Мікробіологічне обґрунтування розробки складу і технології асоційованого пробіотичного препарату на основі оригінальних штамів Aerococcus viridans та Bacillus subtilis

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ.І.І.МЕЧНИКОВА АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ»

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

03.00.07 - мікробіологія

МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ОБГРУНТУВАННЯ РОЗРОБКИ

СКЛАДУ І ТЕХНОЛОГІЇ АСОЦІЙОВАНОГО ПРОБІОТИЧНОГО ПРЕПАРАТУ НА ОСНОВІ ОРИГІНАЛЬНИХ ШТАМІВ

AEROCOCCUS VIRIDANS ТА BACILLUS SUBTILIS

КОШОВА Ірина Петрівна

Харків - 2011

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сьогодні підвищується актуальність бактеріотерапії і бактеріопрофілактики інфекцій різної етіології та локалізації. Все ширше використовуються бактерійні препарати, що створені на основі представників нормальної мікрофлори, для корекції порушень мікробіоценозів людини і для профілактики розвитку патологічних станів (Бельмер С.В., 2006; Шендеров Б.А., 2007; Morotomi M., 2010).

Застосування бактерійних препаратів засноване на розумінні ролі нормальної мікрофлори для організму людини в процесах, що забезпечують неспецифічну резистентність до інфекцій та формування імунної відповіді, антагоністичній ролі нормофлори, участі в регуляції метаболічних процесів, означенні їх антидотної, антиоксидантної та антиканцерогенної дії (Бондаренко В.М., Чуприна Р.П., 2004; Gary B. Huffnagle, 2007).

Еубіотики в порівнянні з антибіотиками та хіміопрепаратами мають ряд переваг - нешкідливість, відсутність побічних реакцій і алергізації макроорганізму, що сприяє їх широкому впровадженню в лікувальну практику. У зв'язку з цим спектр бактерій, які використовують для розробки лікарських препаратів, розширюється з кожним роком, хоча кількість офіційно визнаних змінюється дуже поволі (Самгородська Н.В., Сорокулова І.Б., 1994; Никитенко В.І., 2000; Осипова І.Г, 1998; Суворов А.Н., 2003). Останнім часом активно розробляються моно - та полікомпонентні пробіотики, антибіотикорезистентні пробіотичні препарати, але число впроваджених в практику обмежене.

Важливою частиною створення таких асоційованих пробіотичних препаратів є підбір компонентів його складових за фізіологічними, біохімічними, антагоністичними та іншими властивостями. Актуальним є вивчення взаємодії між асоціантами, що впливає на властивості препарату (Янковський Д.С., 2006).

Переважна частина бактерійних препаратів пробіотичного напрямку ліофілізується. Для реактивації клітин ліофілізованого препарату потрібен досить тривалий час та сприятливі умови травного каналу, у зв'язку із чим, відбувається часткова втрата клітин, особливо в шлунку й тонкій кишці. Стає зрозумілою основна причина зниження пробіотичної активності ліофілізованих препаратів.

Аналіз фармацевтичного ринку пробіотичних препаратів України показав, що таких препаратів всього 37, з них «Біфідумбактерин» - 7 лікарських форм та «Лактобактерин» - 4, але різних виробників. Кількість іноземних виробників перевищує вітчизняних. Усі представлені на ринку України пробіотичні препарати - ліофільно висушені форми або супозиторії, рідких препаратів не представлено зовсім.

Визначене диктує необхідність розробки нових рідких форм пробіотиків, які володіють широким спектром антагоністичних властивостей відносно патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів і, при цьому, не впливають суттєво на облігатну мікрофлору людини.

