Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 57.043:615.361.018.5.013.8

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Виділення та зберігання біологічно активної низькомолекулярної фракції (до 5 КДА) з кордової крові за допомогою низьких температур

03.00.19 - кріобіологія

Абакумова Олена Сергіївна

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Гулевський Олександр Кирилович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, завідувач відділу біохімії холодової адаптації

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, головний науковий співробітник відділу низькотемпературної консервації

доктор біологічних наук, професор, Дєдух Нінель Василівна, Інститут патології хребта та суглоба ім. М.І. Сітенка АМН України, м. Харків, завідувач лабораторії морфології сполучної тканини

Захист дисертації відбудеться 15.12.2009 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий 13.11. 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

академік НАН України,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

кордовий кров хроматографія худоба

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. На сьогоднішній день як в наукових дослідженнях, так і в практичній медицині все більш актуальним стає отримання та використання препаратів з природної сировини, що мають біостимулюючі властивості. Одним з основних етапів технології отримання таких препаратів є створення умов найбільшої екстрактивності біологічно активних речовин з біосубстрату, а також збереження їх фізико-хімічних властивостей і біологічної активності. Зі всього спектру технологій отримання біоактивних сполук з природного матеріалу одними з найбільш перспективних є кріотехнології (Фуллер Б. и др., 2003; Осецкий А.И. и др., 2006). Використання низьких температур при переробці біологічної сировини припиняє протікання обмінних процесів, сприяє більш ефективному вивільненню біологічно активних речовин в екстрагуючий розчин (Lovelock J.E., 1953; Дузу П., 1980; Белоус А.М. и др., 1985; Гулевский А.К. и др., 1988; Fuller B.J., 2004).

Одним з перспективних джерел біологічної сировини є кордова кров, яка містить у своєму складі унікальний збалансований комплекс специфічних плацентарних факторів (Broxmeyer H.E., 1995; Грищенко В.И. и др., 1997; Гольцев А.Н. и др., 1998). Беручи до уваги наявність в кордовій крові комплексу ростових факторів, цитокінів та інших біологічно активних сполук, які забезпечують швидкий ріст та диференціювання тканин, було припущено, що низькомолекулярна фракція кордової крові може мати стимулюючий вплив на клітинний метаболізм і, завдяки цьому, терапевтичну дію на перебіг репаративних процесів при травматичних або виразкових ушкодженнях сполучної тканини у модельних системах. З даних літератури можливо виявити цю активність у фракції з молекулярною вагою компонентів від 5 до 10 кДа (Machicao F. et.al., 1990; Нордвиг Б., 1995; Румянцева С.А., 2002).

Перевагами низькомолекулярної фракції є те, що технологія її отримання виключає наявність білкових та інших високомолекулярних компонентів, що мають антигенні або пірогенні властивості (Румянцева, 2002). Тому дослідження спектру дії низькомолекулярних біологічно активних компонентів кордової крові має важливе практичне значення.

Важливим досягненням кріобіології є можливість тривалого зберігання біопрепаратів за допомогою низьких температур. Перспективним методом в цьому відношенні є консервація методом ліофілізації (Пушкарь Н.С. и др., 1984; Белоус А.М. и др., 1994; Шабунин С.В. и др., 2005). На відміну від інших відомих способів зберігання біологічних об'єктів, при даному методі практично пригнічені окислювальні процеси; завдяки фіксації молекулярної структури зразка зберігаються стійкість складаючих його основу молекулярних комплексів, рівноважна електростатична взаємодія їх атомарних груп, що не тільки зберігає конформацію біомолекул, але і запобігає небажаним хімічним взаємодіям (Осецкий А.И. и др., 2006). Отже, отримання та збереження на основі кріотехнологій низькомолекулярних компонентів кордової крові забезпечить подальший прогрес в дослідженні та розробці препаратів природного походження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі біохімії холодової адаптації в рамках планової теми НДР ІПКіК НАН України «Використання низьких температур для виділення біологічно активних низькомолекулярних компонентів (менше 5 кДа) з кордової крові тварин з метою отримання ранозагоюючих препаратів» (шифр-2.2.6.21 № ДР 0105U003917).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначити метод отримання, умови тривалого зберігання та біологічну активність низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) із підданої кріодеструкції кордової крові великої рогатої худоби.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні задачі:

Розробити метод виділення фракції до 5 кДа із кордової крові великої рогатої худоби з використанням низьких температур.

Вивчити спектр низькомолекулярних компонентів фракції до 5 кДа кордової крові методом хроматографії.

Дослідити вплив фракції до 5 кДа із підданої кріодеструкції кордової крові на перебіг репаративних процесів у слизовій оболонці шлунку (СОШ) на моделі субхронічної виразки шлунку у щурів, використовуючи морфологічні та біохімічні методи.

Дослідити вплив тривалого зберігання фракції до 5 кДа в ліофілізованому стані при 4°С та в замороженому стані при -80°С на її біологічну активність.

Об'єкт дослідження - відновні процеси в слизовій оболонці шлунку після її експериментального ушкодження при використанні фракції до 5 кДа кордової крові, підданої дії низьких температур і ліофілізації.

Предмет дослідження - низькомолекулярна фракція (до 5 кДа) із кордової крові, підданої кріодеструкції, при використанні на моделі субхронічної виразки шлунку у щурів.

Методи дослідження: кріобіологічні, біохімічні, морфологічні, клініко-лабораторні та методи математичної статистики: ліофілізація; моделювання субхронічної виразки шлунку у щурів; оцінка ступеню виразкового ушкодження СОШ; гістологічне і гістохімічне дослідження стану СОШ з використанням методів світлової та лазерної скануючої мікроскопії; для виділення фракції до 5 кДа застосовували метод кріодеструкції та ультрафільтрації; спектр низькомолекулярних компонентів у фракції крові до 5 кДа визначали методом гель-проникної хроматографії; кількість лейкоцитів і еритроцитів оцінювали за загальноприйнятими клінічними методами; для вивчення біохімічних показників крові та вмісту загального гемоглобіну використовували спектрофотометричний метод.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено метод виділення та визначені умови зберігання за допомогою низьких температур і ліофілізації біологічно активної низькомолекулярної фракції із кордової крові великої рогатої худоби з молекулярною вагою компонентів до 5 кДа. Встановлена онтогенетична закономірність наявності біологічно активних регуляторних речовин в крові великої рогатої худоби: плацентарна кров має найбільшу біологічну активність у порівнянні з кров'ю молочних телят і дорослих корів.

