Нові високоефективні симбіотичні системи бобових рослин і рекомбінантних штамів бульбочкових бактерій

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

НОВІ ВИСОКОЕФЕКТИВНІ СИМБІОТИЧНІ СИСТЕМИ БОБОВИХ РОСЛИН І РЕКОМБІНАНТНИХ ШТАМІВ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ

ВОРОБЕЙ Надія Анатоліївна

УДК 581.1:581.133.1:581.557:631.143.461.5

03.00.12 - фізіологія рослин

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Коць Сергій Ярославович,

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України, завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

професор, чл.-кор. НАН України

Мусатенко Людмила іванівна,

Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного

НАН України, завідувач відділу

доктор біологічних наук, професор

Антипчук Адель Федорівна

Відкритий міжнародний університет розвитку

людини “Україна”, завідувач кафедри

Захист відбудеться: “_17_” _ березня__2011 р. о _1200 годині на засіданні

Спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “__9__” _лютого_____ 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Є.Ю. Мордерер

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

мутагенез скринінг бульбочковий бактерія

Актуальність теми. У біосфері планети фіксація молекулярного азоту бульбочковими бактеріями є унікальним процесом, що забезпечує живлення рослин екологічно чистим зв'язаним азотом, поліпшує якість рослинної продукції, сприяє підвищенню родючості грунтів, маючи при цьому пролонговану дію. Проте, в природних умовах бобові рослини використовують лише 10-30% свого азотфіксуючого потенціалу, в той час як інокуляція їх високоефективними штамами бульбочкових бактерій підвищує цей показник до 50% і забезпечує отримання високих урожаїв (Кретович, 1994, Кожемяков А.П., 1997, Коць та ін., 2001, Коць, Моргун, Патика та ін., 2010).

Основним резервом посилення симбіотичної азотфіксації є отримання штамів бульбочкових бактерій із покращеними властивостями. Використання сучасних методів генетичної інженерії, зокрема гібридизації та транспозонового мутагенезу (Simon et al., 1986, Симаров и др., 1990, Rengel, 2002, Smith, 2004, Priefer U. B. et al., 2001, Zhang et al., 2005, Reznikoff, 2008 та ін.) дозволяє значно розширити спектр спадкової мінливості ризобій і відкриває можливість створення штамів із посиленим синтезом нітрогенази і підвищеною здатністю до ефективного симбіозу.

Селекція нових сортів, розширення ареалу їх вирощування у нетрадиційних регіонах, а також втрата з плином часу окремими ризобіями активності зумовлює необхідність отримання нових штамів бульбочкових бактерій, здатних поліпшити азотне живлення бобових рослин.

Вивчення особливостей формування та функціонування симбіотичних систем люцерни, конюшини і сої, які належать до основних бобових культур, що вирощуються в Україні, за участю рекомбінантних штамів бульбочкових бактерій сприятиме розробці заходів для забезпечення високого рівня симбіотичної азотфіксації, створення продуктивних симбіозів у польових умовах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідних тем відділу симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України на 2001-2005 рр. „Вивчити процеси взаємодії бульбочкових бактерій з рослиною-хазяїном та розробити заходи підвищення продуктивності бобових культур за рахунок максимального використання біологічного азоту” (р/№ 0101U000627), на 2002-2006 рр. ”Методами генетичної інженерії отримати нові штами азотфіксувальних мікроорганізмів і створити високоефективні азотфіксувальні системи бобових та злакових культур” (р/№ 0102U002460), на 2006-2010 рр. ”Дослідити фізіологічні процеси функціонування бобово-ризобіального симбіозу і розробити методи його інтенсифікації” (р/№ 0106U006461), на 2006-2011 рр. “Біотехнологічними методами створити високоефективні штами повільнорослих бульбочкових бактерій з широким інокуляційним спектром та вивчити їх взаємодію з рослинами” (р/№0107U004022).

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було створити нові високоефективні симбіотичні системи на основі бобових рослин: конюшини, люцерни та сої і штамів бульбочкових бактерій, отриманих генно-інженерними методами. Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- підібрати штами-реципієнти, провести транспозоновий мутагенез (pSUP2021::Tn5) та отримати Tn5-мутанти бульбочкових бактерій люцерни (Sinorhizobium meliloti), конюшини (Rhizobium leguminosarum bv. trifolii) і сої (Bradyrhizobium japonicum);

- провести первинний скринінг Tn5-мутантів бульбочкових бактерій за ознаками “вірулентність”, “азотфіксація”, “ефективність” та відібрати ризобії із покращеними властивостями;

- з'ясувати можливість формування ефективного бобово-ризобіального симбіозу за участю транскон'югантів (pRD1) бульбочкових бактерій, які зберігались в умовах музею 15 років;

- вивчити фізіологічні особливості росту, розвитку і симбіотичної азотфіксації конюшини, люцерни та сої за інокуляції високоактивними Tn5-мутантами (pSUP2021::Tn5) та музейними транскон'югантами (pRD1) бульбочкових бактерій;

- дослідити ефективність симбіозу люцерни, конюшини та сої при застосуванні одержаних активних рекомбінантних штамів бульбочкових бактерій у грунтово-кліматичних умовах.

Об'єкт дослідження - симбіотичні системи, створені на основі рослин люцерни посівної (Medicago sativa L.), конюшини червоної (Trifolium pratense L.) та сої (Gyicine max L. (Merill)) і штамів бульбочкових бактерій отриманих методами генетичної інженерії.

Предмет дослідження - фізіологічні процеси, що відбуваються у симбіотичних системах люцерни, конюшини та сої, мікросимбіонтами яких є рекомбінантні штами бульбочкових бактерій.

Методи дослідження - фізіологічні (визначення інтенсивності фотосинтезу, темнового дихання рослин та ін.), біохімічні (визначення азотфіксувальної активності симбіотичних систем, вмісту фотосинтетичних пігментів у листках, вмісту азоту у надземній масі рослин), генетичні (транспозоновий мутагенез бульбочкових бактерій, виділення і аналіз геномної ДНК на наявність послідовності гену неоміцинфосфотрансферази транспозону Tn5 (проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)), мікробіологічні (вирощування мікроорганізмів, визначення резистентності до антибіотиків), статистичні (оцінка вірогідності отриманих результатів).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що більшість транскон'югантів швидкорослих бульбочкових бактерій люцерни та конюшини, які протягом 15 років зберігались в умовах музею і вирізняються стабільністю ознак, набутих у процесі кон'югації, здатні утворювати високоефективний симбіоз із рослиною-господарем.

Уперше в Україні транспозоновим мутагенезом при використанні плазміди pSUP2021::Tn5 отримано колекцію нових активних Tn5-мутантів бульбочкових бактерій R. leguminosarum bv. trifoli, S. meliloti і B. japoniсum із поліпшеними ознаками „вірулентність”, „азотфіксація” та „ефективність симбіозу”, які є цінним селекційно-генетичним матеріалом для досліджень і можуть бути використані як біологічна основа бактеріальних добрив під конюшину, люцерну і сою.