Дослідження рідкої форми пробіотичної асоціації на основі Aerococcus viridans (з мікроаерофільним типом метаболізму) і Bacillus subtilis N 3 (рВМВ 105) - з аеробним типом метаболізму), як представників нормальної мікрофлори людини, на наш погляд, є перспективним. B. subtilis росте швидше за A. viridans, та поглинає О₂, створюючи мікроаерофільні умови для A. viridans, тому ми передбачаємо отримати синергідний ефект.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології, імунології та епідеміології Дніпропетровської державної медичної академії на тему: „Біотехнологія отримання асоційованого препарату із Aerococcus viridans і Bacillus subtilis, які входять до складу „А-бактеріну” і „Субаліну”, та дослідження його біологічних властивостей „in vitro” і „in vivo” (номер державної реєстрації - № 0100V003058), у виконанні якої дисертантом особисто проведено дослідження мінливості аерококів, антагоністичні властивості бацил та аерококів, вплив пробіотичного комплексу з A. viridans і B. subtilis на деяких представників умово патогенної мікрофлори. Тема дисертації затверджена на РПК з спеціальностей вірусологія - 03.00.96, мікробіологія - 03.00.07 (протокол № 7 від 2 лютого 2000 р.).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є вивчення біоасоціативної взаємодії пробіотичних штамів A. viridans та B. subtilis та підбір оптимального рідкого поживного середовища для оптимізації росту цих мікроорганізмів для подальшого створення комплексного пробіотичного препарату.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- визначити межі мінливості штамів аерококів при тривалому зберіганні в ліофілізованому стані;

- проаналізувати пробіотичні якості A. viridans та B. subtilis, а також висвітлити перспективи щодо розробки асоційованого пробіотичного препарату;

- підібрати селективне рідке середовище для вирощування Aerococcus viridans і Bacillus subtilis і дослідити динаміку росту вказаних мікроорганізмів у залежності від складу середовища, рН, початкової засівної дози;

- встановити закономірність розвитку обох штамів на щільному та рідкому середовищах при спільному культивуванні (стимулюючи ріст та антагоністичні властивості);

- провести комплексні мікробіологічні, біохімічні та біологічні дослідження зі створення пробіотичної асоціації для корекції дисбіозів та гнійно-запальних раньових інфекцій, а також з метою профілактичної обробки раньової поверхні;

- вивчити біологічну активність створеного пробіотичного комплексу;

Об`єкт дослідження - штами Aerococcus viridans, Bacillus subtilis; пробіотична асоціація аерококів та бацил; музейні та клінічні штами мікроорганізмів.

Предмет дослідження - пробіотичні властивості асоційованого комплексу A.viridians i B.sutilis, взаємодія між цими мікроорганізмами, та вплив різних умов вирощування на активність асоціації мікробів.

Методи дослідження - мікробіологічні, біохімічні, біологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Експериментально обґрунтована доцільність застосування стабільного штаму A. viridans і B. subtilis у складі рідкого пробіотичного комплексу, в якому сумісне вирощування дозволяє підвищити вихід біомаси аерококів та бацил на 29 %.

Доведено, що вирощування і стабілізація комплексу аерококів з бацилами потребує нової технології отримання, що включає застосування оригінального рідкого живильного середовища (рН 6,8 - 7,4) на відварі грибів Pleurotos osteatus, яке містить у своєму складі наступні добавки: Na₂S₂O₃, цистеїн солянокислий та альгінат натрію - як стабілізатори росту і тривалості зберігання, NaHCO₃ - як стабілізатор рН, MgSO₄ і дріжджовий екстракт як стимулятор росту, при їх оптимальному співвідношенні, підібраному експериментальним шляхом. У результаті чого отримано вихід біомаси на 25 - 75% вище ніж при стандартній методиці.

Встановлено ефективність застосування рідкої форми асоціації A. viridans та B. subtilis з пробіотичними властивостями при створенні моделей гнійно-запальних процесів, обумовлених S. aureus та P. aeruginosa.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі комплексних досліджень розроблено оптимальний склад, умови вирощування, визначено якісні характеристики та біологічні властивості пробіотичної асоціації A.viridians i B.subtilis.

