи з дисплазією нігтів мали нормальний слух та психомоторний розвиток. У них відмічалось нормальне фізіологічне потовиділення та нормальний ріст волосся. Батьки хворих осіб мали нормальну морфологію нігтів рук та ніг.

Було обстежено дві сім'ї (F1 та F2). Всі обстежені пацієнти та їх родичі мали пакистанське походження. У хворих з сім'ї F1 спостерігався більш тяжкий перебіг дисплазії нігтів, порівняно з ураженими особами з родини F2. До контрольної групи увійшли 94 здорові особи пакистанського походження та 100 здорових осіб скандинавського походження (табл. 1).

Для ідентифікації локусів-кандидатів використали дослідження однонуклеотидних поліморфізмів та мікросателітних маркерних послідовностей. Для аналізу генів-кандидатів та визначення мутацій використовували секвенування за методом Сенгера. Прогнозування ефектів міссенс-мутацій здійснювали шляхом співставлення їх позицій зі структурними доменами білків та проведення множинного вирівнювання послідовностей досліджуваних білків. Функціональне дослідження мутацій проводили із застосуванням стандартних протоколів для створення молекулярних конструктів, Вестерн-блоттингу, трансфекції, ко-імунопреципітації, конфокальної та FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) мікроскопії, X-gal імуногістохімії, різних типів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (ПЛР зі зворотньою транскриптазою та кількісної ПЛР в реальному часі).

Для статистичної обробки отриманих даних були використані значення середнього арифметичного з урахуванням стандартних відхилень та критерій Ст'юдента. Статистична значимість порівнюваних показників приймалась за достовірну при *p <0.05, **p <0.01 та ***p <0.001.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Генетичні причини синдрому іхтіозу та передчасного народження. Аналіз та характеристика мутацій гена FATP4.

Перша частина роботи була присвячена дослідженню генетичних основ синдрому іхтіозу та передчасного народження (СІПН). Дане захворювання є вродженим та характеризується основною тріадою симптомів: передчасне народження, асфіксія та щільний казеозний сквамозний епітелій. З віком симптоми суттєво слабшають.

Відомо, що СІПН спричиняється порушенням функціонування гена FATP4 [J. Klar et al., 2009]. Цей ген кодує висококонсервативний білок молекулярною масою 72 kDa. Він відіграє ключову роль у метаболізмі дуже довгих жирних кислот та, відповідно, у формуванні бар'єрної функції епідермісу. В літературі описано вісім різних мутацій гена FATP4: одна нонсенс, п'ять міссенс та дві сплайсинг мутації. Більшість описаних пацієнтів є гомозиготами або компаунд гетерозиготами за нонсенс мутацією p.C168X.

В даній роботі на наявність мутацій гена FATP4 було досліджено п'ять родин скандинавського походження. Між сім'ями, залученими до дослідження, не було генетичної спорідненості. Родоводи обстежених сімей наведено на рис.1. Захворювання серед представників родин вказувала на аутосомно-рецесивний тип спадкування або ж можливе спонтанне виникнення мутацій в родинах IR85 та IR125. Для двох родин (25187 та 25291) були доступні лише зразки ДНК хворих пробандів.

Виявлено п'ять різних типів мутацій гена FATP4 (табл.2). П'ять пробандів виявились компаунд-гетерозиготами за попередньо відомою нонсенс-мутацією р.C168X. Один пробанд з ісландської родини 25291 виявився гомозиготою за даною мутацією. Серед обстежених знайдено нову нонсенс-мутацію p.G35X. Інші три варіанти змін нуклеотидної послідовності гена FATP4, знайдені в когорті обстежених пацієнтів, виявились міссенс-мутаціями. Міссенс-мутація p.Q300R була раніше описана [J. Klar et al., 2009]. Решта міссенс-мутацій (p.V477D та p.R504H) є новими. Дослідження успадкування мутацій в межах кожної з родин показало, що мутації були успадковані від батьків пробандів, кожен з яких виявився носієм однієї з мутацій (рис.1).

Таблиця 2. Мутації гена FATP4, виявлені у пробандів, уражених СІПН, з п'яти родин

Родина	Екзон	Нуклеотидна заміна	Амінокислотна заміна	Зиготність	Походження
IR85	екзон 3 екзон 7	c.504c>a c.899a > g	p.C168X p.Q300R	Компаунд-гетерозиготний	Норвегія
IR125	екзон 2 екзон 3	c.103g>t c.504c > a	p.G35X p.C168X	Компаунд-гетерозиготний	Норвегія
25187	екзон 3 екзон 10	c.504c>a c.1430t > a	p.C168X p.V477D	Компаунд-гетерозиготний	Норвегія
25291	екзон 3	c.504c > a	p.C168X	Гомозиготний	Ісландія
DA1	екзон 3 екзон 11	c.504c>a c.1511 g > a	p.C168X p.R504H	Компаунд-гетерозиготний	Данія

Наступним етапом досліджень було позиціювання мутацій відносно структурних доменів білка FATP4. Всі п'ять мутацій розташовані в межах двох структурних доменів білка FATP4 (рис.2).