Вперше встановлена противиразкова дія фракції до 5 кДа із підданої кріодеструкції кордової крові на моделі субхронічної виразки шлунку у щурів. Показано, що введення фракції до 5 кДа кордової крові призводить до зниження місцевої та загальної запальної реакції у експериментальних тварин, посилює метаболічну і проліферативну активність клітинних елементів сполучної тканини, що сприяє відновленню СОШ та прискоренню загоєння виразкового дефекту при експериментальному виразковому ушкодженні шлунку. Встановлено, що противиразкова активність низькомолекулярної фракції кордової крові перебільшує противиразкову активність препарату порівняння актовегіну.

Виявлена чутливість біомолекул низькомолекулярної фракції кордової крові до низькотемпературних факторів, що існують в діапазоні температур фазового переходу вода - льод. Вперше доведена можливість збереження даної фракції у ліофілізованому стані протягом 1 року, а також у замороженому стані протягом 6 місяців.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментальне обґрунтування окремих параметрів кріодеструкції, а також зберігання з використанням низьких температур низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові може бути використане для удосконалення технологічного процесу при виділенні біологічно активних компонентів з природної сировини.

Отримані результати щодо скорочення терміну загоєння виразкового ураження шлунку під дією фракції до 5 кДа кордової крові можуть бути підгрунтям для розробки нового ефективного противиразкового препарату на основі фракції до 5 кДа кордової крові.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз даних літератури, отримані результати експериментальних досліджень, проведений їхній аналіз та статистична обробка. Разом з науковим керівником проф. Гулевським О.К. дисертантом були визначені мета, задачі роботи і способи їх вирішення, обговорені результати і зроблені остаточні висновки. Роботи, опубліковані у співавторстві, відображають результати спільного планування, проведення експериментів та обговорення результатів, при цьому особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1-15] - в моделюванні субхронічного виразкового ураження шлунку у щурів, проведенні і аналізі результатів гістологічних досліджень;

у роботі [7] - в аналізі результатів гістохімічних досліджень стану СОШ;

у роботах [3-5, 12, 13] - у проведенні і аналізі результатів біохімічних досліджень;

у роботах [1, 8-15] - дослідження впливу фракції крові до 5 кДа на клінічні показники периферичної крові: рівень загального гемоглобіну, кількість еритроцитів та лейкоцитів;

у роботах [3, 4, 6, 15] - участь у спільному проведенні хроматографічних досліджень спектру низькомолекулярних компонентів фракції крові до 5 кДа.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на щорічних конференціях молодих вчених «Холод в біології і медицині» (м. Харків, 2006, 2007); I Міжнародній конференції молодих вчених «Біологія: від молекули до біосфери» (м. Харків, 2006); IV з'їзді трансплантологів України (м. Київ, 2007); XIV Російському Національному конгресі «Человек и лекарство» (м. Москва, 2007); конференції-конкурсі робіт молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології» (м. Київ, 2007); міжнародній науковій конференції молодих вчених “Modern problems of microbiology and biotechnology” (м. Одеса, 2007), III Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» (м. Львів, 2007); науковій конференції з міжнародною участю «Нові кріобіотехнології для розв'язання фундаментальних і прикладних задач медицини» (м. Харків, 2008); науково-практичній конференції «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (м. Новий Світ, 2009); І Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Біотехнологія: розробка та контроль препаратів» (м. Київ, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковані 15 наукових робіт, серед яких 7 статей у фахових наукових виданнях та 8 тез доповідей в збірках наукових праць міжнародних і національних науково-практичних конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, заключної частини, висновків і переліку цитованої літератури, який містить 220 найменувань джерел, поданих на 23 сторінках. Загальний обсяг дисертації складає 140 сторінок. Робота проілюстрована 4 таблицями і 39 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експерименти були проведені на 150 безпородних білих щурах згідно «Загальних принципів експериментів на тваринах», схвалених I Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна) і узгоджених з положеннями «Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Низькомолекулярну фракцію (до 5 кДа) отримували із підданої кріодеструкції крові великої рогатої худоби: для більшого руйнування клітинних компонентів і виділення біологічно активних речовин застосовували повільне охолодження цільної крові до -80°С в закритому контейнері об'ємом 150 мл (Шорох Д.Б., 2001) і повільне відігрівання, а також наступну інкубацію при 25°С (60 хв.), 37°С (60 хв.) і 50°С (15 хв.). Для з'ясування температурних характеристик процесу кріодеструкції крові в роботі використовувався програмний заморожувач ЗП 10. Вимірювання температури здійснювали датчиками заморожувача, один з яких реєстрував температуру в центрі контейнеру, а другий - біля стінки контейнеру. Реєстрацію та обробку результатів вимірювання проводили за допомогою ПК, використовуючи програмне забезпечення, що входило до комплекту заморожувача.

Виділення фракції з компонентами молекулярної ваги до 5 кДа із підданої кріодеструкції крові проводилось методом ультрафільтрації (Брок Т., 1987) з використанням мембранного модуля «Vivaflow-200» фірми “Sartorius” (Німеччина), який дозволяє відокремити речовини з молекулярною вагою до 5 кДа. З метою дослідження біологічної активності даної фракції в залежності від стадії онтогенезу, фракцію до 5 кДа отримували також із підданої кріодеструкції крові молочних телят (до двох місяців) і дорослих корів (2 роки).

Частину отриманої фракції піддавали ліофілізації, і зберігали при температурі 4°С протягом 1 року. Збереженість біологічної активності ліофілізованої фракції кордової крові (ЛФКК) досліджували через 6 місяців та 1 рік у порівнянні зі зберіганням фракції в замороженому стані при -80°С в низькотемпературному холодильнику (ФКК(-80°С)) протягом тих же термінів.

