Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. КАРАЗІНА

УДК [612.66+616-092.19]:577.15

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Спеціальність 03.00.04 - Біохімія

Вікові особливості зміни активності ферментів катаболізму альдегідів у серці щурів при іммобілізаційному стресі

Грабовецька Євгенія Романівна

Харків - 2009

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Державній установі «Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України».

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Давидов Вадим В'ячеславович, ДУ «Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України», завідувач лабораторії вікової ендокринології та обміну речовин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України, завідувач кафедри біохімії доктор медичних наук, старший науковий співробітник Новікова Світлана Миколаївна, ДУ «Інститут геронтології АМН України», головний науковий співробітник лабораторії регуляції метаболізму

Захист відбудеться “ 13 ” 01 2010 р. о 16⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету іменi В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету іменi В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ 08” 12 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В.М. Дзюба.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Актуальною проблемою сучасної біології та медицини є з'ясування механізмів альтерації тканин внутрішніх органів за умов стресу та модуляції їх стійкості до стресорного ушкодження в процесі онтогенезу. Це обумовлено особливим значенням стресу у виникненні серцево-судинних захворювань та патології центральної нервової системи (Меерсон Ф.З., 1984; Rozanski A. et al., 1999; Giallauria F. et al., 2007). У процесі онтогенезу відбуваються зміни чутливості міокарда до дії шкідливих факторів стресу (Фролькис В.В., 1994; Lakatta E.G., 2001; Davydov V.V., Shvets V.N., 2001, 2003), що може бути однією з причин виникнення вікової патології серця при старінні (Фролькис В.В., Мурадян Х.К., 1992).

Дослідженнями багатьох авторів було встановлено особливу роль стимуляції вільнорадикальних процесів у виникненні стресорних ушкоджень серця (Меерсон Ф.З., 1984; Барабой В.А., 1991; Davydov V.V., Shvets V.N., 2001; Nayanatara A.K. et al., 2005; Giallauria F. et al., 2007). Важливе значення в модуляції стійкості міокарда до шкідливої дії факторів стресу можуть мати вікові зміни експресії генів антиоксидантних ферментів і ензимів, що беруть участь в репарації пошкоджених клітин (Madamanchі N.R. et al., 2001; Mіkhaіlova O.N. et al., 2005; Stephens J.W. et al., 2008). Останнім часом у літературі все частіше висловлюється думка про те, що чутливість клітин до вільнорадикального ушкодження багато в чому залежить від стану ферментативних систем, що забезпечують утилізацію цитотоксичних карбонільних продуктів обміну (Chen J.J., Yu B.P., 1996; Sіems W.G. et al., 1998; Davydov V.V. et al., 2004; Lassen N. et al., 2006; Chen C.H. et al., 2008; Wenzel P. et al., 2008; Jіa Z. et al., 2008). Однак вивченню їхньої участі в антистресорному захисті міокарда й вікової модуляції чутливості серця до стресу дотепер ще не приділялося належної уваги. До того ж, вивчення вікових аспектів зміни стійкості міокарда до стресу зазначено тільки в геронтологічних дослідженнях (Литошенко А.Я., 1989; Фролькис В.В., Мурадян Х.К., 1992; Фролькис В.В. и соавт. 1994; Lakatta E.G., 2001). Проте чутливість організму до стресу зростає не тільки при старінні, але й на ранніх етапах онтогенезу. Особливе значення має період статевого дозрівання, коли підвищується сприйнятливість організму до зовнішніх несприятливих впливів. Однією з основних причин цього явища може бути зниження стійкості тканин внутрішніх органів до вільнорадикального ушкодження. Проте систематизованих даних з цього питання наразі не існує. Крім того, в літературі відсутні відомості щодо особливостей функціонування ферментів катаболізму цитотоксичних карбонільних продуктів вільнорадикального окиснення в тканинах внутрішніх органів у пубертатному віці. Всебічне вивчення цих питань буде сприяти розширенню існуючих уявлень про механізми вікових змін чутливості серця до стресу й розробки нового перспективного підходу до підвищення стійкості міокарда до стресорного ушкодження шляхом безпосереднього впливу на швидкість процесів катаболізму ендогенних альдегідів у міокардіальних клітинах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в межах держбюджетної теми ДУ «Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України» “Вивчити особливості стресорної модуляції систем захисту тканин внутрішніх органів від вільнорадикального ушкодження в щурів на різних етапах статевого дозрівання” (N державної реєстрації 0105U002436).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення активності ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у субклітинних фракціях серця щурів різного віку й з'ясування особливостей її модуляції за умов іммобілізаційного стресу.

Для реалізації зазначеної мети було визначено такі завдання:

1) дослідити активність NAD⁺- і NADP⁺-залежних альдегіддегідрогеназ, NADН(NADPН)-альдегідредуктаз й глутатіонтрансферази у постмітохондріальній фракції міокарда щурів різного віку: інтактних і тварин, які зазнали іммобілізаційного стресу;

2) оцінити особливості модуляції активності глутатіонтрансферази постмітохондріальної фракції міокарда інтактних щурів різного віку під впливом продуктів вільнорадикального окиснення, зміни рН середовища й зменшення концентрації субстрату;

3) визначити активність NAD⁺-залежної альдегіддегідрогенази, NADН-альдегідредуктази й глутатіонтрансферази у мітохондріальній фракції міокарда щурів різного віку: інтактних і тварин, які зазнали іммобілізаційного стресу;

4) вивчити вміст продуктів вільнорадикального окиснення ліпідів і карбонільованих білків у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях міокарда щурів різного віку: інтактних і тварин, які зазнали іммобілізаційного стресу;

Об'єкт дослідження - процес утилізації ендогенних альдегідів у серці щурів різних вікових груп: інтактних і тварин, які зазнали іммобілізаційного стресу.

