Акумуляція та вивільнення глутамату нервовими терміналями головного мозку щурів
Аналіз препаратів ізольованих нервових терміналей, одержаних з підконтрольних тварин, що зазнали впливу гіпергравітаційного навантаження. Вивільнення нейромедіатора і глутамату з нервових терміналей шляхом екзоцитозу, накопичення нейромедіатора у мозку.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 30.07.2015 |
| Размер файла | 373,1 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ О.В. ПАЛЛАДІНА
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
03.00.04 - біохімія
АКУМУЛЯЦІЯ ТА ВИВІЛЬНЕННЯ ГЛУТАМАТУ НЕРВОВИМИ ТЕРМІНАЛЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУРІВ
Виконала Крисанова Наталія Валеріївна
Київ 2011
АНОТАЦІЯ
Крисанова Н.В. Акумуляція та вивільнення глутамату нервовими терміналями головного мозку щурів. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. ? Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2011
Дисертацію присвячено дослідженню ключових пресинаптичних процесів, що лежать в основі глутаматергічної нейротрансмісії, за умов зміненої гравітації. Проведено порівняльний аналіз структурних (розмір і гранулярність) та функціональних (потенціал плазматичної мембрани та закисленість синаптичних везикул) характеристик нервових терміналей, виділених з головного мозку контрольних тварин та тварин, що зазнали впливу гіпергравітаційного навантаження в краніо-каудальному напрямку. Після впливу гіпергравітаційного навантаження встановлено зміни різної направленості в стимульованому деполяризацією вивільненні нейромедіатора шляхом екзоцитозу, Na+-залежному накопиченні глутамату та вивільненні нейромедіатора з цитозольного пулу нервових терміналей.
На основі одержаних результатів зроблено висновок про перерозподіл нейромедіатора між везикулярним та цитозольним пулами та обернення роботи глутаматних транспортерів, що характерно для гіпоксичного ураження нейронів. Виявлені зміни основних характеристик процесу глутаматергічної передачі можуть розглядатися як передумови розвитку функціональних порушень у нервовій системі під час гравітаційних перевантажень.
Ключові слова: глутамат, екзоцитоз, транспортери глутамата, нервові терміналі головного мозку, гіпергравітація.
нервовій терміналі глутамат екзоцитоз
1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Гравітація є одним з факторів навколишнього середовища, що в ході еволюції мав значний вплив на формування багатьох систем організму тварин, таких як опорно-рухова, серцево-судинна, нервова та інші. В той же час гравітаційне навантаження залишається практично незмінним не лише протягом життя тварини, але і впродовж тривалого еволюційного періоду, що обумовлює відсутність механізмів адаптації до різких змін гравітації. Однак з розвитком технічного прогресу, зокрема авіаційної та космічної галузі, людина все частіше зазнає впливу зміненої гравітації. Сьогодні існує чимало підтверджень того, що перебування в умовах зміненої гравітації супроводжується розладами в різних системах організму, зокрема, призводить до широкого діапазону змін в нервовій системі як морфологічних, так і функціональних [Rahmann H. et al., 1992; Manzey D. et al., 1998; Santucci D. et al., 2002; Bloogg S. et al., 2006]. Характерною рисою останніх є порушення в процесах сприйняття та обробки інформації, які тісно пов'язані з глутаматергічною нейротрансмісією.
L-глутамат є одним з основних медіаторів збуджуючих сигналів у центральній нервовій системі тварин, який відіграє значну роль в реалізації багатьох функцій мозку, зокрема в розпізнаванні, навчанні та пам'яті [Fonnum F. 1984]. Тканина мозку містить значну кількість глутамату - близько 10 мМ, переважна більшість амінокислоти знаходиться в астроцитах та нейронах, де нейромедіатор міститься у двох пулах ? синаптичних везикулах та цитозолі. Концентрація глутамату в позаклітинній рідині не перевищує 1 мкМ, а тривале її підвищення може призвести до розвитку глутаматної нейротоксичності, що виникає внаслідок хронічної надмірної стимуляції рецепторів та спричинює загибель нейронів [Choi D. 1992; Zhang Y., Bhavnani B. 2006]. Позаклітинна концентрація глутамату встановлюється в результаті перебігу двох різнонаправлених процесів: вивільнення та накопичення. Вивільнення нейромедіатора відбувається двома шляхами: з синаптичних везикул внаслідок екзоцитозу та з цитозолю за участю транспортерів плазматичної мембрани. Єдиним шляхом швидкого видалення нейромедіатора з позаклітинної рідини є його поглинання клітинами, що здійснюється високоафінними Na+-залежними глутаматними транспортерами. Порушення балансу між процесами вивільнення та накопичення нейромедіатора виникають при деяких фізіологічних та патологічних станах або під впливом різних фізичних чинників і можуть бути пов'язані з патогенезом низки нейрологічних захворювань.
Вивчення медико-біологічних наслідків дії зміненої гравітації на здоров'я людини завжди привертало увагу багатьох дослідників і сьогодні залишається надзвичайно актуальним. Але більшість подібних досліджень носить морфологічний характер, і лише незначна кількість робіт присвячена безпосередньому вивченню змін механізму нейросекреції. Більш того, роботи з аналізу впливу зміненої гравітації на глутаматергічну трансмісію взагалі відсутні. Дослідження механізмів регуляції активного транспорту глутамату за умов зміненої гравітації є важливим та актуальним, має суттєве теоретичне і прикладне значення та створює біохімічну основу для вирішення проблеми попередження та корекції нейрологічних розладів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках бюджетних тем відділу нейрохімії Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України: «Дослідити регуляторні механізми процесу нейросекреції» (1999-2003, ДР № 0199U000269); «Дослідження механізмів регуляції процесів вивільнення та активного транспорту нейромедіаторів» (2004-2008, ДР № 0104U003277); «Механізми регуляції та шляхи модуляції процесів вивільнення та активного трансмембранного транспорту нейромедіаторів у пресинапсі за умов норми та розвитку нейропатології» (2009-2013, ДР № 0109V002777); а також в рамках Національної космічної програми України (1998-2002) та (2003-2007) за науковими проектами та контрактом з Інститутом ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України (1998-2008), де дисертант була головним виконавцем у 2008 році, та в рамках гранта НАСА-УНТЦ «Вивчення впливу мікрогравітації і гіпергравітації на процес передачі нервового імпульсу і властивості біологічних мембран» (NN-06(R), 2002-2003).
Мета і завдання роботи. Метою роботи було дослідити ключові пресинаптичні процеси, що лежать в основі глутаматергічної нейротрансмісії, зокрема Na+-залежний транспорт глутамату крізь плазматичну мембрану нервових терміналей та вивільнення нейромедіатора шляхом екзоцитозу за умов зміненої гравітації.
Відповідно до вказаної мети було поставлено такі завдання:
- Провести порівняльний аналіз препаратів ізольованих нервових терміналей, одержаних з контрольних тварин та тварин, що зазнали впливу гіпергравітаційного навантаження.
- Оцінити стимульоване деполяризацією вивільнення глутамату з нервових терміналей шляхом екзоцитозу після гіпергравітаційного навантаження.
- Дослідити процес Na+-залежного накопичення нейромедіатора нервовими терміналями після гіпергравітаційного навантаження.
