Вплив іонів металів на стабільність і конформаційну рівновагу мультиланцюгових гомополінуклеотидів: Polya-Polyu, Polya-2polyu і Polya-2polyi

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. Каразіна

УДК 577.32

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук

Вплив іонів металів на стабільність і конформаційну рівновагу мультиланцюгових гомополінуклеотидів: Polya·Polyu, Polya·2polyu І Polya·2polyi

03.00.02. - біофізика

Андрусь Олена Анатоліївна

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-технічному інституті низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної біофізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Барановський Сергій Федорович, Севастопольський національний технічний університет, професор кафедри фізики (м. Севастополь);

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Шестопалова Ганна Вікторівна, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, завідувач відділу біофізики (м. Харків).

Захист відбудеться «___»____________ 2009 року о _____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий «___»_____________ 2009 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

металокомплекс полінуклеотид урацил аденін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтерес до трьохспіральних нуклеїнових кислот викликаний, перш за все, їх використанням при розробці методів лікування вірусних, спадкових і онкологічних хвороб за допомогою антигенної та антизмістової стратегій. Крім того, участь цих структур було знайдено у різних біологічних процесах (наприклад, утворення триплексів основ забезпечує підтримку жорсткої конформації t-РНК, необхідної для її функціонування). Одна з основних проблем, що виникають при роботі с потрійними спіралями нуклеїнових кислот - це той факт, що в фізіологічних умовах вони менш стабільні, ніж відповідні подвійні спіралі, що робить актуальним питання про підвищення стабільності цих структур. Іони металів значно впливають на стабільність і конформаційну рівновагу нуклеїнових кислот, тому є важливим дослідження їх стабільності у присутності йонів металів. Для розуміння молекулярних механізмів взаємодії потрійних спіралей з іонами металів необхідно дослідження фізико-хімічних властивостей їх металокомплексів, таких як природа координуючих центрів, величина константи асоціації, кооперативність плавлення, концентраційний діапазон стійкості та конформаційні переходи, індуковані йонами металів. У теперішній час виконано досить велику кількість робіт з вивчення комплексів іонів металів з двох-, трьох- і чотирьохланцюговими спіралями, однак, отримані дані є далеко не вичерпними.

Для досліджень були вибрані йони Na⁺, Mg²⁺, Ni²⁺ і Cd²⁺. Іони Na⁺ і Mg²⁺ є компонентами внутрішньо- і зовнішньоклітинної рідини, необхідними для нормального функціонування клітин та їх генетичного апарату. З іншого боку, іони Ni²⁺ і Cd²⁺ збільшують кількість мутацій при транскрипції або реплікації ДНК тваринного і рослинного походження, а також пригнічують специфічне ДНК - білкове впізнавання, що може бути джерелом канцерогенезу. При цьому нікель (разом із хромом) має максимальний індекс канцерогенності. Кадмій та його сполуки, що безперервно генеруються індустріальною діяльністю людини, представляють собою основний забруднювач навколишнього середовища.

У якості модельних систем зручно використовувати гомополінуклеотиди, оскільки в залежності від умов вони можуть знаходитись у вигляді клубка, одноланцюгових спіралей, а також утворювати як канонічні, так і неканонічні мультиланцюгові структури. В цій роботі досліджувались двохниткова polyA·polyU (AU), а також трьохниткові polyA·2polyI (A2I) і polyA·2polyU (A2U). Трьохланцюгова A2U є найбільш вивченим трьохспіральним полінуклеотидом: її конформаційна рівновага у розчинах була розглянута у присутності йонів Na⁺, K⁺, Mg²⁺ і Ni²⁺. Однак поведінка A2U у присутності іонів Cd²⁺ до сих пір вивчена не була. Інтерес представляють також трьохланцюгові спіралі, що містять інозинмонофосфат (IMP), зокрема A2I, оскільки вони (як і A2U) утворюються у фізіологічних умовах. Ця обставина, як і можливість заміни AU-пар на AI-пари без істотніх змін структурних параметрів спіралі робить можливим використання нуклеїнових кислот, що містять IMP, при розв'язанні задач генної інженерії. Зважаючи на подібність структурних параметрів потрійних спіралей A2I і A2U є цікавим з'ясувати, наскільки відрізняється їх взаємодія з йонами металів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати дисертації отримані у процесі виконання планових науково-дослідних робіт відділу молекулярної біофізики Фізико-технічного інституту низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України за темою: "Дослідження структурних та фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами" (шифр теми 1.4.10.18.2), а також Міжнародного гранту US Civilian Research and Development Foundation (CRDF) “Elaboration of VCD method to study of metal-ion induced structural polymorphism of DNA and its polypurine-polypyrimidine sequences” № UB2-2442-KH-02 (2002-2004).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення головних закономірностей впливу температури та концентрації йонів металів (Na⁺, Mg²⁺, Cd²⁺ і Ni²⁺) на конформаційну рівновагу у водних розчинах A2I, вивчення впливу йонів Cd²⁺ на конформаційну рівновагу у водних розчинах AU і A2U. А також з'ясування фізичної природи структурних переходів, що індуковані йонами двовалентних металів (Mt²⁺).

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

Отримання фазових діаграм металокомплексів нуклеїнових кислот (діаграм температура конформаційних переходів - концентрація йонів металів).

Визначення атомів, що координують іони металів у мультиланцюгових полінуклеотидах, що створені аденіном, гіпоксантином та урацилом (polyA, поліінозинова кислота (polyI), polyU, A2I, AU і A2U).

Встановлення характеру конформаційних переходів індукованих іонами металів.

Розрахунок констант зв'язування, що характеризують утворення відповідних металокомплексів.

З'ясування впливу різниці й схожості в структурі A2U і A2I на їх термостабільність і взаємодію з іонами Na⁺, Mg²⁺ і Cd²⁺.

Об'єкт дослідження: конформаційні переходи у водних розчинах гомополінуклеотидів.