Предмет дослідження - активність альдегіддегідрогенази, альдегідредуктази й глутатіонтрансферази, регуляція активності глутатіонтрансферази постмітохондріальної фракції міокарда продуктами вільнорадикального окиснення, вміст карбонільних продуктів вільнорадикального окиснення у серці.

Методи дослідження: спектрофотометрія у видимій і ближній ультрафіолетовій області спектра (визначення активності ферментів і вмісту продуктів вільнорадикального окиснення); спектрофлуориметрія (вимір концентрації маркерів стресу в крові й шиффових основ у субклітинних фракціях міокарда); диференційне центрифугування (фракціонування гомогенатів міокарду), статистичний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів визначається вперше представленими даними про активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у субклітинних фракціях серця щурів різних вікових груп. Установлено, що в постмітохондріальній фракції міокарда тварин пубертатного віку вона має мінімальну, а в старих щурів - максимальну величину. Активність мітохондріальних ферментів катаболізму карбонільних продуктів обміну найвища в 1,5- і 24-місячних тварин. У віці від півтора до 12 місяців її величина поступово знижується, досягаючи мінімуму в дорослих статевозрілих щурів.

Уперше показано, що глутатіонтрансферазна активність постмітохондріальної фракції міокарда зменшується під впливом глутарового альдегіду, а також при зниженні рН реакційної суміші й при зниженні концентрації відновленого глутатіону, у більшій мірі в 2- і 24-місячних тварин, ніж у дорослих щурів і тварин раннього пубертатного віку.

Виявлено, що за умов іммобілізаційного стресу в постмітохондріальній фракції серця щурів 1,5-, 2- і 12-місячного віку обмежується активність ензимів, що каталізують окисно-відновні перетворення ендогенних альдегідів. У мітохондріальній фракції міокарда тварин пубертатного віку під впливом стресу виникають зрушення різних напрямків в активності альдегіддегідрогенази, альдегідредуктази й глутатіонтрансферази. У результаті їх появи в 2-місячних щурів підвищується величина сумарної ферментативної активності, що не характерно для тварин інших вікових груп.

Установлено, що зміни активності ферментів катаболізму альдегідів в 2-місячних іммобілізованих щурів супроводжуються підвищенням концентрації ТБК-реактивних речовин і шиффових основ у постмітохондріальній фракції й ТБК-реактивних речовин - у мітохондріальній фракції міокарда. В 1,5-місячних тварин вміст ТБК-реактивних речовин після іммобілізації зростає тільки в мітохондріальній фракції серця. Водночас в 12- і 24-місячних щурів іммобілізаційний стрес не супроводжується підвищенням рівня ТБК-реактивних речовин у досліджених субклітинних фракціях міокарда.

Уперше отримано експериментальні дані про те, що за умов стресу в щурів пубертатного віку, у більшій мірі в 2-місячних тварин, гальмується процес утилізації ендогенних альдегідів у серці. Таке зрушення може бути одним з факторів підвищення чутливості міокарда до стресорних ушкоджень у періоді статевого дозрівання.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють існуючі уявлення про механізми вікових змін стійкості серця до дії шкідливих факторів стресу. Вони вказують на особливу роль гальмування утилізації карбонільних продуктів вільнорадикального окиснення в міокардіальних клітинах у підвищенні чутливості серця до стресу на етапі статевого дозрівання.

Результати проведених досліджень створюють теоретичні передумови для розробки нового перспективного підходу до корекції стійкості міокарда до стресорних ушкоджень у пубертатному віці, пов'язаного зі спрямованим підвищенням швидкості процесів утилізації ендогенних альдегідів у серці.

Результати проведеного дослідження впроваджені у навчальний процес на кафедрі клінічної біохімії та судово-медичної токсикології Харківської медичної академії післядипломної освіти і кафедрі лабораторної діагностики Національного фармацевтичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дослідження виконано під керівництвом доктора медичних наук, професора В.В. Давидова, з яким автор має спільні публікації. Результати, представлені в рукопису, отримано автором самостійно. Автором особисто проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку й аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлено на науково-практичній конференції «Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики» (Харків, 2008); щорічній науковій конференції молодих вчених ДУ «Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України» (Харків, 2008); науковій конференції молодих вчених з міжнародною участю «Актуальні питання геронтології та геріатрії», присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2009); міжвузівській конференції молодих вчених та студентів «Медицина третього тисячоліття» (Харків, 2009); ХІІІ міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2009); ІІ міжнародному науковому міждисциплінарному конгресі студентів-медиків і молодих вчених ISIC (Харків, 2009);V міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2009); VІІ міжрегіональній науковій конференції «Актуальні питання біології та медицини» (Луганськ, 2009), V міжнародній Кримській конференції «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, 2009).

Публікації. Основні положення роботи викладено в 12 наукових публікаціях, серед яких 4 статті у фахових наукових виданнях, які включені в перелік, затверджений ВАК України, й 8 - у збірниках тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 179 сторінках друкованого тексту й складається зі вступу, огляду літератури, методів дослідження, трьох глав власних досліджень, обговорення результатів, висновків і списку цитованої літератури, що містить 280 джерел. Роботу ілюстровано 13 таблицями й 37 рисунками.

Основний зміст роботи

Огляд літератури містить аналіз сучасного стану питання про механізми формування оксидативного стресу, участь карбонільних продуктів вільнорадикального окиснення в реалізації його шкідливих ефектів і вікові особливості чутливості клітин до оксидативного стресу. Велика увага приділяється розгляду механізмів утилізації ендогенних альдегідів у ферментативних реакціях і даним літератури щодо особливості зміни активності ферментів, що каталізують перетворення карбонільних продуктів метаболізму в тканинах внутрішніх органів під впливом стресу й у процесі старіння.