- Дослідити процеси вивільнення нейромедіатора з цитозольного пулу нервових терміналей після гіпергравітаційного навантаження.
Об'єкт дослідження - системи транспорту глутамату в ізольованих нервових терміналях головного мозку щурів (синаптосомах).
Предмет дослідження - зміни транспорту глутамату в синаптосомах за умов гіпергравітації.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено транспорт глутамату в пресинапсі за умов гіпергравітації. Отримано нові дані щодо змін процесів накопичення та вивільнення основного збуджуючого нейромедіатора глутамату нервовими терміналями при дії гіпергравітаційного навантаження. Із застосуванням різних методичних підходів показано, що після гіпергравітаційного навантаження в нервових терміналях відбуваються:
- зміни мембранного потенціалу, активності Na+/K+-АТPази та протонного градієнта синаптичних везикул;
- зниження стимульованого деполяризацією вивільнення нейромедіатора шляхом екзоцитозу, яке, найімовірніше, відбувається за рахунок зменшення акумуляції глутамату синаптичними везикулами;
- зменшення максимальної швидкості захвату глутамату Na+-залежними високоафінними транспортерами глутамату та підвищення їх чутливості до дії специфічних конкурентних інгібіторів;
- збільшення стимульованого деполяризацією вивільнення глутамату з цитозольного пулу.
На основі отриманих результатів показано перерозподіл нейромедіатора між везикулярним та цитозольним пулами та обернення роботи глутаматних транспортерів, що характерно для гіпоксичного ураження нейронів. Виявлені зміни основних характеристик процесу глутаматергічної передачі можуть розглядатися як передумови розвитку функціональних порушень у нервовій системі під час гравітаційних перевантажень.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані дозво-ляють поглибити розуміння основних механізмів синаптичної передачі та нейрохімічних основ синаптичної пластичності, тому мають важливе фундаментальне значення. У той же час результати роботи становлять прикладний інтерес, особливо в галузі охорони здоров'я людини, оскільки стосуються вирішення такої актуальної проблеми сучасної медицини та фармакології, як регуляція процесів глутаматергічної нейропередачі, зокрема роботи транспортерів глутамату, які останнім часом розглядаються як перспективні мішені для фармакологічної корекції низки неврологічних розладів. Результати роботи можуть бути використані при створенні фармакологічних препаратів для попередження та усунення функціональних порушень у нервовій системі під час гравітаційних перевантажень.
Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором проаналізовано наукову літературу за темою дослідження. Дисертантом разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано адекватні методи вирішення поставлених завдань. Дисертантом особисто проведено роботу з експериментальними тваринами, основний обсяг експериментальної роботи дисертантом здійснено власноручно або за безпосередньої його участі. Експерименти з визначення злиття мембран у безклітинній системі проведено разом із старшим науковим співробітником відділу нейрохімії І.О. Трикаш. Аналіз і обговорення результатів проведено спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовано за безпосередньої участі автора.
Апробація результатів дисертації. Основні матеріали роботи доповідалися і були представлені на 17 вітчизняних та міжнародних конференціях, конгресах та з'їздах: літній школі «Pharmacology of synaptic transmission in the nervous system» (Київ, Україна, 2002); Конференції “Life in Space for Life on Earth” (Стокгольм, Швеція, 2002); 4-й Парнасівській конференції (Вроцлав, Польща, 2002); 2-й Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Крим, Україна, 2002); 3-й Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Крим, Україна, 2003); Міжнародному конгресі Європейської асоціації з низької гравітації (Санторіні, Греція, 2005); 5-й Парнасівській конференції (Київ, Україна, 2005); 31-му Конгресі ФЕБС (Стамбул, Туреччина, 2006); 36-му Міжнародному конгресі COSPAR (Пекін, Китай, 2006); 6-й Парнасівській конференції (Краків, Польща, 2007); Конференції “Life in Space for Life on Earth” (Анжу, Франція, 2008); 37-му Міжнародному конгресі COSPAR (Монреаль, Канада, 2008); 17-му Симпозіумі Міжнародної Академії Астронавтики (Москва, Росія 2009); Міжнародному конгресі Європейської асоціації з низької гравітації (Бонн, Німеччина, 2009); 7-й Парнасівській конференції (Ялта, Україна, 2009); 38-му Міжнародному конгресі COSPAR (Бремен, Німеччина, 2010); 10-му Українському біохімічному з"їзді (Одеса, Україна, 2010).
2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. У розділі висвітлено сучасні уявлення про процес передачі нервового імпульсу, структуру та функціонування високоафінних Na+-залежних транспортерів глутамату, екзоцитоз синаптичних везикул. Особливу увагу приділено порушенню активного транспорту глутамату при нейропатологіях, розглянуто зміни функціонування нервової системи за умов мікро- та гіпергравітації.
Матеріали та методи. Моделювання впливу гіпергравітації (ГГ) (10g протягом 60 хв) на тварин (статевозрілих щурів-самців лінії Wistar вагою 100-120 г) в краніо-каудальному напрямку проводили на спеціально сконструйованій центрифузі діаметром 5,5 м. Контрольні тварини перебували в умовах нормальної гравітації (НГ), та були розташовані поблизу центрифуги, і зазнавали впливу шумових та вібраційних факторів, присутніх під час ГГ. Експерименти на тваринах проводили відповідно до європейських та українських законів і політики з біоетики. Відразу після закінчення гіпергравітаційного навантаження виділяли синаптосоми з великих півкуль головного мозку.
Препарат синаптосом з головного мозку щурів одержували диференційним центрифугуванням та центрифугуванням у градієнті густини Ficoll-400 за методом [Cotman, 1974]. Виділені синаптосоми ресуспендували в холодному оксигенованому сольовому розчині, що містив (в мM): NaCl 126; KCl 5; MgCl2 1,4; NaH2PO4 1,0; HEPES 20, pH 7,4; та d-глюкозу 10. Кальцієве середовище містило 2 мM CaCl2, безкальцієве - 2 мM EГTA та не містило доданого Ca2+. Концентрацію білка визначали за методом [Larson et al., 1986].
Дослідження препарату синаптосом методом лазерної кореляційної спектроскопії проводили за допомогою лазерного кореляційного спектрометру “ZetaSizer-3” (Великобританія).
Дослідження препарату синаптосом методом проточної цитометрії проводили на протоковому цитометрі COULTER EPICS XL (Франція).
Визначення потенціалу плазматичної мембрани синаптосом здійснювали з використанням потенціал-чутливого флуоресцентного зонда родаміну 6G на спектрофлуориметрі Hіtachі MPF-4 (Японія) при лзбудження = 528 нм, л емісії = 551 нм (спектральна ширина щілин - 5 нм).
Визначення рівня ацидифікації внутрішньоклітинних компартментів синаптосом проводили за методом [Zoccarato et al., 1999] з використанням рН-чутливого флуоресцентного зонда акридинового оранжевого (АО) на спектрофлуориметрі Hіtachі MPF-4 (Японія) при лзбудження = 490 нм, лемісії = 530 нм (спектральна ширина щілини - 5 нм).