Розроблено метод одержання стабільних штамів аерококів, удосконалено методи їх культивування. Модифіковано рідке рослинне живильне середовище, що має переваги для вирощування аерококів та бацил, які проявляють антагоністичну активність у відношенні до патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, володіють високою ферментативною активністю. Обґрунтовано оптимальні методи культивування клітин Aerococcus viridans 167 і Bacillus subtilis 3 зі збереженням показників життєздатності та біологічних властивостей.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації обговорені на XV Міжнародній конференції й дискусійному науковому клубі „Нові інформаційні технології в медицині, біології, фармакології й екології” (Україна, Крим, Ялта-Гурзуф, 2007 р.), на ХІ Конгресі Світової федерації українських лікарських суспільств (СФУЛТ) (Полтава, 2006 р.), XIII Міжнародній конференції й дискусійному науковому клубі „Нові інформаційні технології в медицині, біології, фармакології й екології” (Україна, Крим, Ялта-Гурзуф, 2006 р.), на VIII з'їзді Українського суспільства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Алушта, 2007 р.), науково-практичній конференції «Пошук і розробка нових профілактичних і лікувальних протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів і пробіотиків» (Харків, 2006 р.), Міжнародній науковій конференції (Одеса, 2006 р.), міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні питання стратегії, тактики застосування й дослідження антибіотиків, антисептиків, дезінфектантів" (Вінниця, 2006 р.), засіданні президії УНМТМЕП ім. Д.К.Заболотного в рамках науково-практичної конференції "Епідеміологія, сучасні методи діагностики й профілактики гострих інфекцій верхніх дихальних шляхів" (Київ, 2007 р.), матеріали науково-практичної конференції «Екологічні проблеми техногенно-навантажених регіонів» (Дніпропетровськ, 2008), міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні системи біозахисту у ветеринарній медицині» (АР Крим, м. Феодосія, 2010), Міжнародній конференції й дискусійному науковому клубі „Нові інформаційні технології в медицині, біології, фармакології й екології ” (Україна, Крим, Ялта-Гурзуф, 2010 р.).

Особистий внесок здобувача. Особиста участь дисертанта полягала в постановці і проведенні експериментальних досліджень з визначення антагоністичних властивостей A. viridans та B. subtilis, модифікації оптимального живильного середовища, визначенні основних показників пробіотичної асоціації з A. viridans та B. subtilis та дослідженні її біологічних і пробіотичних властивостей, формулюванні висновків досліджень. У наукових роботах, опублікованих у співавторстві, автору належить фактичний матеріал і його узагальнення.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових робіт (2 одноосібно), у тому числі 7 статей (4 з яких у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України), один інформаційний лист, одна методична рекомендація, 8 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна роботи викладена на 123 сторінках машинопису, складається зі вступу, п'яти розділів, загальних висновків, списку використаних літературних джерел. Список використаної літератури містить 186 джерел, викладений на 19 сторінках. Робота ілюстрована 25 таблицями та 12 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

аерокок бацила патогенний мікрофлора

У першому розділі роботи представлено огляд літератури, в якому наведено стислі відомості про біологічні властивості пробіотиків та механізми їх дії, склад пробіотиків та критерії їх відбору. Дана характеристика та екологія бактерій родів Aerococcus і Bacillus, означено їх місце в мікробіоценозі організму людини. Розглянуто пробіотичні препарати на основі бактерій Aerococcus viridans і Bacillus subtilis, а також обґрунтована їх клінічна ефективність.

Матеріали, методи і обсяг досліджень представлено у другому розділі. З метою реалізації поставлених завдань за допомогою мікробіологічних методів проводилась ідентифікація культур аерококів та бацил згідно з Evans J.B. (1986), Кременчуцьким Г.М. (1987), Дрозд Т.Е. (1989). Дослідження мінливості штамів аерококів з різними термінами збереження в ліофілізованому стані проводили за допомогою мікробіологічних (Гашинський В.В., 1958), біохімічних (Deelle H.E., 1971; Губський Ю.І з співавт.,1983; Макаренко Е.В., 1988; Каган В.Г. з співавт., 1986; Doelle H.W., 1971) та фізико-хімічних методик (Кременчуцький Г.М., 1994). Дослідження антагоністичних властивостей аерококів та бацил у відношенні умовно патогенних мікроорганізмів проводили за допомогою методики відстроченого антагонізму. Для визначення антагоністичної активності 1 млрд суспензію (за ОСМ) аерококів та бацил у дозі 0,1 мл висівали штрихом по діаметру чашки Петрі з МПА петлею діаметром (3,5 ± 0,5) мм. Посіви інкубували в термостаті при температурі 37±0,5 °С на протязі (24 ± 2) годин. Потім до культури, що виросла підсівали перпендикулярним штрихом посівний матеріал тест-штамів (0,1 мл 1 млрд суспензії мікробів (за ОСМ) в 0,85% розчині натрію хлориду після росту мікроорганізмів на МПА на протязі (18 ± 2) годин.

