Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія Наук України

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.21 ? мікологія

Біологічні особливості Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. та G. lucidum (Curtis: Fr.) P. KarsТ. в культурі

Круподьорова Тетяна Анатоліївна

Київ - 2009

Загальна характеристика роботи

кислотність культивування біологічний штам

Актуальність теми. Унікальність біологічних і біосинтетичних властивостей вищих базидіальних грибів зумовлює їх широке використання у сучасній біотехнології, фармакології, біомедицині. З метою отримання цінних харчових продуктів, різноманітних лікувально-профілактичних засобів і окремих природних біологічно активних речовин проводять дослідження хімічного складу базидіоміцетів, розробляють нові методи культивування.

Ксилотрофні гриби роду Ganoderma Karst., зокрема Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst. і G. applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. широко використовують у східній медицині вже понад 4 тисячі років. Сучасні дослідження грибів G. lucidum і G. applanatum дали змогу виділити з них понад 400 біологічно активних сполук різної хімічної природи й фармакологічних властивостей (Mizuno, 1995, 2002; Wasser, 1997), а використання відповідних тест-систем, результати дослідів на тваринах і клінічні спостереження засвідчили, що препарати, отримані з цих видів грибів, мають онкостатичні, імуномоделювальні, антиоксидантні, антибактеріальні, гепатопротекторні, адаптогенні та інші цінні лікувально-профілактичні властивості (Wasser, Weis, 1999; Reshetnikov, 2001; Wasser et al., 2002b, 2003; Chang, Miles, 2004).

Значну кількість публікацій присвячено медико-біологічним аспектам вивчення видів роду Ganoderma і передусім G. lucidum, водночас морфологічні, фізіологічні, біохімічні особливості G. lucidum і G. applanatum досліджено на незначній кількості штамів, що не уможливлює повною мірою оцінити потенціал культур різного походження. Більшість учених, які вивчали біологію видів роду Ganoderma, особливо G. lucidum, використовували штами азіатського походження. Слід зазначити, що існують лише фрагментарні дані стосовно біологічних властивостей видів G. applanatum і G. lucidum, що були виділені в культуру з плодових тіл, зібраних на території України, тому поповнення Колекції шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІБК) новими штамами цінних лікарських видів базидіоміцетів, дослідження їхніх особливостей, визначення сприятливих умов росту в культурі є актуальними і доцільними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі мікології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України протягом 2005?2008 рр. відповідно до планів НДР за темою № 343 «Фізіолого-морфологічна характеристика лікарських макроміцетів та їх біосинтетична активність (№ державної реєстрації 0104U009743)».

Мета і завдання дослідження. Мета роботи ? дослідити біологічні особливості штамів G. applanatum і G. lucidum за різних умов культивування.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання.

1. Отримати з природного матеріалу чисті культури видів G. applanatum і G. lucidum, поширені на території України.

2. З використанням молекулярно-біологічного методу з'ясувати генетичну різноманітність штамів G. applanatum і G. lucidum, виділених у культуру з плодових тіл, зібраних на території України.

3. Встановити вплив джерел вуглецю та азоту, різних значень кислотності живильного середовища на біосинтез біомаси штамів G. applanatum і G. lucidum.

4. Дослідити вплив температури інкубації на швидкість росту, морфологію і життєздатність вегетативного міцелію культур.

5. Виявити наявність антибіотичної, антивірусної та антиоксидантної активностей штамів.

6. Дослідити динаміку росту та синтезу екзополісахаридів окремими штамами G. applanatum і G. lucidum на рідких середовищах в умовах глибинного культивування.

7. За комплексом ознак відібрати штами, перспективні для культивування на відходах харчової промисловості України.

8. Дослідити хімічний склад і провести медико-біологічні дослiдження біомаси штаму, відібраного для біотехнологічного застосування.

Об'єкт дослідження. Чисті культури 13 штамів G. applanatum і 27 штамів G. lucidum.

Предмет дослідження. Біологічні особливості штамів G. applanatum і G. lucidum у чистій культурі.

Методи дослідження. При вирішенні завдань використано загальноприйняті мікологічні, мікробіологічні, фізіолого-біохімічні, електронно-мікроскопічні, молекулярно-біологічні й статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше виявлено антибактеріальну активність суміші культуральної рідини з дрібнодисперсною біомасою 6 штамів G. applanatum і 8 штамів G. lucidum проти клінічних ізолятів метицилінстійкого і метицилінчутливого штамів Staphylococcus aureus. Вперше відмічено наявність активності культуральної рідини 7 штамів G. applanatum і 7 штамів G. lucidum проти вірусу тютюнової мозаїки на рослинах дурману (Datura stramonium L.). Вперше встановлено антиоксидантну активність штамів G. applanatum.

Отримано нові відомості щодо впливу джерел вуглецевого і азотного живлення й фізико-хімічних факторів культивування (кислотності живильного середовища, температури інкубації) на ріст і життєздатність вегетативного міцелію 13 штамів G. applanatum і 27 штамів G. lucidum.

Практичне значення отриманих результатів. До Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІБК) передано чисті культури 5 штамів G. applanatum і 10 штамів G. lucidum, що були виділені з плодових тіл, зібраних на території України.

Встановлено специфічні особливості 40 досліджених культур за такими показниками, як морфологічні характеристики колоній, радіальна швидкість росту вегетативного міцелію, оптимальні для росту значення температури і кислотності живильного середовища, життєздатність вегетативного міцелію за високих температур інкубації, найсприятливіші джерела вуглецю та азоту, відзначено здатність окремих штамів до біосинтезу антибіотичних й антивірусних речовин, що буде використано для поповнення банку даних культур, які зберігаються в Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.

За комплексом ознак відібрано штам лікарського гриба G. lucidum 1621 з високою продуктивністю біомаси ? 5,6 г/л/добу та екзополісахаридів ? 10 г/л, перспективний для отримання міцеліальної біомаси, розроблено спосіб його культивування на нативній молочній сироватці. Досліджено хімічний склад біомаси G. lucidum 1621, встановлено можливість її застосування як продукту спрямованої дії для зниження рівня холестерину в крові й профілактики атеросклерозу. Штам впроваджено на ВАТ ‹‹СБ МУР›› (Київ) для отримання спеціальних продуктів харчування.