Спектр низькомолекулярних речовин, які містяться у фракції до 5 кДа кордової крові, крові молочних телят, корів і в препараті порівняння Актовегіні оцінювали за допомогою гель-проникної хроматографії на колонці (1,6 х 40 см), яка була заповнена полівініловим гелем Toyopeas 1HW-40 Fine (Toyo Soda, Japan), що дозволяє розділити молекули у діапазоні молекулярних мас від 0,1 до 10 кДа (Белоус А.М. и др., 1997). В якості елюєнта використовували фосфатно-сольовий буфер (Na₂HPO₄ 30 мM, NaCl 200 мM, pH 7,6). В колонку вводилися зразки фракції об'ємом 4 мг (фракції кордової крові - 0,4 мг). Відносний кількісний вміст низькомолекулярних компонентів визначали за площею під піками (h х а, де h -висота піка, а - ширина на піввисоті), віднесеною до суми площ під всіма піками.

Вивчення біологічної активності фракції проводили на експериментальній моделі субхронічної виразки шлунку у щурів (Стефанова О.В., 2001), яку моделювали за допомогою ацетилсаліцилової кислоти (Acidum acetylsalicylicum, фармакологічна субстанція). Експериментальних тварин попередньо витримували на голодній дієті протягом 24 годин без обмеження доступу до води. Кислоту вводили перорально у дозі 150 мг/кг ваги тварини п'ять разів протягом трьох діб. Експериментальні тварини були розділені на 6 груп по 6 тварин в кожній:

Група 1 - інтактні щури (норма).

Іншим тваринам після створення моделі субхронічної виразки шлунку протягом 12 діб внутрішньом'язово вводили:

Групі 2 - фізіологічний розчин (контроль);

Групі 3 - актовегін (препарат порівняння),

Групі 4 - фракцію із кордової крові (ФКК),

Групі 5 - фракцію із крові молочних телят (ФТ),

Групі 6 - фракцію із крові корів (ФК).

Дослідження противиразкової активності фракції кордової крові проводилися у порівнянні з препаратом Актовегін. Це зумовлено тим, що даний лікарський засіб є низькомолекулярним кріогемолізатом (до 5 кДа) із крові молочних телят (яка є онтогенетично близькою до кордової крові), а також, за даним літератури, має противиразкову активність та з успіхом застосовується при виразковій хворобі в клініці та експерименті (Machicao F. et.al., 1990; Nordvig B., 1995; Румянцева С.А., 2002). Дози фракції розраховувалися у відповідності до терапевтичної дози актовегіну, і вводилися із розрахунку 1,2 мг сухої ваги фракції на 100 г ваги тварини.

Для дослідження дії низькомолекулярної фракції кордової крові на загоєння виразки проводили макроскопічне вивчення слизової оболонки шлунку на 12 добу після формування виразкового ураження. Показниками важкості виразкового ураження при макроскопічному вивченні були середня площа виразок в групі, виражена в балах; відсоток тварин з виразками в групі, які дозволили розрахувати інтегральний показник противиразкової активності - виразковий індекс (ВІ), а на його основі - противиразкову активність (ПА, %). Середню площу виразкового ушкодження оцінювали за допомогою системи балів (Стефанова О.В., 2001), яка дозволяє врахувати якісно і кількісно всі види деструкції СОШ, де 0 балів - відсутність виразкових дефектів, 1 бал - наявність набряку, крововиливів, 1-3 невеликих виразок, 2 бали - більш 3 невеликих виразок чи однієї великої, 3 бали - виразка значних розмірів (діаметром до 4 мм). Виразковий індекс та противиразкову активність розраховували за формулами (Стефанова О.В., 2001):

ВІ =	(Середня площа виразкового ураження Ч % тварин з виразками в групі)
	100
ПА, % = 100 % -	ВІ групи тварин, яким вводили препарат Ч100 %
	ВІ контрольної групи

На 3, 7 і 12 добу у периферичній крові щурів визначали активність лужної фосфатази (КФ 3.1.3.1.) за гідролізом фенілфосфату; вміст ТБК-активних продуктів за методом M. Mihara (Mihara M., 1980); оцінювали вміст лейкоцитів, еритроцитів та рівень загального гемоглобіну за загальноприйнятими лабораторними методами (Меньшиков В.В., 1987).

Для гістологічних та гістохімічних дослідженнь фрагменти шлунку фіксували в 10 % розчині формаліну і заливали в парафін. Для отримання оглядових препаратів зрізи товщиною 4-5 мкм фарбували гематоксиліном Эрліха та эозином (Пірс Є., 1962; Ліллі Р., 1969) і аналізували за допомогою світлового мікроскопу. Гістохімічне дослідження в тканині ураженої СОШ вмісту глікозаміногліканів (ГАГ) проводили: гіалуронової кислоти - реакцією з N-N-діетилпсевдоізоцианіном за методом Модиш Л. (Modis L., 1974; Керн М. и др., 1985); вміст сульфатованих ГАГ (хондроітина сульфату) - реакцією з толуїдиновим синім (Modis L., 1974; Керн М. и др., 1985; Саркисов Д.С. и др., 1996). Фотографування матеріалу проводили за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопу LSM 510 МЕТА (“Carl Zeiss”).

Одержані результати обробляли статистично за допомогою комп'ютерного програмного пакету «STATGRAPHIC plus for Windows», версії 2.1, використовуючи непараметричний критерій Манна-Уітні для малих вибірок даних. Рівень вірогідності складав 0,05.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Виділення низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) із підданої кріодеструкції кордової крові і вивчення спектру її компонентів. Найбільше руйнування біологічних мембран, як відомо, відбувається при повільному охолодженні біологічної сировини в діапазоні температур кристалізації води (особливо в точці евтектики даного розчину) і рекристалізації (Fuller B.J., 2004). В роботі (Шорох Д.Б., 2001) було показано, що повільне заморожування біологічної сировини перед фракціонуванням саме до -80°С дозволило отримати кінцевий продукт з найвищою біологічною активністю. Тому в даному дослідженні для ефективного вивільнення біологічно активних компонентів застосовували кріодеструкцію крові в умовах повільного охолодження до -80°С. Ще більшому руйнуванню мембранних структур сприяло повільне відігрівання (Фуллер Б. и др., 2003) крові, а також наступна інкубація при 25°С, 37°С і 50°С для прискорення ферментативного гідролізу (Диксон М. и др., 1982). Проведені дослідження температурних характеристик процесу кріодеструкції крові показали, що процес заморожування крові в контейнері об'ємом 150 мл змінювався в діапазоні швидкостей від 5,6 - 0,3°С/хв., а процес розморожування - в діапазоні швидкостей 3,1 - 0,03°С/хв.