Вперше кількісно охарактеризовано зв'язок між інтенсивністю процесів фотосинтезу, дихання та азотфіксації у люцерни, інокульованої різними за активністю Tn5-мутантами бульбочкових бактерій. Позитивний зв'язок між інтенсивністю азотфіксації і фотосинтезом рослин люцерни, описувався логарифмічною залежністю. Збільшення нітрогеназної активності бульбочок супроводжувалось підвищенням інтенсивності дихання коренів, причому зв'язок цього процесу з азотфіксувальною активністю був виражений сильніше, ніж із масою кореневої системи рослини. Виявлений тісний зв'язок між інтенсивністю азотфіксації і масою рослин, який мав тенденцію до насичення при високих значеннях інтенсивності азотфіксації (вище 1,5 мкмоль С2Н4 /рослину · год)).

В умовах польових дослідів за дії природних екологічних чинників вперше показано, що ефективні симбіотичні системи люцерни, утворені за участю Tn5-мутантів І-2, І-7, Т15 і Т17 характеризуються пролонгованим характером активної асиміляції атмосферного азоту. Це обумовлено як за рахунок прискореного формування симбіотичного апарату на ранньому етапі розвитку рослин (І-2, І-7) так і за рахунок активної азотфіксації кореневих бульбочок у фазу утворення бобів (Т15, Т17), що розкриває перспективу створення полікомпонентних азотфіксувальних препаратів для люцерни.

Практичне значення отриманих результатів. Підібрані штами-реципієнти швидкорослих і повільнорослих бульбочкових бактерій можуть бути використані для отримання Tn5-мутантів S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii, B. japonicum із різними симбіотичними характеристиками.

Нові високоактивні штами бульбочкових бактерій R. leguminosarum bv. trifolii BN9 (пат. № 21785, 2007 р.), B. japoniсum Т66 (пат. № 83298, 2008 р.) та S. meliloti Т17 (пат. № 55432, 2010 р.) захищені патентами України, що дозволяє розглядати їх як основу для виготовлення бактеріальних добрив, інокуляція якими сприятиме інтенсифікації залучення азоту повітря до біологічного циклу та отримання високоякісної, екологічно чистої продукції бобових культур. Штами депоновані в ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАН України та можуть використовуватися у якості експериментального матеріалу для науково-дослідної роботи.

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному аналізі літератури за темою дисертації, оволодінні необхідними методами досліджень, плануванні і проведенні експериментів, аналізі та статистичній обробці одержаних результатів, підготовці до друку наукових робіт. Результати дисертаційної роботи отримані автором самостійно або спільно зі співробітниками ІФРГ НАН України, Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка та Уманського державного педагогічного університету імені Павла Тичини, які є співавторами публікацій. Особистий внесок дисертанта складає понад 75%.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на Міжнародній науковій конференції “Каразінські природознавчі студії” (Харків, 2004 р.), ІІ Всеукраїнській наково-практичній конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука”, присвяченій 160-річчю Національного університету “Львівська політехніка” (Львів, 2004 р.), ІІІ Міжнародній науковій конференції “Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” (Москва, 2004 р.), Першій міжнародній конференції молодих вчених “Сучасні проблеми екології” (Запоріжжя, 2005 р.), науковій конференції молодих вчених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 2005 р.), IV Міжнародній науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Мінськ, 2005), 10-ій школі-конференції молодих учених, присвяченій 50-річчю Пущинського наукового центру РАН “Биология -наука ХХІ века” (Пущино, 2006 р.), на ХІІ з'їзді Українського ботанічного товариства (Одеса, 2006 р.), міжнародній науковій конференції „Современные проблемы адаптации и биоразнообразия” (Махачкала, 2006 р.), Х конференції молодих вчених “Сучасний стан і приорітети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології” (Київ, 2007 р.), ІІІ міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2007 р.), ХІІ з'їзді Товариства мікробіологів України (Ужгород, 2009 р.), на наукових семінарах і щорічних звітах відділу симбіотичної азотфіксації ІФРГ НАН України (2004-2009 рр.).

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані у 26 працях, із них 8 cтаттей, 6 із яких у провідних фахових виданнях, 3 патенти України, 15 тез доповідей у збірниках праць вітчизняних і міжнародних конференцій та з'їздів.

Об'єм та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 226 сторінках друкованого тексту й містить 15 рисунків і 56 таблиць. Робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, шести розділів, у яких наведено результати досліджень, висновків, списку використаної літератури (261 найменування) та 11 додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Перший розділ дисертації складається із п'яти підрозділів, у яких викладено огляд вітчизняної та зарубіжної літератури стосовно фізіолого-біохімічних особливостей формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу, ролі генотипів макро- і мікросимбіонта у забезпеченні його ефективності. Висвітлено проблему зниження симбіотичної активності бульбочкових бактерій, подано загальну характеристику традиційних та генно-інженерних методів отримання нових штамів ризобій. Розглянуто особливості розвитку симбіозу бобових рослин і бульбочкових бактерій, змінених внаслідок застосування транспозонового мутагенезу. Охарактеризовано взаємозв'язок процесів фотосинтезу і азотфіксації у бобових рослин та фізіологічну роль симбіотрофного азоту. На основі аналізу і узагальнення літературних даних обґрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили з рослинами люцерни посівної (Medicago sativa L.) сортів: Зайкевича (селекція Полтавської дослідної станції), Зарниця (селекція Селекційно-генетичного інституту НААН), Ярославна і Ольга (селекція Інституту землеробства НААН України) та конюшини червоної (Trifolium pratense L.) сортів Дарунок і Кумач (селекція Інституту землеробства НААН України), а також сої (Gyicine max L. (Merill)) сорту Мар'яна (спільна селекція ІФРГ НАН України, Селекційно-генетичного інституту НААН та Інституту землеробства НААН). Для інокуляції насіння використані бульбочкові бактерії із колекції азотфіксувальних мікроорганізмів ІФРГ НАН України: люцерни (в тому числі виробничі штами Sinorhizobium meliloti 425а, 441), конюшини (R. leguminosarum bv. trifolii 348а) та сої (B. japonicum 634б і 646), а також транскон'юганти S. meliloti і R. leguminosarum bv. trifoli, які зберігались в умовах музею 15 років. Tn5-мутанти S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii і B. japonicum одержані методом транспозонового мутагенезу спільно зі співробітниками відділу симбіотичної азотфіксації ІФРГ НАН України.

Мікровегетаційні стерильні досліди проводили за методикою Федорова (Федоров та ін., 1986).

Вегетаційні досліди проводили в умовах модельних експериментів на вегетаційному майданчику ІФРГ НАН України при вологості субстрату 60% і природному освітленні. У залежності від завдань досліду по 6-8 рослин вирощували у пластикових посудинах на 0,7 кг піску та 10 і 11-кілограмових посудинах Вагнера, попередньо простерилізованих 20%-ним розчином Н2О2, на промитому річковому піску, збагаченому поживною сумішшю Гельрігеля (Гродзинський А.М., Гродзинський Д.М., 1964), яка містила 0,25 н азоту (1 норма відповідає 708 мг Са(NO3)2 х 4Н2О на 1 кг піску). Перед посівом насіння люцерни і конюшини стерилізували концентрованою сірчаною кислотою 3-5 хв., а насіння сої - 15 хв 70%-ним розчином етанолу, промивали проточною водою та протягом 1 год інокулювали суспензією відповідних культур бульбочкових бактерій. Бактеріальний титр суспензій дорівнював 109 клітин/мл. Повторність дослідів 7-разова. Контролем слугували рослини, інокульовані вихідними та виробничими штамами.