Матеріали і методи дослідження. Роботу виконано на 122 щурах самцях лінії Вістар, які утримувалися в умовах віварію ДУ «Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України». Усіх тварин забезпечували стандартним раціоном харчування. Щурів поділяли на чотири вікові групи: I - 1,5-місячні (ранній пубертатний період); II - 2-місячні (пізній пубертатний період), III - 12-місячні (дорослі статевозрілі), IV - 24-місячні (старі). Окрім того, кожну групу тварин поділяли на дві підгрупи: 1 - інтактні; 2 - щури під впливом іммобілізаційного стресу.

Для відтворення моделі іммобілізаційного стресу тварин фіксували за кінцівки спиною до нерухомої опори на 5 годин на день, два дні поспіль. Після цього їх негайно декапітували під легким ефірним наркозом. Ефективність відтворення іммобілізаційного стресу контролювали за рівнем адреналіну в крові (Atrac C., Madnusson T.A., 1978).

З міокарда лівого шлуночка серця за допомогою скляного гомогенізатора Поттера-Ельвегейма готували 10% гомогенати на середовищі гомогенізації, що містить 0,05 М Трис, 0,005 М сульфату магнію й 0,001 М ЕДТА (рН 7,4). Отримані гомогенати центрифугували при 1000 g протягом 10 хв. у центрифузі Опн-8. Відділяли супернатант і центрифугували його при 10000 g протягом 20 хв. у рефрижераторній центрифузі РС-6 за допомогою насадки пришвидшеної дії. Надосадову рідину, що представляє собою постмітохондріальну фракцію, збирали й заморожували при -20^оС. Осад суспендували з 3 мл середовища гомогенізації. Суспензію центрифугували при 10000 g протягом 20 хв. у центрифузі РС-6. Отриманий осад мітохондрій суспендували з 1 мл середовища гомогенізації й заморожували при -20^оС. Усі процедури з фракціонування гомогенатів міокарда проводили при 4 - 5 ^оС.

У субклітинних фракціях визначали активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів. Активність NAD⁺-залежної альдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3) і NADР⁺-залежної альдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.4) визначали за методом Пирожков С.В., Панченко Л.Ф. (1988). Для визначення ферментативної активності суспензію субклітинної фракції вносили у кварцову спектрофотометричну кювету, що містить (кінцеві концентрації): 0,05 М пірофосфатного буфера (рН 9,0), 0,01 М глутарового альдегіду, 0,005 М ротенону, 0,01 М піразолу й 0,0001 М окисленого NAD (NADP). Швидкість реакції вимірювали за зміною оптичної густини при 340 нм на спектрофотометрі СФ-46. Ферментативну активність виражали в нмоль NAD⁺(NADP⁺) / мг білка · хв.

Активність NADН(NADРН)-альдегідредуктази (КФ 1.1.1.21) визначали за методом Srіvastava S. et al. (2001). Для визначення ферментативної активності суспензію субклітинної фракції вносили в кювету спектрофотометра, що містить (кінцеві концентрації): 0,05 М калій-фосфатного буфера (рН 6,5), 0,01 М глутарового альдегіду й 0,0001 М відновленого NAD(NADP). Швидкість реакції вимірювали за зміною оптичної густини при 340 нм. Ферментативну активність виражали в нмоль NADН(NADPН) / мг білка · хв.

Активність глутатіонтрансферази (КФ 2.5.1.18) визначали за методом Mannervіk B. and Guthenberg C. (1981) з деякими модифікаціями. Для цього суспензію субклітинної фракції вносили в кювету спектрофотометра, що містить (кінцеві концентрації): 0,1 М калій-фосфатного буфера (рН 6,5), 0,001 М динітрохлорбензолу й 0,005 М відновленого глутатіону. Швидкість реакції вимірювали за зміною оптичної густини при 340 нм. Ферментативну активність виражали в нмоль / мг білка · хв.

У мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях міокарда визначали концентрацію карбонільованих білків і продуктів вільнорадикального окиснення ліпідів (шиффових основ і ТБК-реактивних речовин). Визначення вмісту карбонільованих білків проводили за методом Дубинина Е.Е. (2000). У розрахунках використовували коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,1·10⁴ М^-1см^-1. Визначення концентрації шиффових основ проводили за флуориметричним методом Rіce-Evans C.A. et al. (1991). Вміст ТБК-реактивних речовин вимірювали за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою. У розрахунках використовували коефіцієнт молярної екстинкції малонового діальдегіду, що відповідає 1,53 ·10⁵ М^-1 см^-1 (Esterbauer H., Cheeseman K.H., 1990).

Вміст білка в аналізованих пробах досліджували за методом Lowry O. et al. (1955).

Одержані результати статистично обробили з використанням пакетів прикладних програм Excel і «SPSS Statіstіcs 17,0» за допомогою непараметричного методу Wіlcoxon-Mann-Wіtney. Розбіжності між даними вважали вірогідними при Р < 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Проведені дослідження показали, що в процесі онтогенезу змінюється сумарна величина активності альдегіддегідрогенази (АлДГ), альдегідредуктази (АР) й глутатіонтрансферази (ГТ) в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях серцевого м'яза (табл. 1, 2).

