Вплив івермектину та його аналогів на функціональні властивості мембран зародків в’юна

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

АВТОРЕФЕРАТ

ВПЛИВ ІВЕРМЕКТИНУ ТА ЙОГО АНАЛОГІВ НА ФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ МЕМБРАН ЗАРОДКІВ В'ЮНА

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Санагурський Дмитро Іванович, Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри біофізики та біоінформатики

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Калачнюк Григорій Іванович, Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького Міністерства аграрної політики України,

директор Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин, професор кафедри органічної та неорганічної хімії

кандидат біологічних наук, доцент Рибальченко Тарас Володимирович, Київський національний університет імені Тараса Шеченка, доцент кафедри цитології, гістології та біології розвитку

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “ 11 ” травня 2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради К 35.051.14, доктор біологічних наук В.В. Манько

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Біологічні мембрани відіграють важливу роль у підтриманні іонного гомеостазу клітини (Антонов, 1997), беруть участь у регуляції клітинних поділів, проліферації клітин та розвитку організму в цілому (Веренинов, Марохова, 1986; Husain et al., 1997), вони також є центром морфогенетичних процесів раннього розвитку ембріонів (Гойда, 1993). Зміни біоелектричних параметрів зародкових клітин у значній мірі залежить від властивостей самої мембрани (Божкова, 1986; Божкова и др., 1974) та від функціонування іонтранспортних систем, для таких іонів як Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Cl^-. Відомо, що Na⁺, K⁺-помпа не тільки підтримує співвідношення Na⁺/K⁺ у цитоплазмі (Лопина, 1999), а й зумовлює збільшення рівня трансмембранного потенціалу (ТМП) (Медына и др., 1988; Гойда и др., 1989, 1990), а також відповідає за осмотичність бластоцелю зародків (Slack, et al., 1973). Фармакологія макроциклічних лактонів викликає значний науковий інтерес у останні роки через різноплановий вплив на різні клітинні процеси (Griffiths, 2001; Sigal et al., 1991; Wicker et al., 1990; Thomson, Woo, 1989; Chabala et al. 1980). Такі макроліди як FK-506, рапаміцин та аскоміцин проявили властивості імуносупресантів (Griffiths, 2001; Thomson, Woo, 1989). Більше того, FK-506 та рапаміцин проявили високу спорідненість до FK-506-зв'язуючого білка (FKBP12-імунофіліном (Van Duyne et al., 1993), який взаємодіє з ріанодин-чутливими (RyR) та інозитол-1,4,5-трифосфатними рецепторами (Bultynck et al., 2001). Івермектин, відомий антипаразитичний препарат (Campbell et al., 1983), який взаємодіє з нікотинацетилхоліновими, глутамат-чутливими та рецепторами г-аміномасляної кислоти (ГАМК-рецептори) (Adelsberger et al., 2000). Відома здатність івермектину інгібувати АТФ-залежний транспорт іонів Na⁺, K⁺ у нематод Onchocerca volvulus (Shu et al., 2000) та Ca²⁺ у клітинах SH-SY5Y клітинної лінії людської нейробластоми (Bultynck et al., 2001), у м'язах та мікросомальній фракції мозку кроля (Bilmen et al., 2002).

Для виявлення механізмів дії лікарських препаратів зручною моделлю є Na⁺, K⁺-АТФаза. Мембрана є першим бар'єром для проникнення речовин у клітину і саме на мембрані розташовані багаточисленні рецептори, які приймають зовнішні сигнали. Тому, з одного боку для Na⁺, K⁺-АТФази можна застосувати повний арсенал методів інгібіторного аналізу, а з іншого - активність ензиму залежить від стану ліпідного матриксу, що дозволяє виявити та охарактеризувати мембранотропну активність біологічно активних речовин. У роботах Горшкової показано (1999), що використання такої моделі дозволило виявити різницю у механізмах дії близькоспоріднених псолюсозидів А і В, виділених з голотурії Psolus fabricii (Duben et Koren) (Gorshkova et al., 1999). Окрім того, вважають, що Na⁺, K⁺-АТФаза відіграє важливу роль у формуванні серцево-судинної системи організму (Shu et al., 2000). Отже, доцільно вивчати вплив препаратів з мембранотропними властивостями на прикладі їхньої дії на Na⁺, K⁺-АТФазу та подібні іонтранспортні системи.