Рис. 1. Структура обстежених родин та сегрегація різних мутацій гена FATP4 в межах кожної родини

Три з п'яти знайдених мутацій розташовані безпосередньо у функціональних мотивах білка. Для міссенс-мутацій цей факт свідчить на підтримку їх функціональної важливості.

Аналіз консервативності амінокислотних послідовностей, залучених до мутацій.

Рис. 2. Схематичне зображення структури білка FATP4 з позначенням функціональних доменів та позицій мутованих амінокислотних залишків (вказано стрілками)

Для прогнозування впливу міссенс-мутацій на функції білка було проведено множинне вирівнювання послідовностей обраних ділянок білка FATP4 людини та інших видів організмів. В результаті цього була виявлена стійка міжвидова консервативність амінокислот, в яких спостерігались зміни.

Також було порівняно обрані ділянки білка FATP4 з аналогічними ділянками інших білків родини FATP. Цей аналіз показав повну ідентичність амінокислот, залучених до нових міссенс мутацій p.V477D та p.R504H. Для міссенс-мутації p.Q300R ідентичність спостерігалась лише з білком FATP1.

Таким чином, спектр мутацій гена FATP4, асоційованих з СІПН, ширший ніж представлено в науковій літературі. Дане дослідження доповнює та розширює спектр мутацій, однак навряд чи завершує їх повний перелік. Нові варіанти, виявлені нами, включали в себе одну нонсенс-мутацію p.G35X та дві міссенс-мутації p.V477 D та p.R504H. Нонсенс-мутація p.G35X розташовувалась у ТМ домені, який є важливим для вірної локалізації білка FATP4 в клітині. Оскільки ця нонсенс-мутація викликає появу стоп-кодону майже на початку трансляції, вона призводить до синтезу вкороченого нефункціонального білка, що має ефект, подібний до прояву дії нонсенс-мутації p.C168X.

Розташування обох міссенс-мутацій у висококонсервативному АМР домені білка FATP4 свідчить про їх функціональну значимість. ATP/AMP та FATP мотиви цього домену залучені до процесу зв'язування, транспортування та активації дуже довгих жирних кислот (very long chain fatty acids), продукти метаболізму яких входять до складу багатьох ліпідних комплексів клітини.

Мутація p.R504H стала першою мутацією, описаною для FATP мотиву в межах домену АМР. Гіпотетично міссенс-мутації можуть викликати помірні прояви захворювання з частковою втратою функцій білка FATP4. Виконані спостереження виявили відсутність очевидних кореляцій між природою мутацій у білку FATP4 та СІПН фенотипом. Це дає підстави вважати, що міссенс-мутації, про які повідомляється в даній роботі, мають шкідливий вплив на функціонування FATP4, подібний до ефектів нонсенс-мутацій.

Генетичні причини ізольованої дисплазії нігтів. Картування локусів-кандидатів для ізольованої дисплазії нігтів.

Друга частина роботи присвячена дослідженню генетичних основ ізольованої дисплазії нігтів (ІДН). Було обстежено дві родини пакистанського походження (F1 та F2), в яких спостерігалось успадкування ІДН в межах кількох поколінь. Родоводи кожної сім'ї представлені на рис.3. Аналіз родоводів та особливостей розподілу захворювання в сім'ях вказував на аутосомно-рецесивний тип успадкування патології.

Для пошуку локусу-кандидата, пов'язаного із захворюванням, застосовано дослідження однонуклеотидних поліморфізмів та мікросателітних маркерів. В результаті аналізу однонуклеотидних полімофізмів пацієнтів була картована ділянка на довгому плечі хромосоми 8 розміром 800 kb, яка є спільною для всіх пацієнтів з ІДН. Аналіз груп зчеплення за п'ятьма мікросателітними маркерами підтвердив гомозиготність картованої ділянки всіх хворих на ІДН з родини F1 та родини F2 (рис.3). Таким чином, локусом-кандидатом для ІДН виявилась ділянка на довгому плечі хромосоми 8, довжиною 800 kb, в межах якої розташовувались вісім генів.

Пошук гена-кандидата та характеристика його мутацій.

Найбільш імовірним кандидатом на наявність мутацій був ген FZD6. З джерел літератури відомо, що сигнальний шлях WNT-FZD, компонентом якого є білок FZD6, залучений до розвитку спадкової анохілії (відсутності нігтьових пластинок) [D.C. Blaydon et al., 2006]. Також в літературі відмічається роль FZD6 у визначенні патернів росту волосся у мишей [N. Cuo et al., 2004].