Дрібноділянкові та польові досліди. Дрібноділянкові досліди проводили на дослідній ділянці ІФРГ НАН України (грунт сірий лісовий супіщаний). Польові - в умовах Черкаської (грунт темно-сірий опідзолений) та Тернопільської (грунт - чорнозем опідзолений, середньо суглинковий) областей. Насіння висівали із розрахунку: сої - 100 кг/га, конюшини і люцерни - 15 кг/га. Облікова площа ділянок 1, 5 і 10 м2 . Повторність 4-кратна, розміщення - рендомізоване.

Транспозоновий мутагенез проводили за методикою (Новикова и др., 1986) із використанням плазміди pSUP2021::Tn5 (Simon et al., 1986). ПЛР (ланцюгова полімеразна реакція) проводили на ампліфікаторі “Proteus” (Великобританія). Продукти ПЛР аналізували за допомогою електрофорезу в 0,7%-ому агарозному гелі (Chachaty E. et alю, 2000; Reznikoff W. S., 2008). Кількісну оцінку інтенсивності росту (розмноження) бульбочкових бактерій та реізоляцію (виділення бульбочкових бактерій із бульбочок рослин) проводили за загальноприйнятими методами (Нетрусов и др., 2005). Нодуляційну конкурентоздатність ризобій визначали непрямим методом і розраховували за формулою Амаргера (Amarger N., 1981). Азотфіксувальну (нітрогеназну) активність визначали ацетиленовим методом (Hardy et al., 1968; Крикунець, 1993). Інтенсивність фотосинтезу й дихання визначали у контрольованих умовах за допомогою оптико-акустичного інфрачервоного газоаналізатора ГІАМ-5М (Росія). Всі розрахунки зроблені на 1 рослину із врахуванням швидкості потоку повітря через камеру. Розрахунок параметрів газообміну проводили за методикою (Мокроносов, Ковалев, 1989). Площу листків визначали ваговим методом (Третьяков Н.Н. и др., 1982). Визначення вмісту хлорофілів здійснювали за методикою (Wellburn, 1994). Вміст загального азоту у рослинному матеріалі визначали методом К'єльдаля (Плешков, 1985). Для перерахунку на сирий протеїн використовували коефіцієнт 6,25 (Радов А.С. та ін., 1965). Статистична обробка експериментальних даних виконана за Доспєховим (Доспехов, 1985) та при використанні програми Microsoft Excel 2003. У таблицях і на рисунках представлені середні арифметичні та їх стандартні похибки.

ЕФЕКТИВНІСТЬ СИМБІОЗУ БОБОВИХ РОСЛИН І ТРАНСКОН'ЮГАНТІВ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ, ЯКІ ТРИВАЛИЙ ЧАС ЗБЕРІГАЛИСЯ В УМОВАХ МУЗЕЮ

Характеристика транскон'югантів бульбочкових бактерій конюшини і люцерни за здатністю зберігати набуті властивості (плазмідні маркери стійкості до антибіотиків) у чистій культурі та в умовах симбіозу. Вивчення симбіотичних властивостей транскон'югантів бульбочкових бактерій люцерни та конюшини через тривалий термін зберігання має не тільки наукове значення, а вбачає і практичну ціль - відбір стабільних за властивостями, пристосованих до лабораторних умов зберігання, ефективних мікросимбіонтів бобових рослин. У результаті проведених лабораторних дослідів із чистими культурами транскон'югантів S. meliloti і R. leguminosarum bv. trifolii та реізолятами із бульбочок інокульованих ними рослин люцерни та конюшини встановлено, що 60% транскон'югантів після 15 років зберігання в умовах музею є стабільними за успадкованими маркерними ознаками плазміди pRD1 (стійкістю до Km і Tc відповідно у концентраціях 25 і 15 мкг/мл) у чистій культурі та в процесі формування бобово-ризобіального симбіозу.

Ефективність симбіотичних систем люцерни, утворених за участю стабільних транскон'югантів бульбочкових бактерій Sinorhizobium meliloti. Внаслідок інокуляції люцерни відібраними транскон'югантами Т9 і К4 штаму 425а S. meliloti на коренях рослин утворювалися веретеноподібні поодинокі та у вигляді грон бульбочки рожевого забарвлення. У фазу початку утворення бобів загальна маса їх на 1 рослині була найбільшою (рис. 1 (А)). Протягом фаз цвітіння і початку утворення бобів симбіотичні системи люцерни, утворені за участю кон'югантів Т9 і К4, інтенсивніше забезпечували рослини симбіотрофним азотом порівняно з виробничим штамом 348а та іншими транскон'югантами (рис. 1 (Б)). Інокуляція кон'югантами Т9 і К4 забезпечувала прибавку урожаю надземної маси люцерни сорту Ярославна відповідно на 12,4 і 19,0% порівняно до варіанту із обробкою штамом 425а. Вміст протеїну в надземній масі рослин, інокульованих штамами S. meliloti 425а, Т9 і К4 дорівнював відповідно 14,8, 16,0 і 16,9%. Отримані результати свідчать про більшу ефективність селекціонованих транскон'югантів порівняно із штамом-стандартом 425а. Кон'юганти, яким притаманні невисокі вірулентність і азотфіксувальна активність, можуть бути використанні при дослідженні механізмів утворення неефективного бобово-ризобіального симбіозу.

Рис. 1. Динаміка наростання маси (А) і азотфіксувальної активності (Б) бульбочок у люцерни, інокульованої транскон'югантами штаму 425а S. meliloti.

Фаза розвитку рослин: І - початок бутонізації, ІІ - цвітіння, ІІІ - початок утворення бобів

Формування і функціонування симбіотичного апарату та продуктивність конюшини, інокульованої транскон'югантами бульбочкових бактерій R. leguminosarum bv. trifolii. Особливістю розвитку конюшини червоної, інокульованої кращими за симбіотичними ознаками транскон'югантами BN5, BN7 і BN9 R. leguminosarum bv. trifolii, є інтенсивне формування симбіотичних органів на коренях рослин. В умовах вегетаційного досліду у фазу кущіння конюшини маса бульбочок становила в середньому 12,0, 30,0, 17,0 мг, у фазу цвітіння - істотно збільшилась і складала відповідно 475,0, 461,0 і 581,0 мг на рослину, що супроводжувалося зростанням інтенсивності азотфіксації в середньому у 2,8 раза порівняно з рівнем азотфіксації у рослин, бактеризованих вихідним та виробничим штамами. Відмічено також стимулюючий вплив транскон'югантів BN5, BN7 і BN9 на ріст маси надземної частини рослин.