Гідролітичну активність Na+/K+-АТPази визначали як різницю між загальною АТPазною активністю та оуабаїн-нечутливою АТPазною активністю в дигітонін-пермеабілізованих синаптосомах. Неорганічний фосфат визначали за методом [Rathbun, Betlach, 1969].
Активність лактатдегідрогенази визначали спектрофотометрично, використовуючи метод [Amador et al., 1963].
Препарат ізольованих синаптичних везикул, плазматичних мембран та цитозольних білків одержували з лізату синаптосом відповідно до процедури, запропонованої [De Lorenzo and Freedman, 1978; Roseth et al., 1995].
Злиття синаптичних везикул з плазматичними мембранами реєстрували з використанням амфіфільного флуоресцентного зонда октадецил родаміна В хлориду (R18) на спектрофлуориметрі Hitachi 650-10S (Японія) при лзбудження = 560 нм, л емісії = 580 нм (ширина щілини 5 і 6 нм, відповідно) та при 530 нм відсіваючому фільтрі [Hoekstra et al., 1984; Terletska and Trikash, 1998].
Вивільнення глутамату визначали після навантаження синаптосом L-[14C]глутаматом (500 нМ, 251 мКі/ммоль) в кальцієвому середовищі протягом 10 хв. Визначення вивільнення L-[14C]глутамату проводили в зразках (125 мкл суспензії синаптосом, 0,5 мг білка/мл) після 0-30 хв інкубації. Радіоактивність визначали в аліквотах надосаду (100 мкл) та розчиненого в SDS осаду (100 мкл) на сцинтиляційному лічильнику Tracor Analytic Delta 300 (США) із сцинтиляційною сумішшю ACS (1,5 мл).
Захват глутамату синаптосомами визначали в зразках суспензії з концентрацією білка 250 мкг/мл, реакцію ініціювали додаванням суміші L-глутамату та L-[14C]глутамату (251 мКі/ммоль) та інкубували при 37єС. Аліквоти відбирали через 0-10 хв, а потім обробляли одним із наступних способів: фільтрували на фільтрах Whatman GF/C (Англія) або осаджували в мікроцентрифузі «Eppendorf» (20 с при 10 000 g). Радіоактивність вимірювали на лічильнику Tracor Analytic Delta 300 (США) з використанням сцинтиляційної суміші ОCS чи ACS, відповідно.
Статистичний аналіз даних проводили із застосуванням програм Excel та Microcal Origin. Результати наведено як середнє значення ± квадратична похибка середнього значення, отримані за результатами n незалежних експериментів. Різницю між двома групами оцінювали з використанням t-тесту Ст'юдента і вважали статистично значимою при Р?0,05.
2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Порівняльна характеристика препаратів ізольованих нервових терміналей, одержаних з контрольних тварин (НГ-синаптосоми) та тварин, що зазнали впливу гіпергравітаційного навантаження (ГГ-синаптосоми). Методом лазерної кореляційної спектроскопії визначено функцію розподілу за розміром та середній діаметр ізольованих нервових терміналей. Одержані результати вказують, що препарат синаптосом містить частинки розміром від 0,2 до 20 мкм, однак переважна більшість частинок має розміри від 1,5 до 10 мкм, а середній діаметр синаптосом складає 3,24 ± 0,45 мкм (рис. 1, А).
Аналіз препаратів синаптосом методом проточної цитометрії показав, що величина FS, яка є пропорційною розміру частинок, знижувалася в препараті ГГ-синаптосом у порівнянні з НГ-синаптосомами, але ці зміни не були статистично значимими (рис. 1, Б). Показано, що значення SS знижується незначною мірою в препараті ГГ-синаптосом порівняно з НГ-синаптосомами. Ці зміни також не були статистично значимими (рис. 1, В).
Потенціал плазматичної мембрани синаптосом після ГГ знижувався відносно НГ, однак ця різниця не перевищувала 10% (рис.2, А). Визначення цілісності плазматичної мембрани проводили, вимірюючи активність лактатдегідрогенази в інкубаційному середовищі. Було показано, що витікання ферменту протягом 40 хв майже не відрізнялось в НГ- та ГГ-синаптосомах, та складало приблизно 5%. Таким чином, після ГГ впливу цілісність плазматичної мембрани не порушується. Показано, що гідролітична активність Na+/K+-АТРази зменшується після ГГ на 12,0 ± 3,0 % порівняно з НГ (Р?0,05), що може бути однією з причин зниження мембранного потенціалу.
Для оцінки функціонального стану синаптичних везикул було оцінено рівень їхньої ацидифікації за допомогою pH-чутливого флуоресцентного зонда АО. Показано, що синаптичні везикули ГГ-синаптосом зберігають здатність до накопичення протонів, однак при додаванні рівної кількості зонда рівноважний рівень флуоресценції АО в зразках ГГ-синаптосом був вищим приблизно на 10 % у порівнянні з НГ-синаптосомами, що вказує майже на 30 % зменшення накопичення АО синаптичними везикулами після ГГ (рис. 2, Б).
Вивільнення глутамату з синаптосом шляхом екзоцитозу за умов НГ та ГГ. Перший етап досліджень екзоцитозу в НГ та після ГГ було проведено із застосуванням флуоресцентного зонда АО. Як показано на рис. 3, додавання 35 мМ КСl до навантажених АО синаптосом за присутності Ca2+ призводить до різкого зростання флуоресцентного сигналу, після якого відбувається його зменшення. Різниця між базальним рівнем флуоресценції зонда та піком флуоресценції після стимуляції 35 мМ КСl відображає величину екзоцитозу, який майже вдвічі менший після ГГ у порівнянні з нормою (рис. 3, А). В обох випадках після різкого вивільнення зонда внаслідок стимуляції 35 мМ КСl відбувається його зворотний захват, що вказує на наявність процесів ендоцитозу в синаптосомах, таким чином, після ГГ впливу зберігається процес рециклізації синаптичних везикул.
Дослідження із застосуванням флуоресцентного зонда не дозволяють диференціювати процеси, які відбуваються при вивільненні різних нейромедіаторів. Тож нами було вивчено вивільнення нейромедіатора глутамату, міченого радіоактивною міткою (L-[14C]глутамат). Для аналізу вивільнення L-[14C]глутамату було проведено попередньє навантаження синаптосом цією міткою. Після 10 хв інкубації за присутності 500 нМ L-[14C]глутамату приблизно 70 % від загальної кількості внесеного в середовище інкубації міченого нейромедіатора накопичувалося всередині синаптосом (1,2 ± 0,1 нмоль L-[14C]глутамату/мг білка в нормі та 1,1 ± 0,1 нмоль L-[14C]глутамату/мг білка після ГГ), тобто вміст міченого L-[14C]глутамату в обох препаратах синаптосом після навантаження майже не відрізнявся.
Іншою важливою характеристикою препарату синаптосом є позаклітинний рівень L-[14C]глутамату, який після ГГ незначно зменшувався і становив 0,193 ± 0,013 та 0,183 ± 0,013 нмоль/мг білка в нормі та після ГГ, відповідно. Позаклітинний рівень L-[14C]глутамату значною мірою залежить від нестимульованого вивільнення нейромедіатора з синаптосом, яке майже не відрізнялося в НГ- та ГГ-синаптосомах і за 30 хв складало приблизно 5 % від загальної кількості L-[14C]глутамату в синаптосомах.