Визначення результатів дослідження проводили через 18 годин інкубування в термостаті при температурі (37±0,5) °С за розміром зон пригнічення росту тест-культур. Контролем росту тест-культур був їх паралельний висів на чашки з тим же середовищем (МПА) без досліджуємого штаму.

Штами культур бактерій, які були використані в роботі для перевірки чутливості до антагоністичної дії аерококів і бацил, отримані з музею бактеріальних культур РДІСК ім. Л.А. Тарасевича та виділені з патологічного матеріалу в Центральній баклабораторії м. Дніпропетровська в 2006 році.

Об'єктом дослідження були обрані умовно патогенні мікроорганізми: Staphylococcus aureus, Staphylococcus еріdеrmіdіs, Staphylococcus sарrорhуtісus, Еsсhеrісhіа соlі, Proteus vulgаrіs, Кlеbsіеllа рnеumоnіае, Pseudomonas аеrugіnоsа й Саndіdа аlbісаns, виділені з патологічного матеріалу хворих та музейні штами: Staphylococcus aureus 209-р, Staphylococcus еріdеrmіdіs АТСС 14990, Staphylococcus sарrорhуtісus АТСС 15305, Еsсhеrісhіа соlі 374, Proteus vulgаrіs 401, Кlеbsіеllа ozaenae 390, Pseudomonas аеrugіnоsа 1, Citrobacter freundii Ве 113/66, Саndіdа аlbісаns 690.

Чутливість до антибіотиків визначали диско-дифузійним методом згідно „Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков” (1983) та Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів” (МВ 9.9.5-143-2007). Вивчення показників накопичення біомаси B. subtilis та A. viridans проводили на рідкому поживному середовищі рослинного походження з відпрацюванням режимів культивування та оптимізації складу поживного середовища. Вплив рідкої форми препарату пробіотичного комплексу на основі B. subtilis та A. viridans на біологічні властивості деяких представників умовно патогенної флори організму людини вивчали на експериментальних моделях (Elik S.D., 1956; Учитель И.Я., 1978). Було використано 118 лабораторних тварин (миші та щури), при роботі з тваринами користувались “Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, которые используются в экспериментальных и других научных целях” (Страсбург, 1986 р.) та згідно рекомендацій ІІ національного конгресу України з біоетики (Київ, 29 вересня - 2 жовтня 2004) // Журнал АМН України. - 2004. - Т.10, № 4. - С.827-829).

Статистична обробка матеріалів досліджень проводилась з використанням методів біостатистики за допомогою пакетів програм EXCEL-2003 (ліцензійний № 74017-640-0000106-57285), «Биостатистика 4.03» (Москва: Практика, 1998). Основні статистичні характеристики включали: кількість спостережень (n), середню арифметичну (M), похибку середньої величини (m), стандартне відхилення (SD). Оцінка вірогідності відмінностей середніх виконувалася за критерієм Ст'юдента, відносних величин - за критерієм згоди Пірсона Хі-квадрат (²). Різницю між порівнювальними величинами вважали вірогідною при р<0,05.

Результати власних досліджень наведено в 3-у - 5-у розділах.

Протягом тривалого часу (майже 40 років) культура Aerococcus viridans 167 підтримується в музеї культур мікроорганізмів кафедри мікробіології Дніпропетровської державної медичної академії, виділена професором М.Л.Горбуновою в 1962 році з грудного молока. Культура Aerococcus viridans 167 депонована у Всесоюзному музеї культур при Державному контрольному інституті медичних і біологічних препаратів ім. Л.А.Тарасевича №04-223 від 27.5.1971 року. У 2006 р. культура Aerococcus viridans 167 була депонована в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України під реєстраційним номером Aerococcus viridans IBM B-7185.

Впродовж 40 років постійно пересівали і піддавали культуру ліофільному висушуванню, в результаті вказаного остання міняла свої властивості. З цим пов'язане завдання роботи - отримання стабільного штаму Aerococcus viridans 167 і дослідження збереження його властивостей на протязі тривалого часу.

В процесі дослідження доведено, що культури аерококів, які зберігаються протягом тривалого часу в ліофілізованому стані, мають високу морфологічну мінливість в популяції, що приводить до поліморфізму, який усувається за допомогою культивування на рідких поживних середовищах та постійному пасажі штамів. Ці результати збігаються з даними, наведеними Черняєвим С.А.(2002) для аерококів.