Предмет дослідження: молекулярні механізми зміни термостабільності і конформації полінуклеотидів, індукованих іонами одно- і двовалентних металів.

Методи дослідження: диференційна ультрафіолетова (ДУФ) спектроскопія використовувалась для визначення місць зв'язування йонів металів з гомополінуклеотидами; конформаційні переходи, індуковані йонами металів, реєструвалися методом термічної денатурації.

Наукова новизна одержаних результатів.

Показано, що при нагріванні A2I у присутності всіх вивчених іонів спостерігається тільки конформаційний перехід A2IА+I+I (перехід 31).

Отримані залежності термостабільності A2I від концентрації йонів Na⁺, Mg²⁺, Cd²⁺ та Ni²⁺, а також залежності термостабільності AU і A2U від концентрації йонів Cd²⁺.

Визначена відстань між зарядами на одноланцюговій polyI.

Встановлені залежності констант зв'язування йонів Mg²⁺ і Ni²⁺ з A2I від ступеня зв'язування.

Отриманий аналітичний вираз, що встановлює кореляцію між константами зв'язування йонів Mg²⁺ з трьохланцюговими і одноланцюговими полінуклеотидами і значеннями лінійних густин зарядів на їх поверхні.

У присутності йонів Ni²⁺ визначено утворення комплексу, що індукує руйнування потрійної спіралі A2I, а також зменшення її термостабільності та кооперативності плавлення. Запропонована структура комплексу, який дестабілізує A2I. Цей комплекс є внутрішнім хелатом, що включає внутрішньосферну взаємодію йонів Ni²⁺ з атомом N7 та, імовірно, зовнішньосферну - з атомом О6 поліінозинових ланцюгів потрійної спіралі.

У присутності йонів Cd²⁺ також знайдена взаємодія з N7 гіпоксантину, що приводить до зміни структури A2I, яка, однак, при кімнатній температурі до 5·10^-4М Cd²⁺ залишається потрійною спіраллю.

Встановлено, що мала різниця параметрів переходу 31 (кооперативності переходу, інтервалу переходу) і констант зв'язування комплексів іонів металів з A2U і A2I обумовлена подібністю їх структури.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі експериментальні залежності, а також результати проведених теоретичних розрахунків і запропонована структурна модель, перш за все, можуть бути використані при аналізі та інтерпретації експериментальних досліджень у сфері молекулярної біофізики, зокрема, при вивченні нуклеїнових кислот.

Крім того, результати досліджень фундаментальних властивостей триплексних полінуклеотидів та їх складових, яким присвячена ця робота, можуть мати практичне значення для біохімії і медицини, оскільки для застосування триплексів при створенні лікарських препаратів ген-направленої дії на основі антигенної та антизмістової стратегій необхідним кроком є знання фізичних властивостей цих структур.

Зокрема, однією з головних проблем на шляху створення таких препаратів є низька стабільність триплексних полінуклеотидів. Встановлений температурно-концентраційний діапазон стійкості гомополінуклеотидів у присутності різних іонів металів, а також механізм їхнього впливу на конформаційний стан полінуклеотидів можуть бути використані для коректного вибору триплексних послідовностей, на основі яких розробляються лікарські препарати, а також при виборі йонів металів, що сприяють формуванню триплексів та забезпечують їхню стабільність.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає: у роботах [1, 5-9] - пошук і критичний аналіз літературних даних, участь у проведенні експериментальних досліджень, розрахунок констант зв'язування; в роботах [2-4, 10-17] - участь у постановці задачі, аналіз та інтерпретація отриманих даних.

Апробація результатів дисертації. Головні результати досліджень, що увійшли до дисертації, були представлені та обговорені на:

1. 26 European Congress on Molecular Spectroscopy (EUCMOS), Villeneuve d'Ascque, 2002.

2. III З'їзд Українського біофізичного товариства, Львів, 2002.

3. XVI International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals", Ukraine, Sebastopol, 2003.

4. Конференция Молодых ученых «Физика низких температур», Харьков, 2004.

5. 8^th EPS Conference on Atomic and Molecular Physics, Rennes, France, 2004.

6. World Polymer Congress (MACRO) Paris, France, 2004.

7. 5^th International Conference on Biological Physics, 2004, Goteborg, Sweden.

8. 1 Украинская научная конференция «Проблемы биологической и медицинской физики», Харьков, Украина, 2004.

9. XVII International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals", Ukraine, Beregove, 2005.

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані у 17 наукових працях, у тому числі в 4 статтях у наукових фахових журналах та в 13 тезах доповідей на національних і міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, шести розділів і висновків. Загальний обсяг дисертації складає 141 сторінку. Дисертація містить 35 рисунків і 9 таблиць. Список використаних джерел (203 найменування) займає 23 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мету і головні задачі дослідження, відзначено наукову новизну і практичне значення роботи, наведено відомості про апробацію результатів.

У розділі 1 представлено огляд літератури за темою дисертації. Розглянуто біологічну роль неканонічних структур нуклеїнових кислот. Проаналізовано сучасний стан проблеми взаємодії йонів металів з одно- та багатоланцюговими гомополінуклеотидами. Висвітлено основні методи аналізу систем іонів металів з нуклеїновими кислотами.

У розділі 2 наведена загальна характеристика матеріалів та методів дослідження.