У польових дослідах (Черкаська і Київська обл.) за присутності у грунті „місцевих” рас ризобій, інокуляція конюшини транскон'югантами BN7 і BN9 забезпечила утворення в 1,6-1,8 раза більше бульбочок на сорті Дарунок і в 2,1 на сорті Кумач порівняно із інокуляцією виробничим штамом 348а (табл. 1). При цьому азотфіксувальна активність симбіотичних утворень на рослинах обох сортів збільшилась у середньому на 40%.

Ефективність інокуляції конюшини штамом BN9 засвідчує збільшення урожаю (середня врожайність двох укосів за 2 роки) зеленої маси у рослин сорту Дарунок на 40,4 ц/га (16,4%), а сорту Кумач - 33,7 ц/га (14,0%) порівняно із інокуляцією виробничим штамом 348а та зростання на 4,1% вмісту протеїну у надземній масі рослин першого укосу. На штам BN9 R. leguminosarum bv. trifolii отримано патент України (№ 21785, 2007 р.).

Отже, за результатами багаторічних досліджень встановлено, що конюшина активно інфікується транскон'югантами бульбочкових бактерій, які протягом 15 років зберігались в умовах музею і успадкували набуті властивості, результатом чого є збільшення урожаю зеленої маси рослин та покращення його якості.

Таблиця 1

Вплив інокуляції трансконюгантами R. leguminosarum bv. trifolii на симбіотичні властивості та урожай зеленої маси конюшини (польові досліди 2004-2007 рр.)

Варіант	Сорт
	Дарунок	Кумач
	Кількість бульбочок, шт./рослину	АвА	Урожай, ц/га	Кількість бульбочок, шт./рослину	АвА	Урожай, ц/га
Без інокуляції	31±3	0,12±0,02	236,8	13±2	0,09±0,01	224,4
Штам 348а (виробничий)	112±10	0,36±0,04	246,1	96±6	0,59±0,06	244,9
Транскон'югант
BN5	128±10	0,23±0,02	252,8	-	-	-
BN7	206±15	0,53±0,03	271,6	-	-	-
BN9	180±12	0,51 ±0,05	286,5	200±11	0,82±0,05	278,6
НІР 0,05			34,8			28,1

Примітка 1. Тут і в табл. 4 АвА - азотфіксувальна активність, мкмоль С2Н4/ (рослину•год), 2. - - досліди не проводили.

ТРАНСПОЗОНОВИЙ МУТАГЕНЕЗ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ SINORHIZOBIUM MELILOTI, RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV.TRIFOLII ТА BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM

Підбір штамів-реципієнтів та отримання Tn5-мутантів швидкорослих (S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii) та повільнорослих (B. japonicum) бульбочкових бактерій. Реципієнтів відбирали за ознаками: чутливістю до канаміцину (25-50 мкг/мл) і стійкістю до стрептоміцину (800-1000 мкг/мл). Всього проаналізовано 33 штами бульбочкових бактерій. Найбільш придатними реципієнтами для мобілізуючого штаму Escherichia coli S17-1 - донора плазміди pSUP2021::Tn5, який використовували при проведенні транспозонового мутагенезу, виявилися 2 штами R. leguminosarum bv. trifolii 348а, 8St, 2 штами - S. meliloti 441 і 425а - та штам B. japonicum 646 (табл. 2).

У результаті Tn5-мутагенезу штамів 425а і 441 S. meliloti та 348а R. leguminosarum bv. trifolii отримали відповідно 500 і 300 та 103 стійких до канаміцину (Kmr) їх мутантних клонів, а також 750 Tn5-мутантів ризобій сої. У штаму 8St R. leguminosarum bv. trifolii мутантів не отримали. Частота виникнення Kmr клітин залежала від генотипу бульбочкових бактерій,

Таблиця 2

Інтенсивність росту B. japonicam, S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii на середовищах із різними концентраціями антибіотиків

Концентрація антибіотиків, мкг/мл	Штам
	B. japonicam	S. meliloti	R. leguminosarum bv. trifolii
	646	425а	441	348а	8St
Без антибіотиків (контроль)	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
Канаміцин 25	+ +	+ +	+ +	+ +	+ +
Канаміцин 50	-	-	-	+	-
Стрептоміцин 800	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + + +
Стрептоміцин 1000	+ + +	+ + + +	+ + + +	*	*

Примітка. Ріст ризобій: + + + + - на рівні контролю; + + + - дещо слабший; + + - дуже слабкий; + - ледве помітний; - - відсутній; * - не визначали залучених до Tn5-мутагенезу і становила для S. meliloti 425а - 1,4·10-6, 441 - 1,7·10-7, R. leguminosarum bv. trifolii 348а - 1,9·10-7, B. japonicam 646 - 1,4·10-6 .

Особливості геному отриманих Tn5-мутантів бульбочкових бактерій. У результаті аналізу ДНК отриманих Tn5-мутантів методом ПЛР встановлено присутність фрагменту ДНК гену неоміцинфосфотрансферази транспозону Tn5 у бульбочкових бактерій люцерни Т17, Т23, І-2, конюшини Т2к, Т72к та сої Т66, Т21-2, що підтверджує набуту ними резистентність до канаміцину (200 мкг/мл) і є результатом інтеграції в їх геном транспозону Tn5 (рис. 2).



Рис. 2. Електрофорез в 0,7%-ному агарозному гелі продуктів ПЛР ампліфікації ДНК бульбочкових бактерій люцерни (1-4), конюшини (5-7), сої (8-10) та E.coli S17-1 (К) з використанням праймерів до гену неоміцинфосфотрансферази Tn5. 1 - вихідний штам S. meliloti 425а; Tn5-мутанти S. meliloti: 2 - Т17, 3 - T23, 4 - І-2; 5- вихідний штам R. leguminosarum bv. trifolii 348а; Tn5-мутанти R. leguminosarum bv. trifolii: 6 - Т2к, 7- Т72к; 8 - вихідний штам B. japonicum 646; Tn5-мутанти B. japonicum: 9 - Т66, 10 - Т21-2; М - маркер молекулярних мас.

ЕФЕКТИВНІСТЬ СИМБІОЗУ ЛЮЦЕРНИ ІЗ Tn5-МУТАНТАМИ SINORHIZOBIUM MELILOTI

Первинний скринінг Tn5-мутантів S. meliloti за вірулентністю, азотфіксувальною активністю та Eff++- фенотипом люцерни. У результаті первинного скринінгу 84 Tn5-мутантів штамів S. meliloti 441 і 425а за покращеними симбіотичними показниками: нодуляція (кількість утворених кореневих бульбочок), азотфіксувальна активність (відновлення ацетилену до етилену) та ефективність (збільшена надземна маса рослин) люцерни у стерильних мікровегетаційних дослідах відібрали 16, які перевищували штам-стандарт 425а за одним або одночасно за кількома показниками. Із них - 12 перевищують штам 425а за ефективністю (на 20,2-48,2%), 10 - за активністю нодуляції (на 24,2-68,7%), 12 - за інтенсивністю азотфіксації (на 24,2-100,5%). Відібрані Tn5-мутанти слугували базовим матеріалом для селекції високоактивних штамів бульбочкових бактерій - мікросимбіонтів люцерни.