Таблиця 1. Активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів (нмоль / мг білка_я хв) у постмітохондріальній фракції міокарда щурів, різних за віком, під впливом стресу (M + m; n = 5 - 6)

Фермент/Група тварин	АР (NADН)	АР (NADРН)	Ал Г (NAD+)	А ДГ (NADР+)	ГТ
1,5-міс.	інтактні	0,28+0,04	0,95 + 0,07	1,19+ 0,07	0,21+0,02	1,8 + 0,1
	стрес	0,35+0,03	*0,58+0,07	*0,64+0,07	0,32+0,05	*2,8 + 0,2
2-міс.	інтактні	0,30+0,05	**0,09+ 0,02	0,97+ 0,07	**0,38+0,04	2,0 + 0,1
	стрес	*0,13+0,02	0,12+0,01	*0,69+0,06	*0,21+0,01	2,1 + 0,2
12-міс.	інтактні	**0,82+0,22	**0,27+0 ,06	1,17+ 0,11	** ***1,30+0,24	** ***2,4 + 0,2
	стрес	0,76+0,14	0,14+0,02	*0,73+0,06	1,44+0,25	2,2 + 0,2
24-міс.	інтактні	**0,80+0,17	**0,41+ 0,08	1,21+ 0,15	**0,77+0,06	**5,2 + 0,4
	стрес	*1,95+0,25	0,36 + 0,06	1,40 + 0,09	*0,32+0,06	5,1 + 0,3

Примітки: * - дані вірогідно відрізняються від показників у інтактних тварин (Р < 0,05); ** - дані вірогідно відрізняються від показників у 1,5-місячних інтактних тварин (Р < 0,05); *** - дані вірогідно відрізняються від показників у 24 - місячних інтактних тварин (Р < 0,05).

У пубертатному віці (1,5 - 2 місяці) активність мітохондріальних ферментів утилізації ендогенних альдегідів вище, ніж у постмітохондріальній фракції. У процесі онтогенезу від 2-місячного до 24-місячного віку відбувається поступове підвищення її величини в постмітохондріальній фракції міокарда. Так, у 12-місячному віці сумарна активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у постмітохондріальній фракції значно перевищує, а в 24-місячних щурів - знаходиться на рівні такої в мітохондріях. серце катаболізм іммобілізаційний стрес

Внесок окремих ензимів у величину сумарної активності ферментів катаболізму карбонільних продуктів обміну в субклітинних фракціях міокарда щурів різного віку неоднаковий. У постмітохондріальній фракції міокарда 1,5-, 2- і 24-місячних щурів глутатіонтрансферазна активність вище, ніж активність ензимів, що каталізують окисно-відновні перетворення альдегідів (табл. 1). У мітохондріальній фракції навпаки, активність ферментів, що каталізують окисно-відновні перетворення ендогенних альдегідів, перевищує глутатіонтрансферазну активність. До того ж у щурів 1,5-, 12- і 24-місячного віку альдегідредуктазна активність мітохондрій вище, ніж альдегіддегідрогеназна.

Таблиця 2. Активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів (нмоль / мг білка _я хв) у мітохондріальній фракції міокарда щурів, різних за віком, під впливом стресу (M + m; n = 5 - 6)

Вік	Група	АР (NADН)	АлДГ (NAD+)	ГТ
1,5-міс.	інтактні	7,2 + 0,5	1,52+ 0,14	1,3+ 0,2
	стрес	6,7 +1,0	*0,74 +0,04	*2,0 +0,2
2-міс.	інтактні	**1,7+ 0,5	**2,55+ 0,11	1,2+ 0,1
	стрес	*9,0+0,8	*1,38+0,27	1,7+0,2
12-міс.	інтактні	** ***1,7+0 ,1	** ***0,42+ 0,08	**0,47+ 0,05
	стрес	2,1+0,2	0,44+0,08	0,32+0,05
24-міс.	інтактні	5,6 + 1,1	1,57 + 0,32	**0,34 + 0,10
	стрес	9,0 + 0,6	1,65 + 0,08	0,50 + 0,10

Примітка. Те ж, що в таблиці 1.

Поява вікових змін у величині сумарної ферментативної активності в субклітинних фракціях міокарда пов'язана з модуляцією активності окремих ферментів катаболізму ендогенних альдегідів.

У табл. 1 і 2 можна побачити, що у процесі онтогенезу в період розвитку від 1,5-місячного до 12-місячного віку в постмітохондріальній фракції серця відбувається поступове підвищення активності глутатіонтрансферази, NADH-АР і NADP⁺-АлДГ, а в мітохондріальній фракції - зниження глутатіонтрансферазної активності. Виникнення зрушень супроводжується підвищенням частки NADР⁺-залежного ензиму в альдегіддегідрогеназній активності й NADH-залежного ферменту в альдегідредуктазній активності в постмітохондріальній фракції серця.

Така вікова модуляція ферментативної активності визначає появу максимального значення сумарної активності ензимів катаболізму альдегідів у постмітохондріальній фракції міокардіальних клітин при старінні, а мінімального - у пубертатному віці.

У мітохондріальній фракції серця відбувається інше: у щурів віком від півтора до 12 місяців поступово знижується сумарна активність ферментів катаболізму ендогенних альдегідів.

Однак надалі, до 24-місячного віку, величина цього показника зростає до його рівня в 1,5-місячних щурів.

Результати проведених досліджень свідчать про те, що через модуляцію ферментативної активності у процесі онтогенезу змінюються умови для утилізації ендогенних альдегідів у міокарді. Наслідком цього стає виникнення вікових особливостей у прояві захисної дії ферментів катаболізму карбонільних продуктів обміну в серці за умов підвищеної швидкості утворення даних метаболітів.

Зважаючи на це, було проведено вивчення активності АлДГ, АР і ГТ у серці щурів, різних за віком, під впливом іммобілізаційного стресу.

Дослідження показали, що найбільш виражені зрушення в активності ферментів утилізації ендогенних альдегідів у міокарді при стресі виникають у щурів пубертатного віку. В 1,5-місячних іммобілізованих тварин у постмітохондріальній фракції серцевого м'яза знижується активність (NAD⁺)АлДГ і (NADРН)АР, хоча активність глутатіонтрансферази в них, навпаки, зростає.

Зрушення, що виникли, обумовлюють обмеження ролі NAD⁺-залежного ферменту в альдегіддегідрогеназній активності й збільшення частки NADH-залежного ферменту в альдегідредуктазній активності. У 2-місячних щурів за умов стресу зменшується активність (NAD⁺)АлДГ, (NADР⁺)АлДГ і (NADH)АР, у порівнянні з її вихідною величиною. Це супроводжується підвищенням внеску NADРН-ізофермента в загальну альдегідредуктазну активність постмітохондріальної фракції серця.