У реалізації сигналу від цитоплазматичної мембрани до біосинтетичного апарату заплідненої яйцеклітини важливу роль відводять іонам Ca²⁺. При заплідненні спостерігається збільшення [Ca²⁺]_i у морських їжаків (Sillers, 1985) шпорцевої жаби (Keating et al., 1994; Muto et al., 1996), під час запліднення ооцитів Urechis caupo (Echiura) (Stephano, Gould, 1997), асцидій, нематод та ссавців (Dumollard et al., 2002; Nixon et al., 2000). Показано коливання [Ca²⁺]_і також у гомогенаті зародків в'юна протягом періоду дроблення (Гойда, 1993). Функцію Ca²⁺-помп забезпечують Ca²⁺, Mg²⁺-АТФази (Pavoine et al., 1987; Teo et al., 1988), тому основним чинником збільшення [Ca²⁺]_і протягом клітинних поділів зародків більшість дослідників вважають АТФ-залежний транспорт катіонів Ca²⁺ через плазматичну мембрану бластомерів. Вплив авермектинів не досліджувався з використанням зародкових об'єктів, що може бути критерієм для оцінки можливості подальшого використання досліджуваних препаратів. Залежність розвитку організму від активності систем іонного транспорту у більшості випадків є очевидною. У зв'язку з цим, дослідження молекулярних механізмів дії авермектинів на системи іонного транспорту є актуальним завданням для біофізики, для розуміння аспектів та причин їх токсичності, різноплановості дії цих препаратів на клітину та розвиток організму загалом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано відповідно до тематики наукових досліджень Львівського національного університету імені Івана Франка як складову частину таких науково-дослідних держбюджетних тем: “Еволюція іонтранспортних систем в період раннього розвитку зародків риб”, № держреєстрації 0105U002210 (2005-2006 рр.), “Гідробіоценози заповідних та антропогеннозмінених територій західноукраїнської частини Головного європейського вододілу”, № держреєстрації 0107U002055 (2007 р.), “Антиоксидантна і транспортні системи мембран зародків холоднокровних за дії лазерного випромінювання”, № держреєстрації 0108U004148 (2008-2009 рр.), а також гранту Президента України для підтримання наукових досліджень молодих учених “Динаміка активності мембранних АТФаз зародків риб”, № держреєстрації 0107U010322 (2007 р.).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у дослідженні впливу авермектинів на функціонування мембранних систем активного транспорту Na⁺, K⁺ та Ca²⁺ у зародкових клітинах в'юна Misgurnus fossilis L., а також у вивченні механізмів їхнього впливу упродовж ембріогенезу та токсичності препаратів. Для досягнення цієї мети вирішували такі завдання:

З'ясувати кінетичні характеристики Na⁺, K⁺-ATФази зародків в'юна Misgurnus fossilis L. упродовж раннього ембріогенезу.

Дослідити вплив (залежно від концентрації) макроциклічних лактонів авермектинового класу (авермектину та івермектину) на Na⁺, K⁺- та сумарну Са²⁺, Mg²⁺-АТФазну активності зародків на різних стадіях раннього ембріогенезу в'юна.

Встановити зміни динаміки ТМП бластомерів зародків протягом синхронних поділів бластомерів за умов впливу авермектинів.

Дослідити морфологічні зміни зародків та личинок в'юна за наявності в середовищі інкубації досліджуваних препаратів.

Провести дисперсійний аналіз впливів досліджуваних чинників на зміни активності оуабаїнчутливої АТФази зародкових мембран.

З'ясувати характер змін ультраструктури бластомерів зародків в'юна, інкубованих у нормальному середовищі та в присутності препаратів авермектинового класу.

Об'єкт дослідження: Na⁺, K⁺- та Ca²⁺-АТФази мембран зародків в'юна.

Предмет дослідження: механізми впливу авермектинів на функціонування Na⁺, K⁺- та Ca²⁺-АТФази мембран зародків в'юна.