Особистий внесок здобувача. Робота є самостійним дослідженням здобувача, яким проаналізовано наукову літературу, виконано основний обсяг експериментальних досліджень, узагальнено результати, систематизовано і статистично оброблено дані експериментального матеріалу.

Планування певних напрямів роботи, формулювання й обговорення основних положень та їх висновків, підготовку до друку наукових статей проведено спільно з науковим керівником дисертаційної роботи д-ром біол. наук Н.А. Бісько. Молекулярно-біологічні дослідження плодових тіл виконано проф. J. Zhang і C. Tang (Інститут лікарських та їстівних грибів, Шанхай, Китай). Встановлення антимікробної активності штамів здійснено у співпраці з кандидатами біол. наук Б.Ф. Васильєвою і О.В. Єфременко (ДУ НІІ пошуку антибіотиків ім. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва, Росія), антивірусної активності ? з д-ром біол. наук О.Г. Коваленко, О.М. Поліщук (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, Україна), хімічного складу біомаси ? з канд. біол. наук Т.А. Пучковою (Інститут мікробіології АН Білорусі, Мінськ, Білорусь), медико-біологічні дослідження біомаси G. lucidum ? з д-ром мед. наук М.П. Гуліч, кандидатами мед. наук О.Д. Ольшевською, О.О. Ятченко (Інститут гігієни та медичної екології ім. О. М. Марзеєва АМН України, Київ, Україна). У роботах, опублікованих у співавторстві, особистий внесок здобувача становить не менше 50 %.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати роботи викладено та обговорено на засіданнях відділу мікології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (Київ, Україна 2005-2008). Результати дисертаційної роботи було представлено на III і IV Всеросійських конгресах «Успехи медицинской микологии» (Москва, Росія, 2006?2007) і наукових конференціях «Актуальні проблеми ботаніки та мікології» (Київ, Україна, 2006), «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Мінськ, Білорусь, 2006, 2008), «Молодь і поступ біології» (Львів, Україна, 2007), «The 4^th International Medicinal Mushroom conference» (Любляна, Словенія, 2007), «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Одеса, Україна, 2007), «Биология: от молекулы до биосферы» (Харків, Україна, 2007), «Современная микология в России» (Москва, Росія, 2008), «Иммунология, аллергология и инфектология» (Москва, Росія, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 16 праць, у тому числі 5 статей у фахових виданнях, 11 матеріалів і тез доповідей у збірниках вищенаведених наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 6 розділів, висновків, додатку і списку використаних джерел літератури (352 джерел, із них 200 ? іншомовних). Загальний обсяг роботи становить 214 стор., з них 135 стор. займає текстова частина роботи і 43 стор. список джерел літератури. Дисертація ілюстрована 34 рисунками і 37 таблицями. Робота вміщує Додаток А ‹‹Практичне застосування результатів›› (3 стор.).

Основний зміст

РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. і G. lucidum (CurtIS: FR.) P. КАRST., ОСНОВНІ НАПРЯМИ ЇХ ДОСЛІДЖЕННЯ У КУЛЬТУРІ, ЛІКАРСЬКЕ ЗНАЧЕННЯ

У розділі, який є оглядом літератури і складається з трьох підрозділів, наведено систематичне положення й загальна характеристика G. applanatum і G. lucidum, висвітлено відомості про об'єкти дослідження у культурі, узагальнено результати праць щодо їхніх морфолого-культуральних, біологічних, біосинтетичних властивостей та умов, сприятливих для росту і синтезу цінних метаболітів. Розглянуто сучасний стан досліджень лікувальних властивостей G. applanatum і G. lucidum, викладено результати їх використання у медицині. З урахуванням аналізу літературних даних визначено актуальність власного дослідження.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктами досліджень були чисті культури 13 штамів G. applanatum і 27 штамів G. lucidum різного географічного походження з роду Ganoderma (табл. 1), які зберігаються у Колекції культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (IБK).

Таблиця 1. Список досліджених штамів G. applanatum і G. lucidum

Міцеліальну культуру виділяли з плодових тіл, зібраних у природних умовах, відповідно до загальноприйнятої методики (Бухало, 1988).

Виділення геномної ДНК з плодових тіл G. applanatum і G. lucidum, зібраних на території України, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) виконано за стандартними методами (Raeder, Broda, 1985) з використанням універсальних праймерів (White et al., 1990, Gillings, Holley, 1997).

Вплив джерел вуглецю та азоту на ріст досліджених штамів досліджували на глюкозо-аспарагіновому живильному середовищі (Бісько, 1988). Замість глюкози як джерела вуглецю до живильного середовища вносили лактозу, сахарозу чи крохмаль у кількості, що була еквівалентна 10 г глюкози в перерахунку на вуглець. Джерелами азоту були аспарагін, нітрат натрію, сульфат амонію, які додавали у середовища в кількостях, еквівалентних 0,4 г аспарагіну в перерахунку на азот. Контролем слугував ріст культур на обраному середовищі без глюкози та аспарагіну.

Ріст культур за різних значень концентрацій іонів водню (рН 3,2; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 і 7,3) вивчали на синтетичному живильному середовищі з глюкозою.

Дослідження швидкості росту, впливу температури на життєздатність, морфолого-культуральні ознаки штамів проводили за загальноприйнятими методами (Перт, 1978; Билай, 1980; Методы …, 1982; Бухало, 1988) на агаризованому пивному суслі (СА). Оптимальні та критичні для росту вегетативного міцелію значення температури визначали в діапазоні від 5 ± 1 до 45 ± 0,5 °С.

Антимікробну активність екстрактів суміші культуральної рідини з дрібнодисперсною біомасою визначали методом дисків (Методы …, 1982). Антивірусну активність культуральної рідини певних культур проти вірусу тютюнової мозаїки встановлювали згідно з описаною методикою (Коваленко, 1983). Визначення антиоксидантної активності на основі дослідження кінетики окислення відновленої форми 2,6-дихлорфеноліндофенолy киснем повітря за наявності та за відсутності біологічного матеріалу проведено відповідно до відомої методики (Семенов, 1985).