Вивільнення L-[14C]глутамату шляхом екзоцитозу в НГ та після ГГ досліджували при деполяризації високими концентраціями KCl в кальцієвому і безкальцієвому середовищі. Кількість глутамату, що вивільняється з везикульованого пулу, визначали як різницю між величиною загального вивільнення в кальцієвому середовищі і Са2+-незалежного вивільнення. Са2+-залежне вивільнення L-[14C]глутамату, стимульоване деполяризацією синаптосом 35 мМ KCl, тобто вивільнення нейромедіатора шляхом екзоцитозу зменшувалося з 14,4 ± 0,7 % від загального вмісту міченого L-[14C]глутамату в синаптосомах в нормі до 6,2 ± 1,9 % після ГГ (Р?0,05, n=6) (рис. 3, Б).
Також нами було досліджено Са2+-залежне вивільнення L-[14C]глутамату з синаптосом з використанням блокатора потенціал-залежних K+-каналів - 4-амінопіридину. Стимульоване 2 мМ 4-амінопіридином Са2+-залежне вивільнення міченого нейромедіатора після ГГ виявилося нижчим приблизно на 40 % у порівнянні з нормою і становило 6,54 ± 1,22 % та 11,1 ± 1,6 % від загального вмісту міченого глутамата для ГГ- та НГ-синаптосом, відповідно (Р?0,05, n=3).
Зниження Са2+-залежного вивільнення нейромедіатора після ГГ може бути спричинене зміною активності потенціал-залежних кальцієвих каналів, щоб перевірити це припущення ми стимулювали вивільнення глутамату з синаптосом шляхом екзоцитозу кальцієвим іонофором - іономіцином. При додаванні 1 мкМ іономіцину до суспензії синаптосом Са2+-залежне вивільнення глутамату було значно меньшим за умов ГГ та складало 11,4 ± 1,8 % від загального вмісту міченого L-[14C]глутамату, а в нормі цей показник становив 20,0 ± 1,9 % (Р?0,05, n=3).
Злиття синаптичних везикул з плазматичною мембраною у безклітинній моделі. Виявлені зміни у вивільненні L-[14C]глутамату шляхом екзоцитозу після ГГ можуть бути спричинені порушенням злиття синаптичних везикул з плазматичною мембраною, тому нами було застосовано безклітинну модель, що дозволяє дослідити злиття синаптичних везикул з везикулами плазматичних мембран за присутності цитозольних білків та Ca2+, який використано для ініціації процесу злиття. Злиття досліджували з використанням R18 [Hoekstra et al., 1984], яким мітили синаптичні везикули.
Показано, що синаптичні везикули, плазматичні мембрани та цитозольні білки після впливу ГГ зберігають здатність до злиття, і його рівень майже не змінюється порівняно з нормою (рис. 4, А):
SV h + PM h + P h (v Ca2+) ? SV c + PM c + P c (v Ca2+),
де (SV c), (PM c), (P c) - синаптичні везикули, плазматичні мембрани та цитозольні білки одержані з мозку контрольних тварин, а (SV h), (PM h), (P h) - синаптичні везикули, плазматичні мембрани та цитозольні білки одержані з мозку тварин, що зазнали впливу гравітаційного навантаження.
Нами проведено дослідження впливу ГГ на здатність до злиття окремо мембранних компонентів безклітинної системи. У цій серії експериментів використано синаптичні везикули та везикули плазматичних мембран, виділені з контрольних тварин та тварин, що зазнали ГГ навантаження, а також цитозольні білки, одержані лише від контрольних тварин. При аналізі стимульованого злиття SVh та PMh у середовищі з Pc показано, що швидкість злиття між мембранними компонентами, одержаними з ГГ-тварин, була нижчою у порівнянні з системою, що містила контрольні мембранні компоненти (рис. 4, Б):
SV h + PM h + P c (v Ca2+) < SV c +PM c + P c (v Ca2+).
Таким чином, можна відзначити, що після ГГ знижується здатність до злиття мембранних компонентів безклітинної системи. Також нами визначено вплив ГГ на фузогенну активність цитозольних білків синаптосом. Досліджено злиття мембранних компонентів, одержаних від контрольних тварин, у середовищі, що містило білки, виділені з ГГ-тварин. У системі, що містить Ph, контрольні мембранні компоненти зливаються ефективніше, ніж у системі, що містить контрольні цитозольні білки (рис. 4, В):
SV c + PM c + P h (v Ca2+) > SV c +PM c + P c (v Ca2+).
Отже, здатність цитозольних білків до стимуляції злиття мембранних компонентів у безклітинній системі зростає після ГГ.
Вміст нейромедіатора в цитозолі оцінювали за витіканням L-[14C]глу-тамату з синаптосом, пермеабілізованих дигітоніном, в нормі та після ГГ. Показано, що витікання попередньо навантаженого L-[14C]глутамату, визначене через 1 хв після додавання дигітоніну, становило 10,0 ± 0,5 % від загального вмісту мітки в НГ-синаптосомах та 12,1 ± 0,5 % після ГГ (Р?0,05, n=4).
Таким чином, нами показано, що після ГГ загальна кількість глутамату в синаптосомах та його позаклітинна концентрація не змінюються. В той же час кількість глутамату в синаптичних везикулах зменшується, а вміст нейромедіатора в цитоплазматичному пулі збільшується, тому можна стверджувати, що після ГГ відбувається перерозподіл нейромедіатора з синаптичних везикул до цитоплазми.
Високоафінне Na+-залежне накопичення глутамату синаптосомами в нормі та за умов ГГ. Термінація глутаматергічної трансмісії відбувається за рахунок видалення нейромедіатора з синаптичної щілини шляхом його захвату нервовими клітинами. Цей процес забезпечується транспортерами збуджуючих амінокислот (EAAT) плазматичної мембрани, які можуть модулювати процес нейротрансмісії. Тому на наступному етапі дослідження було проведено оцінку кінетичних характеристик процесу високоафінного Na+-залежного накопичення глутамату НГ- та ГГ-синаптосомами.
Для визначення кінетичних характеристик накопичення глутамату вивчали залежність початкової швидкості процесу захвату від концентрації глутамату в середовищі інкубації. Підвищення концентрації L-[14C]глутамату в середовищі інкубації від 2 до 25 мкМ приводило до зростання початкової швидкості накопичення глутамату. На основі отриманих даних з використанням методу подвійних обернених координат Лайнуївера-Берка розраховано величини уявних констант Міхаеліса (КМ) для НГ- та ГГ-синаптосом, які становили 10,7 ± 2,5 та 6,7 ± 1,5 мкМ, відповідно, (n=9) У той же час максимальна швидкість накопичення L-[14C]глутамату (Vmax) значно знижувалася в ГГ-синаптосомах у порівнянні з нормою і дорівнювала 5,6 ± 0,9 та 12,5 ± 3,2 нмоль·хв-1·мг білка-1, відповідно, (Р?0,05, n=9) (рис. 5, А). Зміни максимальної швидкості можуть відбуватися через зміни електрохімічних градієнтів іонів, необхідних для транспорта, активності транспортерів або їх кількості на плазматичній мембрані.