Секвенування всіх семи екзонів гена FZD6 встановило гомозиготність пацієнтів за нонсенс-мутацією p.E584X. Ця мутація була виявлена у чотирьох хворих осіб з родини F1. В родині F2 було виявлено міссенс-мутацію p.R511C. Чотири хворі особи з родини F2 були гомозиготами за цією мутацією.

Відомо, що FZD6 є трансмембранним білком з молекулярною масою 79 кДа. Білок складається з N-термінальної екстрацелюлярної частини, семи трансмембранних доменів, трьох екстра- та трьох інтрацелюлярних петель, та С-термінальної інтрацелюлярної частини [G. Schulte et al., 2007].

На N-термінальному кінці знаходиться домен CRD, який здатен зв'язуватись з білками родини WNT, в результаті чого запускається ключова функція білка FZD6, яка полягає в активації внутрішньоклітинних компонентів різних типів WNT-сигнальних шляхів, що в свою чергу залучені до багатьох біологічних процесів, таких як клітинна проліферація, диференціація та поляризація, міграція та регенерація [T.P. Rao, M. Kuhl, 2010].

На С-термінальній частині білка розташований PDZ-зв'язуючий домен, який складається з двох мотивів. Мотив KTxxxW є абсолютно консервативним для всіх білків родини FZD та відповідає за зв'язування з сигнальними білками родини DVL, що визначає запуск каскаду реакцій WNT-сигнальних шляхів. В хвості С-термінальної частини білків FZD розташований VTTE мотив домену PDZ, який має специфічну для кожного білка родини послідовність та, відповідно, вибірковість до зв'язування з певними типами лігандів.

Міссенс-мутація р.R511C розташувалась поруч з KTxxxW мотивом PDZ домену, а саме на відстані семи амінокислотних залишків від нього в напрямку С-термінального кінця. Нонсенс-мутація p.E584X була локалізована на відстані 73 амінокислотних залишків від міссенс-мутації, ближче до VTTE мотиву.

Зв'язок мутації FZD6 з патологією кігтів у мишей.

Аналіз лінії мутантних мишей Fzd6-/- виконували з метою дослідження особливостей формування кігтів. В результаті візуального огляду 27 особин виявлено, що приблизно 50% самців, але не самок, Fzd6-/- мишей мали аномальну морфологію кігтів порівняно з диким типом мишей, група яких склала 30 особин.

Здійснено спробу пов'язати експресію FZD6 з раннім ембріональним розвитком кігтів мишей. Досліджувані миші були гетерозиготними за алелем FZD6 дикого типу та нефункціональним алелем (Fzd6+/-). Аналіз експресії FZD6 здійснювали у ембріонів мишей на 14,5, 15,5, 16,5 та 17,5 дні ембріонального розвитку. Було проаналізовано по 3 ембріони мишей на кожен термін ембріогенезу. Тимчасове раптове підвищення експресії мРНК FZD6 спостерігалось на кінчиках пальців приблизно на 16,5 день ембріонального розвитку.



Рис. 3. Гаплотипи осіб, уражених ІДН, та здорових членів родин, виявлені в результаті аналізу груп зчеплення

У мікроскопічних дослідженнях препаратів кінцівок ембріонів Fzd6+/- мишей від 16,5 дня ембріонального розвитку виявлено, що тимчасове раптове підвищення експресії мРНК FZD6 відбувається переважно в епідермісі кінчиків пальців в зоні формування кігтів.

Отже, в результаті досліджень особливостей експресії гена FZD6 встановлено патерни тимчасової експресії мРНК FZD6, які виникали на 16,5 день ембріонального розвитку. Підвищення експресії мРНК FZD6 відбувалось на кінцівках, переважно в епідермісі нігтьового ложа та вентральної частини пальця.

Функціональні ефекти мутацій білка FZD6. Рівні експресії та локалізація мутантних варіантів білка FZD6 в клітині.

Нонсенс-FZD6 мутантні фібробласти пацієнта експресували 13 % від нормального рівня експресії мРНК FZD6 в контрольних фібробластах (рис.4). Такий результат підтримує гіпотезу про деградацію білка FZD6 з нонсенс-мутацією.

Рис. 4. Кількісна оцінка експресії FZD6 в фібробластах пацієнта та контрольних клітинах. По осі ординат вказано співвідношення порогових циклів ампліфікації кДНК FZD6 та кДНК в-актина (ДДС_T)

Для моделювання міссенс-мутантного стану клітин та дослідження функціональних ефектів обох мутацій було створено три типи молекулярних конструктів: конструкт ”дикого типу” (WT; [FZD6(wt)]) та два конструкти з мутаціями (p.E584X; [FZD6(nonsense)] та р.R511C; [FZD6(missense)]. Для візуалізації результатів експериментів всі молекулярні конструкти були поєднані з зеленим флуоресцентним білком (GFP).