Характер зрушень, що виникають в активності ферментів, указує на те, що в пізньому пубертатному віці при стресі формуються умови для обмеження швидкості утилізації карбонільних продуктів обміну в цитозолі міокардіальних клітин.

Зазначеному процесу також сприяє висока чутливість глутатіонтрансферази постмітохондріальної фракції серця тварин цього віку до ефекту інгібування окремих факторів, що виникають у міокарді при стресі (ацидозу, зниження концентрації відновленого глутатіону й накопичення альдегідів).

У щурів раннього пубертатного віку подібне зрушення, імовірно, виражене у меншій мірі, ніж у 2-місячних тварин.

Причиною цього є підвищення активності глутатіонтрансферази, що каталізує найпотужніший шлях утилізації ендогенних альдегідів у міокардіальних клітинах (Lі Y. et al., 2005), що певною мірою компенсує обмеження використання альдегідів в окисно-відновних реакціях за рахунок зменшення активності (NADРH)АР і (NAD⁺)АлДГ.

На відміну від щурів пубертатного віку, у дорослих статевозрілих тварин після дводенної іммобілізації не відбувається істотних змін в активності ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у серці. Лише одне зрушення, пов'язане зі зниженням активності (NAD⁺)АлДГ, не може істотно змінювати швидкість метаболізму ендогенних альдегідів.

Його поява відображує лише модуляцію активності ферменту, що може виникати за рахунок вільнорадикального окиснення поліпептидного ланцюга при стресорній стимуляції вільнорадикальних процесів у кардіоміоцитах (Меерсон Ф.З., 1984; Davydov V.V., Shvets V.N., 2001, 2003; Nayanatara A.K. et al., 2005).

У старих тварин, як і в 12-місячних щурів, при іммобілізації зменшується активність тільки одного ензиму в постмітохондріальній фракції міокарда - (NADР⁺)АлДГ.

Але висока глутатіонтрансферазна активність та підвищення активності (NADH)АР створюють умови для ефективної утилізації ендогенних альдегідів у міокардіальних клітинах за умов стресу.

На відміну від ферментів постмітохондріальної фракції, активність мітохондріальних ензимів катаболізму ендогенних альдегідів при стресі модулюється тільки в щурів пубертатного віку (табл. 2).

Проявом цього є зниження активності (NAD⁺)АлДГ в 1,5- і 2-місячних тварин, а також підвищення активності глутатіонтрансферази в 1,5-місячних і (NADH)АР - в 2-місячних щурів. Характерно, що зрушення в активності цих ензимів у тварин раннього пубертатного віку при стресі не супроводжуються зміною величини сумарної активності ферментів утилізації ендогенних альдегідів у мітохондріях.

Поряд з тим, у щурів пізнього пубертатного віку даний показник різко зростає порівняно до його вихідного рівня.

Таким чином, міокардіальні ферменти катаболізму альдегідів при стресі проявляють значно більшу лабільність у щурів пубертатного віку, ніж у дорослих і старих тварин.

Причому в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях серця в 1,5- і 2-місячних щурів виникає різний характер змін ферментативної активності. У такій ситуації велику цікавість становить питання про те, як саме ці зрушення супроводжуються зміною концентрації карбонільних продуктів обміну в субклітинних фракціях міокарда щурів за умов стресу.

Для його розв'язання було проведено вивчення вмісту ТБК-реактивних речовин у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях міокарда тварин різних вікових груп під впливом стресу.

Дані, наведені на рис. 1, показують, що підвищення вмісту ТБК-реактивних речовин у постмітохондріальній фракції міокарда за умов іммобілізаційного стресу відбувається тільки в 2-місячних щурів.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Вміст ТБК-реактивних речовин у постмітохондріальній фракції міокарда щурів, різних за віком, під впливом стресу.

Примітка. * - дані вірогідно відрізняються від показників у інтактних тварин (Р < 0,05 до інтактних).

Одночасно в тварин зростає рівень кінцевих продуктів обміну - шиффових основ. Їхня концентрація в постмітохондриальній фракції міокарда в 2-місячних іммобілізованих щурів зростає на 53% порівняно з інтактними тваринами цієї вікової групи (рис. 2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Вміст шиффових основ у постмітохондріальній фракції міокарда щурів, різних за віком, під впливом стресу.

Примітка. * - дані вірогідно відрізняються від показників у інтактних тварин (Р < 0,05 до інтактних).

У мітохондриальній фракції міокарда виникає дещо інша ситуація з накопиченням ТБК-реактивних речовин при стресі. На рис. 3 зазначено, що підвищення їхнього вмісту при стресі відбувається тільки в щурів пубертатного віку, до того ж у 1,5-місячних більше, ніж у 2-місячних тварин. Однак збільшення концентрації шиффових основ, як кінцевих продуктів метаболізму ендогенних альдегідів, у них не відбувається.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Вміст ТБК-реактивних речовин у мітохондріальній фракції міокарда щурів, різних за віком, під впливом іммобілізаційного стресу.

Примітка. * - дані вірогідно відрізняються від показників у інтактних тварин (Р < 0,05 до інтактних).

Одержані дані свідчать про те, що підвищення активності окремих ферментів катаболізму ендогенних альдегідів, що виникає в періоді статевого дозрівання, не забезпечує ефективної утилізації карбонільних продуктів метаболізму, які утворюються в мітохондріях під впливом стресу. Така ситуація може виникати за умов різкого зростання швидкості радикалоутворення в мітохондріях. Непрямим підтвердженням цього є результати досліджень, пов'язаних з вивченням особливостей накопичення карбонільованих білків у мітохондріальній фракції серця іммобілізованих щурів різних вікових груп.