Функціонування високоафінних Na+-залежних глутаматних транспортерів плазматичної мембрани тісно пов'язане з накопиченням нейромедіатора у синаптичних везикулах, яке забезпечується протонним градієнтом, утвореним везикулярною Н+-АТРазою. Нами застосовано бафіломіцин А1 - високоспецифічний інгібітор везикулярної АТРази V-типа для з'ясування взаємовідносин між закисленням синаптичних везикул та швидкістю накопиченням глутамату транспортерами плазматичної мембрани. Показано, що додавання 100 нМ бафіломіцину А1 спричиняє значне зниження як початкової швидкості захвату нейромедіатора, так і його акумуляції за 10 хв. Початкова швидкість знижувалася більше ніж удвічі після застосування бафіломіцину А1 як в нормі (з 2,5 ± 0,2 до 1,1 ± 0,05 нмоль·хв-1·мг білка-1), так і після ГГ (з 2,05 ± 0,1 до 0,9 ± 0,05 нмоль·хв-1·мг білка-1). Однак за присутності бафіломіцину А1 швидкість накопичення глутамату в ГГ- синаптосомах була нижчою, ніж у нормі. Таким чином, можна припустити, що порушення функціонування синаптичних везикул, хоч і спричинює зменшення початкової швидкості накопичення глутамату, але не є єдиною причиною зниження активності транспортерів глутамату при ГГ.
Вплив специфічних інгібіторів транспортерів на накопичення глутамату синаптосомами в нормі та після ГГ. Інгібітори транспортерів глутамату є зручним інструментом для дослідження процесів накопичення глутамату. В експериментах використано оборотні конкурентні інгібітори нетранспортабельний DL-трео-?-бензилоксіаспартат (DL-ТВОА) та транспор-табельний DL-трео-?-гідроксіаспартат (DL-ТНА). За літературними даними ці інгібітори взаємодіють однаково ефективно з усіма типами транспортерів глутамату і відрізняються між собою лише за здатністю переноситися всередину клітини, яка характерна для DL-ТНА та відсутня у DL-ТВОА. Аналіз впливу інгібіторів на процес накопичення L-[14C]глутамату синаптосомами виявив, що їх дія є концентраційно-залежною в НГ та після ГГ, однак вплив на процес накопичення глутамату ГГ-синаптосомами дещо відрізнявся порівнянно з нормою. Показано, що за дії 10 мкM DL-TBOA початкова швидкість накопичення L-[14С]глутамату для ГГ-синаптосом знижується на 51,0 ± 4,1 %, а для НГ-синаптосом - на 38,0 ± 3,8 % (Р?0,05; n = 4) (рис. 5, Б). Додавання 10 мкM DL-ТНА зменшує початкову швидкість на 40,0 ± 4,0 % в НГ та 53,0 ± 4,0 % після ГГ (Р?0,05; n=4) (рис. 5, Б). Одержані результати вказують на зростання чутливості глутаматних транспортерів плазматичної мембрани до дії інгібіторів DL-ТВОА та DL-ТНА після впливу ГГ.
Класичним нейрональним транспортером глутамату вважається ЕААТ3, тоді як EAAT2 досить тривалий час відносили до гліальних транспортерів, однак останнім часом з'явилися дані, що в нейронах експресується один із сплайсингових варіантів EAAT2 [Chen W. Et al., 2004]. Оскільки транспортери EAAT3 та EAAT2 відрізняються за регуляцією експресії на плазматичній мембрані та умовами переходу між роботою в прямому та оберненому режимі, то здається доцільним проаналізувати участь різних видів транспортерів у накопиченні L-[14C]глутамату синаптосомами в нормі та після впливу ГГ.
Для дослідження роботи глутаматних транспортерів типу EAAT2 засто-совано високоспецифічний по відношенню до цих транспортерів інгібітор - дигідрокаїнат (DHK). При використанні 200 мкM DHK початкова швидкість накопичення L-[14C]глутамату в нормі знижувалася на 54,0 ± 2,5 % (з 2,5 ± 0,2 до 1,15 ± 0,2 нмоль·хв-1·мг білка-1), а після ГГ - на 48,0 ± 2,5 % з (2,05 ± 0,1 до 1,06 ± 0,05 нмоль·хв-1·мг білка-1) (Р?0,05, n=4) (рис. 5, Б). Таким чином, встановлено, що як в нормі, так і після ГГ захват глутамату через глутаматні транспортери типу EAAT2 майже не відрізняється.
Вплив специфічних інгібіторів протеїнкінази С на накопичення глутамату синаптосомами в нормі та після ГГ. Однією з причин зменшення Vmax без зміни КМ процесу накопичення L-[14C]глутамату може бути зміна поверхневої експресії глутаматних транспортерів, тобто їх кількості на поверхні плазматичної мембрани нервових терміналей. Один із механізмів регуляції поверхневої експресії глутаматних транспортерів відбувається за участю протеїнкінази С. Вважається, що процес регуляції поверхневої експресії глутаматних транспортерів є надзвичайно важливим для синаптичної пластичності, тому нами з'ясовано, чи бере протеїнкіназа С участь у регуляції накопичення глутамату за умов ГГ. Для визначення внеску протеїнкіназа С-залежного механізму регуляції активності глутаматних транспортерів в зміни накопичення L-[14C]глутамату між НГ- та ГГ-синаптосомами нами застосовано високоселективний інгібітор цього ферменту - GF 109 203X.
Одержані дані вказують, що застосування 100 нМ GF 109 203X призводить до зниження початкової швидкості накопичення L-[14C]глутамату НГ-синаптосомами на 15 % (з 2,5 ± 0,1 до 2,17 ± 0,1 нмоль·хв-1·мг білка-1) (Р?0,05, n=4). В ГГ-синаптосомах за дії інгібітора початкова швидкість накопичення L-[14C]глутамату майже не змінювалася і складала 99,7 ± 2,0 % порівняно з контролем, або 2,05 ± 0,1 та 2,04 ± 0,05 нмоль·хв-1·мг білка-1 в контролі та за дії 100 нМ GF 109 203X, відповідно. Окремо варто зазначити, що акумуляція глутамату за 10 хв майже не змінювалася за дії GF 109 203X як у НГ, так і після ГГ, що вказує на вплив інгібітора винятково на рівні транспортерів плазматичної мембрани.
Вивільнення глутамату з цитоплазми синаптосом. Вивільнення глутамату з цитозольного пулу може здійснюватися як через транспортери, так і транспортер-незалежним шляхом через аніонні канали, цистин-глутаматний обмінник або шляхом трансмембранної дифузії. Тому для коректної оцінки вивільнення через транспортери спочатку визначали транспортер-незалежне вивільнення L-[14C]глутамату з цитозолю, для чого нами застосовано нетранспортабельний інгібітор глутаматних транспортерів DL-TBOA, що дає змогу майже повністю заблокувати як захват, так і вивільнення глутамату через транспортери. Інкубування синаптосом з 10 мкM DL-TBOA призводить до збільшення тонічного вивільнення глутамату на 2,0 ± 0,4 % від загального вмісту мітки порівняно з вивільненням без DL-TBOA, а при додаванні 100 мкM DL-TBOA - на 3,5 ± 0,5 % як в НГ-, так і в ГГ-синаптосомах. Таким чином, транспортер-незалежне нестимульоване вивільнення глутамату не відрізняється в НГ та після впливу ГГ.