Як показали дані, отримані в ході проведення експериментів по вивченню антагонізму Aerococcus viridans 167 різних серій, залежно від терміну зберігання змінюється їх антагоністична активність. У більшості досліджень антагоністична активність знижується зі збільшенням строку зберігання штамів, також спостерігається збільшення меж мінливості біологічних властивостей штамів.

Для отримання стабільного штаму аерококів, який увійшов до складу пробіотичного комплексу (на основі аерококів та бацил), вивчали морфологічні, біохімічні, антагоністичні властивості штамів аерококів різних строків зберігання в ліофілізованому стані.

Відібрано штам аерококів з найбільш стабільними властивостями (серія 1985 року): біохімічними, морфологічними, антагоністичними властивостями, а також, термін збереження штаму (10 років).

Після відбору аерококу серії 1985 року, з культури клітин відібрано ізольовані колонії по методу Дригальского. З чистих культур ізольованих колоній аерококу робили суспензію клітин на основі фізіологічного розчину, готували препарат «висяча крапля». За допомогою мікроманіпулятора відбирали окремі клітини та пересівали на поживне середовище МПА. Після інкубації на протязі 3 діб в термостаті при температурі (37 ± 0,5) °С колонії перевіряли за всіма характерними показниками. Колонії, характерні за ознаками аерококів, відбирали та підтримували їх на рідкому та щільному живильних середовищах (МПБ та МПА) при постійному пересіві.

Дослідження стабільності властивостей відібраного штаму проводили на протязі року (контроль показників проводився кожні 2 місяці) за такими показниками: морфологія, лактатоксидазна та оксидазна активність, продукція супероксиду, антагоністична активність (порівняна зі стандартною) та кількість живих клітин.

Отримані результати дозволяють зробити висновок про доцільність розробки підходу для відновлення вивчених властивостей та їх підтримку в стабільних межах у штамів, що тривало зберігаються.

Для створення пробіотичного комплексу було необхідно вивчити взаємний антагонізм А. viridans і В. subtilis на різних середовищах (м'ясо-пептонному агарі, грибному агарі та з додаванням до грибного агару 1% глюкози).

Аналіз результатів експерименту показав, що при підсіюванні у різні строки інкубації А. viridans до В. subtilis та B. subtilis до A. viridans на різних живильних середовищах (МПА, грибний агар та грибний агар з добавками) взаємного антагонізму не виявлено. На живильному середовищі яке містить грибний агар з додаванням 1% глюкози (підсів B. subtilis до A. viridans) після 72 годин інкубації спостерігався незначний антагонізм.

Для створення асоційованого пробіотичного комплексу на основі бацил і аерококів необхідно було дослідити спільну антагоністичну активність до різних представників умовно патогенної мікрофлори. Для досліду сумісного антагонізму культури аерококів і бацил вирощували на грибному середовищі 24 години при 37єС, отримували 1 мдлр суспензію кожної культури, далі висівали на грибний агар в співвідношенні 1:1. Через 24 години інкубації підсівали штами тест-культур.

Виходячи з даних табл. 1, 2 можна припустити, що найсильніше спільна антагоністична активність А. viridans і В. subtilis проявляється по відношенню до C. albicans 690, S. epidermidis АТСС 14990 та K. ozaenae 390. У результаті проведених досліджень були отримані результати, які свідчать, що спільна антагоністична активність Аеrососсus viridans і Васіllus subtilis до різних штамів тест-культур у 1,5-2 рази вище, ніж антагоністична активність Аеrососсus viridans і Bacillus subtilis окремо (p<0,05-0,001) (табл. 1, 2).

Таблиця 1. Антагоністична активність Аеrососсus viridans і Васіllus subtilis до музейних штамів тест-культур

Примітка: p<0,05-0,001.

Таблиця 2. Антагоністична активність Аеrососсus viridans і Васіllus subtilis до клінічних штамів

Примітка: p<0,05-0,001.

Результати цього дослідження продиктували необхідність продовження роботи з розробки асоційованого пробіотичного препарату, що містить у складі представників нормальної мікрофлори - А. viridans і B. subtilis із широким спектром антагоністичної активності щодо різних груп бактерій.