Вищезазначені результати експериментальних досліджень дозволяють зробити висновок про те, що за умов іммобілізаційного стресу в щурів пізнього пубертатного віку ефективність утилізації карбонільних продуктів метаболізму в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях серця обмежується. Проте причини виникнення такого зрушення в субклітинних фракціях міокарда різні. У постмітохондріальній фракції вони пов'язані з обмеженням активності ферментів утилізації ендогенних альдегідів, а в мітохондріальній - з їх неадекватною активацією в умовах вираженої стресорної стимуляції вільнорадикальних процесів.

Обмеження ефективності утилізації карбонільних продуктів обміну призводить до накопичення їх у міокардіальних клітинах. Маючи виражену цитотоксичну і генотоксичну дію, вони є своєрідним посередником в реалізації шкідливого ефекту стресу на міокард (Uchіda K., 2000). Це відображує збільшення чутливості серця до шкідливих факторів стресу у щурів пізнього пубертатного віку і є однієї з причин зростання захворюваності серцево-судинною патологією на даному етапі онтогенезу (Коренев М.М., Носова О.М., 2002; Коренев Н.М. и др., 2003).

На ранньому етапі статевого дозрівання ситуація з утилізацією карбонільних продуктів обміну в міокардіальних клітинах при стресі є більш сприятливою, ніж у пізньому пубертатному періоді. Причиною цього є характерні для даного етапу розвитку особливості стресорної модуляції активності ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у постмітохондріальній фракції серцевого м'яза, що забезпечують підтримку стабільної концентрації ендогенних альдегідів.

На відміну від щурів пубертатного віку, в старих тварин за умов стресу не виникає зрушень в активності ферментів утилізації карбонільних продуктів обміну, які могли б сприяти зниженню швидкості катаболізму ендогенних альдегідів у серці.

Підтвердженням цього є результати досліджень, згідно з якими іммобілізація 24-місячних щурів не супроводжується збільшенням вмісту ТБК-реактивних речовин і шиффових основ у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях (рис. 1 - 3), хоча в них й відбувається накопичення карбонільованих білків.

Все це свідчить про те, що підвищення чутливості серця до стресу при старінні, відоме з літератури (Фролькис В.В. и соавт., 1994; Lakatta E.G., 2001), не пов'язане з ферментативною системою захисту міокарда від карбонільних продуктів вільнорадикального окиснення.

Таким чином, у процесі онтогенезу відбувається зміна значення ферментів катаболізму ендогенних альдегідів щодо захисту міокарда від шкідливої дії стресу.

У періоді статевого дозрівання, а особливо на його пізньому етапі, виникає модуляція ферментативної активності, що сприяє гальмуванню утилізації цитотоксичних карбонільних продуктів метаболізму в кардіоміоцитах і істотно впливає на підвищення чутливості серця до шкідливих факторів стресу.

Висновки

У результаті проведених експериментів були встановлені вікові особливості модуляції активності ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у субклітинних фракціях міокарда щурів, які формують передумови для зміни чутливості серця до стресу в процесі онтогенезу. На підставі результатів досліджень було зроблено такі висновки:

1. У постмітохондріальній фракції міокарда глутатіонтрансферазна активність перевищує активність ферментів, що каталізують перетворення альдегідів в окисно-відновних реакціях. У періоді розвитку від 1,5- до 12-місячного віку активність ГТ, NADH-залежної АР і NADР⁺-залежної АлДГ поступово зростає, досягаючи максимальної величини в дорослих тварин.

2. Глутатіонтрансферазна активність постмітохондріальної фракції міокарда зменшується при зниженні рН реакційної суміші, а також при внесенні в неї глутарового альдегіду й зниженні концентрації відновленого глутатіону більшою мірою в 2- і 24-місячних щурів, ніж в 1,5- і 12-місячних тварин. Перекис водню в 0,5 мМ концентрації сприяє зростанню глутатіонтрансферазної активності в 1,5-, 2- і 24-місячних щурів.

3. У мітохондріальній фракції міокарда активність АлДГ і АР перевищує активність ГТ. У тварин 1,5-, 12- і 24-місячного віку активність АР вище за активність АлДГ. Сумарна величина активності ферментів катаболізму альдегідів у мітохондріях максимальна в 1,5-місячному віці. У періоді розвитку від 1,5- до 12-місячного віку відбувається її поступове зниження, а до 24-місячного віку вона повертається до свого рівня в 1,5-місячних щурів.

4. Іммобілізація тварин 1,5-, 2- і 12-місячного віку супроводжується зниженням активності ензимів, що каталізують окисно-відновні перетворення ендогенних альдегідів у постмітохондріальній фракції міокарда. У 1,5-місячних щурів одночасно зростає активність ГТ. У мітохондріальній фракції міокарда іммобілізованих тварин пубертатного віку виникають зрушення активності АлДГ, АР і ГТ різних напрямів, які в 2-місячних щурів супроводжуються зростанням величини їхньої сумарної активності.

5. За умов іммобілізаційного стресу в постмітохондріальній фракції серця в 2-місячних щурів зростає концентрація ТБК-реактивних речовин і шиффових основ, а в мітохондріальній фракції міокарда в 1,5- і 2-місячних тварин збільшується вміст ТБК-реактивних речовин. В 12- і 24-місячних іммобілізованих щурів не відбувається накопичення ТБК-реактивних речовин в обох досліджених субклітинних фракціях серця.

6. У щурів пізнього пубертатного віку під впливом іммобілізаційного стресу відбувається гальмування утилізації ендогенних альдегідів у серці.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Грабовецкая Е.Р. Активность энзимов утилизации альдегидов в сердце крыс разного возраста при иммобилизационном стрессе [Текст] / Е.Р. Грабовецкая, В.В. Давыдов // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, N 1. - С. 99 - 104. (Здобувачем проведено моделювання іммобілізаційного стресу, субклітинне фракціонування серця й визначено активність ферментів утилізації альдегідів у постмітохондріальній фракції, виконано статистичний аналіз і складено літературний огляд).