Для досягнення мети у роботі використовували біофізичні, біохімічні методи, в тому числі методи кінетичного аналізу, та статистичні (дисперсійний аналіз) методи досліджень, а також метод світлової та електронної мікроскопії.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше отримано кінетичні параметри гідролізу АТФ та встановлено кінетичні особливості функціонування Na⁺, K⁺-АТФази у зародкових клітинах в'юна Misgurnus fossilis L., виявлено зміни цих параметрів протягом синхронних поділів бластомерів. Проведено дослідження впливу авермектинів на зародкових об'єктах. Встановлено, що вплив авермектинів реалізується на мембранному рівні, а саме через інгібування Na⁺, K⁺-ATФази. Ступінь інгібувального впливу препаратів залежить не тільки від концентрації препаратів у середовищі інкубації, а й від стадії розвитку зародків та від структури самих препаратів, яка визначає їхні фізико-хімічні властивості. Розраховані значення констант напівінгібування (І₅₀) свідчать про зв'язок змін Na⁺, K⁺-АТФазної активності з різним ступенем чутливості ферменту до дії авермектинів протягом раннього ембріогенезу. Показано здатність авермектинів також інгібувати сумарну Са²⁺-АТФазну активність мембран, хоча чутливість цих систем транспорту кальцію є менша, однак не виключено, що такі зміни мають свій вклад у токсичні ефекти викликані препаратами. З'ясовано, що вплив авермектинів призводить до значних морфологічних змін у розвитку зародків, які свідчать про високу ембріотоксичність для водних організмів. На це також вказують значні ультраструктурні зміни клітинних органел бластомерів зародків в'юна у перші години розвитку, які є очевидними наслідками змін іонного балансу клітин та порушенням метаболічних процесів, які в кінцевому підсумку ведуть до розвитку аномалій та загибелі зародків. Встановлено зв'язок між зниженням активності АТФаз та впливом авермектинів на динаміку ТМП. Отримані зміни у динаміці ТМП бластомерів вказують на вплив ліків як на компоненти активного транспорту, так і на системи пасивного транспорту іонів, які беруть участь у підтриманні мембранного потенціалу.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють уявлення про механізми впливу авермектинів на Na⁺, K⁺- та Са²⁺-помпи мембран зародкових клітин і на морфогенетичні процеси, зокрема на ультраструктуру бластомерів зародків. Також розкривають причини побічних явищ викликаних препаратами, які реалізуються на клітинному рівні, розширюють можливості використання даних ліків не тільки як антипаразитичних, а також як препарати, які модулюють системи активного транспорту ембріональних та високо диференційованих клітин, у дослідженнях механізмів реалізації клітинної відповіді на модифікуючі фактори. Ці результати будуть впроваджені у навчальний процес при викладанні загального курсу біофізики та спецкурсів з “Біофізики мембран”, “Механізми біологічної дії модифікуючих факторів” у Львівському національному університеті імені Івана Франка. Вони можуть бути використані для токсикологічної оцінки біологічно активних та фармакологічних препаратів та можуть мати рекомендаційний характер при дозуванні препаратів, а тому мають значення для медицини та ветеринарії. Враховуючи вищезазначене, дані результати є цінними для біофізики, фармакології, ветеринарії та медицини.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури. Планування напрямків досліджень, аналіз та інтерпретація одержаних результатів проведені за участю наукового керівника д.б.н., професора Д.І. Санагурського.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення дисертації були представлені на: ІV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006); Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2006-2008 рр.); 11 та 12 міжнародній школі-конференції молодих вчених “Біологія - наука ХХІ століття” (Росія, Пущіно, 2007-2008); 6 Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинної сигналізації” (Польща, Краків, 2007); XV міжнародній конференції студентів та аспірантів та молодих вчених. “Ломоносов-2008” (Росія, Москва, 2008); Міжнародному симпозіумі “Біологічна рухливість: досягнення та перспективи” (Росія, Пущіно, 2008); Міжнародній науковій конференції восьмого з'їзду Білоруського громадянського об'єднання фотобіологів та біофізиків “Молекулярні, мембранні і клітинні основи функціонування біосистем” (Білорусія, Мінськ, 2008); Міжнародній науковій конференції “Біофізичні механізми функціонування живих систем” (Львів, 2008); ІІІ міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2008 р.), а також на щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2005-2008 рр.), наукових семінарах кафедри біофізики та біоінформатики (2005-2008 рр.) та міжкафедральному семінарі біологічного факультету у січні 2009 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них 5 статей у фахових наукових журналах та 9 тез доповідей у матеріалах міжнародних та вітчизняних наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури, яка включає 323 джерела. Робота викладена на 169 сторінках, ілюстрована 56 рисунками і 4 таблицями.