Дослідження росту грибів у глибинній культурі та отримання рідкого посівного міцелію зроблено відповідно до описаної методології (Бухало, 1988; Соломко та ін., 1992, 1994) на відходах харчової промисловості України. Під час культивування контролювали основні параметри: накопичення маси міцелію, зміна рН живильного середовища, вміст екзополісахаридів у культуральній рідині.

Мікроструктури культур досліджували з використанням сканувальної електронної мікроскопії (СЕМ), JSM-35C (Японія), за наведеною в літературі методикою (Бухало, 1985, 1988).

Загальний азот у біомасі визначали за методом Кьельдаля (Плешков, 1985). Сирий протеїн розраховували перерахунком кількості загального азоту з використанням коефіцієнту 4,38 (Бісько, 1983, Chang, 1996). Амінокислотний склад білків досліджували на амінокислотному аналізаторі T-339 («Mikrotechna», Чехія) після відповідної обробки зразків (Овчинников, 1974). Ліпіди екстрагували методом Фолча (Folch, 1957), жирнокислотний склад ліпідів аналізували за метиловими етерами жирних кислот на газорідинному хроматографі «Chrom-5» (Чехія) (Верещагин, 1963, Кейтс, 1985). Загальну кількість золи визначали стандартним методом після спалювання зразків у муфельній печі при 500 °С (Починок, 1976). Кількість загальних вуглеводів розраховували балансовим методом (Crisan, 1978). Вміст екзополісахаридів визначали фенол-сірчанокислим методом (Грушенко, 1978).

Програму медико-біологічних досліджень впливу біомаси G. lucidum на тест-об'єкти ? білих щурів ? складено відповідно до рекомендацій з координації робіт у галузі одержання безпечних продуктів харчування об'єднаного комітету ФАО/ВОЗ (Принципы…, 1981).

Отримані експериментальні дані опрацьовано із застосуванням статистичних методів досліджень і за допомогою комп'ютерних пакетів Photo Shop 6.0, UPGMA, StatSoft Statistika 6.0.

Розділ 3. дослідження генетичної різноманітності штамів Ganoderma applanatum і G. lucidum

Дослідження генетичного варіювання за ITS- ділянками ядерної рДНК показало чітке розділення видів G. applanatum (G11?G15) i G. lucidum (G1?G10) (рис. 1). Серед досліджених культур найбільшу генетичну подібністю (100 %) за ампліфікованими фраг-ментами встановлено лише для G. lucidum 1906 і 1907, плодові тіла яких знайдено на різних деревах дуба, і G. applanatum 1898, 1899, що ізольовано в культуру з карпофорів, зібраних відповідно на грабі й букові, які належать до одного порядку Fagales.

Зазначимо, що G. applanatum 1896 і 1897, плодові тіла яких росли на території заказника «Конча-Заспа» на різних деревах однієї породи ? дуба ? на противагу вищезазначеним штамам виявились досить різними. Більшість культур мали однаковий ступінь генетичної близькості (96 %) за ампліфікованими фрагментами: G. lucidum 1904 і 1905, 1908 і 1906, 1907, 1909 і 1910 та G. applanatum ? 1896 і 1898, 1899. Найменш подібними між собою (89 %) були G. lucidum ? 1912 і 1913, які й до решти культур цього виду характеризувалися 82%-м ступенем близькості. Також досить відрізнявся штам G. applanatum 1897, подібність якого за ампліфікованими фрагментами до інших ізолятів G. applanatum становила 87,5 %.

Розділ 4. вплив джерел живлення і Фізико-Хімічних факторів на ріст культур

Важливим напрямом сучасних мікологічних і біотехнологічних досліджень залишається вивчення живильних потреб культур, їх вимог до кислотності живильного середовища, встановлення оптимальних параметрів росту й синтезу метаболітів на видовому і штамовому рівнях.

4.1. Вплив джерел вуглецю та азоту на ріст культур. Загальновизнано, що вуглеце- та азотовмісні компоненти відіграють провідну роль у живлені та рості грибів. За результатами проведених експериментів встановлено певні відмінності між дослідженими штамами G. applanatum і G. lucidum за показником накопичення біомаси на середовищах з різними джерелами вуглецевого та азотного живлення. Усі досліджені культури були здатні рости з різною інтенсивністю на обраних джерелах вуглецю і азоту, за винятком штаму G. applanatum 1896. З'ясовано, що 9 із 27 штамів G. lucidum (1621, 1900, 1901, 1908, 1910, 1911, 1912, 1913, 921) і лише один із 13 штамів G. applanatum (1572) мали здатність накопичувати однакову кількість біомаси на середовищах з усіма використаними джерелами вуглецю. Поряд з цим встановлено, що більшість досліджених штамів надавали перевагу лише одному певному джерелу вуглецю. Так, крохмаль був кращим джерелом для росту 15,4 % штамів G. applanatum і 14,8 % штамів G. lucidum. Наявність у живильному середовищі глюкози сприяла накопиченню максимальної кількості біомаси G. applanatum 920, 1593, 1896 і G. lucidum 1788, 1903, 1904. Найліпшою для росту G. lucidum 1608 і 1907 виявилась сахароза. Порівняно з іншими джерелами вуглецю лактоза була найсприятливішою для росту G. lucidum 1888. Певні культури добре росли на середовищах із трьома з чотирьох досліджених джерел вуглецю. Однаковою мірою утилізували глюкозу, лактозу, сахарозу G. lucidum 1683, 1902, 1905, 1909. Аналогічну закономірність росту відмічено при використанні глюкози, сахарози або крохмалю для G. applanatum 1701, 1530, 1553. Деякі штами накопичували однакову біомасу за наявності у живильному середовищі моно- чи полісахариду. Це було характерно для G. applanatum 1672, 1552, 1898 і G. lucidum 1670, 1787, 331, які добре росли як на глюкозі, так і на крохмалі. Тотожній характер росту встановлено для низки штамів на живильному середовищі з ди- або полісахаридом. Сахароза і крохмаль сприяли інтенсивному росту G. applanatum 1897, G. lucidum 1607, лактоза і крохмаль ? G. lucidum 1888, 1906. Для 38,5 % штамів G. applanatum і 55,5 % G. lucidum кількості синтезованої біомаси на лактозі й сахарозі не відрізнялись. Найбільший врожай біомаси за сприятливіших для росту джерел вуглецю мали G. applanatum 920, 1572, 1593, 1899 (4,0?4,6 г/л) і G. lucidum 1670, 1888, 1788, 1621 (3,0?3,3 г/л) на 14-ту добу стаціонарного культивування.