У роботі досліджувались наступні полінуклеотиди: polyA (Serva), polyU (Serva), polyІ (Sigma), AU (Sigma), A2U (Sigma) і A2I (рис. 1), а також мономери IMP (Serva) і аденозинмонофосфат (AMP) (Serva). Полінуклеотиди та хлориди Na⁺, Mg²⁺, Ni²⁺ та Cd²⁺ розчиняли в какодилатному (pH=7,0; [Na⁺]=10^-3М) буфері, в який добавляли NaCl. Для отримання трьохланцюгової A2I розчиняли солі polyA і polyІ, концентрація яких співвідносилась як 1:2, також у какодилатному буфері, що містив 0,099М NaCl. Більшість вимірювань у присутності йонів Mt²⁺ проведено для розчинів, що містили 0,1M Na⁺, однак у деяких випадках - при менших концентраціях Na⁺ (0,01М і 0,03М). Для отримання трьохланцюгової A2I розчиняли солі polyA і polyІ, концентрація котрих співвідносилась як 1:2, також у какодилатному буфері, що містив 0,099М NaCl. Для того щоб реакція утворення A2I пройшла більш повно, розчин, що містив polyA і polyI і мав сумарну концентрацію фосфору полінуклеотидів (Р) (0,81)10^-2М, витримували протягом 120 годин при 4⁰С. При вимірюванні ДУФ спектрів Р=(6ч7)·10^-5М, в експериментах по плавленню Р=(2ч3)·10^-5М. Похибка визначення концентрації Р та йонів металів складала 0,5%.

Головною перевагою ДУФ спектроскопії є її більша інформативність у порівнянні з абсолютною УФ спектроскопією. Так, для спектрофотометра М40 при вимірюванні диференційних спектрів чутливість у 50 разів більше, чим при вимірюванні абсолютних. Крім того, ДУФ спектр має декілька характерних особливостей: позитивні та негативні екстремуми, а також ізобестичні точки. Положення і кількість цих елементів ДУФ спектрів залежать не тільки від природи основи, з якою взаємодіє йон, але й від природи атома, що його зв'язує. Ідея методу визначення координуючих атомів полягає у порівнянні форми ДУФ спектрів металокомплексу з аналогічним спектром стандартного комплексу, для якого атом, що зв'язує йон, відомий. ДУФ спектри мають таку властивість, що їх форма, яка є результатом зсування смуг поглинання основ і (або) зміни їх інтенсивності при взаємодії з іоном, не залежить від величини зсуву смуги, і таким чином, від концентрації йонів. Цей факт дозволяє використовувати розведені розчини, зводячи до мінімуму агрегацію полінуклеотидів у відсутності йонів, а також збільшити діапазон їх концентрацій. Експериментальні ДУФ спектри реєстрували з використанням 4-кюветної схеми. Похибка вимірювання оптичної густини складала 0,5%. Вимірювання проводилися на спектрофотометрі Specord M 40, Carl Zeiss Jena.

Термічну денатурацію полінуклеотидів проводили в герметичних кварцевих кюветах, розміщених у двох ідентичних мідних блоках, що знаходилися в камері спектрофотометра Specord UV VIS фірми Carl Zeiss Jena. Нагрівання проводилося зі швидкістю 0,25⁰С/хв. Криві конформаційних переходів реєструвались в максимумі поглинання полінуклеотидів. Похибка вимірювання температури знаходилась в межах ±0,5⁰С.

Запис ДУФ спектрів зразків робили за допомогою з'єднаного зі спектрофотометром комп'ютера у вигляді залежностей зміни коефіцієнта екстинкції від частоти поглинання (()), а запис кривих плавлення - у формі залежностей гіперхромного коефіцієнта від температури (h(Т)), де , A(T) - зміна оптичної густини розчину, що відповідає даній температурі, А_То - початкове значення оптичної густини розчину, - довжина хвилі, на якій реєструвалася крива плавлення.

У розділі 3 наведено експериментальні результати дослідження взаємодії йонів Na⁺ і Mg²⁺ з трьохланцюговою A2I.

Нагрівання A2I при [Na⁺]0,1М приводить тільки до одного кооперативного конформаційного переходу (рис. 2), який, очевидно, є переходом 31 (A2IA+I+I). Відсутність будь-яких інших переходів (зокрема, 32 і 21) підтверджується також відсутністю зміни поглинання розчинів A2I при =_i=(35,70,2)10³cм^-1, де _i - хвильове число, що відповідає ізобестичній точці на ДУФ спектрах, індукованих переходом спіраль-клубок в A2I. Параметри цього переходу, такі як похідна dh(T)/dT, що характеризує кооперативність процесу ((0,120,02)⁰С^-1), та інтервал цього конформаційного переходу T ((34,5)⁰C) (T=T_f -T_s, де T_f і T_s , відповідно, температури кінця і початку переходу) близькі до тих, що спостерігаються для переходу 31 A2U [Сорокін, 2001].

Як видно з рисунка 3A крива 2, температура цього переходу (T_m) є лінійною функцією логарифму концентрації йонів Na⁺. Зростання _m при збільшенні вмісту йонів Na⁺ задовільно відображає теорія Манінга. Згідно з цією теорією,

(1)

Тут T_m і H відповідно температура переходу та його ентальпія на нуклеотид. Для переходу 31

, (2)

де _I, _A і _A2I - лінійні густини негативного заряду на поверхні відповідно одноланцюгових polyI, polyА і трьохланцюгової A2I. 1/=b/l_B, (b - відстань між проекціями заряду на вісь полімерної нитки, а l_B=7 - довжина Б'єррума у воді при кімнатній температурі).

Таблиця 1. Лінійна густина заряду на полінуклеотидах (о) та її зміна при переході 31 (До^-1).

оІ-1	о-1А	о-1U	о-1A2І	о-1A2U	До-1A2І	До-1A2U
0,530,03 ()	0,40 (а)	0,61 (b)	0,16 (а)	0,144 (а)	0,3260,02 ()	0,395 ()

() - розраховано у цій роботі; (а) - [Зенгер, 1987]; (b) - [Кантор, 1985].

Формули (1) і (2) дозволяють оцінити невідомі значення _І і b_І для одноланцюгової polyI, використовуючи дані таблиці 1 і значення H₃₁=3,25ккал/моль·град [Фуджиока, 1982] і (рис. 3A, крива 2). Розраховані значення _I=1,90,1, b_I=(3,60,2) . Величина близька до знайденої раніш для одноланцюгової polyU, що знаходиться, як і polyI, при 0,1М Na⁺ і T>23⁰C у стані повністю розупорядкованого клубка (табл. 1).