Універсальні поживні середовища, що задовольняють більшість мікробіологічних цілей та широко на сьогодні використовують - мґясо-пептонний бульйон і мґясо-пептонний агар, рибні гідролізати, тобто середовища, засновані на використанні мікроорганізмами для забезпечення своїх живильних потреб тваринних білків.

Основним недоліком живильних середовищ на основі м'ясо-пептонного бульйону є підвищена собівартість вихідної речовини і складність технології отримання. В той же час, недостатній розвиток отримав напрям, заснований на розробці живильних середовищ з використанням рослинної сировини. Метою досліджень було підбір та оптимізація живильного середовища з підвищеними ростовими якостями для виділення і накопичення біомаси аерококів і бацил. У якості рослинної сировини використано відвар вищих грибів Pleurotus ostreatus (глива звичайна), які вирощували на субстраті з лузги соняшника (Кременчуцький Г.М. та інш., 2006).

Як свідчать показники, наведені в таблиці 3, поживне середовище на основі відвару гливи (з додаванням натрію хлориду 0,9 %, агар-агару 3%, рН 7,0 - 7,4) має ростові переваги по відношенню до МПА. Кількість життєздатних клітин аерококів та бацил збільшилась в середньому на 9-15 % при вирощуванні на грибному агарі, що є передумовою для подальшого дослідження та розробки поживного середовища культивування бацил та аерококів.

Таблиця 3. Ростова цінність грибного агаризованого живильного середовища для різних тест-культур аерококів та бацил у порівнянні із МПА

Примітка. * - p<0,05 порівняно з МПА.

Для розробки науково-обґрунтованої технології пробіотичного комплексу нами був зроблений підбір складу середовища на основі рослинної сировини, для культивування аерококів і бацил, щоб концентрація клітин у асоціації була не менш 1·10⁹ колоніє утворюючих одиниць (КУО) в 1 мл.

Для накопичення біомаси A. viridans 167 і B. subtilis 3 (рВМВ105) застосовували рідкі живильні середовища різного складу, приготовлені на основі бульйону грибів гливи звичайної: грибний бульйон з рівнем амінного азоту 150 мг %; грибний бульйон з додаванням різних вуглеводів, амінокислот і вітамінів, що відповідає потребам A. viridans167 і B. subtilis 3 (рВМВ105).

У рідке живильне середовище (рН 6,8 - 7,4) на відварі грибів додавали різні добавки (Na₂S₂O_3, MgSO₄, NaHCO₃, дріжджовий екстракт, цистеїн солянокислий та альгінат натрію), засівали по 0,1 мл 1 млрд суспензій добових культур виробничих штамів аерококів і бацил окремо один від одного та при сумісному культивуванні. Посіви інкубували при (37 ± 0,5) єС на протязі (24 ± 2) годин.

При культивуванні на грибному бульйоні (амінний азот 150 мг %) з мінеральними добавками кількість живих клітин антагоністів при сумісному вирощуванні бацил і аерококів та концентрація клітин була вищою, ніж при окремому культивуванні (рис.1).

Рис. 1. Кількість бацил та аерококів при культивуванні окремо та сумісно на грибному бульйоні з добавками

У результаті проведених експериментів підібрано оптимальне живильне середовище, яке задовольняє ростові потреби аерококів і бацил.

При проведенні досліджень по спільному культивуванню штамів A. viridans і B. subtilis, була встановлена можливість одержання асоційованого комплексу на основі вищевказаних бактерій. Нашим завданням було дослідження впливу комплексної пробіотичної асоціації, на основі штамів бактерій A. viridans і B. subtilis на деяких представників умовно патогенної мікрофлори.

При експериментальному вивченні антимікробної терапії зовнішніх гнійно-запальних процесів використано моделі: стафілококової інфекції на білих мишах, опіків і ран на щурах, обумовлених синьогнійною інфекцією.

Модель стафілококової інфекції на білих мишах створювали шляхом введення 0,1 мл 1 млрд суспензії добової культури S. aureus, виділену від хворого з гнійного відділення, підшкірно на бокову поверхню тварини. Ця модель дозволила одержати чітко виражені симптоми запалення, які розвивалися в мишей на 2-3 добу після інфікування й зберігалися на протязі 10-13 діб. Стафілококи при підшкірному введенні інтенсивно розмножувалися й сприяли наростанню місцевих проявів захворювання.