Слід зазначити, що 6 штамів G. lucidum 921, 1888, 1889, 1608, 1901, 1906 і лише один штам G. applanatum 1897 однаково росли на середовищі з органічним (аспарагін) і мінеральними (амонійним й нітратним) джерелами азоту. Більшість штамів G. lucidum (1621, 1902, 1905, 1907, 1908, 1909, 1911, 1913) і 3 штами G. applanatum (1701, 1672, 1899) накопичували максимальну кількість біомаси за наявності у середовищі аспарагіну чи сульфату амонію. Наявність у живильному середовищі аспарагіну або нітрату натрію забезпечувало кращий ріст G. lucidum 1787, 1683, 1910, 1911, 1912, 922 і G. applanatum 1572, 1895. Використані в роботі джерела мінерального азоту для окремих культур були взаємозамінними. Так, для 46,1 % штамів G. applanatum та 70,4 % G. lucidum кількості синтезованої біомаси на середовищах з сульфатом амонію і нітратом натрію не відрізнялись. Особливим виявився G. lucidum 1887, що краще накопичував біомасу на середовищі з нітратним азотом. Найбільшу масу міцелію за найліпших джерел азоту продукували G. applanatum 920, 1701, 1572, 1593 (4,0?4,7 г/л) і G. lucidum 1670, 1788 (3,0 і 3,3 г/л) на 14-ту добу стаціонарного культивування.

4.2. Вплив кислотності живильного середовища на накопичення біомаси. Базові знання особливостей росту грибів за різних значень рН необхідні для оптимізації умов поверхневого, глибинного культивування з метою отримання біомаси і/чи фармакологічно цінних метаболітів - меланінів, терпенів, полісахаридів тощо. Під час поверхневого культивування на рідкому синтетичному середовищі з глюкозою більшість культур G. аpрlanatum (61,5 %) і G. lucidum (51,9 %) росли у діапазоні рН від 3,2 до 7,3. У 23,1 % штамів G. аpрlanatum і 37,0 % штамів G. lucidum ріст культур спостерігали в інтервалі рН від 4,0 до 7,3. Решта досліджених штамів обох видів мали вужчий діапазон росту. Так, G. аpрlanatum 1553 накопичував біомасу при рН 3,2?7,0, G. аpрlanatum 1898 ? при значеннях рН від 4,5 до 7,0, а штами G. lucidum 921 і 1902 ? при рН 4,0?7,0. Найменший діапазон значень рН 4,5?6,0 встановлено для росту G. lucidum 1889. Значення рН культуральної рідини наприкінці культивування усіх досліджених штамів знижувались залежно від початкового значення рН на 0,2-2,4 одиниці. На обраному живильному середовищі найбільшу біомасу накопичували штами G. аpрlanatum і G. lucidum у діапазоні значень рН від 4,0 до 6,5, що дає змогу віднести їх до aцидофільних грибів. Домінуючим показником кислотності для синтезу максимальної біомаси штамами G. аpрlanatum був рН 5,0, G. lucidum ? 5,5. На відміну від штамів G. lucidum штами G. аpрlanatum, мали інтенсивніший ріст, який виявлявся у кількості синтезованої ними біомаси. За найсприятливіших для активного росту значень рН вихід біомаси штамів G. аpрlanatum на 21-шу добу культивування у стаціонарних умовах становив 5,2?13,4 г/л, G. lucidum ? від 1,9 до 9,0 г/л.

4.3. Вплив температури інкубації на швидкість росту, життєздатність вегетативного міцелію і морфологію культур. Температура ? важливий фактор, який суттєво впливає на ріст і життєздатність грибів (Жданова, Василевская, 1982; Бухало, 1988). Досліджено ріст культур на СА за температури інкубації 5, 12, 20, 28, 30 ± 1 °С. Ріст міцелію усіх досліджених штамів роду Ganoderma відбувався у діапазоні температур від 12 до 32 єС. У 62 % штамів G. аpplanatum і 52 % штамів G. lucidum ріст при 5 єС був відсутній протягом 30 діб. Однак ця температура не була критичною, оскільки в разі подальшої інкубації міцелію при 28 єС їх ріст відновлювався. Штами обох видів при 12 єС росли дуже повільно порівняно з вищими значеннями температури. Оптимальною для росту 8 штамів G. аpplanatum і 17 штамів G. lucidum була температура 28 °С, а 32 єС ? для росту 5 штамів G. аpplanatum і 10 штамів G. lucidum. За результатами проведених досліджень культури обох видiв належать до мезофілів. Однією з найважливіших характеристик конкретних штамів є їх швидкість радіального росту. До швидкорослих культур, радіальна швидкість яких дорівнює чи перевищує 8 мм/добу (Ломберг, 2005), віднесено 61,5% досліджених нами штамів G. аpplanatum і 37,0 % штамів G. lucidum. Лише G. lucidum 921, радіальна швидкість росту якого була менша ніж 4 мм/добу, є повільноростучим. Найбільшу групу штамів G. lucidum (59,3 %) і 38,5 % штамів G. аpplanatum за цим критерієм складали такі, що здатні рости з радіальною швидкістю росту від 4 до 8 мм/добу і належать до проміжної групи. Максимальну радіальну швидкість росту за оптимальної температури інкубації мали G. аpplanatum 1701, 1552 (9,3 і 9,1 мм/добу відповідно) й G. lucidum 1889, 1903 (11,8 і 11,5 мм/добу відповідно). За температури інкубації 20 єС штами G. applanatum (61,5 %) і G. lucidum (55,6 %) росли зі швидкістю 4-6 мм/добу. У G. applanatum як при 28 єС, так і при 32 єС домінувала група штамів зі швидкістю росту 8-10 мм/добу, у G. lucidum - від 6 до 8 мм/добу.