Подібно йонам Na⁺, іони Mg²⁺ підвищують термостабільність A2I (рис. 3B). Оскільки йони Mg²⁺ не змінюють спектри поглинання A2I, polyI і polyА, то зростання Т_m обумовлене взаємодією магнію з фосфатними групами A2I і одноланцюгових полінуклеотидів, що утворюються в результаті її плавлення.

Згідно з отриманими даними (рис. 3, крива 2), діаграми конформаційної рівноваги A2I не мають критичних точок не тільки у присутності йонів Na⁺, але й іонів Мg²⁺. Можлива причина цього полягає у різниці в стабільності Уотсон-Криківських пар A2U і A2I з-за різної відстані між їх глікозидними зв'язками. Мала стабільність обох пар триплету A2I проявляється також у тому, що (Т_m)₃₁ A2I на (13ч19)^оС нижче (Т_m)₃₁ A2U у розчинах, що містять іони Na⁺ і Mg²⁺ (рис. 3).

Підвищення _m при збільшенні вмісту йонів Mg²⁺ (крива 2, рис.3B) задовільно описується теорією лігандів. Вважаючи, що стехіометрія комплексів іонів Мg²⁺ з потрійними і одноланцюговими полінуклеотидами n = 0,5, залежність зміни температури переходу 31 від концентрації вільних іонів Мg²⁺ (А_f) має вигляд:

. (3)

Тут К - константи зв'язування йонів Мg²⁺ з відповідними полінуклеотидами.

Рівняння матеріального балансу при Т= Т_m:

, (4)

де ступінь зв'язування. Використовуючи дані таблиці 2, а також , 3·Н=9,8ккал/моль·триплет [Фуджиока, 1982] і K_A2I=750M^-1, була розрахована теоретична залежність Т_m A2I від концентрації йонів Mg²⁺(крива 3 рис. 3B). Як видно з рисунка 3B, її форма відтворює форму експериментальної залежності. Кількісна різниця складає приблизно 2,5⁰С.

Виходячи з умови, що (T_m)_exp=(T_m)_theor в усьому діапазоні концентрацій іонів Мg²⁺, за формулами (3) і (4) була розрахована залежність K_A2I від С_A2I (рис. 4а). Згідно з рисунком 4а, зв'язування йонів Мg²⁺ з фосфатами A2I антикооперативно (y=dlogK/dС= - 0,32), що обумовлено електростатичним відштовхуванням між іонами, зв'язаними з полімером, та йонами, що адсорбуються ним з розчину.

Як видно з рисунка 3, для A2I і A2U похідні і в області переходу відрізняються не більш ніж на 20%. З іншого боку, різниця між значеннями констант зв'язування йонів Мg²⁺ з A2I і A2U і між величинами констант зв'язування з одноланцюговими полінуклеотидами (табл. 2) також невеликі і знаходяться у межах помилки їх визначення.

Таблиця 2. Константи зв'язування (М-1) іонів Mg2+ з фосфатами полінуклеотидів при 0,1М Na+.

KA2І	KA2U	KІ	KA	KU
С=0	С=1	С=0	С=1
1250(*)	600(*)	1000(с)	480(**)	280 (a)	200 (b)	250 (b)

(*) - отримано у цій роботі; (**) - визначено, вважаючи, що для A2U, як і для A2I, y= - 0,32 (рис. 4); (а) - [Діблер, 1987], (b) - [Кракауер, 1974], (с) - [Сорокін, 2002].

Залежність Т_m A2I від log[Mg²⁺], що описується формулою (3), є нелінійною. Однак, вона повинна бути близькою до лінійної біля точки перегину, що відповідає концентрації D_*, у якій друга похідна від дТ_m по logD дорівнює нулю (рис. 3B).

Оскільки K_A мало відрізняється від K_І (табл. 2), можна замінити K_A і K_І на K₁=. В області заміни Т_m повна концентрація йонів Mg²⁺ на порядок більша Р, тому можна вважати, що A_fD. Таким чином, формула (3) має вигляд:

, (5)

де , а K₃K_A2І.

Взявши другу похідну від Т_m по lnD і прирівнявши її до нуля, отримуємо

. (6)

При D=D_* вираз для _t приймає простий вигляд.

, (7)

де .

З формул (1) і (7) виходить, що

. (8)

Як видно з таблиці 1, різниця між лінійними густинами заряду на одноланцюгових полінуклеотидах різного типу достатньо мала. Тому можна вважати для простоти, що _AUІ1, а _A2І3. В цьому разі формула (8) має вигляд

, (9)

де - константа для даного полінуклеотида.

З цієї формули виходить, що різниця між лінійними густинами зарядів на одно- і трьохланцюговому полінуклеотидах визначає величину відношення їх констант зв'язування з іонами Mg²⁺. Таким чином, порівняно невелика різниця між значеннями К_A2I і К_A2U з одного боку, а також між значеннями К_A, К_І і К_U з іншого (табл. 2), обумовлені близькістю параметрів, що характеризують структуру і конформацію цих полінуклеотидів (табл. 1).

У розділі 4 наведено дані про вплив іонів Cd²⁺ і Ni²⁺ на термостабільність та УФ-поглинання A2I та її складових - polyI, IMP та AMP.

Взаємодія йонів Ni²⁺ з IMP викликає зміну інтенсивності та положення смуг поглинання нуклеотиду. Аналіз форми ДУФ спектрів IMP+Ni²⁺ (рис. 5а) і порівняння їх з літературними даними показали, що основним атомом інозину, що координує йони перехідних металів, є N7. При цьому головним типом металокомплексів є макрохелати, що складаються з внутрішньосферної координації йона з N7 та зовнішньосферної (через молекули води октаедричної гідратної оболонки йона) з атомами кисню фосфатної групи (О(Р)).