Ефективність симбіотичної взаємодії люцерни і Tn5-мутантів S. meliloti в умовах вегетаційних дослідів. Встановлено, що ряд симбіотичних пар (люцерна + бульбочкові бактерії), утворених за участю Tn5-мутантів штамів S. meliloti 425а і 441, які в умовах мікровегетаційного досліду мали підвищені симбіотичні показники, стабільно зберігали їх рівень відносно штаму-стандарту 425а і в умовах вегетаційного досліду (рис. 3). Протягом онтогенезу у люцерни, інокульованої Tn5-мутантами, кількість та маса утворених бульбочок суттєво варіюювала в залежності від генотипу мікросимбіонта. Особливості формування симбіотичного апарату зумовили відмінності перебігу фізіолого-біохімічних процесів у рослин люцерни. Перспективними за господарсько-цінними ознаками є Tn5-мутанти Т15, Т17, Т21, Т24, Т37, І-2, І-7 і І-10. Інокуляція ними люцерни забезпечувала утворення симбіотичних систем із більшою азотфіксувальною активністю порівняно із бактеризацією штамом 425а.

Рис. 3. Ефективність симбіотичної взаємодії люцерни з Tn5-мутантами S. meliloti у порівнянні з виробничим штамом 425а (вегетаційні досліди)

Як наслідок, поліпшувалось азотне живлення рослин за рахунок його симбіотрофної форми, збільшувалася продуктивність і вміст азоту в надземній масі. Інокуляція люцерни малоактивним мікросимбіонтом Т18 обмежувала кількість асимільованого азоту, що надходив у надземні органи і включався у метаболізм. Рослини, недостатньо забезпечені азотом, формували меншу фітомасу із меншим вмістом азотних сполук.

Оцінка симбіозу сучасних сортів люцерни і Tn5-мутантів S. meliloti за ефективністю і особливостями функціонування симбіотичного апарату в умовах польового досліду. Відомо, що інтенсивність симбіотичної фіксації азоту варіює в залежності від сорту рослин та грунтово-кліматичних умов вирощування У результаті проведених багаторічних досліджень (2004-2008 рр.) встановлено, що люцерна посівна сортів Ярославна, Зайкевича, Зарниця і Ольга утворює ефективний симбіоз із Tn5-мутантами S. meliloti І-2, І-7, Т15, Т17, які характеризуються підвищеною комплементарністю. З'ясовано, що Tn5-мутанти S. meliloti І-2, І-7 інтенсивніше фіксують N2 у симбіозі із люцерною сортів Зайкевича і Ярославна, а мутанти Т15 і Т17 - із люцерною сортів Ольга, Зарниця, а також Ярославна порівняно із застосуванням виробничого штаму 425а (рис. 4).

Залежно від грунтово-кліматичних умов (Тернопільська, Київська обл.) і сорту люцерни інокуляція мутантами І-2 і І-7 забезпечувала прибавку урожаю зеленої маси на 33,5-55,1 ц/га (11,0-18,0%), а інокуляція Tn5-мутантом Т17 - на 39,4-48,2 ц/га (13,1-15,5%) порівняно з бактеризацією рослин штамом 425а (табл. 3).

Рис. 4. Азотфіксувальна активність різних сортів люцерни, за інокуляції активними Tn5-мутантами S. meliloti (польові досліди). І - перший та ІІ - другий рік вегетації люцерни

Таблиця 3

Урожай зеленої маси люцерни, інокульованої Tn5-мутантами S. meliloti (польові досліди 2004-2008 рр., середній із 2-х укосів за два роки )

Варіант	Урожай зеленої маси, ц/га	Прибавка до штаму 425а	Урожай зеленої маси, ц/га	Прибавка до штаму 425а
		ц/га	%		ц/га	%
	Сорт Ярославна	Сорт Ольга
Штам 425а	311,2			300,4
Tn5-мутант 425а:Т15	343,8	32,6	10,5	322,8	22,4	7,5
Т17	359,4	48,2	15,5	339,8	39,4	13,1
НІР 0,05	37,7	16,1
	Сорт Ярославна	Сорт Зайкевича
Штам 425а	311,2			310,5
Tn5-мутант 441: І-2	356,5	45,3	14,6	344,0	33,5	11,0
І-7	366,3	55,1	18,0	346,7	36,2	12,0
НІР 0,05	37,7	20,0

Встановлено, що функціонування бобово-ризобіального симбіозу люцерни і Tn5-мутантів Т15, Т17, І-2 і І-7 характеризується подовженим періодом активної фіксації азоту. У фазу стеблування інтенсивність асиміляції N2 симбіотичними системами була істотно вищою за рахунок більшої вірулентності Tn5-мутантів

І-2 та І-7 і генетично детермінованої активності нітрогеназного комплексу бактероїдів бульбочок утворених за їх участю (рис. 5). Із початком цвітіння люцерни інтенсивність азотфіксації кореневих бульбочок знижувалася у рослин усіх варіантів досліду. Проте у період формування генеративних органів (фази початок утворення бобів і утворення бобів) у рослин, інокульованих Tn5-мутантами Т15 і Т17 S. melilotі, азотфіксувальна активність тривалий час трималася на досить високому рівні і перевищувала інші варіанти досліду у 2,6-3,8 раза. Особливість селекціонованих Tn5-мутантів І-2, І-7 S. meliloti інтенсивніше асимілювати атмосферний азот у симбіозі із рослиною-господарем на початку її вегетативного розвитку (фаза стеблування) і Т15, Т17 - в період формування бобів у перспективі може бути використана при створенні комплексних азотфіксувальних препаратів із пролонгованою ефективністю дії. На один із кращих мікросимбіонтів люцерни - штам S. meliloti Т17 отримано патент України № 55432.

Рис. 5. Азотфіксувальна активність люцерни, інокульованої мутантними штамами S. meliloti (польовий дослід). Фаза розвитку люцерни: І- стеблування, ІІ - бутонізація, ІІІ - цвітіння, ІV - початок утворення бобів, V - утворення бобів

ЕФЕКТИВНІСТЬ СИМБІОЗУ КОНЮШИНИ ІЗ Tn5-МУТАНТАМИ RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. TRIFOLII

У результаті первинного скринінгу за симбіотичними показниками в умовах мікровегетаційних дослідів відібрано 11 Tn5-мутантів R. leguminosarum bv. trifolii, за інокуляції якими у конюшини червоної кількість бульбочок збільшувалась на 12,7-118,2%, азотфіксувальна активність на 13,7-85,8%, надземна маса рослин на 20,6-40,3%, порівняно із показниками рослин, інокульованих штамом-стандартом 348а. В умовах вегетаційних дослідів (табл. 4) три Tn5-мутанти R. leguminosarum bv. trifolii Т2к, Т28к, Т72к були в рівній мірі вірулентними і суттєво переважали решту за нодуляційною активністю у фази кущіння, бутонізації і цвітіння. Зокрема, у фазу початку цвітіння на конюшині за їх участю було сформувано у 1,4-1,7 раза більше бульбочок, які домінували за масою. Надземна маса рослин збільшилась на 29,6-41,8% при посиленні ризогенезу. Інтенсифікація фізіологічних процесів у конюшини забезпечувалася збільшенням нітрогеназної активності симбіотичного апарату, яка у фазу початку цвітіння перевищувала в середньому у 2,5 раза показники рослин інокульованих