Знання температурних меж, максимуму та оптимуму росту є вагомими фізіологічними характеристиками різних штамів, які мають значення для реалізації процесу культивування. Представлялось важливим ретельніше дослідити життєздатність вегетативного міцелію штамів G. lucidum і G. applanatum різного походження за ознакою наявності чи відсутності росту під час інкубації за високих температур (від 33 до 45 °С з кроком 1°С). Ми відмітили ріст міцелію у всіх досліджених штамів на 3-тю добу культивування за температури 33 °С. З подальшим збільшенням температури інкубації спостерігали значну штамову варіабельність за обраною ознакою серед обох досліджених видів. Слід зазначити, що більшість досліджених штамів G. applanatum і G. lucidum незадовільно переносила вплив підвищення температури. Так, для 30,7 % штамів G. applanatum встановлено критичну температуру росту 39 °С, а для 37,1 % штамів G. lucidum - 36 °С. Водночас виявлено штами обох видів, які зберігали життєздатність вегетативного міцелію у діапазоні 34?44 °С. Серед культур G. lucidum найбільшу життєздатність міцелію мали штами 1902, 1903, 1889, здатні поновлювати ріст міцелію після 3-добової інкубації за температури 44 °С. Унікальним був G. applanatum 1899, який відновлював ріст міцелію навіть після температури інкубації 43 °С.

Однією з суттєвих культуральних ознак культур є характеристика міцеліальної колонії. Досліджено вплив температури інкубації 20, 28 та 32 °С на морфологію міцеліальних колоній G. applanatum і G. lucidum, культивованих на СА. На відміну від існуючих у літературі даних щодо відсутності впливу температури на морфологію колоній штамів G. applanatum і G. lucidum ми встановили, що цей фактор впливає на деякі морфологічні характеристики. Так, підвищення температури з 20 до 32 °С сприяло зростанню кількості типів колоній у штамів G. applanatum (рис. 2), стимулювало появу та інтенсивність пігментації у більшості штамів обох видів, змінювало морфологію міцеліальних колоній у 7 штамів G. applanatum і 17 штамів G. lucidum. Водночас, серед досліджених нами культур були й такі, що не змінювались (6 штамів G. applanatum і 10 штамів G. lucidum). Температура значною мірою впливала на зональність культур, менше ? на забарвлення реверзуму та зовнішню лінію колоній. Лише ознаки міцеліальних колоній G. lucidum 1906, 1908, 1909 в діапазоні температур 20 - 32 єС були стабільними. На відміну від G. applanatum на колоніях більшості штамів G. lucidum з віком формувалась шкіряста плівка.

Встановлено, що для штамів G. lucidum характерна більша різноманітність морфологій колоній за всіх досліджених температур, ніж для штамів G. applanatum. Особливо помітна ця різниця між видами за температури інкубації 20 і 28 єС. Виявлено домінування шкірястого типу міцеліальних колоній для штамів G. applanatum за усіх досліджених температур, а для штамів G. lucidum ? лише при 28 і 32 єС (рис. 2, 3). Повстисті колонії частіше спостерігали у штамів G. lucidum при 20 єС. Варто також зауважити, що 5 із 10 штамів G. lucidum (1904, 1906, 1908, 1909, 1911), виділені в культуру з однієї географічної території, мали однаковий тип міцеліальних колоній за усіх досліджених температур інкубації.

Штами G. applanatum і G. lucidum, виділені у культуру з плодових тіл, які були зібрані на території України, за швидкістю радіального росту, життєздатністю вегетативного міцелію, морфолого-культуральними особливостями колоній, синтезом біомаси за різних значень рН середовища, здатністю використовувати різні джерела вуглецевого і азотного живлення не відрізнялись від штамів цих видів іншого походження, що зберігаються у Колекції культур шапинкових грибів (IБK).

Розділ 5. Дослідження біосинтетичної активності культур

Особливого значення набувають дослідження, спрямовані на використання базидіальних лікарських грибів як перспективних об'єктів продукування грибної біомаси і біосинтезу різноманітних речовин з імуномодулювальними, антиоксидантними, антибактеріальними, цитопротекторними, протипухлинними та іншими властивостями.

5.1. Антимікробна активність культур. Досліджено суміш культуральної рідини з дрібнодисперсною біомасою 13 штамів G. applanatum і 27 штамів G. lucidum. Як тест-об'єкти було використано 14 умовно-патогенних культур із Всеросійської колекції мікроорганізмів (BKM): 3 штами Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, B. mycoides, B. pumilis, Leuconostoc mesenteroides, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Comamonas terrigena, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans і Aspergillus niger. Mи виявили антибактеріальну активність суміші культуральної рідини з дрібнодисперсною біомасою (сконцентрованих у 10 разів) 6 штамів G. applanatum і 8 штамів G. lucidum проти клінічних ізолятів ? метицилінстійкого і метицилінчутливого штамів S. aureus, а також B. subtilis. Причому наявність активності встановлено у 4 штамів G. applanatum і 5 штамів G. lucidum, виділених у культуру з плодових тіл, зібраних на території України. За спектром антибактеріальної дії досліджені нами штами можна розподілити на три групи: G. applanatum 1552 і G. lucidum 1908, 1905 пригнічували ріст усіх трьох вищезазначених тест-бактерій, G. applanatum 1530 і G. lucidum 1898, 1912 - 2 штамів S. aureus, решта культур (G. applanatum 1672, 1701, 1553 і G. lucidum 1670, 1889, 1903, 1607, 1910) ? лише однієї тест-бактерії ? метицилінстійкого штаму S. aureus. Діаметр зони пригнічення росту тест-культур становив 9?16 мм.

5.2. Антивірусна активність культур. У результаті проведених дослідів вперше виявлено, що культуральна рідина усіх обраних 7 штамів G. applanatum (4 штами були ізольовані із плодових тіл цього виду, зібраних на території України) і 7 штамів G. lucidum пригничувала розвиток вірусу тютюнової мозаїки на рослинах дурману. Інфекційність і кількість некрозів на листках дурману, як правило, варіювала залежно від штаму гриба й концентрації водного розчину його ліофілізованої культуральної рідини. Серед культур обох видів слід виділити G. lucidum 1887, інгібуюча дія якого досягала максимального значення за концентрації культуральної рідини 10 мг/мл і не змінювалась за підвищення концентрації до 100 мг/мл. Найактивнішими були G. applanatum 1553, що пригнічував розвиток вірусної інфекції на 98,4 %, і G. lucidum 1887 з інгібуючою активністю понад 86 %.