Зроблено припущення, що одним з ефектів міссенс-мутації може бути невірна інтеграція білка FZD6 в клітинну мембрану та, відповідно, виключення або зниження його функціональної активності. При дослідженні субклітинної локалізації FZD6(wt)-GFP та FZD6(missense)-GFP спостерігалась очевидна різниця локалізації двох варіантів білка FZD6 (рис. 5). FZD6(wt)-GFP розташовувався, в основному, в плазматичній мембрані і лише у кількох клітинах відмічена внутрішньоклітинна локалізація. В той же час для FZD6(missense)-GFP спостерігались протилежні домінуючі патерни локалізації. Більшість клітин мали FZD6(missense)-GFP у складі внутрішньоклітинних везикул (рис. 5).



Рис. 5. Кількісна оцінка патернів розподілу різних варіантів FZD6 в клітині. По осі абсцис вказано типи локалізації білка: ПМ - плазматична мембрана, В - везикули

Везикулярний розподіл білка може свідчити про підвищення рівня його деградації. Для дослідження природи спостережуваних везикул застосовано колокалізаційні експерименти з використанням різних везикулярних маркерів в комбінації з різними варіантами білка FZD6. Спостерігалась очевидна колокалізація для обох FZD6(wt)-GFP та FZD6(missense)-GFP та лізотракеру. Це вказує на те, що внутрішньоклітинні везикули, що несуть в собі GFP сигнал та спостерігаються переважно в FZD6(missense)-GFP експресуючих клітинах, являють собою лізосоми.

Отже, мутантний білок FZD6 втрачає правильні патерни клітинної локалізації і переважно розташовується в цитоплазматичних везикулах, які належать до лізосомального метаболічного шляху. Такі патерни локалізації вказують на підвищений рівень лізосомальної деградації білка, і, як наслідок, втрату функціонального внеску FZD6 в процеси життєзабезпечення клітин.

Вплив мутацій на взаємодію білка FZD6 з його основними внутрішньоклітинними лігандами.

Оскільки міссенс-мутація розташована дуже близько до KTxxxW мотиву, було припущено, що в присутності цієї мутації білок FZD6 може втрачати ефективність зв'язування з DVL. Для перевірки припущення проведено ряд експериментів з ко-експресії молекулярних конструктів FZD6(wt)-GFP та FZD6(missense)-GFP з конструктом DVL1-FLAG в клітинах HEK293Т. Показано, що при відсутності експресії FZD6 у DVL1-FLAG позитивних клітинах спостерігаються характерні агрегації FLAG сигналу в цитоплазмі. Ко-експресія DVL1-FLAG та FZD6(wt)-GFP викликала радикальне рекрутування DVL1-FLAG до плазматичної мембрани, що свідчило про факт взаємодії FZD6 та DVL1. Цікаво, що мембранне рекрутування DVL1-FLAG спостерігалось також в присутності FZD6(missense)-GFP. Це вказує на те, що міссенс-мутантний білок також може взаємодіяти з DVL1.

FZD6(missense)-GFP, який знаходився в межах лізосомальних везикул, не рекрутував DVL1-FLAG, що підтримує гіпотезу відносно функціональної інактивації FZD6 при його включенні до лізосом.

Додатковим підтвердженням взаємодії між мембранним FZD6(missense) та DVL1 стали результати експериментів з використанням FRET мікроскопії, яка дозволяє визначати взаємодію між двома молекулами, розташованими на відстані не більше 10 Е. Ко-експресія FZD6(wt)-GFP та FZD6(missense)-GFP з DVL1-FLAG з використанням Cy3-коньюгованих вторинних антитіл виявила наявність тісної взаємодії як для FZD6(wt)-GFP та DVL1-FLAG, так і для мембранного FZD6(missense)-GFP та DVL1-FLAG.

Наступним кроком було дослідження взаємодії різних варіантів FZD6 з білками DVL2 та DVL3. Було проведено котрансфекцію клітин HEK293Т конструктами myc-FZD6(wt), myc-FZD6(nonsense) або myc-FZD6(missense) в комбінації з конструктами DVL2-RFP або DVL3-RFP. Взаємодію білків оцінювали з використанням методу коімунопреципітації, який дає змогу визначити факт формування білкових комплексів.