Основний зміст роботи

У розділі „Огляд літератури” узагальнено та охарактеризовано сучасні уявлення про основні механізми дії авермектинів (Мандзинець, 2008), проаналізовано властивості іонтранспортних систем як мішеней, через які можуть реалізуватись побічні ефекти дії авермектинів.

Матеріали і методи досліджень. Для дослідження функціонування Na⁺, K⁺- та Ca²⁺-АТФаз використовували зародки в'юна Misgurnus fossilis L. у період від запліднення яйцеклітин до закінчення синхронних поділів бластомерів. Овуляцію стимулювали внутрішньом'язовим введенням самкам хоріогонічного гонадотропіну (500 од.). Ікру одержували через 36 год після стимуляції та запліднювали в чашках Петрі суспензією сперміїв отриманих за Нейфахом (Нейфах, 1977). Стадії розвитку контролювали візуально під бінокулярним мікроскопом МБС-9. Фракцію мембран зародків в'юна одержували методом диференційного центрифугування (Evans, 1980; Луцик та ін., 1986). Зародки попередньо гомогенізували у буферному розчині, який містив (ммоль/л): сахарозу - 120,0; трис-Cl - 10,0 (рН=7,4; t= 4^оС); KCl - 130,0; MgCl₂ - 5,0. Рештки зародкового жовтка осаджували центрифугуванням упродовж 10 хв при 1600 g. Надосадову рідину, збагачену фрагментами плазматичних мембран (ПМ) та мембранами ендоплазматичного ретикулуму одержану після центрифугування 10 хв при 10000 g, зберігали при t=-20^оС (Луцик та ін., 1986).

Для визначення АТФазної активності зародкових мембран використовували стандартне середовище інкубації наступного складу (ммоль/л): NaCl -30,0; KCl -125,0; MgCl₂ - 3,0; трис-Cl - 50,0 (рН=7,4; t= 23^оС) у яке вносили аліквоту мембранних фракцій (0,1 мл). Na⁺, K⁺-ATФазну активність визначали у стандартному середовищі при додаванні та за відсутності оуабаїну (1 ммоль/л). Середовище інкубації для Ca²⁺, Mg²⁺-АТФазної активності, окрім того, містило CaCl₂ (0,01 ммоль), і в ході реакції додавали азид Na (1,0 ммоль/л) та оуабаїн (1,0 ммоль/л) (Федірко, 2002). АТФ-гідролазну в обох випадках реакцію ініціювали додаванням 3 ммоль/л АТФ. Визначали вміст неорганічного фосфору (Р_i) за модифікованим методом Фіске-Суббароу (Прохорова, 1982). Питому активність АТФаз мембран зародкових клітин оцінювали за різницею вмісту Р_i у середовищах різного складу й виражали в мкмоль Р_i у перерахунку на мг білка за год. Вміст білка в середовищі інкубації визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). У дослідженнях in vitro досліджувані авермектини додавали по 0,1 мл розчину відповідної концентрації (0,001ч10 мкг/мл) безпосередньо під час реакції. Досліджували авермектину (діюча речовина - авермектин В₁) та івермектину (22,23-гідроавермектин В₁). У дослідженнях in vivo розчини авермектинів (0,01ч1 мкг/мл) вносили у середовище інкубації зародків після запліднення. Морфологічні зміни зародків та личинок за дії авермектинів фотографували з допомогою цифрової камери з насадкою мікроскопа Люмам-ИЗ.

Вимірювання та реєстрацію ТМП клітин зародків у період дроблення бластомерів проводили на спеціально сконструйованій установці. Зародки переносили в камеру (об'єм 0,5 мл), зі зміною розчину (швидкість 0,2 мл/хв) при довготривалих дослідах. Мікроелектроди у тримачах механічних мікроманіпуляторів вводили в зародок, контролюючи введення під об'єктивом мікроскопа МБС-9 (Костюк, Кришталь, 1981; Санагурский, 1983; Гойда, 1993). В камеру вносили інкубаційне середовище з авермектинами у концентрації 0,1 мкг/мл, які виготовляли на основі фізіологічного розчину для холоднокровних - розчину Гольтфретера (Mladineo et al., 2006), і проводили реєстрацію ТМП зміненого під дією авермектинів.