2. Грабовецкая Е.Р. Возрастные особенности изменения активности ферментов утилизации альдегидов в митохондриях сердца крыс при стрессе [Текст] / Е.Р. Грабовецкая, В.В. Давыдов // Пробл. старения и долголетия. - 2009. - Т. 18, N 2. - С. 166 - 173. (Здобувачем проведено моделювання іммобілізаційного стресу, субклітинне фракціонування серця й визначено активність ферментів утилізації альдегідів у мітохондріальній фракції, виконано статистичний аналіз і складено літературний огляд).

3. Грабовецкая Е.Р. Возрастная динамика активности ферментов метаболизма альдегидов в сердце крыс [Текст] / Е.Р. Грабовецкая, В.В. Давыдов // Експериментальна і клінічна медицина. - 2009. - N 1. - С. 24 - 27 (Здобувачем проведено моделювання іммобілізаційного стресу, субклітинне фракціонування серця й визначено активність ферментів утилізації альдегідів у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях, виконано статистичний аналіз і складено літературний огляд).

4. Грабовецкая Е.Р. Возрастные особенности модуляции глутатионтрансферазной активности постмитохондриальной фракции миокарда крыс возникающими при стрессе факторами [Текст] / Е.Р. Грабовецкая, В.В. Давыдов // Пробл. старения и долголетия. - 2009. - Т. 18, N 3. - C. 295 - 300. (Здобувачем проведено субклітинне фракціонування серця й вивчено активність глутатіонтрансферази у постмітохондріальній фракції, виконано статистичний аналіз і складено літературний огляд).

5. Грабовецкая Е.Р. Активность ферментов утилизации альдегидов в постмитохондриальной фракции сердца крыс разного возраста при стрессе [Текст] / Е.Р. Грабовецкая // Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики: матеріали наук.-практ. конф., 30 жовтня 2008 р. - Харкiв, 2008. - С. 34.

6. Грабовецкая Е.Р. Особенности модуляции активности глутатионтрансферазы из миокарда старых крыс [Текст] / Е.Р. Грабовецкая // Актуальні питання геронтології та геріатрії: тези доповідей наук. конф. молодих вчених з міжнар. участю, присвяченої пам'яті академіка В.В. Фролькіса, 27 сiчня 2009 р. - Київ, 2009. - С. 25 - 26.

7. Грабовецкая Е.Р. Возрастные особенности изменения содержания продуктов свободнорадикального окисления в постмитохондриальной фракции миокарда крыс при стрессе [Текст] / Е.Р. Грабовецкая // Медицина третього тисячоліття: збірник тез міжвуз. конф. молодих вчених та студентів, 20 - 21 січня 2009 р. - Харків, 2009. - С. 8.

8. Grabovetskaya E.R. Aldehyde reductase activity in the heart of pubertal rats during stress [Text] / E.R. Grabovetskaya // 2^nd International Scientific Interdisciplinary Congress for medical students and young doctors, 7 - 8 April, 2009: abstract book. - Kharkiv, 2009. - P. 29 - 30.

9. Грабовецкая Е.Р. Особенности накопления продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков в митохондриях миокарда крыс пубертатного возраста при иммобилизационном стрессе [Текст] / Е.Р. Грабовецкая // ХIII міжнародний медичний конгр. студентiв та молодих вчених: матеріали конгр., 27- 29 квітня 2009 р. - Тернопiль, 2009. - С. 239.

10. Грабовецька Є. Р. Активність ферментів утилізації ендогенних альдегідів у мітохондріях серця щурів різного віку за умов стресу [Текст] / Є.Р. Грабовецька // Молодь і поступ біології: тези доповідей V міжнародної конф. студентів та аспірантів, 12-15 травня 2009 р. - Львів, 2009. - С. 245 - 246.

11. Grabovetskaya E.R. Changes in the level of products of free radical oxidation of lipids and proteins in the myocardium of pubertal rats in stress conditions [Text] / E.R. Grabovetskaya // Актуальні питання біології та медицини: матеріали VII міжрегіональної наук. конф. 28-29 травня 2009 р. - Луганськ, 2009. - С. 91 - 92.

12. Давыдов В.В. Активность ферментов утилизации эндогенных альдегидов в сердце крыс пубертатного возраста при стрессе [Текст] / В.В. Давыдов, Е.Р. Грабовецкая // Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: матер. V международной Крымской конференции, Судак, 21 сентября 2009 г. - Москва, 2009. - С. 18. (Здобувачем проведено моделювання іммобілізаційного стресу, субклітинне фракціонування серця й вивчено активність ферментів утилізації альдегідів у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях).

Анотація

Грабовецька Є.Р. Вікові особливості зміни активності ферментів катаболізму альдегідів у серці щурів при іммобілізаційному стресі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2009.

Дисертацію присвячено вивченню активності ферментів утилізації карбонільних продуктів вільнорадикального окиснення у серці щурів різного віку під впливом іммобілізаційного стресу.

Встановлено, що в процесі онтогенезу змінюється активність альдегіддегідрогенази, альдегідредуктази й глутатіонтрансферази у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях серцевого м'яза. За умов іммобілізаційного стресу, більшою мірою в щурів пубертатного віку, ніж у дорослих і старих тварин, виникає модуляція активності ферментів катаболізму ендогенних альдегідів у субклітинних фракціях серця. Водночас у 1,5- і 2-місячних щурів зростає концентрація ТБК-реактивних речовин і шиффових основ у мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях міокарда. У щурів пізнього пубертатного віку це зростання більш виражене. Виникнення таких зрушень свідчить про уповільнення процесів утилізації ендогенних альдегідів у серці щурів пубертатного віку під впливом стресу.