Для вивчення здатності пробіотичного комплексу ("ПК") до впливу на стафілококи 35 білим мишам була уведена підшкірно доза стафілокока (1 мл 1 млрд суспензії) та у різний термін до та після ведення суспензії зі стафілококом - 0,1 мл «ПК» (2 млрд клітин на одне введення). 10 мишей склали контрольну групу. Проводилося спостереження за часом прояву місцевих симптомів хвороби та їх інтенсивністю розвитку.

З'ясувалося, що введення препарату у різні терміни: на 5 годин раніше стафілококів, через 5 хвилин та через 5 годин після введення останніх, спричиняє антагоністичну дію й перешкоджає розвитку інфільтрату. "ПК", уведений у дозі 0,1 мл 2 млрд добової культури пробіотичної асоціації через 24 і 48 годин, зменшує строки прояву хвороби. В цих випадках, починаючи з 3-4 доби, місцевий процес у піддослідних мишей помітно вгасав на відміну від тварин контрольної групи, де вельми виражений інфільтрат зберігався ще і на 8 добу спостереження.

Все вказане свідчить, що пробіотична асоціація аерококів та бацил має захисний ефект. Для підтвердження зробленого висновку поставлено наступну серію експериментів на 60 білих мишах, у яких була модельована раньова стафілококова інфекція. «ПК» з аерококів та бацил застосували з лікувальною метою, наносячи на раньову поверхню тварин у різних кількостях у момент самого бурхливого розвитку запалення. Із цією метою п'яти групам білих мишей (по 10 штук у кожній) з розвиненим запальним процесом робили аплікації з різними дозами дослідного пробіотичного комплексу: 1,25^.10⁸; 0,25^.10^9; 0,5^.10⁹; 1,0^.10⁹ й 2,0^.10⁹. Ще 10 мишей склали контрольну групу.

Систематично здійснювали спостереження за ступенем прояву місцевих симптомів запалення і щодня у декількох тварин з метою бактеріологічного контролю робили посів відокремлюваного з раньової поверхні на 10% жовтково-сольовий агар для виявлення стафілококів.

Одноразове нанесення аерококів у кількості 1 та 2 млрд клітин в 8 випадках із 10 (90,0 %) сприяло зникненню всіх симптомів запалення в перші 2 доби від початку їх застосування. Дані бактеріологічного дослідження гнійних запалень показали, що в групах мишей, яким наносили аплікації з "ПК", паралельно зі зникненням місцевих симптомів запалення зменшувалася й кількість стафілококів, що висіваються із гнійника. На 7 добу стафілококи вже не висівали зовсім. Одноразове нанесення суспензії пробіотичної асоціації аерококів та бацил на гнійник сприяло загасанню місцевих симптомів хвороби протягом перших двох днів від початку лікування. У досліджуваному матеріалі, виділеному з раньової поверхні, на яку наносили аплікацію з «ПК», від кожної миші виявлялося багато аерококів та бацил на 8-10 добу після їх однократного введення, тоді як кількість стафілококів зменшувалась. Отримані результати представлені у табл. 4.

Таблиця 4. Співвідношення клітин «пробіотичного комплексу» до стафілококів у гної залежно від дня спостереження (у перерахуванні на 1 мл); M ± m, n = 6

Пробіотичний комплекс сприяв загоєнню запального процесу, починаючи з 2-3 доби. У мишей, яким застосовували «ПК», гнійник у порівнянні з іншими тваринами (контрольними) мав менші розміри й желеподібну консистенцію.

Для створення експериментальної моделі опіків, інфікованих Pseudomonas aeruginosa, тваринам проводили загальну анестезію тіопенталом натрію, після цього на депільовану бокову поверхню тварини наносили травму через металічне кільце (діаметр 2 см) ватним тампоном, змоченим у спирті та підпаленим. Рану підсушували стерильним тампоном та у центр опіку вносили інфікуючу дозу P. aeruginosa (1 мл 10⁹ клітин), чекаючи на повне всмоктування.