5.3. Антиоксидантна активність культур. Проведено дослідження динаміки антиоксидантної активності (АОА) біомаси і культуральної рідини окремих культур. З'ясовано, що подовження експозиції культивування збільшувало АОА біомаси, водночас АОА культуральної рідини, навпаки, зменшувалась. Величина АОА культуральної рідини на 7-му добу культивування майже не відрізнялась від АОА біомаси на 28-му добу культивування у стаціонарних умовах, тому подальші досліди ми проводили з культуральною рідиною штамів після 7 діб культивування. Встановлено, що усі зразки культуральної рідини досліджених культур мали різний ступінь АОА. У цілому на 7-му добу культивування АОА культуральної рідини штамів G. applanatum варіювала в межах від 0,7·10^-3 до 3,9·10^-3 л/(мл·хв), штамів G. lucidum ? від 0,4 ·10^-3 до 5,7·10^-3 л/(мл·хв). Слід виділити G. applanatum 1530, 1897, 1672 і G. lucidum 1889, 1906, 1912, що мали найбільшу активність ? 3,3?5,7·10^-3 л/(мл·хв). Для штамів G. applanatum АОА встановлено вперше.

5.4. Дослідження динаміки росту й синтезу екзополісахаридів G. applanatum і G. lucidum на рідких середовищах. Вивчення живильних потреб досліджених штамів G. applanatum і G. lucidum дало змогу відібрати штами, що краще за інші культури росли на живильних середовищах з лактозою або крохмалем і за швидкістю радіального росту віднесено до групи швидкорослих культур. Як живильні комплексні середовища для G. applanatum 1572 і G. lucidum 1621 обрали нативну молочну сироватку виробництва ВАТ «Яготинського маслозаводу» (м. Яготин, Київська обл.) і крохмальну крупку ? відхід виробництва ВАТ «Кремнянський крохмальний завод» (с. Кремно, Житомирська обл.). Отримані дані динаміки накопичення біомаси досліджених G. applanatum 1572 і G. lucidum 1621 на обраних середовищах підпорядковувались загальним закономірностям розвитку мікроорганізмів в умовах періодичної культури. Виявлено певні відмінності, що виражались у тривалості фаз росту й синхронності динаміки росту культур і продукування полісахаридів. Синхронність динаміки росту та утворення екзополісахаридів відмічено лише для періоду культивування G. applanatum 1572 на молочній сироватці після 11-ї доби (рис. 4). Тривалість лаг-фази обох видів під час росту на молочній сироватці, а також G. applanatum 1572 на крупці становила 1 добу. Для G. lucidum 1621 при культивуванні на крупці було характерно подовження лаг-фази до 3 діб. Кількість міцеліальної маси обох видів після лаг-фази збільшувалась, що є характерним для фази активного росту. На середовищі з молочною сироваткою найліпше ріс G. lucidum 1621 з середньою швидкістю накопичення біомаси у активній фазі росту 5,6 г/л/добу. G. applanatum 1572 на обох живильних середовищах мав майже однакову середню швидкість накопичення біомаси: на молочній сироватці вона становила 2,05 г/л/добу (рис. 4), на середовищі з крупкою ? 2,2 г/л/добу. Встановлено, що молочна сироватка була сприятливішим середовищем для накопичення культурального міцелію та екзополісахаридів для обох культур. На цьому живильному середовищі отримано максимальну кількість міцелію (G. applanatum 1572 ? 17,2 ± 0,1 г/л на 11-ту добу, G. lucidum 1621 ? 29,6 ± 0,4 г/л на 5-ту добу) та екзополісахаридів (G. applanatum 1572 ? 9,1 ± 0,1 г/л на 11-ту добу і G. lucidum 1621 ? 10,0 ± 0,1 г/л на 11-ту добу). Пік накопичення міцеліальної маси G. applanatum 1572 на крупці становив 15,2 ± 0,4 г/л на 11-ту добу, G. lucidum 1621 ? 7,0 ± 0,5 г/л ? на 9-ту добу експерименту, найбільша кількість екзополісахаридів 5,3 ± 0,5 г/л була синтезована G. applanatum 1572 на 13-ту добу росту, а G. lucidum 1621 ? 4,2 ± 0,2 г/л на 15-ту добу культивування.

У процесі росту культур і синтезу екзополісахаридів кислотність живильних середовищ змінювалась від 0,5 до 1,7 одиниць за початкового значення рН 5,5.

Дані проведених дослідів підтверджують можливість використання відходів харчової промисловості для глибинного культивування міцелію грибів G. applanatum і G. lucidum. За результатами експериментів відібраний штам G. lucidum 1621 є біотехнологічно перспективним об'єктом для отримання біомаси та екзополісахаридів при культивуванні на молочній сироватці.

5.5. Морфологія ростових форм й мікроструктур вегетативного міцелію G. applanatum і G. lucidum у глибинній культурі. Відомо, що умови глибинного культивування зумовлюють зміни морфології культур (Бисько, 1983; Соломко, 1985; Бухало, 1988; Wagner et al., 2004). За результатами експериментів виявлено відмінності у морфології досліджених культур залежно від виду гриба і складу живильного середовища. Середовище з крупкою сприяло появі міцеліальних агломератів майже однакового розміру, тоді як молочна сироватка обумовлювала продукування агломератів різного розміру. В умовах глибинного культивування G. applanatum 1572 на крупці формувались пухкі агломерати, а на молочній сироватці ? гладкі й тверді. І, навпаки, для G. lucidum 1621 на середовищі з крупкою зафіксовано акумуляцію твердіших агломератів з нитчастим ростом на поверхні, ніж на молочній сироватці. На обох обраних живильних середовищах для G. applanatum 1572 характерним було утворення агломератів неправильної форми, а для G. lucidum 1621 ? агломератів з нитчастим ростом на поверхні. Штами мають морфологічні структури, які дають змогу контролювати чистоту росту культур. На СА, інокульованому глибинним міцелієм досліджених культур, з використанням СЕМ ми виявили характерні для цих видів вищих базидіоміцетів анастомози, пряжки і тонкостінні, сферичні кутикулярні клітини з гладкою поверхнею. На відміну від G. applanatum для міцелію G. lucidum були характерні хламідоспори.