При [Ni²⁺] 310^-4M форма ДУФ спектрів polyI, індукованих іонами Ni²⁺ (рис. 5b), подібна тим, що спостерігаються для IMP (рис. 5a). Це дозволяє зробити висновок про те, що йони Ni²⁺ утворюють макрохелати і у випадку polyI. При цьому, однак, на спектрах _a polyI короткохвильова ізобестична точка зсувається в червоний бік на 2000см^-1 у порівнянні з її положенням на спектрах _a IМР. Крім того, довгохвильовий негативний мінімум на ДУФ спектрах polyI має малу інтенсивність, а при збільшенні концентрації Ni²⁺ трансформується в позитивне плече, розташоване в області (3235)10³см^-1 (рис. 5b). Такі зміни форми спектрів _a при переході від IМР до polyI можна пояснити тим, що у випадку polyI в більш явній формі, чим у випадку IМР, проявляється енолізація інозину, обумовлена переносом протона від атома кисню O_W до O6 (рис. 1).

Концентраційні залежності _а в екстремумах ДУФ спектрів polyI (криві 1 і 2, рис. 6A) свідчать про існування двох типів комплексів, що утворюються полінуклеотидом з іонами Ni²⁺. Перший, що утворюється при [Ni²⁺]10^-4M (ділянка a-b, крива 1, рис. 6A) , природно приписати утворенню макрохелатів. Другий утворюється при концентраціях никелю ([Ni²⁺]210^-4M) (ділянка c-d, крива 1, рис. 6A), на порядок вищих за концентрацію фосфатних груп. Можливою моделлю другого типу комплексу є металокомплекс нуклеозиду, в якому йон Ni²⁺ внутрішньосферно зв'язаний з N7 і зовнішньосферно - з О6 (внутрішній хелат).

В області концентрацій нікеля, що перебільшують 510^-4M, спостерігається зростання оптичної густини розчинів polyI при 32000см^-1, обумовлене появою у розчині частинок, що розсіюють (наприклад, неструктурованих агрегатів або компактних частинок).

Як видно з концентраційних залежностей екстремумів ДУФ спектрів A2I (рис. 6A, крива 3), цей полінуклеотид утворює з іонами Ni²⁺ один комплекс при [Ni²⁺]3·10^-4 M. Порівняння ДУФ-спектрів A2I, індукованих іонами Ni²⁺ (рис. 7а) з ДУФ спектрами одноланцюгової polyI (рис. 5b) (а саме, близьке розташування максимумів на спектрі (38000см^-1) для A2I і (37600см^-1) для polyI ), а також той факт, что основна зміна поглинання A2I, викликана йонами Ni²⁺, спостерігається при концентрації йонів, що майже на два порядки перебільшує концентрацію фосфатів полінуклеотиду (рис. 6A, крива 3), свідчить про те, що найбільш вірогідним типом цього комплексу є внутрішній хелат.

В області малих концентрацій нікель, як і інші вивчені йони, підвищує термостабильність A2I (рис. 6A, крива 4). Однак цей ефект складає всього 5⁰С і досягається при концентрації 210^-4М Ni²⁺. Подальше підвищення вмісту нікелю призводить до зниження термостабільності A2I (рис. 6A. крива 4). Ці результати знаходяться у кількісній згоді з даними ДУФ спектроскопії: зменшення T_m спостерігається саме в тому концентраційному діапазоні, де, згідно з даними рис. 6A та їхній інтерпретації, відбувається зв'язування йонів нікелю з N7 гіпоксантину і руйнування потрійної спіралі.

Константу зв'язування, що відповідає утворенню нікелем з polyI і A2I макрохелатів (К^b) і внутрішніх хелатів (K^ih), визначали с використанням концентраційних залежностей інтенсивності екстремумів ДУФ спектрів відповідних систем (рис. 6A) і формули (10)

, (10)

На ділянці c-d (крива 1, рис. 6A) [Ni²⁺] на порядок більша P, тому вважали, що A_f [Ni²⁺]. Згідно з кривою 1 рисунка 6A, для polyI при С_I^ih=0,5 K_I^ih=2000 M^-1. Результати розрахунків K представлені у таблиці 3.

Таблиця 3. Константи зв'язування (К, М^-1) іонів Ni²⁺ з полінуклеотидами.

	Кb	Кih
polyА	9000 (а)
polyI	(а)	2000 (*)
А2I	(*)	550 (*)

Індекси b та ih відносяться відповідно до утворення макрохелатів і внутрішніх хелатів. (*) - отримано в цій роботі; (а) - [Діблер, 1987].

Для розрахунку констант зв'язування йонів Ni²⁺ з A2I, що відповідають різним типам комплексів (табл. 3), а також залежності константи утворення йонами Ni²⁺ з A2I макрохелатів, була також, як і для йонів Mg²⁺, використана теорія лігандів. Аналіз отриманих результатів показав, що константи утворення йонами Ni²⁺ з A2I макрохелатів не залежать від ступеня зв'язування (рис. 4b) і за порядком величини співпадають з константами утворення макрохелатів іонами Ni²⁺ з одноланцюговими полінуклеотидами (табл. 3). Також встановлено, що причинами зменшення термостабільності A2I при високих концентраціях іонів Ni²⁺ є енергетична доцільність зв'язування йонів з одноланцюговими полінуклеотидами () (табл. 3).

Окрім хелатних комплексів, що включають взаємодію з гетероатомами основ, для катіонів повинна бути характерною також кулонівська взаємодія з негативно зарядженими фосфатними групами полінуклеотидів. Константи зв'язування, що відповідають утворенню такого комплексу, визначаються валентністю катіона і тому повинні слабо залежати від природи полінуклеотидів. Тому вважали, що для йонів Mg²⁺ і Ni²⁺ ці константи однакові (табл. 2).

Форма ДУФ спектрів A2I, індукованих іонами Сd²⁺ (рис. 7b) аналогічна формі спектрів комплексів A2I з іонами Ni²⁺ (рис. 7а). Для комплексів A2I+Сd²⁺ було також проведене порівняння з ДУФ спектрами IMP і AMP, індукованими Cd²⁺, і результат свідчить про те, що N7 гіпоксантина є атомом, що координує кадмій в потрійній спіралі. З рис. 6B і 7b видно, що зміна спектра поглинання A2I в присутності йонів Сd²⁺ починається при концентрації, що перебільшує 10^-4М, і закінчується при [Cd²⁺] 510^-4 M.