Оцінку біологічної активності фракції із підданої кріодеструкції кордової крові проводили на експериментальній моделі субхронічного виразкового ураження шлунку у щурів за здатністю загоювати виразкові дефекти. Використання моделі виразки, яку створювали за допомогою ацетилсаліцилової кислоти, забезпечило формування поодиноких глибоких виразок розміром 2Ч3 мм², які кровоточать, приблизно у 30 % тварин, а в інших - множинних ерозій довжиною 0,2 - 2,5 мм, які займають 1/3 - 1/2 товщини СОШ. Середня площа виразок після формування моделі у щурів контрольної групи, яких не піддавали лікувальній дії, становила 2,5 ± 0,20 балів, а виразковий індекс 2,5 (табл. 2). На 12 добу експерименту в області малої кривизни шлунку спостерігалися крововиливи, набряк, гіперемія середнього ступеню, порушення складчастості шлунку; наявність звиразкувань було знайдено у 100 % тварин, середня площа яких була 1,8 ± 0,15 балів, а виразковий індекс складав 1,8 (табл. 1).

Отримані результати щодо впливу різних умов інкубації після заморожування-відтавання кордової крові на активність отримуваної фракції показали, що інкубація крові при 50°С дозволяє отримати найбільш активну фракцію, яка при введенні експериментальним тваринам на 12 добу сприяє більш ефективному зменшенню площі виразкової поверхні (табл. 1).

Отримані за допомогою гель-проникної хроматографії спектри відображають вміст у фракції кордової крові, крові телят, корів і препараті актовегін низькомолекулярних речовин різної хімічної природи з молекулярною масою від 0,3 до 5 кДа. Порівняльний аналіз хроматографічних профілів ФКК і актовегіна дозволив виявити істотні відміни в локалізації виявлених піків і кількісному вмісту присутніх в них речовин. Експериментальні дані (рис. 1) показують, що для обох препаратів тільки 4 піка із 14 знайдених є спільними: 2, 4, 6, 7. Однак вміст речовин цих піків в ФКК і актовегіні істотно відрізняється (рис. 1А, В).

Таблиця 1. Противиразкова активність фракції (до 5 кДа), отриманої після інкубації розмороженої кордової крові при різних позитивних температурах

Умови досліду (n=6) Температура і час інкубації	Кількість тварин з виразками в групі, %	Середня площа виразок, бали	Виразковий індекс	Противиразкова активність, %
12 доба експерименту
Контроль	100	1,8 ± 0,15#	1,8	-
25°С (60 хв.)	50	0,5 ± 0,2*#	0,3	78,57
37°С (60 хв.)	66	0,7 ± 0,19*#	0,5	64,29
50°С (15 хв.)	33	0,3 ± 0,19*	0,1	92,86

Примітки: * - відмінності достовірні (р<0,05) у порівнянні з контролем, # - відмінності достовірні (р<0,05) у порівнянні з інкубацією крові при 50°С.

З рис. 1 (А) видно, що хроматографічний профіль актовегіну містить 9 основних піків. Основна частина компонентів актовегіну міститься в піку 4 (34,92 %). Проведені дослідження показали, що спектр компонентів ФТ подібний до спектру компонентів актовегіна (рис. 1А, Б).

Основну частину низькомолекулярних компонентів кордової крові (39,56 %) містить пік 7, вміст якого в актовегіні лише 4,38 % (рис. 1В). В ФКК відсутні піки 1, 9, 11, 13, 14. Ще одна особливість складу ФКК - поява нових піків 3, 5, 8, 10, 12. Є також менш істотні кількісні відміни у вмісті речовин піків 2 і 6.

Спектр низькомолекулярних складових крові корів містить 9 основних піків, але найбільше відрізняється від попередніх спектрів за формою хроматограми (рис. 1Г). Основну частину компонентів ФК містить пік 9 (36,07 %), а також пік 6 (24,90 %), вміст якого в інших спектрах низький. Пік 4 містить 3,96 % речовин, у порівнянні з актовегіном, де вміст компонентів в ньому найбільший.

Отже, маючи різний спектр компонентів, фракція кордової крові, крові молочних телят, корів і актовегін можуть по-різному впливати на перебіг репаративних процесів у модельних системах, але виявлені відмінності не виключають того, що вони мають спільний активний компонент. Крім того, отримані результати вказують на те, що склад і наявність активних речовин в низькомолекулярній фракції крові великої рогатої худоби змінюються в процесі онтогенезу.

Вплив фракції до 5 кДа із підданої кріодеструкції кордової крові на репаративні процеси в слизовій оболонці шлунку при субхронічному виразковому ураженні. Оскільки до теперішнього часу не можна ідентифікувати активний компонент актовегіну і фракції до 5 кДа кордової крові, дію низькомолекулярних фракцій вивчали за даними біологічної активності. Більш детальне вивчення терапевтичної дії фракції до 5 кДа із підданої кріодеструкції кордової крові проводили на експериментальній моделі субхронічного виразкового ураження шлунку у щурів за макроскопічними, гістологічними, гістохімічними, біохімічними і клінічними показниками. Дослідження противиразкової активності фракції кордової крові проводили у порівнянні з референс-препаратом Актовегіном, а також у порівнянні з дією фракції до 5 кДа із крові молочних телят і дорослих корів.

Макроскопічне дослідження шлунків 4 групи тварин, лікованих ФКК, показало на 12 добу практично повну відсутність виразкових дефектів (ВІ = 0,1), наявність незначної гіперемії та рідких геморагій. Колір і складчастість шлунків наближалися до аналогічних показників у інтактних тварин. Середня площа виразок становила 0,3 ± 0,19 бали, що вірогідно менше порівняно з контролем, актовегіном, ФТ і ФК (табл. 2). Виразковий індекс складав 0,1, а противиразкова активність - 92,86 %.