Для електронно-мікроскопічних досліджень зародки на стадіях 2 бластомерів та на 6 годині розвитку (10 поділ бластомерів), які знаходились у середовищі з додаванням відповідних концентрацій авермектинів, фіксували впродовж години 1,5% розчином глутарового альдегіду в 0,2 моль какодилатному буфері (рН 7,2; t= 4^оС). Зразки промивали в какодилатному буфері і додатково фіксували 1 год (t=4^оС) у 2% розчині OsO₄. Препарати відмивали від фіксаторів і зневоднювали у зростаючих концентраціях етанолу (50%, 70%, 90% і абсолютному - 100%), окису пропілену і поміщали в епоксидну смолу Epon-812 (Уикли, 1975). Зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6, контрастували 15 хв 2% розчином уранілацетату і додатково цитратом свинцю за Рейнольдсом (Reynolds, 1963). Перегляд і фотографування зразків виконували на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100.

Статистичне опрацювання експериментальних даних, однофакторний та двофакторний дисперсійний аналізи проводили відповідно з допомогою пакету Microsoft Excel. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента. Обчислення кінетичних констант здійснювали за допомогою програмного пакету GraphPad Prizm 5. Критичні рівні достовірності при перевірці статистичних гіпотез у дослідженнях брали рівними 0,95, 0,99 та 0,999.

Результати досліджень та їх обговорення

Кінетичні особливості функціонування Na⁺, К⁺-АТФази за нормальних умов. У результаті проведених досліджень встановлено, що залежність активності досліджуваної АТФази ПМ зародкових клітин від концентрації АТФ є двофазною, практично на усіх досліджуваних стадіях розвитку зародків. Криві залежності функціонування Na⁺, К⁺-АТФази від рівня АТФ у середовищі інкубації дещо відмінна на досліджуваних стадіях розвитку зародків: спостерігається стрімке зростання її активності з підвищенням концентрації АТФ до 1,5 ммоль, вихід на плато (2, 16, 64 бластомерів) та подальше збільшення в діапазоні 2,0-3,0 ммоль (8-10 поділи бластомерів). Такий складний характер залежності активності ферменту від концентрації субстрату, ймовірно, зумовлений появою в їхніх молекулах ділянок із різною спорідненістю до АТФ на різних стадіях ембріогенезу. Максимального значення активності Na⁺, K⁺-АТФаза досягає на 8 стадії поділу бластомерів зародків в'юна (Целевич та ін., 2004), як і оуабаїнрезистентна базальна Mg²⁺-АТФаза зародків (Целевич та ін., 2007). При дослідженні характеру роботи Nа⁺, К⁺-АТФази на зародках морських їжаків Strongylocentrotus purpuratus i Litechinus pictus (Leong, Manahan, 1997), показано, що активність АТФ-гідролази для незаплідненої яйцеклітини та при заплідненні майже ідентична, а швидке зростання активності ферменту відбувається від стадії бластули до ранньої гаструли, після чого залишається незмінною до стадії вилуплення. Подібні зміни Nа⁺, К⁺-АТФазної активності описано для морського їжака Hemicentrotus pulcherrimus (Mitsunaga-Nakatsubo et al., 1992). У кінці періоду синхронних поділів бластомерів (6-7 години розвитку) активуються макромолекулярні синтези, особливо масивний синтез нових мРНК (Озернюк, 1985), який вимагає значних енерговитрат і призводить до перерозподілу клітинних макроергів, з чим імовірно й пов'язана відмінність ферментативної активності енергозалежних систем транспорту на цьому етапі розвитку у порівнянні із першими поділами бластомерів.

Шляхом лінеаризації одержаних кривих у координатах Лайнуівера-Берка визначено каталітичні параметри Na⁺, K⁺-активованого, Mg²⁺-залежного гідролізу Атф у мікросомальній фракції мембран зародків в'юна протягом раннього ембріогенезу. Уперше встановлено кінетичні характеристики для даного ферменту протягом раннього ембріогенезу (табл. 1). Показано, що кінетичні характеристики V_max й K_m для Na⁺, К⁺-АТФази на різних стадіях поділу бластомерів дещо відмінні. Величини K_m знаходяться в діапазоні значень 10^-3 моль/л, які свідчать про невисоку активність ферменту на цих стадіях розвитку, оскільки відомо, що чим менше K_m, тим більша активність ферменту.