Як видно з залежності зміни температури переходу, при [Cd²⁺]210^-4M термостабільність A2I практично не змінюється (рис. 6B крива 2). При більшому вмісті кадмію термостабільність потрійної спіралі різко зменшується. Примітно, що зниження T_m (рис. 6B крива 2) і зміна інтенсивності спектра поглинання A2I, обумовлене зв'язуванням кадмію з N7 гіпоксантину (рис.6В крива 1), відбувається в одному і тому ж концентраційному діапазоні. Це дозволяє зробити висновок, що зміна термостабільності A2I в присутності кадмію обумовлена зв'язуванням його йонів з N7 гіпоксантину та утворенням, як і у випадку нікелю, внутрішнього хелату.

Оскільки в присутності нікелю і кадмію форма кривих плавлення A2I та їх похідних подібна до форми кривих плавлення в присутності йонів Mg²⁺ і Nа⁺, вони в авторефераті не наведені.

У розділі 5 вивчені індуковані підвищенням температури та йонами Cd²⁺ конформаційні переходи в AU та A2U.

Криві плавлення комплексів AU+Cd²⁺ (рис. 8 a, b) показують, що в залежності від концентрації катіонів у розчині індуковані нагріванням конформаційні переходи в AU можуть бути двох типів: в інтервалі концентрацій 610^-6ч6•10^-5М Cd²⁺ - одностадійне руйнування подвійної спіралі на окремі нитки polyA і polyU (21) (рис. 8а); при [Cd ²⁺]6•10^-5 М - двофазні, що включають трансформацію дуплекса в триплекс (23) і однониткову polyA а потім - руйнування утвореної триплексної структури A2U (31) (рис. 8b).

Використовуючи концентраційні залежності T_m для різних конформаційних переходів, побудована діаграма фазового стану AU+Cd²⁺ для 0,03M Na⁺ і порівняна з діаграмами для AU+Cd²⁺ в 0,1M Na⁺ і для AU+Mg²⁺ в 0,01M Na⁺ (рис. 9). При цьому визначено, що положення критичної точки [Mt ²⁺]_cr в концентраційній шкалі двовалентних іонів залежить від вмісту йонів Na⁺ в розчині: чим вища концентрація [Na⁺], тим більша концентрація [Mt ²⁺] відповідає критичній точці. Гілка до [Mt ²⁺]_cr відповідає звичайному переходу спіраль-клубок (21) в AU. Цей перехід відбувається у вузькому температурному інтервалі (15)⁰С (рис. 8а). При порівняно невисокій концентрації натрію (до 0,03М) зростання концентрації йонів Cd²⁺ супроводжується стабілізацією (на 5⁰С) подвійної спіралі AU (рис. 9), что обумовлено зв'язуванням іонів з фосфатними групами дво- та однониткових полімерів. Майже ніякого впливу йонів кадмію на термостабільність двониткової AU не спостерігається при високій концентрації одновалентних іонів (0,1 М Na⁺) внаслідок їх екрануючої дії на фосфатні заряди. При критичній концентрації кадмію (~6•10^-5М) починають утворюватися потрійні спірали A2U, область існування яких розширюється з ростом [Cd ²⁺]. Як це випливає з різкого зменшення температури переходу 31 (рис. 9), при [Cd ²⁺]4•10^-4M виникає сильна дестабілізація потрійної спіралі, очевидно, із-за утворення кадмієм макрохелатного комплексу.

На відміну від А2I, криві плавлення A2U в присутності йонів Cd²⁺ мають дві кооперативних ділянки (рис. 8c криві 1 і 2). Перша відповідає відокремленню нитки polyU від потрійної спіралі A2U (перехід 32), а друга - розпаду подвійної спіралі AU (перехід 21) на окремі нитки. Однак при [Cd ²⁺]_cr 1,810^-4M (критична концентрація) замість двох послідовних переходів має місце тільки один конформаційний перехід: перехід 31 (рис. 8c крива 3). В результаті на діаграмі T_m-[Cd ²⁺] (рис. 10) спостерігається критична точка, що відповідає цій критичній концентрації йонів кадмію.

В роботі отримані фазові діаграми комплексів A2U з іонами Cd²⁺ в розчинах, що містять 0,03М Na⁺ (рис. 10, крива 1) і 0,01М Na⁺ (рис. 10, крива 2). В області малих концентрацій іонів Cd²⁺ підвищення їх вмісту приводить до збільшення термостабільності A2U (тобто до зростання (T_m)₃₂) (рис. 10), что обумовлене зв'язуванням іонів Cd²⁺ з фосфатними групами A2U. Разом зі зростанням спорідненості йонів Cd²⁺ до основ AU, що утворюються в результаті переходу 32, і до основ A2U стабілізуючий ефект від зв'язування з фосфатними групами зменшується за рахунок дестабілізуючого ефекту від зв'язування з основами, тому температура переходу 21 збільшується незначно (д(T_m)₂₁~3ч4⁰С), а стабільність переходу 31 А2U практично не змінюється (рис. 10).

Конформаційні переходи 3>2 і 2>1 A2U при меншому вмісті йонів Na⁺ (0,01М) починаються при більш низькій (на ~3ч4,5⁰С) температурі, чим при 0,03М Na⁺ (рис. 10), що говорить про те, що при постійній концентрації йонів Cd²⁺ збільшення вмісту йонів Na⁺ в розчині веде до стабілізації структури A2U і AU, котра утворюється в результаті переходу 3>2. Крім того, більш високому вмісту йонів Na⁺ відповідає більше значення критичної концентрації Cd²⁺ на фазовій діаграмі (рис.10). Аналогічний ефект спостерігається й у випадку AU (рис. 9).