Спостерігали наявність білкових комплексів, сформованих білками FZD6(wt) та DVL2-RFP або DVL3-RFP (рис. 6). Аналогічне формування білкових комплексів спостерігалось для FZD6(missense). Для нонсенс-мутантного білка FZD6 ко-імунопреципітація ні з DVL2, ні з DVL3 не виявлена. нуклеотидний іхтіоз мутація патогенез

Рис. 6. Взаємодія FZD6(wt) та FZD6(missense) з DVL2 та DVL3. U (unbound) - фракції білків без додавання зв'язуючих магнітних часток, B (bound) - фракції білків з додаванням зв'язуючих магнітних часток

Отже, міссенс-мутантний FZD6 білок, розташований в плазматичній мембрані, здатний взаємодіяти з лігандами DVL1,2 та 3. Однак через підвищену лізосомальну деградацію білка, його щільність в плазматичній мембрані знижена і, відповідно, є зниженим функціональний ефект від взаємодії з білками DVL. Білок FZD6 з нонсенс-мутацією не виявив властивостей, які би свідчили про його взаємодію з білками DVL2 та DVL3.

Взаємодія мутантного білка FZD6 з різними стимуляторами WNT-сигнальних шляхів.

Для того, щоб дослідити ефект мутантного білка FZD6 на роботу різних WNT-сигнальних шляхів, стимулювали контрольні фібробласти та фібробласти пацієнта, гомозиготного за нонсенс-мутацією FZD6, білками WNT-3A та WNT-5A, які приймають участь у в-катенін-залежному та в-катенін-незалежному WNT-сигнальних шляхах відповідно.



Рис. 7. Вплив WNT-3A та WNT-5A стимуляції на експресію в-катеніна. (А) Рівні експресії мРНК в-катеніна. По осі ординат вказано співвідношення порогових циклів ампліфікації кДНК в-катеніна та кДНК в-актина (ДДС_T). (Б) Співвідношення кількості в-катеніна за різних умов стимуляції клітин, нормоване відносно кількості в-актина

Стимуляція білком WNT-3A призвела до підвищення рівнів експресії мРНК в-катеніна в контрольних фібробластах, але не у фібробластах пацієнта (рис. 7А). Спостерігалось підвищення загальної кількості синтезованого білка в-катеніна в контрольних фібробластах, порівняно з мутованими клітинами (рис. 7Б). Це демонструє втрату мутантними клітинами здатності відповідати на стимуляцію WNT-3A і, відповідно, запускати каскад реакцій WNT-в-катенінового шляху.

Рис. 8. Вплив WNT-3A та WNT-5A стимуляції на експресію DKK1. По осі ординат вказано співвідношення порогових циклів ампліфікації кДНК DKK1 та кДНК в-актина (ДДС_T)

Опосередковано, через антагоніст WNT-в-катенінового шляху DKK1 досліджено активацію в-катенін-незалежних механізмів при стимуляції фібробластів WNT-3A та WNT-5A. Після стимуляції WNT-5A спостерігався підвищений рівень експресії мРНК DKK1 в контрольних фібробластах, але не в FZD6-нонсенс фібробластах (рис. 8).

Рис. 9. Вплив WNT-3A та WNT-5A стимуляції на експресію MSX1. По осі ординат вказано співвідношення порогових циклів ампліфікації кДНК MSX1 та кДНК в-актина (ДДС_T)

Додатковим підтвердженням порушення ефективності роботи мутантного FZD6 при взаємодії з WNT-5A став аналіз транскрипційного фактора MSX1, який стимулює DKK1 та кілька інших інгібіторів в-катенін-залежного WNT-сигнального шляху. В узгодженні з результатами аналізу мРНК DKK1, спостерігалось підвищення рівнів мРНК MSX1 у WNT-5A стимульованих контрольних фібробластах, але не у фібробластах пацієнта (рис. 9).

Отже, в даній роботі показано, що FZD6-нонсенс мутантні клітини втрачають здатність відповідати на обидва типи білків-стимуляторів WNT-3A та WNT-5A порівняно з контрольними клітинами. Також продемонстровано нездатність нонсенс-мутантного білка FZD6 взаємодіяти з внутрішньоклітинними лігандами DVL. В комплексі ці результати підтримують інформацію щодо участі FZD6 у різних WNT-сигнальних шляхах та гіпотезу відносно виключення нонсенс-варіанту FZD6 з цих шляхів і подальшого руйнування їх перебігу.