Дослідження дії пробіотичної асоціації аерококів та бацил були проведені на 44 щурах, 20 склали дослідну, а 24 - контрольну групу. У дослідної групи тварин інфіковані рани щоденно обробляли «ПК» (2 млрд в 1 мл) до видужання. «ПК» наносили у вигляді інстиляцій на раньову поверхню (експозиція 2 хв). Раньову поверхню у контрольної групи тварин обробляли в такий же спосіб, щоденно та с такою ж експозицією але ізотонічним розчином хлориду натрію. За щурами спостерігали 3 тижні. Показниками дії «ПК» були: інтенсивність проявів запалення, терміни загибелі тварин або загоєння раньової поверхні.

У контрольній групі загибель тварин наступала від розвитку синьогнійного сепсису в більш ранній термін (2-3 доба), чим у досліджуваних, де був застосований «ПК» аерококів і бацил.

Перифокальне запалення було менш вираженим по своїй інтенсивності в досліджуваній групі тварин. При цьому рани швидше звільнялися від гною й покривалися сухим струпом. Рани у 58,8 % щурів експериментальної групи повністю гоїлися з відторгненням струпа до 11-ї доби спостереження. У контрольній групі тварин аналогічна картина спостерігалася лише в 22,2 % випадків (²=4,9; p<0,05) (рис. 2). Кількість Р. aeruginosa, що містяться у виділеннях з ран лікованих тварин, починаючи з моменту застосування препарату, була менше ніж у контролі.

Рис. 2. Строки загоєння раньової поверхні у тварин під дією «ПК» та в контрольній групі

Адгезія й колонізація ран «ПК» вивчалася на раньовій моделі, викликаній синьогнійною інфекцією. Для створення моделі синьогнійної інфекції на депільовану бокову поверхню тварини, яка находилась під наркозом, наносили скальпелем травму на шкіру розрізаючи вздовж 3 см. Розводили кінці рани, підсушуючи їх стерильним ватним тампоном, та у центр рани вносили інфікуючу дозу P. aeruginosa (1 мл 10⁹ клітин). Через 20-24 години вдруге вносили інфікуючу дозу P. aeruginosa (1 мл 10⁹ клітин). Для інфікування використали штам P. aeruginosa виділений від опікового хворого у лабораторії СЕС. Додаткове введення культури синьогнійної палички у рану сприяло обтяженню розвитку патологічного процесу з довготривалим періодом прояву клінічних симптомів запалення. Дію пробіотичного комплексу з аерококів та бацил спостерігали при нанесенні аплікацій на раньову поверхню (1 мл 10⁹ клітин), кожен день до видужання.

До застосування «ПК» рівень обсіменіння ран щурів збудником (P. аeruginosa) у наших дослідженнях склав 4,5*10⁶ КУО/мл.

У тварин, яким робили аплікації «ПК», обсіменіння ран P. аeruginosa нижче критичного рівня відзначали, починаючи з 4-ї доби застосування «ПК» (табл. 6).

На 14-у добу в них з ран збудник практично не висівався. У контролі спостерігалася менш виражена тенденція до очищення ран від збудника.

Зниження висівання нижче критичного рівня встановлено лише на 7-у добу. На 14 день мікробного очищення ран у тварин контрольної групи не спостерігали.

Дослідження біоптатів на 23 добу експерименту показало, що в біоптатах ран тварин, яким робили аплікації «ПК», чітко проглядалася зріла грануляційна тканина з розширеними судинами, невелика кількість кокової та бацилярної мікрофлори в епідермі, місцями пікнотично зморщені ядра. У біоптатах з ран пацюків контрольної групи на 23 добу у тварин відзначений некроз сполучної тканини, що була представлена аморфною масою, виражений набряк, повнокров'я судин, місцями відзначені ділянки аморфної грануляційної тканини, подекуди - лейкоцитарна інфільтрація.

Таким чином, вивчення захисної дії рідкого препарату, виготовленого з A. viridans та B. subtilis (пробіотичного комплексу), при дослідженні на експериментальних моделях, обумовлених стафілококовою і синьогнійною інфекціями, показало його ефективність, що обумовлено, скоріше за все, підвищеними пробіотичними властивостями за рахунок синергічного ефекту.

Таблиця 6. Кількість клітин Pseudomonas aeruginosa, висіяних з ран щурів (M±m, n=10)

Примітка: * - p<0,001 в порівнянні з контролем.