Са2+-незалежне вивільнення глутамату при KСl-стимульованій деполяризації зростало з 7,7 ± 2,8 % в НГ-синаптосомах до 12,9 ± 2,0 % в ГГ-синаптосомах. Для визначення участі транспортерів у цьому процесі було досліджено вплив DL-ТВОА на KСl-стимульоване Са2+-незалежне вивільнення. Показано, що 10 мкM DL-TBOA зменшує Са2+-незалежне вивільнення L-[14С]глутамату в нормі на 15,2 ± 2,2%, а після впливу ГГ - на 26,2 ± 3,9 % (Р?0,05, n=4), а 100 мкM DL-TBOA інгібує вивільнення на 44,0 ± 3,0 % в нормі та на 50,4 ± 4,0 % після ГГ (рис. 6, А). Таким чином, зміни Са2+-незалежного вивільнення, що спостерігаються після впливу ГГ, пов'язані зі зміною роботи транспортерів у реверсному режимі.
Вивільнення глутамату з синаптосом з виснаженим везикулярним пулом нейромедіатора. Порушення накопичення глутамату синаптичними везикулами після впливу ГГ може призводити до збільшення цитозольного пулу нейромедіатора, що впливає на його вивільнення. Тому було застосовано синаптосоми із виснаженим везикулярним пулом, що дозволяє дослідити вивільнення медіатору із цитозольного пулу, уникаючи впливу процесів накопичення/вивільнення нейромедіатору синаптичними везикулами.
Для стимуляції виходу міченого нейромедіатора із синаптичних везикул нами використано протонофор карбоніл-ціанід-р-трифлуорометоксифеніл-гідразон (FCCP). Показано, що додавання 1 мкM FCCP відразу спричинює вивільнення глутамату, яке триває протягом значного періоду часу. При порівнянні FCCP-стимульованого вивільнення глутамату з НГ- та ГГ-синаптосом виявлено різницю на початковому етапі дії протонофору. Так, за перші 30 с вивільнення глутамату становило 4,8 ± 1,0 % та 8,0 ± 1,0 % від загального вмісту мітки для НГ- та ГГ-синаптосом відповідно (Р?0,05, n=11) (рис. 6, Б). Однак ця різниця повністю зникала за наступні 2 хв, і протягом подальшої інкубації, що тривала ще 13 хв, динаміка вивільнення глутамату з НГ- та ГГ-синаптосом не відрізнялася.
Нами застосовано KCl у високих концентраціях, щоб оцінити стимульоване деполяризацією вивільнення глутамату через транспортери за цих умов. Варто відмітити, що стимульоване деполяризацією (35 мМ KCl) вивільнення глутамату шляхом екзоцитозу дорівнювало нулю після застосування FCCP як у нормі, так і після ГГ, тому подальші експерименти з використанням KCl проводили в безкальцієвому середовищі. Стимульоване високими концентраціями KCl вивільнення цитозольного глутамату із синаптосом, попередньо оброблених 1 мкM FCCP протягом 5 хв, значно збільшувалося (з 27,0 ± 2,2 % від загально вмісту мітки в нормі до 35,0 ± 2,3 % після ГГ) (Р?0,05, n=4). Потрібно зазначити, що позаклітинний рівень глутамату при внесенні KCl (на 5-й хв після додавання FCCP) не відрізнявся для НГ- та ГГ-синаптосом. Стимульоване KCl вивільнення глутамату за цих умов відбувалося через обернення роботи глутаматних транспортерів, оскільки воно значною мірою інгібувалося DL-TBOA.
Вивчено вивільнення L-[14C]глутамату з цитозольного пулу шляхом гетерообміну з DL-ТНА, показано що воно зростає після ГГ, особливо за умов дисипації протонного градієнта синаптичних везикул протонофором.
Виявлені в роботі зміни Na+-залежного накопичення глутамату, перерозподіл нейромедіатора між везикулярним та цитозольним пулами та обернення роботи глутаматних транспортерів можуть лежати в основі розвитку функціональних порушень у нервовій системі за умов зміненої гравітації.
ВИСНОВКИ
Актуальним питанням сучасної космічної біології є дослідження впливу зміненої гравітації на організм людини та медико-біологічних наслідків її дії. Перебування людини в умовах гіпергравітації призводить до порушень у нервовій системі, зокрема функціональних, які становлять серйозну загрозу для безпеки польотів. Зміни у процесах сприйняття та обробки інформації, асоціативних реакціях, когнітивних можливостях, пам'яті, що спостерігаються при гіпергравітаційних навантаженнях, можуть бути пов'язані з порушеннями глутаматергічної нейротрансмісії. Очевидно, що подальший прогрес у розумінні нейрологічних наслідків дії гіпергравітації не є можливим без з'ясування її впливу на активний транспорт глутамату у нервових терміналях головного мозку. Одержані в роботі результати дають підстави зробити наступні висновки:
1. Проведено порівняльний аналіз ключових процесів, які лежать в основі глутаматергічної нейротрансмісії, в нормі та за умов гіпергравітації. (Для моделювання гравітаційного перевантаження щурів, що спричинює перерозподіл рідини в організмі у краніо-каудальному напрямку, було спеціально сконструйовано центрифугу з діаметром ротора 5,5 м.) Показано зміни Na+-залежного транспорту глутамату крізь плазматичну мембрану ізольованих нервових терміналей головного мозку щурів (синаптосом) та вивільнення нейромедіатора шляхом екзоцитозу за умов гіпергравітації.
2. Розмір та гранулярність синаптосом не змінюються, однак величина потенціалу плазматичної мембрани незначно зменшується, а закислення синаптичних везикул суттєво знижується після гіпергравітації.
3. Са2+-залежне вивільнення глутамату з синаптосом зменшується внаслідок зниження вмісту нейромедіатора в синаптичних везикулах, а цитозольний рівень глутамату зростає, що свідчить про перерозподіл нейромедіатора між везикульованим та цитозольним пулом внаслідок дії гіпергравітації.
4. Загальна швидкість злиття синаптичних везикул з плазматичними мембранами у безклітинній модельній системі не змінюється після гіпергравітіції. Однак зареєстровано зниження здатності мембранних компонентів до злиття та зростання фузогенної активності синаптосомальних цитозольних білків за цих умов.
5. Кінетичні характеристики високоафінного Na+-залежного накопичення глутамату синаптосомами змінюються після гіпергравітації: спостерігається значне зниження максимальної швидкості накопичення та незначне підвищення афінності.
6. Ефективність дії конкурентних інгібіторів глутаматних транспортерів нетранспортабельного DL-трео-?-бензилоксіаспартату та транспортабельного DL-трео-?-гідроксіаспартату, які є специфічними для всіх типів глутаматних транспортерів, підвищується, а дигідрокаїнату ? специфічного інгібітора глутаматних транспортерів ЕААТ 2 типу - не змінюється після гіпергравітації.