ВИСНОВКИ

У дисертації експериментально досліджена конформація та стабільність дуплексів, триплексів та їх складових у присутності йонів металів, а також зроблений теоретичний аналіз їх структури та параметрів зв'язування. Результати і висновки роботи поглиблюють уявлення про взаємодію йонів металів з нуклеїновими кислотами і можуть бути використані у дослідженнях з молекулярної біофізики, а також при розробці препаратів ген-направленої дії.

Головні результати роботи можна сформулювати наступним чином:

1. Вперше отримані залежності термостабільності A2I від концентрації йонів Na⁺, Mg²⁺, Cd²⁺ і Ni²⁺. Показано, що при нагріванні A2I в присутності цих іонів має місце тільки конформаційний перехід A2IА+I+I (перехід 31). Можливою причиною цього є вирівнювання стабільностей Хугстинівської та Уотсон-Криківської пар основ за рахунок великої відстані між глікозидними зв'язками в Уотсон-Криківській парі.

2. Використовуючи теорію Манінга, вперше визначені відстань між зарядами та лінійна густина заряду на одноланцюговій polyI. Використовуючи теорію лігандів, вперше отримані залежності констант зв'язування йонів Mg²⁺ і Ni²⁺ з A2I від ступеня зв'язування.

3. Єдиним типом зв'язування йонів Mg²⁺ з A2I в усьому концентраційному діапазоні є кулонівська взаємодія з негативно зарядженими атомами кисню фосфатних груп. Ця взаємодія не змінює конформацію полінуклеотиду, але призводить до підвищення його термостабільності.

4. Отриманий аналітичний вираз, що встановлює зв'язок між макроскопічними параметрами, що характеризують електростатичну взаємодію йонів металів з фосфатними групами трьохланцюгових та одноланцюгових полінуклеотидів (константи зв'язування), і мікроскопічними параметрами, що характеризують структуру цих полінуклеотидів (лінійні густини зарядів на їх поверхні). Цей вираз дозволяє пояснити невеликі відмінності значень констант зв'язування йонів Mg²⁺ з фосфатами A2I і A2U близькістю структури цих полінуклеотидів.

5. При низьких концентраціях іони Ni²⁺, на відміну від іонів Cd²⁺, підвищують термостабільність A2I при взаємодії з негативно зарядженими атомами кисню фосфатних груп цього полінуклеотиду. При великих концентраціях іонів Ni²⁺ і Cd²⁺ знайдено утворення комплексу, що індукує руйнування потрійної спіралі A2I і пониження її термостабільності. Цей комплекс, імовірно, являє собою внутрішній хелат, що включає внутришньосферну взаємодію йонів Ni²⁺ з N7 і зовнішньосферну - з О6 поліінозинових ланцюгів потрійної спіралі. Утворення такого комплексу обумовлено більшою енергетичною вигідністю їх зв'язування з одноланцюговими полінуклеотидами, ніж з трьохланцюговою спіраллю.

6. Вперше отримана діаграма фазової рівноваги комплексу AU+Cd²⁺. Показано, що при низьких концентраціях Cd²⁺ перехід AUA+U (перехід 21) є однофазним. При концентраціях Cd²⁺, більших за критичну, відбувається формування потрійної спирали A2U, область існування якої розширюється при збільшенні [Cd²⁺].

7. Вперше виміряні фазові діаграми комплексів A2U+Cd²⁺. Ці діаграми змінюють характер конформаційного переходу з ростом концентрації йонів Cd²⁺ з двофазного A2UAU+U A+U+U (перехід 3>2>1) на однофазний A2UA+U+U (перехід 3>1).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Сорокин В.А., Валеев В.А., Гладченко Г.О., Андрусь Е.А., Благой Ю.П. Влияние ионов Na⁺ и Cd²⁺ на стабильность тройной спирали полиA-2полиI// Вісник ХНУ імені В.Н. Каразіна №568, Біофізичний вісник. - 2002. - Т. 11(2) - С. 30-35.

Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Andrus E.A., Blagoi Yu.P. Na⁺ and Mg²⁺ ion effect on the stability of a polyI-polyA-polyI triple helix// Macromol. Biosci. - 2004 - Vol. 4 - P. 532-538.

Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Andrus E.A., Karachevtsev V.A., Blagoi Yu.P. Mg²⁺ and Ni²⁺ ion effect on stability and structure of triple poly(I)-poly(A)-poly(I) helix// International Journal of Biological Macromolecules. - 2005 - Vol. 35 - P. 201-210.

Гладченко Г.О., Благой Ю.П., Сорокин В.А., Валеев В.А., Андрусь Е.А., Карачевцев В.А. Влияние ионов кадмия на фазовое равновесие в двунитевой poly(rA)poly(rU) // Вісник ХНУ імені В.Н. Каразіна, Біофізичний вісник. - 2007. - Т. 18(1) - С. 14-22.

Gladchenko G.O., Sorokin V.A., Andrushchenko V.V., Valeev V.A., Andrus E.A., Van de Sande J.H., Wieser H., Blagoi Yu.P. UV and VCD spectroscopic study of heating and Me²⁺ ions-induced conformational transitions in poly(rA)-poly(rU) complexes// Book of abstracts 26 European Congress on Molecular Spectroscopy (EUCMOS). - Villeneuve d'Ascque. - 2002. - P. 111.

Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Andrus E.A., Karachevtsev V.A., Blagoi Yu.P. Effect of structural organization level of homopolynucleotides containing adenine, uracile and hipoxantine on their interaction with Cd²⁺ and Ni²⁺ // III З'їзд Українського біофізичного товариства. - Львів.- 2002. - C. 4.

Andrus E.A., Sorokin V.A., Valeev V.A, Gladchenko G.O. Sodium ion effect on stability of triple helix poly I*poly A*poly I// In: XVI International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". - Sebastopol, Ukraine. - 2003. - P. 191.