Таблиця 2. Противиразкова активність фракції до 5 кДа кордової крові, актовегіну, крові молочних телят та корів

Умови досліду (n=6)	Кількість тварин з виразковими ушкодженнями в групі, %	Середня площа виразок, бали	Виразковий індекс	Проти виразкова активність, %
Після створення моделі
	100	2,5 ± 0,20	2,5	-
12 доба експерименту
Контроль	100	1,8 ± 0,15#	1,8	-
актовегін	50	0,5 ± 0,2*	0,3	78,57
Фракція кордової крові	33	0,3 ± 0,19* #	0,1	92,86
Фракція крові молочних телят	83	1,0 ± 0,24*#	0,8	42,86
Фракція крові корів	100	1,8 ± 0,15#	1,8	-

Примітки: * - відмінності достовірні (р<0,05) у порівнянні з контролем, # - відмінності достовірні (р<0,05) у порівнянні з актовегіном.

Дослідження шлунків 3 і 5 групи тварин, якій вводили препарат порівняння актовегін та ФТ, показало на 12 добу значно меншу виразність виразкового процесу: геморагій було небагато, вони були невеликі, спостерігалася незначна гіперемія, колір і складчастість шлунків наближалися до аналогічних показників у інтактних тварин (ВІ = 0,3 та 0,8 відповідно) (табл. 2). Середня площа виразок після введення актовегіну становила 0,5 ± 0,20 бали (що достовірно менше порівняно з контролем і достовірно більше порівняно з групою після введення ФКК), а після введення ФТ - 1,0 ± 0,24 бали (що вірогідно менше порівняно з контролем) (табл. 2). Противиразкова активність складала 78,57 % та 42,86 % відповідно.

При дослідженні шлунків щурів групи 6, якій вводили ФК, відмічалися такі ж явища, як і при введенні фізіологічного розчину в контрольній групі (табл. 2).

Гістологічний і гістохімічний аналіз препаратів шлунку показав, що на 12 добу експерименту в групах 2 (контроль) і 6 (ФК) спостерігались множинні ерозії довжиною 0,2 - 2,5 мм, що займали 1/3 - 1/2 товщини СОШ, в одиничних випадках

досягали власної мязової пластинки, скорочення залоз, порушення їх структури до атрофії, пікноз ядер епітеліальних клітин, просвіти гемокапілярів заповнені гіперагрегатами еритроцитів, значна запальна реакція та істотне зменшення кількості «+» сумарних ГАГ (гіалуронової кислоти та хондроітина сульфату), що вказує на перевагу деструктивних процесів над репаративними.

В групі 4 після введення ФКК, відмічалися відновлення товщини і структури залозистого шару, незначні пошкодження поверхнево - ямкового епітелію, наявність всіх типів спеціалізованих клітін в головних залозах, присутність великої кількості кровоносних судин та клітин фібробластичного ряду, що проліферують. В цей строк спостерігалася інтенсивна «++++» реакція на сумарні ГАГ, що також вказує на інтенсивність перебігу репаративно-відновлюваних процесів в ураженій СОШ. Це свідчить про пригнічення перебігу виразкового ураження шлунку, спричиненого аспірином, під дією фракції кордової крові.

Гістологічне і гістохімічне відновлення тканинних структур після використання актовегіну (група 3) та ФТ (група 5) відбувалося швидше, ніж після введення ФК (група 6) і фізіологічного розчину (група 6), але було менш виразним, ніж у тварин, яким вводили ФКК (група 4).

Процеси вільно-радикального окислення (ВРО), за сучасними уявленнями, відіграють важливу роль в патогенезі виразкової хвороби (Скрипник І.М., 2001; Шеремета Л.М., 2007; Кучеренко М.Є. та ін., 2007). Вільні радикали, що утворюються, і продукти ПОЛ гальмують процеси проліферації в клітинах покривно-ямкового епітелію СОШ, що є однією з причин зниження її репаративних можливостей.

В результаті проведених досліджень встановлено, що формування моделі виразкового ураження СОШ супроводжується підсиленням процесів ВРО, що виражалося в достовірному (Р<0,05) підвищенні вмісту ТБК-активних продуктів в сироватці периферичної крові в групі контрольних тварин вже на 3 добу, яке на 7 добу досягало 47,2 ± 0,4 мкмоль/л в порівнянні з нормою 19,7 ± 0,9 мкмоль/л (рис. 2). Нормалізації даного показника в контрольній групі тварин до завершення експерименту не спостерігалося. Аналогічна динаміка вмісту ТБК-активних продуктів спостерігалася в 6-ій групі (ФК) (рис. 2).

Після введення тваринам з виразкою актовегіну та ФТ вміст ТБК-активних продуктів достовірно (Р<0,05) знижувався в порівнянні з контролем і ФК на 12 добу і становив 23,4 ± 0,3 мкмоль/л та 25,0 ± 0,2 мкмоль/л відповідно (рис. 2).

Нормалізація вмісту ТБК-активних продуктів була відмічена тільки після введення ФКК на 12 добу експерименту (рис. 2). Можливо, це пов'язано з тим, що кордова кров володіє підвищеним вмістом речовин, які беруть участь в антиоксидантному захисті (Ballin A. et.al., 1995).

Ще одним важливим параметром, що змінюється при виразковій хворобі і відображає розвиток в організмі запального процесу, є активність лужної фосфатази (ЛФ). Відомо, що підвищення активності ЛФ при виразковій хворобі шлунку відображає поширеність запального процесу, а динаміка активності ферменту дає уявлення про перебіг хвороби (Шубич М.Г. и др., 1980). Оскільки ЛФ ефективно бере участь в енергетичних процесах клітини, підвищення активності даного ферменту свідчить про інтенсифікацію внутрішньоклітинних метаболічних процесів і накопичення ферментного білку, що витрачається в процесі фагоцитозу.

Вивчення активності ЛФ після формування субхронічної виразки шлунку в контрольній групі тварин показало достовірне (Р<0,05) її підвищення на 3 добу в 1,6 разів порівняно зі значенням норми (рис. 3). Зниження активності ферменту до 489,5 ± 11,0 О/л у порівнянні з нормою (350,4 ± 5,0 О/л) відбувалося на 12 добу дослідження. Аналогічна динаміка активності ЛФ спостерігалася в 6-ій експериментальній групі, який вводили фракцію крові корів. Нормалізація активності ферменту була відмічена на 12 добу експерименту після введення ФКК і актовегіну (рис. 3). Отже, введення актовегіну і ФКК сприяє зниженню запальної реакції в слизовій оболонці шлунку.