Кореляція між фенотипом пацієнтів та міссенс-мутацією FZD6 спонукала до припущення про часткове збереження функцій білка при даному мутантному варіанті. Результати досліджень показали, що FZD6-міссенс мутантний білок локалізується переважно в лізосомах, в той час як нормальний білок FZD6 більшістю знаходиться у плазматичній мембрані. Це вказує на підвищений рівень лізосомальної деградації мутантного білка, і, як наслідок, втрату повноцінного функціонального внеску білка FZD6 в процес формування та розвитку нігтів. Міссенс-мутантний білок показав здатність до взаємодії з внутрішньоклітинними лігандами DVL, однак лише невелика його частка, локалізована в клітинній мембрані. FZD6-міссенс, розташований в лізосомах, не проявляв активності по відношенню до DVL. Тобто, в даному випадку спостерігається часткове збереження функції білка. Такий загальний функціональний стан білка реалізується у появі симптомів дисплазії нігтів, але вони можуть бути слабшими порівняно з симптомами при нонсенс-мутації, оскільки функція FZD6 частково зберігається. Результати, отримані в даній роботі, вказують на важливість білка FZD6 в процесі регуляції розвитку нігтів у ссавців.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі наведено результати, які розширюють знання щодо генетичних причин виникнення та молекулярних механізмів патогенезу двох рідкісних аутосомно-рецесивних спадкових ектодермальних захворювань - синдрому іхтіозу і передчасного народження та ізольованої дисплазії нігтів.

1. Встановлено, що спектр мутацій гена FATP4 при синдромі іхтіозу і передчасного народження ширший, ніж описано в літературі: підтверджено, що нонсенс-мутація p.C168X є домінуючою в скандинавській групі пацієнтів, але при цьому виявлено три нові мутації - одну нонсенс-мутацію p.G35X та дві міссенс-мутації p.V477D та p.R504H.

2. Встановлено, що нові мутації призводять до змін у функціонально важливих доменах білка FATP4: обидві міссенс-мутації порушують амінокислотну послідовність у висококонсервативному АМР-домені білка; зміна внаслідок нонсенс-мутації в ТМ-домені спричиняє передчасну термінацію трансляції та синтез вкороченого нефункціонального білка. Показано стійку міжвидову та внутрішньогрупову консервативність ділянок білка FATP4, на які впливають мутації.

3. Показано, що ізольована дисплазія нігтів з аутосомно-рецесивним типом успадкування обумовлена принаймні двома мутаціями гена FZD6: нонсенс-мутацією p.E584X та міссенс-мутацією p.R511C. Визначено кореляцію між зазначеними мутаціями та фенотипом пацієнтів: перша мутація поєднана з тяжкими ураженнями нігтів, друга - викликає дисплазію нігтів у більш легкій формі.

4. З'ясовано вплив міссенс-мутації p.R511C на клітинну локалізацію білка FZD6: мутантний білок переважно розташовується в цитоплазматичних везикулах, які належать до лізосомального метаболічного шляху.

5. Показано, що нонсенс-мутація p.E584X призводить до порушення зв'язування білка FZD6 з його внутрішньоклітинними лігандами - білками DVL. Клітини, гомозиготні за цією мутацією, не здатні правильно відповідати на дію активаторів WNT-сигнальних шляхів.

6. Визначено факт порушення формування кігтів у мишей, дефектних за геном FZD6. Встановлено локалізацію патернів експресії гена FZD6 під час ембріонального розвитку мишей: ген FZD6 експресується на кінцівках (переважно в епідермісі нігтьового ложа та вентральної частини пальців) на 16-17 день ембріонального розвитку.

7. Обґрунтовано, що ізольовану дисплазію нігтів можна класифікувати як аутосомно-рецесивну ектодермальну дисплазію групи А з дефектами регуляції ембріонального розвитку та сигнальних систем клітин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Sobol M. FATP4 missense and nonsense mutations cause similar features in Ichthyosis Prematurity Syndrome / M. Sobol, N. Dahl, J. Klar // BMC Research Notes. - 2011. - Vol.4 (9). - http://www.biomedcentral.com/1756-0500/4/90.

Особистий внесок здобувача - проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз результатів, підготовка публікації до друку.

2. Mutations in Frizzled 6 Cause Isolated Autosomal-Recessive Nail Dysplasia / A-S. Frojmark, J. Schuster, M. Sobol et al. // American Journal of Human Genetics. - 2011. - Vol. 88 (6). - P. 852-860.

Особистий внесок здобувача - проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз результатів, підготовка публікації до друку.

3. Соболь М. В. Рідкісна форма спадкового іхтіозу: клінічні прояви та генетичні дефекти (огляд літератури) / М. В. Соболь, С. В. Демидов // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики. - 2011. - Вип. 22. - С. 314-324.

Особистий внесок здобувача - аналіз літературних джерел, підготовка публікації до друку.

4. Соболь М.В. Рання діагностика моногенних хвороб як запорука ефективного лікування та попередження генетично обумовленої патології / М.В.Соболь // Перинатологія та педіатрія. - 2011. - №3 (47). - С. 140-143.

Особистий внесок здобувача - проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз результатів, підготовка публікації до друку.

5. Соболь М.В. Синдром ихтиоза и преждевременного рождения ассоциирован с мутациями гена FATP4 / М.В. Соболь // Здоровье женщины. - 2011. - №8 (64). - С. 141-146.