Однак на стадіях 16, 64 бластомерів та стадії 10 поділу K_атф близькі за значеннями (?2,7 ммоль) до тих, які характерні для низькоафінних центрів ферменту Са²⁺-АТФаз ПМ клітин печінки щурів (Pavoine et al., 1987). Такі величини K_атф відповідають фізіологічній концентрації Mg-АТФ у цитоплазмі досліджуваних клітин, не тільки для Na⁺, К⁺-, але й для Са²⁺-АТФаз ПМ. безпосередньо не беруть участі в каталітичному циклі, однак зв'язування з ними АТФ підвищує інтенсивність та ефективність перебігу етапів циклу. Це в свою чергу узгоджується із загальною тенденцією підвищенні активності Na⁺, К⁺-АТФази упродовж досліджуваних стадій ембріогенезу (Целевич та ін., 2008).

Таблиця 1 Каталітичні параметри Na⁺, К⁺-АТФази зв'язування АТФ зародкових клітин в'юна на різних стадіях розвитку (М ± m, n=10, p>0,95)

Вважають, що такі низькоафінні центри мають більш регуляторне значення і Тоді як на перших поділах клітин (стадія 2 бластомерів) ці центри характеризуються удвічі вищою спорідненістю до субстрату реакції. Отже, Na⁺, К⁺-АТФаза ПМ зародкових клітин в'юна характеризується досить низькою спорідненістю до АТФ (згідно визначених K_атф), це свідчать про наявність у молекулі ферменту відповідних регуляторних центрів. Зв'язування з ними нуклеозидтрифосфату регулює та прискорює каталітичний цикл молекули АТФази. Не виключено, що впродовж раннього ембріогенезу зародків у молекулах ферментів наявні також високоафінні (каталітичні) центри зв'язування з АТФ. Згідно отриманих значень їх кількість незначна, однак вони ймовірно переважають на самих перших поділах бластомерів (тобто активуються в перші хвилини після запліднення). Однак, для підвищення швидкості перебігу проміжних етапів каталітичної реакції та максимально ефективної роботи АТФази, для нормального проходження поділів та формування все нових бластомерів, необхідним є зв'язування субстрату реакції з регуляторним центром ферменту, навіть при нефізіологічних концентраціях останнього. Як зазначають вчені (Nakamura et al., 2003), асоціація АТФ за таких умов з низькоафінними центрами прискорює не тільки гідролітичний цикл, але й впливає на спорідненість катіон-зв'язуючих центрів ферменту до катіонів, які транспортує Na⁺, К⁺-АТФаза.

Вплив авермектинів на активність Na⁺, K⁺-АТФази та сумарної Са²⁺, Mg²⁺ -АТФазної активності зародків в'юна у дослідженнях in vitro та in vivo. Відомо, що авермектини володіють високою ліпофільністю, яка визначає їхні мембранотропні властивості. Відомо, що авермектини здійснюють свою антипаразитичну дію через активацію глутаматчутливих хлорних каналів, а також впливають на рецептори чутливі до г-аміномасляної кислоти (ГАМК-чутливі рецептори) присутні у мембранах нейронів безхребетних (Cully et al., 1994; Duce, Scott 1985). У нервових клітинах хребетних мішенню для авермектинів є інші мембранні рецептори: аденозинові, холецистокінінові, адренергічні (б1, б2, в1, в2), глутамат-чутливі, дофамінові (D1-5), мускаринові, опіатні (µ-, к- та д-підтипи) та 5-гідрокси-триптамінові, а також калієві канали. Активація авермектинами гліцинових рецепторів у мозку щурів (Graham et al., 1984) може бути основою їхнього внеску у токсичні ефекти, які спостерігали у поведінкових дослідах на тваринах (Dawson et al., 2000).