Розділ 6. хімічний склад і медико-біологічні дослідження біомаси G. lucidum

У вирішенні питань стосовно можливості харчового використання біотехнологічних об'єктів ? лікарських грибів ? головна роль належить гігієнічним дослідженням, які дають змогу виключити можливий небезпечний вплив грибної біомаси на організм людини.

6.1. Хімічний склад міцеліальної маси G. lucidum. Біомаса глибинного міцелію G. lucidum 1621, вирощена глибинно на молочній сироватці, характеризується високим вмістом загальних вуглеводів, домінуванням у складі білка глютамінової, аспарагінової кислот і цистіну, значною кількістю у складі ліпідів ненасичених жирних кислот ? лінолевої, пальмітинової та олеїнової.

6.2. Медико-біологічні дослідження біомаси G. lucidum. Дослідження, проведені з метою визначення впливу на організм тварин сухої біомаси G. lucidum 1621, показало, що його щоденне і тривале (6 міс.) додавання до харчового раціону не змінювало масу органів щурів. У дослідних тварин не виявлено також статистично вагомих відхилень при визначенні добового діурезу, відносної щільності сечі, вмісту сечовини та активності аланінамінотрансферази у сироватці крові, відсотку гемолізу еритроцитів, активності каталази цитозоля печінки, рівня атерогенних в-ліпопротеїдів, загальних ліпідів у сумарному рівні, гідроперекислів і малонового діальдегіду. Результати експериментів на щурах довели нетоксичність вживання сухої біомаси G. lucidum 1621. Аналіз даних обміну ліпідів засвідчив можливість використання дослідної біомаси як біологічно активної добавки, як продукту спрямованої дії для зниження холестерину і профілактики атеросклерозу.

Висновки

1. Досліджено морфолого-культуральні, молекулярно-біологічні, фізіологічні й біосинтетичні властивості 40 штамів цінних лікарських грибів G. applanatum і G. lucidum, у тому числі 22 штамів, ізольованих з плодових тіл, зібраних на території України.

2. Встановлення генетичного варіювання за ITS-праймерами ядерної рДНК показало чітке розділення видів G. applanatum i G. lucidum, виділених з плодових тіл, зібраних на території України. Штами G. applanatum за наявністю ампліфікованих фрагментів є близькими один до одного на рівні 87,5 %, штами G. lucidum ? 82 %. Встановлено 100%-ву генетичну подібність G. lucidum 1906 і 1907, ізольованих з плодових тіл, що росли на Quercus L., а також G. applanatum 1898 і 1899, виділених з плодових тіл, які були зібрані на Carpinus L. і Fagus L. відповідно.

3. Визначено швидкість радіального росту міцелію 40 досліджених штамів за температури інкубації від 20 до 32 єС. Встановлено, що температура 28 єС оптимальна для росту 8 штамів G. аpplanatum і 17 штамів G. lucidum, решта культур росли з максимальною швидкістю при 32 єС. Максимальну швидкість радіального росту мали G. аpplanatum 1701 (9,3 мм/добу при 28 °С), 1552 (9,1 мм/добу при 32 °С) і G. lucidum 1889 (11,8 мм/добу при 28 °С), 1903 (11,5 мм/добу при 32 °С). Серед штамів G. applanatum при 28 і 32 °С порівняно з культурами G. lucidum відмічено значно більший відсоток швидкорослих штамів.

4. Підвищення температури інкубації з 20 до 32 °С зумовлювало зростання мінливості морфології міцеліальних колоній, стимулювало появу та інтенсивність пігментації у більшості штамів обох видів, за винятком 6 штамів G. applanatum і 10 штамів G. lucidum, тип міцеліальних колоній яких був стабільним. Встановлено домінування шкірястого типу колоній при 20?32 єС для штамів G. applanatum і при 28?32 °С для штамів G. lucidum. За температури 20 °С у штамів G. lucidum переважав повстистий тип колоній. На відміну від G. applanatum на колоніях більшості штамів G. lucidum з віком формувалась шкіряста плівка.

5. Виявлено значну штамову варіабельність життєздатності вегетативного міцелію культур G. applanatum і G. lucidum за високих температур (33?45 °С). Для більшості штамів G. аpрlanatum критичною температурою росту була 39 °С, для штамів G. lucidum ? 36 °С. Вперше показано, що деякі культури не втрачали життєздатність вегетативного міцелію навіть за температури інкубації 43 °С (G. applanatum 1899) і 44 °С (G. lucidum 1902, 1903, 1889).

6. Більшість культур G. аpрlanatum (61,5 %) і G. lucidum (51,9 %) росла на рідкому синтетичному живильному середовищі з глюкозою у діапазоні рН від 3,2 до 7,3, для інших культур діапазон значень рН, сприятливих для росту, був вужчим. Максимальний синтез біомаси штамами G. аpрlanatum спостерігали переважно при рН 5,0, штамами G. lucidum ? при рН 5,5.

7. Встановлено, що штамова варіабельність фізіологічних властивостей штамів у межах обох видів виявлялась у різному рівні накопичення біомаси під час росту на синтетичному живильному середовищі з різними джерелами вуглецю (глюкоза, лактоза, сахароза, крохмаль) та азоту (аспарагін, сульфат амонію, нітрат натрію). Лише 9 штамів G. lucidum та 1 штам G. applanatum синтезували однакову біомасу на усіх обраних джерелах вуглецю. 47,1 % штамів G. applanatum і 70,4 % штамів G. lucidum однаково росли з використанням органічного й мінерального джерел азоту, інші ? віддавали перевагу органічному азоту, G. applanatum 1896 не ріс на середовищі з нітратом натрію.