7. Транспортер-залежне вивільнення глутамату, стимульоване деполяризацією, та вивільнення глутамату шляхом гетерообміну з DL-трео-?-гідроксіаспартатом зростають після гіпергравітації, особливо за умов дисипації протонного градієнта синаптичних везикул протонофором.
8. Експериментальні дані, отримані при аналізі дії гіпергравітації на акумуляцію та вивільнення глутамату нервовими терміналями, є суттєвими для розуміння біохімічних механізмів, що лежать в основі розвитку функціональних порушень у нервовій системі під час гравітаційних перевантажень.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Борисова Т.А. Исследование влияния гипергравитационного стресса на активное поглощение L-глутамата нервными окончаниями головного мозга крыс / Т.А. Борисова, Н.В. Крысанова, Н.Г. Гиммельрейх // Укр. біохім. журн.- 2002.- Т. 74, № 3.- С. 98-103.
2. Борисова Т.A. Моделированная гравитация и глутаматэргическая передача в больших полушариях мозга / Т.A. Борисова, Н.В. Крысанова, Н.Г. Гиммельрейх // Космічна наука і технологія.- 2002.- Т. 8, №5/6.- С. 62-65.
3. Borisova T. Na+-dependent glutamate efflux from rat brain synaptosomes under extremal condition / T. Borisova, N. Krisanova, N. Himmelreich // Journal of Gravitational Physiology.- 2003.- V.10, №1.- Р. 43-44.
4. Борисова Т.А. Модулирующее влияние ингибиторов глутаматных транспортеров на процесс накопления и освобождения нейромедиатора нервными окончаниями мозга крыс / Т.А. Борисова, Н.В. Крысанова, Н.Г. Гиммельрейх // Укр. біох. журн.- 2005.- Т. 77, № 3.- С. 61-67.
5. Borisova T. Presynaptic transporter-mediated release of glutamate evoked by the protonophore FCCP increases under altered gravity conditions / T. Borisova, N. Krisanova // Advances in Space Research.- 2008.- V.42, №12.- Р. 1971-1979.
6. Borisova T. Presynaptic release of glutamate by heteroexchange under altered gravity conditions / T. Borisova, N. Krisanova // Microgravity Science & Technology.- 2009.- V. 21. - Р. 197-201.
7. Krisanova N.V. Synaptopathy under conditions of altered gravity: Changes in synaptic vesicle fusion and glutamate release / N.V. Krisanova, I.O. Trikash, T.A. Borisova // Neurochemistry International.- 2009.- V.55.- Р. 724-731.
8. Borisova T.A. Glutamatergic Transmission in the Rat Brain and Gravitational Stress / T.A. Borisova and N.V. Krisanova // International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System”, Kyiv, Ukraine, June 16-18, 2002: Neurophysiology. - 2002.- V.34, №2/3. - P.137-138.
9. Borisova Т.A. Artificial gravity and functional plasticity of nerve system L-[14C]glutamate uptake by nerve terminals from rat cerebellum and cerebral hemispheres under hypergravity stress / T.A. Borisova, N.V. Krisanova, N.H. Himmelreich // Conference “Life in Space for Life on Earth”, Stockholm, Sweden, 2-7 June 2002: Abstract Book.?2002.?P.245.
10. Borisova Т.A. Exocytotic release of glutamate under altered gravitational environment / T.A. Borisova, N.V. Krisanova // 4-th Parnas Conference, Wroclaw, Poland, 15-17 September, 2002: Abstract Book.?2002.? P. 99.
11. Борисова Т.А. Моделированная гравитация и глутаматэргическая передача в мозжечке и больших полушариях головного мозга крыс / Т.А. Борисова, Н.В. Крысанова, Н.Г. Гиммельрейх // 2-я Украинская конференция по перспективным космическим исследованиям, Крым, Украина, 21-27 сентября, 2002: Сборник тезисов. ?2002.? С. 160.
12. Борисова Т.А. Экзоцитоз и Nа+-зависимое освобождение ГАМК и глутамата из нервных окончаний головного мозга в экстремальных условиях / Т.А. Борисова, Н.Г. Позднякова, Н.В. Крысанова, Н.Г. Гиммельрейх // 3-я Украинская конференция по перспективным космическим исследованиям, Крым, Украина, 14-20 сентября, 2003: Сборник тезисов. ?2003.? С. 58.
13. Borisova Т. Effects of the glutamate transporter inhibitors on the L-[14C]glutamate uptake and release in nerve terminals before and after exposure of rats to centifuge-induced artificial gravity / T. Borisova, N. Krisanova, N. Himmelreich //Meeting of the European Low Gravity Research Association, Santorini, Greece, 21-23 September, 2005: ELGRA News, Bulletin of the European Low Gravity Research Association.?2005.? V.24.? P.253-254.
14. Borisova Т. Сentrifuge-induced hypergravity as the new animal model system for studying presynaptic processes in brain / T. Borisova, N. Krisanova, N. Himmelreich // 5-th Parnas Conference, Kiev, Ukraine, 26 - 29 April, 2005: Ukr.biochim.journal.? 2005.? V.77, № 2.?P.15.
15. Borisova Т. Increasing effect of the inhibitor on glutamate release in low [Na+] media under extremal conditions / T. Borisova, N. Krisanova, N. Himmelreich //31-st Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Instambul, Turkey, 24-29 June, 2006: FEBS Journal.?2006.? V.273, Suppl.s1.?P.236.
16. Borisova Т.A. Effect of the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon on the glutamate release from rat brain nerve terminals under altered gravity conditions / T.A. Borisova, N.V. Krisanova // 36-th COSPAR Scientific Assembly, Beijing, China, 16 - 23 July 2006: Abstract Book. Session F1.2-0003-06.?2006.? Abstract? COSPAR2006-A-00548.
17. Krisanova N. The synaptosomal release of glutamate from cytosolic pool was changed in brain hypoxia simulated modeling / N. Krisanova, T. Borisova. // 6-th Parnas Conference, Krakow, Poland, May 30 - June 2, 2007: Acta Biochimica Polonica. ? 2007.? V.54, Suppl. 2.?P. 40-41.
18. Borisova Т. Large Radius Human Centrifuge and abnormal presynaptic glutamate transport / T. Borisova, N. Krisanova // Conference “Life in Space for Life on Earth”, Angers, France, 22 - 27 June 2008: Abstract Book.? P. 111.
19. Borisova T. Exposure to altered gravity conditions results in hypoxia-related enhancement of the presynaptic transporter-mediated release of glutamate / T. Borisova, N. Krisanova // 37-th COSPAR Scientific Assembly, Montreal, Canada, 13 - 20 July 2008: Abstract Book, Session F44.? Abstract? F44-0000-08.
20. Borisova Т. Glutamate transporter uptake and reversal in presynaptic nerve terminals isolated from rats subjected to hypergravity / T. Borisova, N. Krisanova // 17-th IAA Human in Space Symposium, Moscow, Russia, 7-11 June, 2009: Abstract Book.? P. 19.
21. Krisanova N. Possible mechanisms underlining the reduction in presynaptic transporter-mediated uptake of glutamate under hypergravity conditions / N. Krisanova, T. Borisova // ELGRA Biennial Symposium and General Assembly, Bonn, Germany, 1 - 4 September, 2009: Abstract Book.? V.26.?P.259.