Після встановлення позитивного впливу фракції кордової крові на загоєння виразкового ураження шлунку доцільно було оцінити загальний стан організму експериментальних тварин за допомогою стандартних лабораторних показників: рівня гемоглобіну, кількості еритроцитів та лейкоцитів у периферичній крові. Виразкове ураження шлунку приводило до різкого зниження рівня гемоглобіну і кількості еритроцитів, які на 7 добу експерименту були на 29,0 % та на 27,6 % відповідно нижчими за норму. До кінця строку експерименту (12 діб) не відмічалося нормалізації даних показників. Використання ФКК приводило до швидкого відновлення еритропоезу: вже на 3 добу спостерігалася нормалізація вмісту еритроцитів і рівня гемоглобіну. Після введення актовегіну на 12 добу відмічалася нормалізація даних показників, а після введення ФТ - достовірне їх підвищення у порівнянні з контролем. При використанні ФК динаміка гематологічних показників не відрізнялася від контрольної групи після введення фізіологічного розчину.

Внаслідок виразкоутворення в периферичній крові щурів був лейкоцитоз, який спостерігався на протязі всього експерименту. Застосування актовегіну приводило до нормалізації даного показника на 3 добу, а ФКК - 12 добу експерименту, чого не визначалось в інших групах тварин.

Отже, введення ФКК експериментальним тваринам позитивно впливає на досліджувані показники периферичної крові, що може вказувати на дію фракції на рівні цілісного організму. Таким чином, отримані результати дозволяють вважати, що ФКК стимулює процеси кровотворення, можливо активуючи киснезалежний шлях утворення енергії, що сприяє зниженню запалювальних процесів і відновленню слизової оболонки шлунку в більш коротші терміни у порівнянні з контрольною групою тварин.

Вплив низькотемпературного зберігання та ліофілізації на біологічну активність фракції до 5 кДа кордової крові. Вплив тривалого зберігання фракції кордової крові у ліофілізованому стані при 4°С на її біологічну активність вивчали у порівняльному аспекті з низькотемпературним зберіганням при -80°С за такими показниками, як середня площа виразкового ушкодження, вміст ТБК-активних продуктів та активність лужної фосфатази в периферичній крові тварин.

Показано, що як введення нативної фракції, яку безпосередньо після отримання поміщували в низькотемпературний холодильник (-80°С), так і фракції одразу після ліофілізації, однаково ефективно зменшує середню площу виразкового ушкодження, призводить до нормалізації вмісту ТБК-активних продуктів (рис. 4) та активності ЛФ (рис. 5) в периферичній крові тварин, чого не спостерігається в контролі.

Встановлено, що зберігання ЛФКК протягом 6 місяців при 4°С не впливало на її біологічну активність. Макроскопічне вивчення шлунків тварин показало на 12 добу спостереження, що середня площа виразок становила 0,3 ± 0,19 бали, що не відрізнялося від результатів введення ЛФКК одразу після ліофільної сушки. Також була встановлена нормалізація вмісту ТБК-активних продуктів (рис. 4) та активності ЛФ (рис. 5).

Після введення ЛФКК, що зберігалася протягом 1 року при 4°С, середня площа виразок не відрізнялася від результатів після введення ЛФКК, яка зберігалася 6 місяців. Незначні зміни у порівнянні з попередніми результатами відмічалися у вмісті ТБК-активних продуктів (рис. 4) та активності ЛФ (рис. 5).

Після введення фракції кордової крові, яку зберігали в замороженому стані при -80°С, спостерігалася декілька інша картина.

Введення експериментальним тваринам ФКК(-80°С), що зберігалася протягом 6 місяців, показало при макроскопічному дослідженні шлунків на 12 добу, що середня площа виразок не відрізнялася від результатів введення фракції одразу після отримання. При вивченні вмісту ТБК-активних продуктів (рис. 4) та активності ЛФ (рис. 5), не спостерігалося їх нормалізації, однак відмічалася позитивна динаміка, що виражалося у вірогідному (Р<0,05) зниженні даних показників у порівнянні з контролем.

Однак, суттєві зміни у дії ФКК(-80°С) були відмічені після зберігання її протягом 1 року. Після введення даної фракції середня площа виразок складала 0,5 ± 0,18 балів, що вірогідно більше у порівнянні з введенням фракції, яка зберігалася 6 місяців. Вміст ТБК-активних продуктів також був вірогідно (Р<0,05) більшим у порівнянні з результатами після 6 місяців зберігання. Вірогідних змін активності ЛФ від попередніх результатів не спостерігалося.

Проведені дослідження показали, що зберігання фракції в ліофілізованому стані при 4°С протягом 1 року не впливає на її здатність зменшувати площу виразкового ушкодження, у порівнянні зі зберіганням фракції в замороженому стані при -80°С, що зберігає дані властивості протягом 6 місяців.

Зберігання ЛФКК протягом 6 місяців не впливало на її здатність нормалізувати вміст ТБК-активних продуктів (рис. 4) і активність ЛФ (рис. 5) в периферичній крові тварин, на відміну від зберігання ФКК протягом даного терміну в замороженому стані при -80°С. Зберігання фракції як у ліофілізованому стані при 4°С, так і в замороженому при -80°С протягом 1 року приводило до зниження її здатності нормалізувати вміст ТБК-активних продуктів і активність ЛФ в периферичній крові тварин. В обох випадках відмічалася позитивна динаміка даних показників, що виражалося у вірогідному (Р<0,05) зниженні продуктів ПОЛ і активності ферменту в порівнянні з контролем. Однак, як вміст ТБК-активних продуктів (рис. 4), так і активність ЛФ (рис. 5), після введення ЛФКК були достовірно (Р<0,05) нижчими у порівнянні з застосуванням ФКК(-80°С). Отже, введення ліофілізованої фракції кордової крові після всіх досліджуваних строків зберігання скоріше нормалізує процеси ПОЛ і активність ЛФ в периферичній крові тварин, що сприяє скорішому зниженню запальної реакції в слизовій оболонці шлунку, і, внаслідок цього, її відновленню в більш ранні терміни експерименту.