Особистий внесок здобувача - аналіз літературних джерел, підготовка публікації до друку.

6. Sobol M. Nonsense and missense mutations in acyl-CoA synthetase are associated with a rare form of ichthyosis / M. Sobol, N. Dahl, J. Klar // The 4th international conference for young scientists “Molecular biology: advances and perspectives”: abstracts. - Kyiv, 2011. - P. 84.

Особистий внесок здобувача - проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз результатів, підготовка публікації до друку.

7. Sobol M. Novel mutations in FATP4 associated with Ichthyosis Prematurity Syndrome / M. Sobol, N. Dahl, J. Klar // European Human Genetics Conference 2011: abstracts. - Amsterdam, 2011. - P.441-442.

Особистий внесок здобувача - проведення молекулярно-генетичних досліджень, аналіз результатів, підготовка публікації до друку.

АНОТАЦІЯ

Соболь М.В. Генетично-молекулярні основи синдрому іхтіозу і передчасного народження та ізольованої дисплазії нігтів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.15 - генетика (біологічні науки). - ДУ “Науковий центр радіаційної медицини” АМН України, м. Київ, 2011.

Дисертація присвячена дослідженню генетичних та молекулярних основ двох ектодермальних захворювань - синдрому іхтіозу і передчасного народження та ізольованої дисплазії нігтів.

Визначено три нові мутації гена FATP4, асоційовані з синдромом іхтіозу та передчасного народження: p.G35X , p.V477D та p.R504H. Також виявлено дві вже відомі мутації гена FATP4: p.C168X та p.Q300R. Обстежені пацієнти є компаунд-гетерозиготами або гомозиготами за нонсенс-мутацією p.C168X. Виявлено відсутність кореляцій між природою даних мутацій та патологічним фенотипом. Це дає підстави вважати, що міссенс-мутації мають вплив на функціонування FATP4, подібний до ефектів нонсенс-мутацій.

Встановлено, що ізольована дисплазія нігтів викликається мутаціями гена FZD6: нонсенс-мутацією p.E584X та міссенс-мутацією p.R511C. Нонсенс-мутація p.E584X поєднана з тяжкими ураженнями нігтів, міссенс-мутація p.R511C викликає більш легку форму дисплазії нігтів. У пацієнтів спостерігаються розлади регуляції кількох FZD6-залежних метаболічних шляхів, які необхідні для правильного формування, розвитку та регенерації нігтів.

Ключові слова: ектодермальні захворювання, синдром іхтіозу та передчасного народження, ізольована дисплазія нігтів, FATP4, FZD6, мутації.

АННОТАЦИЯ

Соболь М.В. Генетически-молекулярные основы синдрома ихтиоза и преждевременного рождения и изолированной дисплазии ногтей. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика (биологические науки). - ГУ “Научный центр радиационной медицины” АМН Украины, г. Киев, 2011.

Диссертация посвящена исследованию генетических и молекулярных основ двух эктодермальных заболеваний - синдрома ихтиоза и преждевременного рождения и изолированной дисплазии ногтей.

Выявлены три новые мутации гена FATP4, ассоциированные с синдромом ихтиоза и преждевременного рождения: p.G35X, p.V477D и p.R504H. Также выявлены две уже известные мутации гена FATP4: p.C168X та p.Q300R. Обследованные пациенты являются компаунд-гетерозиготами либо гомозиготами по нонсенс-мутации p.C168X. Определено отсутствие корреляций между природой данных мутаций и патологическим фенотипом. Это дает основания считать, что миссенс-мутации имеют влияние на функционирование FATP4, подобное эффекту нонсенс-мутаций.

Установлено, что изолированная дисплазия ногтей вызывается мутациями гена FZD6: нонсенс-мутацией p.E584X и миссенс-мутацией p.R511C. Нонсенс-мутация p.E584X ассоциирована с тяжелыми поражениями ногтей, миссенс-мутация p.R511C вызывает более легкую форму дисплазии ногтей. У пациентов наблюдаются нарушения регуляции нескольких FZD6-зависимых метаболитических путей, которые необходимы для правильного формирования, развития и регенерации ногтей.

Ключевые слова: эктодермальные заболевания, синдром ихтиоза и преждевременного рождения, изолированная дисплазия ногтей, FATP4, FZD6, мутации.

SUMMARY

Sobol M. Genetic and molecular studies of Ichthyosis Prematurity Syndrome and Isolated Nail Dysplasia. - Manuscript.

Thesis for biological science candidate degree on the speciality 03.00.15 - genetics. - The State Institution “Research Center for Radiation Medicine” of the AMS of Ukraine, Kyiv, 2011.