Valeev V.A., Sorokin V.A., Andrus E.A. Effects of divalent metal ions on long-wave absorption of nitrogen bases of heteropolynucleotides and their monomers// In: XVI International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". - Sebastopol, Ukraine. - 2003. - P. 247.

Sorokin V.A., Valeev V.A., Andrus E.A., Blagoi Yu.P. Cadmium ion effect on stability and conformational of triple helix poly I*poly A*poly I// In: XVI International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". - Sebastopol, Ukraine. - 2003. - P. 316.

Андрусь Е.А., Сорокин В.А., Валеев В.А., Гладченко Г.О., Благой Ю.П., Карачевцев В.А. Влияние ионов Ni ²⁺ на конформационное равновесие в растворах polyI-polyA-polyI// Конференция Молодых ученых «Физика низких температур». - Харьков. - 2004. - C. 20.

Gladchenko G.O., Blagoi Yu.P., Sorokin V.A., Valeev V.A., Andrus E.A., Karachevtsev V.A. Effect of divalent metal ions on phase equilibrium in poly(rA)-poly(rU) complexes// Book of Abstract 8^th EPS Conference on Atomic and Molecular Physics. - Rennes, France. - 2004. - V. 28F, Part II. - P. 13-8.

Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Andrus E.A., Karachevtsev V.A., Blagoi Yu.P. Effect of structural pecularities of three-stranded polyI-polyA-polyI (A2I) on their stability in solutions containing Mg²⁺ and Ni²⁺ ions// Proceedings World Polymer Congress (MACRO). - Paris, France. - 2004. - P. I 841.

Gladchenko G.O., Blagoi Yu.P., Sorokin V.A., Valeev V.A., Andrus E.A., Karachevtsev V.A. Effect of Cd²⁺ ions on phase equilibrium in poly(rA)-poly(rU) complexes// Proceedings World Polymer Congress (MACRO). - Paris, France. - 2004. - P. I 951.

Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Andrus E.A., Karachevtsev V.A., Blagoi Yu.P. Effect of magnesium and nickel ions on stability of triple helix polyI-polyA-polyI (A2I)// Book of Abstracts 5^th International Conference on Biological Physics. - Goteborg, Sweden. - 2004. - P.78.

Сорокин В.А., Валеев В.А., Гладченко Г.О., Андрусь Е.А., Карачевцев В.А., Благой Ю.П. Конформационное равновесие polyI-polyA-polyI в растворах, содержащих ионы Ni²⁺// Тезисы Докладов I Украинской научной конференции «Проблемы биологической и медицинской физики». - Харьков, Украина. - 2004. - P. 43.

Gladchenko G.O., Blagoi Yu., Sorokin V., Valeev V., Andrus E., Karachevtsev V. Conformation transitions in polyA-polyU complexes with Cd²⁺ ions, studied by UV-VIS spectroscopy// In: XVII International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". - Beregove, Ukraine. - 2005. - P. 255-256.

Sorokin V., Andrus E., Valeev V., Gladchenko G.O., Blagoi Yu., Karachevtsev V. Comparative analysis of Ni²⁺ ion effect on conformational equilibrium of three-stranded helices A2U and A2I// In: XVII International School-Seminar "Spectroscopy of Molecules and Crystals". - Beregove, Ukraine. - 2005. - P. 258.

АНОТАЦІЯ

Андрусь О.А. Вплив іонів металів на стабільність і конформаційну рівновагу мультиланцюгових гомополінуклеотидів: polyA·polyU, polyA·2polyU і polyA·2polyI. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2009.

Проведено експериментальне дослідження комплексів іонів металів (Na⁺, Mg²⁺, Ni²⁺ і Cd²⁺) з трьохланцюговою A2I та її складовими (polyI, polyA, AMP, IMP), а також іонів Cd²⁺ с мультиланцюговими гомополінуклеотидами AU і A2U та їх складовими (polyA і polyU) у водних розчинах. Одержані диференційні ультрафіолетові спектри металокомплексів, що дозволило визначити вплив іонів на конформацію полінуклеотидів, встановити місця зв'язування йонів, а також запропонувати структуру комплексів і механізм викликаного йонами руйнування спіралей AU, A2U і A2I. Отримані діаграми конформаційної рівноваги, які характеризують стан комплексів у широкому діапазоні температур і концентрацій іонів. Виконані розрахунки констант зв'язування йонів Mg²⁺ і Ni²⁺ з polyI і A2I. Визначено значення лінійної густини негативного заряду на одноланцюговій polyI, а також отримано аналітичний вираз, згідно з яким відношення констант зв'язування йонів Mg²⁺ з трьохланцюговими та одноланцюговими полінуклеотидами визначається різницею між значеннями лінійних густин зарядів на їх поверхні.

Ключові слова: мультиланцюгові полінуклеотиди, іони металів, термостабільність, конформаційні переходи, УФ спектроскопія, термічна денатурація.

АННОТАЦИЯ

Андрусь Е.А. Влияние ионов металлов на стабильность и конформационное равновесие мультицепочечных гомополинуклеотидов: polyA·polyU, polyA·2polyU и polyA·2polyI. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина Харьков, 2009.

Проведено экспериментальное исследование комплексов ионов металлов (Na⁺, Mg²⁺, Ni²⁺ и Cd²⁺) с трехцепочечной A2I и ее составляющими (polyI, polyA, AMP, IMP), а также ионов Cd²⁺ с мультицепочечными гомополинуклеотидами AU и A2U и их составляющими (polyA и polyU) в водных растворах. В качестве экспериментальных методов применялись дифференциальная УФ-спектроскопия и термическая денатурация. Метод дифференциальной УФ-спектроскопии позволяет определять места связывания ионов металлов с полинуклеотидами путем сравнения с эталонными спектрами. Существенным его достоинством является возможность использовать широкий диапазон концентраций полинуклеотидов и ионов металлов. Метод термической денатурации - классический метод для исследования переходов спираль-клубок в полинуклеотидах. Применение этого метода позволило получить фазовые диаграммы для систем полинуклеотид-ионы металла.

...