Таким чином, сублімаційне консервування є більш ефективним методом низькотемпературного зберігання фракції до 5 кДа кордової крові, оскільки дозволяє в більшому ступені зберегти її біологічну активність. Зберігання фракції в замороженому стані при -80°С можливо протягом 6 місяців, оскільки зберігання протягом 1 року знижує її біологічну активність.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової проблеми, яка стосується використання кріотехнологій для отримання і зберігання низькомолекулярної біологічно активної фракції із кордової крові тварин, а також доцільності її використання для стимуляції репаративних процесів в слизовій оболонці шлунку після субхронічного виразкового ураження.

1. Встановлено, що застосування кріодеструкції кордової крові з використанням одноразового циклу повільного заморожування-відтавання на першому етапі технологічного процесу та ультрафільтрації на другому дозволяє екстрагувати з даної природної сировини низькомолекулярну фракцію (до 5 кДа), біологічна активність якої перевищує біологічну активність препарату порівняння актовегіну.

2. Встановлено, що фракція до 5 кДа, отримана із підданої кріодеструкції кордової крові, володіє противиразковою дією на моделі субхронічної виразки шлунку. Використання ФКК сприяє достовірному зниженню площі виразкового ураження, яке корелює з відновленням мікроциркуляції, товщини та структури залозистого шару на фоні зниження рівня лейкоцитарної інфільтрації ушкоджених тканин, стимуляцією синтезу глікозаміногліканів, що веде до скорочення строків відновлення слизової оболонки шлунку і в більш ранні терміни у порівнянні з референс-препаратом актовегіном.

3. Повнота і швидкість відновлення ушкодженої слизової оболонки шлунку залежить від стадії онтогенезу, на якій отримували низькомолекулярні фракції із крові тварин, і знижуються в ряду: фракція із кордової крові > фракція із крові молочних телят > фракція із крові дорослих корів (остання не має противиразкової дії). Встановлено, що спектр компонентів (до 5 кДа) ФКК якісно і кількісно відрізняється від спектру компонентів актовегіну, фракції із крові телят і корів.

4. Введення ФКК тваринам з виразкою сприяє нормалізації вмісту ТБК-активних продуктів та активності лужної фосфатази в периферичній крові, що свідчить про протизапалювальну дію фракції кордової крові.

5. Застосування ФКК у тварин з виразковим ураженням шлунку призводить до нормалізації таких клінічних показників периферичної крові, як рівень гемоглобіну, кількість еритроцитів та лейкоцитів.

6. Проведені дослідження показали, що ліофілізація та заморожування до -80°С нативної фракції кордової крові не знижує її противиразкової активності. Виявлена доцільність зберігання фракції в ліофілізованому стані через практично повну схоронність її біологічних властивостей протягом 1 року. Після введення ліофілізованої фракції кордової крові даного терміну зберігання спостерігалося скоріше зниження площі виразкового ураження, нормалізація вмісту продуктів ПОЛ і активності лужної фосфатази в периферичній крові щурів у порівнянні з введенням фракції, яка зберігалася при -80°С. Зберігання фракції в замороженому стані при -80°С можливо протягом 6 місяців, оскільки зберігання протягом 1 року знижує ії біологічну активність.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Гулевский А.К. Перспективы применения низкомолекулярной фракции кордовой крови в лечении язвенной болезни желудка / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова // Трансплантологія. - Т. 9, № 1. - 2007. - С.63 - 65.

2.Эффект стимуляции репаративных процессов под влиянием фракции до 5 кДа из пуповинно-плацентарной крови крупного рогатого скота / А.К. Гулевский, В.И. Грищенко, Н.Н. Моисеева, Е.С. Абакумова, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, О.Л. Долгих // Доповіді Національної Академії Наук України. - № 2. - 2008. - С. 157 - 160.

3.Влияние фракции кордовой крови (до 5 кДа) крупного рогатого скота на биохимические показатели крови при экспериментальной субхронической язве желудка у крыс / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Долгих // Український біохімічний журнал. - 2008. - Т. 80, № 2. - С. 120 - 126.

4.Исследование биологической активности фракции до 5 кДа из криогемолизата крови крупного рогатого скота / А.К. Гулевский, Н.Н. Моисеева, Е.С. Абакумова, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, О.Л. Горина, А.В. Трифонова, Е.Г. Иванов // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18, № 4. - С. 531-534.

5.Гулевський О.К. Вплив низькотемпературного зберігання та ліофілізації на біологічну активність фракції до 5 кДа кордової крові корів / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова // Бюл. «Ветеринарна біотехнологія». - 2009. - № 15. - С. 79-83.

6.Гулевський О.К. Вивчення противиразкової активності низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) крові великої рогатої худоби в залежності від стадії онтогенезу / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова, Н.М. Моісєєва // Клінічна фармація. - 2009. - Т. 13, № 2. - С. 54-58.

7.Гулевський О.К. Вплив низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) кордової крові на морфологічні показники слизової оболонки шлунку щурів при експериментальній субхронічній виразці / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова // Вісник проблем біології і медицини. - 2009. - Вип. 2. - С.158 - 163.

8.Изучение язвозаживляющего действия низкомолекулярной фракции (меньше 5 кДа), выделенной из крови молочных телят, на модели хронической язвы желудка у крыс / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Долгих // Проблемы криобиологии. - 2006.- Т. 16, № 4. - С. 438.

9.Изучение противоязвенного действия фракций до 5 кДа крови молочных телят и кордовой крови на модели хронической язвы желудка у крыс / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева, О.Л. Долгих // I Міжнародна конференція молодих вчених [“Біологія: від молекули до біосфери”]: Тези доп. - Харків, 2006. - С. 59.

10.Противиразкова дія ліофілізованої фракції до 5 кДа кордової крові / О.К. Гулевський, О.С. Абакумова, Н.М. Моісєєва, О.Л. Долгіх // Збірник тез III Міжнародної наукової конференції молодих вчених [“Молодь та поступ в біології”]. - Львів, 2007. - С.463 - 464.