Genetic basics of two ectodermal disorders - Ichthyosis Prematurity Syndrome and Isolated Nail Dysplasia - are presented in this thesis.

Ichthyosis prematurity syndrome (IPS) is a rare form of autosomal recessive ichthyosis characterized by polyhydramnion and premature birth of the affected child. Newborns exhibit respiratory complications and a thick caseous desquamating epidermis. During the first months of life the symptoms become gradually milder. Patients suffer from a lifelong non-scaly ichthyosis with atopic manifestations. Histological analysis of the skin reveal thickening of the epidermis. Patients with IPS have been reported from Scandinavia, Middle East, southern Europe and Africa.

The disease is associated with mutations in the fatty acid transport protein 4 (FATP4) gene. The FATP4 protein plays a central role in the transport and activation of fatty acids in the epidermis for normal epidermal barrier function. Eight distinct FATP4 mutations have been reported in IPS patients. The p.C168X nonsense variant is prevalent in the Scandinavian IPS population and all patients from this geographical region were found homozygous or compound heterozygous for this mutation.

Herein the identification of FATP4 mutations in six Scandinavian probands including three novel mutations is reported. All six patients were compound heterozygous or homozygous for the p.C168X mutation which further illustrates the high prevalence for this mutation in the northern European population. Also a novel p.G35X nonsense mutation was identified. Another three sequence variants were predicted to result in missense mutations. p.Q300R missense mutation has been reported previously. There were two novel messense mutations p.V477D and p.R504H identified in present study. All mutations were inherited by probands from healthy parents who were heterozygous carriers of different mutations.

All mutations were located in the functional domains of FATP4 protein. The three missense mutations (p.Q300R, p.V477 D and p.R504H) were situated in the highly conserved AMP-binding domain. Strong conservation of the amino acids corresponding to the novel missense mutations in the patients had been observed.

There appear to be no obvious correlations between the nature of mutations in the FATP4 protein and the IPS phenotype. This suggests that the missense mutations reported herein have deleterious effects on FATP4 function which are similar to the effects of the nonsense mutations. This study adds to the mutational spectrum associated with IPS, which may improve genetic diagnosis of the disease as well as future functional analysis of FATP4.

Isolated Nail Dysplasia (IND) is a rare congenital disorder. All affected individuals show a variable degree of onychauxis (thick nails), hyponychia, and onycholysis of fingernails and toenails. Fingernails had a claw-like appearance. No other disorders or anomalies of ectodermal tissues (i.e., hair, teeth, sweat glands, or skin) were noted and individuals with dysplastic nails had normal hearing, normal psychomotor development and reported normal sweating as well as normal hair growth. Two consanguineous Pakistani families (F1 and F2) affected by autosomal-recessive IND were investigated. The affected individuals from family F1 presented with a more severe nail dysplasia compared to affected individuals from family F2. 800 kb region on chromosome 8 appeared to be the locus-candidate for the disorder.

Sequencing analysis of FZD6 revealed two different mutations in the patients: p.E584X and p.R511C. FZD6 belongs to the heptahelical class of FZD receptors with an internal PDZ-interacting motif necessary for the recruitment of the phosphoproteins DVL 1-3 and other signaling factors as well as for trafficking of the receptor. Both FZD6 mutations result in alterations of the intracellular tail in the key functional PDZ-domain.

FZD6 is an important protein for several WNT-signaling pathways that are indispensable for numerous developmental processes such as tissue morphogenesis, differentiation, and regeneration in all animals. By interaction with different WNT and DVL proteins it activates number of cellular processes.

The nonsense mutant fibroblasts expressed 13% of FZD6 mRNA levels in primary control fibroblasts supporting nonsense-mediated mRNA decay. The interaction between FZD6-nonsense and any of DVL proteins were not detected that indicates the loss of main functional activity in FZD6 with nonsense mutation. FZD6 with the missense mutation showed improper integration into the cell membrane, increased lysosomal degradation that result in reduced capability for DVL recruitment.

The investigation of downstream effects of WNT-3A and WNT-5A stimulation of nonsense-mutated fibroblasts was performed by analysis of levels of mRNA expression for в-catenin, DKK1 and MSX1. Increased mRNA levels were observed in WNT-5A-stimulated control fibroblasts but not in patient fibroblasts for all three factors. These results suggest that patient fibroblasts homozygous for the FZD6 nonsense mutation fail to respond properly to both WNT-3A and WNT-5A activation.

Present combined results show that IND can be caused by dysfunctional FZD6 or loss of FZD6 with a subsequent misregulation of several FZD6-mediated pathways required for proper formation and regeneration of nails throughout life.

Key words: ectodermal dysplasia, Ichthyosis Prematurity Syndrome, Isolated Nail Dysplasia, FATP4, FZD6, mutations.

Размещено на Allbest.ru

...