Ключові слова: міокард, мітохондрії, цитозоль, онтогенез, стрес, альдегіди, альдегіддегідрогеназа, альдегідредуктаза, глутатіонтрансфераза.

Аннотация

Грабовецкая Е.Р. Возрастные особенности изменения активности ферментов катаболизма альдегидов в сердце крыс при иммобилизационном стрессе. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2009.

Диссертация посвящена изучению ферментов утилизации карбонильных продуктов свободнорадикального окисления в сердце крыс разного возраста при иммобилизационном стрессе.

В исследованиях использовали крыс четырех возрастных групп: I - 1,5-месячные (ранний пубертатный период); II - 2-месячные (поздний пубертатный период), III - 12-месячные (взрослые половозрелые) и IV - 24-месячные (старые). Животных каждой возрастной группы делили на 2 подгруппы: 1 - интактные; 2 - крысы, подвергнутые иммобилизационному стрессу. Эффективность воспроизведения стресса оценивали по уровню адреналина в крови. В митохондриальной и постмитохондриальной фракциях миокарда исследованных групп крыс проводили определение активности альдегиддегидрогеназы, альдегидредуктазы и глутатионтрансферазы, а также концентрации ТБК-реактивных веществ, шиффовых оснований и карбонилированных белков.

Установлено, что в пубертатном возрасте суммарная активность альдегиддегидрогеназы, альдегидредуктазы и глутатионтрансферазы в митохондриях миокарда превышает ее величину в постмитохондриальной фракции, у 24-месячных крыс она соответствует таковой, а у 12-месячных животных - становится ниже, чем в постмитохондриальной фракции. В процессе онтогенеза происходит изменение активности ферментов утилизации эндогенных альдегидов в сердце. В постмитохондриальной фракции миокарда в пубертатном возрасте она имеет минимальную величину, а при старении - максимальную. Активность митохондриальных ферментов катаболизма карбонильных продуктов обмена наиболее высока в раннем пубертатном периоде и позднем онтогенезе. В период развития от 1,5- до 12-месячного возраста она постепенно понижается и становится минимальной у взрослых половозрелых животных.

Исследования показали, что глутатионтрансфераза постмитохондриальной фракции миокарда более чувствительна к понижению рН реакционной смеси, ингибирующему эффекту глутарового альдегида и уменьшению концентрации восстановленного глутатиона у 2- и 24-месячных, чем у 1,5- и 12-месячных крыс.

При иммобилизационном стрессе в постмитохондриальной фракции миокарда 1,5-, 2- и 12-месячных животных понижается активность отдельных ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные превращения альдегидов. Проявление этого сдвига более выражено у крыс пубертатного возраста. В митохондриальной фракции миокарда 1,5- и 2-месячных животных, подвергнутых иммобилизационному стрессу, возникают разнонаправленные изменения в активности альдегиддегидрогеназы, альдегидредуктазы и глутатионтрансферазы. Их появление у 2-месячных иммобилизированных крыс сопровождается повышением величины суммарной активности этих энзимов.

Обнаружено, что параллельно с модуляцией активности исследованных ферментов в постмитохондриальной фракции сердца у 2-месячных иммобилизированных крыс повышается концентрация ТБК-реактивных веществ и шиффовых оснований, а в митохондриальной фракции миокарда у 1,5- и 2-месячных животных увеличивается содержание ТБК-реактивных веществ. В то же время у 12- и 24-месячных иммобилизированных крыс не происходит накопления ТБК-реактивных веществ в митохондриальной и постмитохондриальной фракциях сердца.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что у крыс пубертатного возраста при иммобилизационном стрессе происходит торможение процессов утилизации эндогенных альдегидов в миокарде. Это предопределяет повышение чувствительности сердца к действию повреждающих факторов стресса на этапе полового созревания.

Ключевые слова: миокард, митохондрии, цитозоль, онтогенез, стресс, альдегиды, альдегиддегидрогеназа, альдегидредуктаза, глутатионтрансфераза.

Summary

Grabovetskaya E.R. Age-related peculiarities in the activity of aldehyde scavenger enzymes in rat's heart during immobilization stress. - The manuscript.

Thesis for a Candidate of Biological Sciences degree by speciality 03.00.04 - biochemistry. -V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2009.

The thesis is devoted to investigation of the age-related peculiarities in the activity of aldehyde scavenger enzymes in the heart of rats of various ages during immobilization stress.

The obtained results show certain changes in the activity of aldehyde dehydrogenase, aldehyde reductase and glutathione transferase in the mitochondrial and postmitochondrial fractions of the heart muscle during ontogenesis. Under immobilization stress, the modulation of the activity of endogenous aldehydes scavenger enzymes in subcellular fractions of the hearts of pubertal rats appears to be stronger than those of adult and old ones. At the same time, 1,5- and 2-month old rats have an increased level of TBA-reactive substances and Schiff bases in mitochondrial and postmitochondrial fractions of myocardium. Older pubertal rats show higher levels. These alterations indicate inhibition of endogenous aldehydes scavenge in pubertal rats` heart during stress.

Key words: myocardium, mitochondria, cytosole, ontogenesis, stress, aldehydes, aldehyde dehydrogenase, aldehyde reductase, glutathione transferase.

Перелік скорочень

АлДГ - альдегіддегідрогеназа

АР - альдегідредуктаза

ГТ - глутатіонтрансфераза

МТ - мітохондріальна фракція

ПОЛ - перекисне окиснення ліпідів

ПостМТ - постмітохондріальна фракція

ТБК-реактивні речовини - речовини, що реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою

GSH - відновлений глутатіон

NAD⁺ - окислений нікотинамідаденіндинуклеотид

NADН - відновлений нікотинамідаденіндинуклеотид

NADР⁺ - окислений нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат

NADРН - відновлений нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат

Размещено на Allbest.ru

...