11.Woundhealing and antiulcer activity of lactescent calf, cow and cord blood fractions less than 5 kDa / A.K. Gulevsky, Ye.S. Abakumova, N.N. Moiseeva, O.L. Dolgich // Book of abstract of the young scientists' international scientific conference [«Modern problems of microbiology and biotechnology»]. - Odessa, 2007. - P.134.

12.Гулевский А.К. Противиразкова дія фракції до 5 кДа кордової крові / А.К. Гулевский, Е.С. Абакумова // Український біохімічний журнал. - Т. 79, №4. - 2007. - С. 115.

13.Абакумова Е.С. Противоязвенная активность фракции до 5 кДа, полученной из криогемолизата кордовой крови, на модели субхронической язвы желудка у крыс / Е.С. Абакумова, Н.Н. Моисеева // Проблемы криобиологии. - Т. 17, № 2. - 2007. - С. 194.

14.Биологическая активность фракции до 5 кДа кордовой крови / А.К. Гулевский, Н.Н. Моисеева, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, Е.С. Абакумова // XIV Российский Национальный конгресс [«Человек и лекарство»]: Сб. Материалов конгресса. - Москва, 2007. - С. 814.

15.Гулевский А.К. Изучение свойств биологически активных веществ низкомолекулярных фракций до 5 кДа из крови крупного рогатого скота / А.К. Гулевский, Н.Н. Моисеева, А.Ю. Никольченко, И.И. Щенявский, Е.С. Абакумова, О.Л. Горина, Е.Г. Иванов // Научно-практическая конференция [«Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения»]: Тезисы докладов. - Новый Свет, 2009. - С. 291.

АНОТАЦІЯ

Абакумова О.С. Виділення та зберігання біологічно активної низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) з кордової крові за допомогою низьких температур - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2009.

Дисертаційна робота присвячена виділенню та зберіганню на основі кріотехнологій низькомолекулярної фракції (до 5 кДа) із кордової крові корів (ФКК), а також з'ясуванню її впливу на перебіг репаративних процесів при експериментальному субхронічному виразковому ураженні шлунку у щурів.

Виділення фракції крові до 5 кДа здійснювали методом ультрафільтрації із підданої кріодеструкції кордової крові. Хроматографічні дослідження показали, що спектр низькомолекулярних речовин ФКК відрізняється від спектру компонентів препарату порівняння актовегіну.

Встановлено, що ФКК має противиразкову активність на моделі субхронічної виразки шлунку. Використання ФКК сприяло достовірному зниженню площі виразкового ураження, відновленню мікроциркуляції, товщини та структури залозистого шару на фоні зниження рівня лейкоцитарної інфільтрації ушкоджених тканин, стимулювало синтез глікозаміногліканів, що вело до відновлення слизової оболонки шлунку в більш ранні терміни у порівнянні з референт - препаратом актовегіном. Введення ФКК тваринам з виразкою приводило до швидкої нормалізації біохімічних (вміст ТБК-активних продуктів та активність лужної фосфатази) та клінічних показників периферичної крові (рівня гемоглобіну, кількості еритроцитів та лейкоцитів).

Показана можливість зберігання ФКК в ліофілізованому стані через практично повну схоронність її біологічних властивостей протягом 1 року, і у замороженому стані при -80°С протягом 6 місяців.

Ключові слова: кордова кров, кріодеструкція, низькомолекулярна фракція до 5 кДа, субхронічна виразка шлунку, противиразкова активність, відновлювані процеси, низькотемпературне зберігання, ліофілізація.

АННОТАЦИЯ

Абакумова Е.С. Выделение и хранение биологически активной низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) из кордовой крови с помощью низких температур - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2009.

Диссертационная работа посвящена выделению и сохранению на основе криотехнологий низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) из кордовой крови коров (ФКК), а также оценке ее влияния на течение репаративных процессов при экспериментальном субхроническом язвенном поражении желудка у крыс. В задачи исследования входило: разработать метод выделения фракции до 5 кДа из кордовой крови коров с использованием низких температур; изучить спектр низкомолекулярных компонентов ФКК методом хроматографии; исследовать влияние ФКК на течение репаративных процессов в слизистой оболочке желудка на модели субхронической язвы желудка у крыс, используя морфологические и биохимические методы; изучить влияние длительного хранения ФКК в лиофилизированном состоянии при 4°С и в замороженном состоянии при -80°С на ее биологическую активность.

Фракцию до 5 кДа выделяли методом ультрафильтрации из подвергнутой криодеструкции кордовой крови, а также из крови молочных телят и коров. Было показано, что спектр низкомолекулярных компонентов (до 5 кДа) ФКК отличается от спектра компонентов фракции крови телят, коров и препарата актовегин.

Введение ФКК при субхроническом язвенном поражении желудка способствовало снижению площади язвенного поражения, восстановлению микроциркуляции, толщины та структуры железистого слоя на фоне снижения уровня лейкоцитарной инфильтрации поврежденных тканей, стимулировало синтез гликозаминогликанов, что вело к сокращению срока восстановления слизистой оболочки желудка и в более ранние сроки по сравнению с референс - препаратом актовегином. Было показано, что полнота и скорость восстановления поврежденной слизистой оболочки желудка зависит от стадии онтогенеза, на которой выделяли низкомолекулярную фракцию из крови животных, и снижается в ряду: фракция из кордовой крови > фракция из крови молочных телят > фракция из крови взрослых коров (последняя не имеет противоязвенной активности).

Введение ФКК животным с язвенным поражением приводило к быстрой нормализации показателей периферической крови (уровня гемоглобина, количества эритроцитов и лейкоцитов), а также содержания ТБК-активных продуктов и активности щелочной фосфатазы.

Результаты, полученные при изучении влияния лиофилизации и низкотемпературного хранения на биологическую активность ФКК, выявили возможность ее хранения в лиофилизированном состоянии при 4°С на протяжении 1 года и в замороженном состоянии при -80°С на протяжении 6 месяцев. Проведенные исследования показали, что хранение ФКК в лиофилизированном виде в течение 1 года практически полностью сохраняет ее биологические свойства, что выражается в более быстром снижении площади язвенного поражения, нормализации содержания продуктов ПОЛ и активности щелочной фосфатазы в периферической крови животных по сравнению с введением фракции, которая хранилась при -80°С.

...