22. Krisanova N.V. Synaptic vesicle heterotypic/homotypic fusion and glutamate release under conditions of altered gravity / T.O. Borisova, N.V. Krisanova, I.O. Trikash. // 7-th Parnas Conference, Yalta, Crimea, 3-7 October 2009, The Ukrainian Biochemical Journal - 2009. - V.81, №4. - Р.94.
23. Borisova T. Protein Kinase C-dependentregulation of synaptosomal glutamate uptake under conditions of hypergravity / T. Borisova, N. Krisanova, A. Borisov, R. Sivko, // 38-th COSPAR Scientific Assembly, Bremen, Germany, 16 - 25 July 2010: Abstract Book, Session F44.? Abstract? F44-0027-10.
24. Крисанова Н. Участь протеїнкінази С в регуляції процесу захвата глутамату нервовими закінченнями головного мозку щурів за умов зміненої гравітації / Н. Крисанова, Р. Сівко, Т. Борисова // 10-й Український біохімічний з"їзд, Одеса, Україна, 13-17 вересня, 2010: Укр. біохім. журн.?2010.? Т. 82, № 1.? С. 199.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків. Ефективність функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту. Вільнорадикальні процеси в мозку при експериментальному гіпотиреозі в щурів при фізичному навантаженні.
автореферат [84,7 K], добавлен 20.02.2009Функціонально-структурна характеристика спинного мозку. Значення нейронних елементів спинного мозку. Розподіл аферентних та еферентних волокон на периферії. Функції спинного мозку. Механізми розвитку міотатичних рефлексів. Складові частини стовбура мозку.
презентация [559,8 K], добавлен 17.12.2014Ступені організації тварин. Амеба і людиноподібна мавпа як антиподи тваринного світу. Вища організація нервової системи у тварин. Приручення дельфінів, спостереження за поведінкою. Експерименти над восьминогами, значення розвитку головного мозку в комах.
реферат [4,7 M], добавлен 15.04.2010Характеристика компонентів адгезивної міжклітинної комунікації олігодендроцитів та нейронів. Класифікація неоплазій, що виникають у головному мозку ссавців. Патологія міжклітинних контактів гліоцитів і нейронів при дисембріогенетичних новоутвореннях.
курсовая работа [2,3 M], добавлен 31.01.2015Клас хребетних тварин. Костисті риби як найбільш пристосовані до проживання у водному середовищі хребетні. Довжина тіла риб. Розміри головного мозку по відношенню до величини тіла. Статева система, запліднення ікри, швидкість росту і тривалість життя риб.
реферат [1,4 M], добавлен 10.02.2011Мієлінізація протягом постнатального розвитку гризунів. Вплив ішемії мозку на експресію основного білка мієліну. Дегенерація олігодендроцитів та їх відновлення після фокальної ішемії мозку. Структура та функції мієліну. Непрямий імуноферментний аналіз.
дипломная работа [2,1 M], добавлен 08.02.2016Механізми дії та функції цитокінів у нервовій системі, їх взаємодії на рівні головного мозку. Рецептори цитокінів в межах центральної нервової системи (ЦНС). Стимуляція гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової системи як доказ прямого впливу цитокінів на ЦНС.
реферат [5,7 M], добавлен 13.11.2013Головний мозок як складний біологічне пристрій, принципи передачі даних по нервах та від одного нейрона до іншого. Можливості мозку щодо сприйняття і зберігання необмеженої кількості інформації. Мнемоніка як сукупність різних прийомів запам'ятовування.
презентация [1005,6 K], добавлен 23.09.2015Гістамін: історія вивчення, властивості, структура, шляхи синтезу і вивільнення. Активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази у нирках інтактних тварин. Зміна активності у нирках щура за дії гістаміну у концентраціях 1 та 8 мкг/кг.
курсовая работа [1,5 M], добавлен 20.07.2014Загальне поняття про вищу нервову діяльність. Онтогенетичний розвиток великих півкуль головного мозку. Типи вищої нервової діяльності. Фізіологічна єдність і взаємодія першої і другої сигнальних систем дітей. Чутливість і мінливість молодого організму.
реферат [37,3 K], добавлен 17.12.2012Біоритми як загальні властивості живого. Структурні елементи біоритмів, їх класифікація. Поведінкові реакції тварин і методи їх вивчення. Методика вироблення штучного циркадного біоритму у самців щурів лінії Вістар. Проведення тесту "Відкрите поле".
дипломная работа [226,2 K], добавлен 21.03.2011Будова органу сприймання звукових коливань. Периферичний відділ вуха як орган слуху. Центральний відділ вуха - сенсорний центр кори головного мозку. Функції зовнішнього, середнього, внутрішнього вуха; формування звукового образу. Причини погіршення слуху.
презентация [183,7 K], добавлен 23.10.2015Основи анатомії і фізіології собаки. Форма і внутрішня будова органів та їх функції. Системи органів травлення, дихання, кровообігу та лімфоутворення, сечовиділення, розмноження. Будова і функції відділів головного мозку, обмін речовин та енергії.
доклад [1,8 M], добавлен 19.03.2010Антиоксидантна система як захист проти вільних радикалів. Гістамін:історія вивчення, структура, шляхи синтезу і вивільнення. Визначення активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, вплив на неї наявності гістаміну в нирці щура.
курсовая работа [1,7 M], добавлен 22.06.2014Розвиток нервової системи та принципи формування організму на ранніх стадіях. Регенерація та регуляція росту нервових волокон, дія центра росту і периферичних областей на нерви. Розвиток функціональних зв'язків та cуть відносин центра і периферії.
курсовая работа [1,9 M], добавлен 21.09.2010Розгляд загальних положень механізму трансформації бактерій, рослин та тварин. Дослідження трансформації листових дисків тютюну шляхом мікроін’єкцій. Методика отримання трансформованих пагонів, їх підтримання і розмноження за допомогою брунькових пазух.
курсовая работа [349,3 K], добавлен 15.10.2014Уявлення про ознаки пристосування тварин до захисту від ворогів у природі, причини зникнення тварин. Шляхи охорони і збереження тварин у природі; ознаки пристосування окремих тварин. Сприйняття об'єктів природи, їх цінність; охорона тваринного світу.
конспект урока [113,2 K], добавлен 10.01.2010Живі організми як об'єктивні реальні форми буття. Хронобіологія – наука про біоритми. Екологічні і фізіологічні аспекти ритмічних процесів. Ритмічні добові коливання фізіологічних процесів у людини та біолектрична активність мозку і м`язової системи.
доклад [13,6 K], добавлен 31.05.2009Дослідження потужності електроенцефалограми людей з правобічним та лівобічним профілями асиметрії у стані функціонального спокою. Формування індивідуального профілю латералізації сенсорних і рухових функцій залежно від структурної організації мозку.
статья [188,4 K], добавлен 24.04.2018Здатність людини сприймати запахи речовин за допомогою нюхових рецепторів, їх будова та кількість. Процес формування відчуття запаху. Значення аналізатора нюху в житті людини, місце його розташування. Периферичний та центральний відділи нюхового мозку.
презентация [3,9 M], добавлен 12.11.2011