Таблиця 4

Вплив інокуляції Tn5-мутантами R. leguminosarum bv. trifolii на симбіотичні властивості та продуктивність конюшини (фаза - початок цвітіння)

Варіант	АвА	Маса бульбочок, мг	Кількість бульбочок, шт./рослину	Суха надземна маса, г/посудину
				І укіс	ІІ укіс	Урожай за 2 укоси	± до штаму 348а, %
Штам 348а	1,82±0,12	141,2±8,4	77,2±2,6	12,7	10,9	23,6
Tn5-мутант
Т2к	4,20±0,34	145,7±11,9	132,6±12,1	14,3	12,2	26,5	+ 12,3
Т28к	5,13±0,68	168,8±10,9	120,2±13,0	14,7	11,9	26,6	+ 12,7
Т29к	2,53±0,18	154,5±16,8	79,6±7,9	11,7	10,9	22,5	- 4,8
Т40к	2,96±0,27	121,6±12,0	105,5±9,2	12,8	10,8	23,6	- 0,4
Т72к	4,42±0,41	195,8±13,7	133,6±14,0	14,3	13,7	27,9	+ 18,2
НІР0,05		1,4	1,0	1,2

штамом 348а. Таким чином, вперше отримані високоактивні Tn5-мутанти бульбочкових бактерій R. leguminosarum bv. trifolii Т2к, Т28к і Т72к, внаслідок симбіотичної взаємодії із якими рослини конюшини набули здатності до більш інтенсивної фіксації атмосферного азоту, що забезпечувало збільшення їх продуктивності порівняно із функціонуванням симбіозу за участю виробничого штаму 348а.

ЕФЕКТИВНІСТЬ СИМБІОЗУ СОЇ ІЗ Tn5-МУТАНТАМИ

Bradyrhizobium japonicum

Селекція Tn5-мутантів B. japonicum за симбіотичними властивостями та Eff+-фенотипом рослин. У результаті скринінгу за симбіотичними показниками 70-ти мутантів штаму 646 B. japonicum в умовах мікровегетаційного, вегетаційного та дрібноділянкових польових дослідів відібрані 4 активні Tn5-мутанти Т3-11, Т118, Т130-4 і Т66, які забезпечували інтенсивнішу асиміляцію N2 в бульбочках сої, поліпшували азотне живлення рослин, що сприяло стимуляції їх вегетативного росту в більшій мірі ніж вихідний 646 і виробничий 634б штами. У подальшому ці Tn5-мутанти використали для створення високоефективних симбіотичних систем сої.

Азотфіксувальна активність, бульбочкоутворення, вегетативний ріст та продуктивність сої залежно від штаму-інокулянту в умовах польового досліду. Бактеризація сої Tn5-мутантами B. japonicum Т118 і Т66 забезпечувала збільшення маси бульбочок на 36,4-41,2% порівняно з інокуляцією рослин виробничим штамом 634б (табл. 5). У сої, як і інших зернобобових культур, ефективність симбіозу суттєво обмежена тим, що у фазі дозрівання зерна активність ферменту нітрогенази бульбочок помітно знижується порівняно із фазами бутонізації і цвітіння. Адже період утворення бобів супроводжується відтоком асимілятів до генеративних органів, у результаті призупиняється активний ріст вегетативної маси рослин, різко знижується азотфіксувальна активність бульбочок. У рослин сої, інокульованих Tn5-мутантами B. japonicum Т118 і Т66, зниження рівня активності було значно меншим. У фазу утворення бобів азотфіксувальна активність бульбочок за участю Tn5-мутанта Т118 дорівнювала 9,2, Т66 - 9,6, а штамів 634б і 646 - відповідно 3,6 та 3,7 мкмоль C2H4 / (рослину ·год) (табл. 5).

Таблиця 5

Ефективність інокуляції сої сорту Мар'яна Tn5-мутантами B. japonicum (польові досліди 2005-2007 рр., Черкаська обл.)

Варіант	Азотфіксація, мкмоль С2Н4 / (рослину · год)	Маса бульбочок, г	Середній урожай, ц/га	± до штаму 634б
	Фаза розвитку рослин		ц/га	%
	цвітіння	утворення бобів
Без інокуляції	-	-	-	24,5	- 2,0	- 7,6
штам 634б (виробн.)	33,4±1,8	3,6±0,4	0,85±0,01	26,5	-	-
штам 646(вихідний)	27,5±2,6	3,7±0,2	0,99±0,01	25,9	- 0,6	- 2,3
Tn5-мутант: Т3-11	33,1±3,3	5,3±0,1	1,07±0,06	27,7	+ 1,2	+ 4,5
Т118	34,0±2,7	9,2±0,8	1,16±0,10	28,7	+ 2,2	+ 8,3
Т66	45,8±3,0	9,6±0,2	1,20±0,09	32,7	+ 6,2	+ 23,4
Т130-4	23,1±1,4	3,0±0,3	0,15±011	27,4	+ 0,9	+ 3,4
НІР 0,05			2,5

Таким чином, вперше показано, що інокуляція сої новими Tn5-мутантами B. japonicum Т66 і Т118 забезпечує утворення бульбочок, здатних до інтенсивнішої асиміляції атмосферного азоту у фазу утворення бобів, порівняно із вихідним та штамом-стандартом і тим самим збільшує надходження біологічного азоту у рослини у період наливу зерна. У перспективі ці штами можуть бути використані як мікросимбіонти середньо- та пізньостиглих сортів сої. Приріст урожаю зерна за інокуляції мутантом Т118 становив 2,8 ц/га (10,8%), а Т66 - 6,8 ц/га (26,3%) порівняно до вихідного штаму 646 і відповідно 2,2 ц/га (8,3%) та 6,2 ц/га (23,4%) порівняно зі штамом 634б B. japonicum.

Таким чином, вивчення ефективності інокуляції сої Tn5-мутантами B. japoniсum показало, що в умовах польового досліду ці бактерії здатні утворювати на коренях активні бульбочки, що приводить до посилення симбіотичної азотфіксації, підвищення врожаю надземної маси рослин та сприяє нагромадженню у ній сухої речовини і білка.

Дослідження ефективності застосування Tn5-мутанта Т66 B. japoniсum при вирощуванні сої, проведені в різних агрокліматичних умовах (Черкаській і Київській областях), виявили беззаперечну його перевагу над виробничим і вихідним штамами. На штам Т66 B. japoniсum отриманий патент України (№ 83298, 2008 р.).

ФІЗІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ БОБОВИХ РОСЛИН У СИМБІОЗІ ІЗ ВИСОКОАКТИВНИМИ МУТАНТАМИ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ

Вплив інокуляції генетично зміненими активними бульбочковими бактеріями S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii і B. japonicum на стан асиміляційного апарату та накопичення хлорофілу у рослини-господаря. При аналізі біометричних показників досліджуваних рослин встановлено видові особливості їх розвитку під впливом інокуляції. Так, інокуляція люцерни рекомбінантними штамами приводила до інтенсивнішого галуження та росту пагонів, формування вищого травостою, збільшення площі листкової поверхні порівняно із рослинами, інокульованими вихідним та виробничим штамами. У рослин сої, інокульованих Tn5-мутантами Т3-11 і Т66 B. japonicum, у фазу бутонізації висота стебел була більшою на 11,0 і 18,7 см, ніж у інокульованих штамом 634б. У конюшини за інокуляції активними транскон'югантами R. leguminosarum bv. trifolii інтенсивніше відбувалось кущіння. Загальною ознакою для всіх дослідних культур було збільшення фотосинтетичного апарату під дією інокуляції активними штамами (рис. 6). Найвищі показники вмісту фотосинтетичних пігментів - хлорофілів a і b - у листках рослин люцерни відмічали за інокуляції активними мутантами І-2, Т17, конюшини - BN9, сої - Т66 порівняно із рослинами, бактеризованими виробничими штамами відповідно 425а, 348а та 634б.



Рис. 6. Вміст хлорофілів у листках люцерни, сої та конюшини (фаза бутонізації), за умов інокуляції активними рекомбінантними штамами бульбочкових бактерій

Вміст азоту і протеїну в надземній масі рослин, інокульованих активними мутантами бульбочкових бактерій. Рівень вмісту білкових речовин у вегетуючих рослин - один із головних критеріїв їх господарської цінності. Нагромадження білка в рослинах є ознакою, яка найтісніше пов'язана із інтенсивністю азотфіксації. Інокуляція селеціонованими штамами із підвищеною азотфіксувальною активністю забезпечувала накопичення більшого вмісту азоту і протеїну в надземній масі рослин. Вміст протеїну в листках люцерни, за обробки насіння активними Tn5-мутантами Т15, Т17 був на 1,4-3,8 абс. % більшим ніж у рослин інокульованих штамом 425а. Інокуляція конюшини транскон'югантами BN5, BN7 та BN9 приводила до збільшення вмісту протеїну в надземній масі в середньому на 2,8-4,1 абс. % у рослин першого і на 0,3-1,3 абс. % - другого укосу. Найбільше протеїну в повітряно-сухій речовині містила конюшина, інокульована транскон'югантом ВN9 R. leguminosarum bv. trifolii.

Фізіологічна реакція люцерни і сої на iнокуляцiю сумішшю активного Tn5-мутанта і неактивного штаму бульбочкових бактерій. Відносна конкурентоздатність Tn5-мутантів бульбочкових бактерій. Важливим фактором, який регулює становлення симбіозу бобових рослин і інтродукованих у біоценози штамів-інокулянтів бульбочкових бактерій, є здатність останніх конкурувати із мікробною біотою грунту і зокрема із специфічними штамами ризобій. Особливістю онтогенезу рослин, інокульованих сумішшю культур ризобій (активний Tn5-мутант+неактивний конкурентоздатний штам-тестор), є сповільнення росту надземної маси та активація ризогенезу. Рівень зниження показників кількості, маси та азотфіксувальної активності бульбочок рослин залежав від активності мікросимбіонта. Активні Tn5-мутанти B. japonicum і S. meliloti в різній мірі послаблювали “агресивний” вплив високонкурентних неактивних штамів (відповідно 604к та СХМ1-48). Конкурентоздатність штаму 425а і нових Tn5-мутантів І-2 і Т17 S. meliloti становила 78, 70,0 і 80,0% на сорті Ярославна, а штаму 634б і Tn5-мутантів Т66, Т21-2 B. japonicum на сої сорту Мар'яна відповідно 84, 89 і 94%, що дозволяє рекомендувати їх для виготовлення бактеріальних добрив під сою та люцерну з метою підвищення їх продуктивності.

Взаємозв'язок азотфіксації і фотосинтезу як основних складників продукційного процесу у люцерни, інокульованої Tn5-мутантами S. meliloti. У бобових рослин існує взаємозв'язок між процесами азотфіксації і фотосинтезу, проте ступінь його прояву і кількісні характеристики залишаються дискусійними (Heichel, 1984, Коць та ін., 1995, 1999, Shabayev et al., 1996, Kaelke, Dawson, 2003), а при функціонуванні симбіотичних систем бобових рослин за участю Tn5-мутантів - взагалі нерозкритими. Кількісні характеристики взаємозв'язку між процесами асиміляції вуглецю і азоту вивчали за інокуляції рослин різними за ефективністю генотипами ризобій, на фоні низького вмісту мінерального азоту в субстраті. За результатами наших досліджень у люцерни у фази прихованої бутонізації і цвітіння зв'язок між інтенсивністю азотфіксації і фотосинтезом описувався логарифмічною залежністю (R2=0,86) з тенденцією до насичення (рис. 7А). Очевидно, існує деяке оптимальне співвідношення між забезпеченістю рослин азотом та інтенсивністю фотосинтезу, оскільки значна частина фракції азоту в листках припадає на долю ключового ферменту асиміляції CO2 - Рубіско (Horton, 2000), накопичення якого у великих кількостях може супроводжуватися зниженням його сумарної активності на одиницю білка внаслідок неможливості підтримання всіх молекул в активному стані іншим ферментом - активазою Рубіско (Portis, 2003). Проте, це не слід розглядати як негативне явище, оскільки білки листків є мобілізаційним резервом азоту для наливу зерна, що особливо актуально для бобових.

У цей же період розвитку люцерни нами встановлений тісний зв'язок (R2=0,95) між інтенсивністю азотфіксації і масою рослини, який описувався квадратним рівнянням і при значеннях азотфіксації більших ніж 1,5 мкмоль C2Н4/(рослину · год) крива маси практично досягала плато (рис. 7Б). Ймовірно, існування ''плато'' обумовлено збільшенням енергозатрат рослини на фіксацію молекулярного азоту з підвищенням активності симбіотичного апарату, що може привести до ситуації, коли фотосинтез не в змозі забезпечити повною мірою потреби ростових процесів рослини-господаря у асимілятах і енергозатрати його симбіонтів. Атрагуюча сила бульбочок, вірогідно, вище атрагуючої сили у ростових меристем рослини, тому у фазу цвітіння, коли спостерігається висока активність симбіотичної азотфіксації, відбувається гальмування вегетативного росту люцерни (не зважаючи на високу інтенсивність фотосинтезу) внаслідок відтоку асимілятів у бульбочки та їх втрат у результаті виділення СО₂ в ході дихання, необхідного для забезпечення енергією нітрогеназного комплексу. Дійсно, збільшення нітрогеназної активності бульбочок супроводжувалося підвищенням інтенсивності дихання коренів. Цей зв'язок описувавсь степеневою функцією далекою від насичення (R²=0,86) (рис. 7В) у досліджуваному діапазоні цих фізіологічних параметрів. Причому зв'язок інтенсивності дихання з азотфіксувальною активністю був виражений сильніше ніж із масою коренів (R²=0,80) (рис. 7Г), що свідчить про провідну роль симбіотичного апарату в формуванні енергетичного статусу кореневої системи бобових.