8. При дослідженні біосинтетичної активності культур G. applanatum і G. lucidum вперше виявлено антибактеріальну активність суміші культуральної рідини з дрібнодисперсною біомасою 6 штамів G. applanatum і 8 штамів G. lucidum проти клінічних ізолятів метицилінчутливого та метицилінстійкого штамів S. aureus. Уперше відмічено наявність антивірусної активності культуральної рідини 7 штамів G. applanatum і 7 штамів G. lucidum проти вірусу тютюнової мозаїки на рослинах дурману (Datura stramonium L.). Вперше встановлено антиоксидантну активність штамів G. applanatum.

9. За комплексом ознак відібрано штам G. lucidum 1621 з високою продуктивністю біомаси ? 5,6 г/л/добу і екзополісахаридів ? 10 г/л, перспективний для глибинного культивування на молочній сироватці. Результати медико-біологічних досліджень засвідчують можливість застосування отриманої біомаси як продукту спрямованої дії для зниження рівня холестерину в крові й профілактики атеросклерозу. Штам впроваджено на ВАТ ‹‹СБ МУР›› (Київ) для виробництва спеціальних продуктів харчування.

Література

1. Круподьорова Т.А. Вплив температури на швидкість радіального росту та культурально-морфологічні особливості штамів лікарських грибів Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. та G. lucidum (Curt.: Fr.) Karst. / Т.А. Круподьорова, Н.А. Бісько // Український ботанічний журнал. ? 2007. ? Т. 64, № 6. ? С. 875?883. (Здобувачем самостійно досліджено вплив температури на швидкість радіального росту та культурально-морфологічні особливості культур, здійснено збір, узагальнення та аналіз даних літератури).

2. Круподьорова Т.А. Вплив кислотності поживного середовища на накопичення біомаси штамами лікарських грибів Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. та G. lucidum (Curt.) Р. Karst. / Т.А. Круподьорова // Збірник наукових праць Луганського Національного аграрного університету. ? 2008. ? № 83. ? С. 54?60.

3. Круподьорова Т.А. Антимікробна активність штамів Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. та G. lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst. в умовах глибинного культивування / Т.А. Круподьорова, Н.А Бісько, Н.Л. Поєдинок та ін. // Український ботанічний журнал. ? 2008. ? Т. 654, № 4. ? С. 590?595. (Здобувачем самостійно отримано біомасу 13 штамів Ganoderma applanatum та 27 штамів G. lucidum, здійснено збір, узагальнення та аналіз даних літератури).

4. Круподьорова Т.А. Вплив джерел азоту на ріст Ganoderma lucidum (Curt.) P. Karst. та G. applanatum (Perst.) Pat. / Т.А. Круподьорова // Збірник наукових праць Луганського Національного аграрного університету. ? 2008. ? № 96. ? С. 15?21.

5. Kovalenko O.G. Screening of metabolites produced by strains of Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst. and Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. for their activity against tobacco virus / O.G. Kovalenko, O.M. Polishchuk, T.A. Krupodorova et al. // Вісник Київського національного університету ім. Тараса Шевченка. ? 2008. ? № 51. ? С. 32?34. (Здобувачем самостійно отримано біомасу 7 штамів Ganoderma applanatum та 7 штамів G. lucidum, прийнята безпосередня участь у проведенні експериментів щодо інфікування рослин).

6. Круподерова Т.А. Перспективы применения грибов рода Ganoderma в современной медицине / Т.А. Круподерова // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. науч. конф., 1?2 июня 2006 г. ? Минск; Раков, 2006. ? С. 276?278.

7. Круподьорова Т.А. Вплив температурного фактора на швидкість радіального росту Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. та G. lucidum (Curt.: Fr.) Р. Karst. / Т.А. Круподьорова // Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології: матеріали міжнар. конф. молодих учених-ботаніків, 27?30 вер. 2006 р. ? К., 2006. ? С. 150?151.

8. Круподерова Т.А. Физиологические характеристики штаммов Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. и G. lucidum (Curt.: Fr.) Р. Karst. / Т.А. Круподерова // Успехи медицинской микологии. ? Т. 9. ? М.: Национальная академия микологии, 2007. ? С. 243?245.

9. Круподерова Т.А. Лекарственные свойства грибов рода Ganoderma Р. Karst. / Т.А. Круподерова // Успехи медицинской микологии. ? Т. 7. ? М.: Национальная академия микологии, 2006. ? С. 288?290.

10. Круподьорова Т.А. Ідентифікація штамів Ganoderma sp. в культурі / Т.А. Круподьорова // Тези доповідей молодих учених: матеріали II Міжнар. конф. молодих учених, 19?21 лист. 2007 р. ? Х., 2007. ? С. 346?347.

11. Круподьорова Т.А. Вплив джерел вуглецю та азоту на накопичення біомаси лікарським грибом Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. / Т.А. Круподьорова // Молодь та поступ біології: ІІІ Міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів, 23?27 квіт. 2007 р. ? Львів, 2007 р. ? С. 423?424.

12. Kvasko E. Antioxidant activity of medicinal mushrooms Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) P. Karst. and Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst strains / E. Kvasko, T. Krupodоrova // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: materials of III Int. young scientists conf., 15?18 may 2007. ? Odessa, 2007. ? P. 90?91.

13. Krupodorova T.A. The effect of initial pH on biomass production of Ganoderma applanatum and G. lucidum strains / T.A. Krupodorova // International Journal of Medicinal Mushroom. ? 2007. ? Vol. 9, № 3?4. ? P. 322.

14. Круподерова Т.А. Культурально-морфологические и физиологические особенности роста Ganoderma lucidum (Curt.) Р. Karst. на комплексных средах / Т.А Круподерова // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы VI Междунар. науч. конф., 2?6 июня 2008 г. ? Минск, 2008. ? С. 75?77.

15. Круподерова Т.А. Рост штаммов Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. и G. lucidum (Curt.) P. Karst. в культуре / Т.А. Круподерова, Н.А. Бисько // Современная микология в России: тезисы докладов. ? 2008. ? С. 510.

16. Круподерова Т.А. Исследование биосинтетической активности штаммов Ganoderma applanatum (Pers.: Wallr.) Pat. и G. lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst. из коллекции шляпочных грибов Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины / Т.А. Круподерова, Н.А. Бисько, Б.Ф. Васильева и др. // Иммунология, аллергология, инфектология. ? 2009. ? № 2. ? С. 187.

Размещено на Allbest.ru