Отже, для максимальної реалізації потенціалу високоефективних штамів бульбочкових бактерій необхідні комплементарні їм генотипи рослин із фотосинтетичним апаратом, здатним до адекватного збільшення інтенсивності асиміляції СО₂ і збалансованого забезпечення асимілятами як симбіотичного апарату, так і ростових процесів самого макросимбіонта.

Рис. 7. Зв'язок (А) - між інтенсивністю азотфіксації і асиміляції СО₂ рослин, (Б) - між інтенсивністю азотфіксації і масою цілих рослин люцерни, (В) - між азотфіксувальною активністю бульбочок і диханням коренів, (Г) - між загальною масою коренів і їх диханням у люцерни, інокульованої різними за ефективністю Tn5-мутантами штаму 425а S. meliloti. Трикутниками позначені варіанти з інокуляцією малоактивним мутантом Т18, прямими лініями - кути нахилу ділянок кривої, які відносяться до фази скритої бутонізації і цвітіння

ВИСНОВКИ

1. Уперше показано, що транскон'юганти бульбочкових бактерій люцерни та конюшини, які протягом тривалого часу (15 років) зберігались в умовах музею і вирізняються стабільністю ознак, набутих у процесі кон'югації, здатні утворювати високоефективний симбіоз із рослиною-господарем, результатом чого є активізація фотосинтетичних процесів за рахунок максимального використання симбіотрофного азоту та підвищення продуктивності рослин на 12,0-16,4% порівняно із виробничими штамами.

2. Методом транспозонового мутагенезу при використанні плазміди pSUP2021::Tn5 отримані активні Tn5-мутанти швидкорослих (S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii) і повільнорослих (B. japonicum) бульбочкових бактерій із поліпшеними ознаками „вірулентність”, „азотфіксація” та „ефективність симбіозу”, які є цінним генетичним і селекційним фондом для підвищення інтенсивності біологічної азотфіксації бобовими рослинами.

3. Молекулярно-генетичний аналіз показав наявність гена неоміцинфосфотрансферази транспозону Tn5 у мутантів бульбочкових бактерій S. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii і B. japonicum, що свідчить про інтеграцію в їх геном транспозону Tn5 і підтверджує набуту резистентність бактерій до канаміцину (200 мкг/мл).

4. Між інтенсивністю азотфіксації і фотосинтезом рослин люцерни існує тісний позитивний зв'язок (R2=0,86), який описувався логарифмічною залежністю. Збільшення нітрогеназної активності бульбочок супроводжувалося підвищенням інтенсивності дихання коренів, причому зв'язок цього процесу з азотфіксувальною активністю був виражений сильніше (R2=0,86), ніж із масою коренів рослини (R2=0,80).

5. Виявлено тісний зв'язок між інтенсивністю азотфіксації і масою рослин люцерни (R2=0,95), який мав тенденцію до насичення при високих значеннях інтенсивності азотфіксації (вище 1,5 мкмоль С2Н4 /(рослину • год).

6. Люцерна посівна утворює ефективний симбіоз із активними Tn5-мутантами І-2, І-7, Т15, Т17 S. meliloti, які характеризуються підвищеною комплемен-тарністю до сортів Ярославна, Зайкевича, Зарниця і Ольга, що обумовлює залежно від грунтово-кліматичних умов і сорту рослин прибавку урожаю зеленої маси в межах 33,5-55,1 ц/га (11,0-18,0%) порівняно з бактеризацією виробничим штамом 425а.

7. Ефективні симбіотичні системи люцерни, утворені за участю Tn5-мутантів І-2, І-7, Т15 і Т17, протягом вегетаційного періоду мають пролонгований характер активної асиміляції атмосферного азоту, який проявляється в інтенсифікації процесу азотфіксації за рахунок прискореного формування симбіотичного апарату на ранньому етапі розвитку та компенсації зниження асиміляційних процесів внаслідок більшої маси бульбочок у фазу утворення бобів, що розкриває перспективу створення полікомпонентних азотфіксувальних препаратів.

8. У ефективній симбіотичній системі Glycine max (L.) Merr. - Т66 B. japonicum інтенсифікація процесу асиміляції N2 зумовлює стимуляцію вегетативного росту рослин, біосинтетичних процесів і сприяє збільшенню зернової продуктивності на 6,2-6,8 ц/га (23,4-26,3%) порівняно з бактеризацією виробничим 634б та вихідним 646 штамами.

9. Рекомбінантні штами бульбочкових бактерій люцерни і сої характеризуються високою конкурентоздатністю (відповідно 70,0-80,0% та 84-94%) - однією із провідних ознак при формуванні ефективних симбіозів із високим продукційним потенціалом.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Воробей Н.А. Дослідження симбіотичних систем сої, утворених за участю транспозантів Bradyrhizobium japonicum / Н.А. Воробей, С.Я. Коць, С.М. Маліченко, Р.А. Якимчук // Физиология и биохимия культ. растений. - 2006. - Т. 38, № 5. - С. 418-426. (Особистий внесок 85%).

2. Воробей Н.А. Ефективність симбіотичних систем люцерни за інокуляції Tn5-мутантами Sinorhizobium meliloti / Н.А. Воробей, С.Я. Коць, І.М. Бутницький // Физиология и биохимия культ. растений. - 2007. - Т. 39, № 2. - С. 105-113. (Особистий внесок 75%).

3.Воробей Н.А. Симбіотичні властивості та стабільність плазмідних маркерів у музейних транскон'югантів Sinorhizobium meliloti /Н.А. Воробей // Физиология и биохимия культ. растений. - 2005. - Т. 37, № 4. - С. 341-348.

4.Воробей Н.А. Характеристика транскон'югантів бульбочкових бактерій Rhizobium leguminosarum bv. trifolii після тривалого зберігання в умовах музею / Н.А. Воробей, С.К. Береговенко, В.К. Даценко, Л.А. Кудрявченко // Физиология и биохимия культ. растений. - 2004. - Т. 36, № 1. - С. 64-71. (Особистий внесок 75%).

5.Воробей Н.А. Азотфіксувальна активність та ріст вегетативних органів люцерни за сумісної інокуляції суспензіями на основі активного і неактивного штамів Sinorhizobium meliloti / Н.А. Воробей, С.Я. Коць // Физиология и биохимия культ. растений. - 2009. - Т. 41, № 2. - С. 162-167. (Особистий внесок 80%).

6.Киризий Д.А. Взаимосвязь азотфиксации и фотосинтеза как основных составляющих продукционного процесса у люцерны / Д.А. Киризий, Н.А. Воробей, С.Я. Коць // Физиология растений. - 2007.- Т. 54, № 5. - С. 666-671. (Особистий внесок 60%).

7.Пат. № 83298 Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum T66 для одержання бактеріального добрива під сою. Коць С.Я., Маліченко С.М., Воробей Н.А., Даценко В.К., заявл. 25.10.2006, опубл. 25.06.2008. Бюл. № 12. (Особистий внесок 65%).

...