Відсутність даних про наявність у зародкових клітинах на перших годинах розвитку основних мішеней дії авермектинів дозволило припустити, що ліки діють на так звані другорядні мішені, до яких належать ферменти, які здійснюють АТФ-гідролазні реакції, і забезпечують активний транспорт іонів крізь мембрану. Зручність та адекватність такої тест -системи, як зародки риб, зумовили доцільність її використання у дослідженні механізмів впливу авермектинів на маловивчені мішені дії препаратів (Nagel, Dar, 2002), Відомо, що івермектин впливає на активність Na⁺, К⁺- та Mg²⁺-ATФаз у нематод O. volvulus (Shu et al., 2000). Виходячи з цього і вищевказаного, дослідили вплив авермектинів на функціонування іонтранспортних систем мембран зародків в'юна за умов in vivo та in vitro. Показано, що природній авермектин та напівсинтетичний івермектин дозозалежно інгібують активність Na⁺, K⁺-ATФази ПМ зародків в'юна на різних стадіях розвитку. Причому зменшення активності ферменту були виражені по-різному, хоча останній характеризувався більшою чутливістю до дії препаратів на пізніших стадіях ембріогенезу - 8 та 10 поділ бластомерів (Мандзинець та ін., 2008) .

У дослідженнях in vitro вплив авермектину в діапазоні концентрації 0,001ч10 мкг/мл на різних стадіях ембріогенезу зумовлював зміни Na⁺, K⁺-АТФазної активності зародків, які набували певного коливного характеру протягом досліджуваних стадій. Зокрема характер коливних змін зберігався при всіх досліджуваних концентраціях і характеризувалися певною періодичністю (рис. 1, А). На стадії 2 бластомерів оуабаїнчутлива Атфазна активність за наявності авермектину в усьому досліджуваному діапазоні концентрацій зазнавала найменших змін у порівнянні з іншими стадіями, активність зменшувалась в середньому на 22,7±0,3 % (p>0,99) у порівнянні з контролем на цій стадії. Суттєве зменшення АТФазної активності зародків в'юна на 56,4±0,7 % (p>0,99) спостерігалось при дії авермектину в концентрації 10 мкг/мл на стадії 64 та 10 поділу бластомерів. На відміну від авермектину, дія івермектину за умов проведення досліджень in vitro (рис. 1, Б) у високих концентраціях вела до вірогідного зменшення Na⁺, K⁺- АТФазної активності зародків протягом раннього ембріогенезу в'юна.У концентраціях 1-10 мкг/мл зміни Na⁺, K⁺-АТФазної активності зародків в'юна були більш вираженими набували характеру експоненти (рис. 1, Б), хоча коливний характер змін зберігався за низьких концентрацій (ніж 10 мкг/мл). У випадку дії препарату в концентрації 0,1 мкг/мл зміни оуабаїнчутливої Атфазної активності мембран бластомерів протягом досліджуваних стадій розвитку була подібна до змін активності у контролі, та становила 41-52% активності контролю. За низьких концентрацій коливання було двофазним з наростанням на стадії 16 бластомерів та зниженням на наступній стадії і подальшим циклом змін на двох наступних стадіях. Слід зауважити, що при дії івермектину у концентрації (10 мкг/мл) Na⁺, K⁺-АТФазна активність мембран була мінімальною на стадії 8 поділу бластомерів і становила 1,01±0,2 мкмоль Р_i/год •мг білка (n=9).

Відмінну картину спостерігали у дослідженнях in vivo. За наявності у середовищі інкубації івермектину у діапазоні концентрацій 0,01ч1 мкг/мл спостерігали наявність коливань, які характеризуються зниженням активності ферменту на стадіях 16 та 64 бластомерів і наростанням на стадії 8 поділу бластомерів з незначним зниженням на стадії 10 поділу. При дії івермектину у концентрації 1 мкг/мл відмічено найбільше зниження активності, яке становило 69,5±6,5% на стадії 2 бластомерів. Результати двофакторного дисперсійного аналізу свідчать, що вплив авермектинів на загальну мінливість активності Na⁺, K⁺-АТФази є суттєвий та рівноцінний за величиною у дослідженнях in vivo та in vitro, частка впливу становила у середньому 80-90 %. Проте вплив івермектину на зміни активності Nа⁺, K⁺-АТФази мембран у ембріогенезі в'юна мав більш виражений ефект. Отримані результати можна пояснити відмінністю у хімічній будові досліджуваних препаратів, яка визначає їх фізико-хімічні властивості. Відомо, що наявність насиченого зв'язку у положенні С₂₂-С₂₃ посилює антипаразитичні властивості івермектину, тоді як в авермектину зв'язок є ненасиченим (Campbell et al., 1983). авермектин мембрана клітина

Згідно літературних даних івермектин здатний інгібувати активність ферментів кальцій-транспортуючих систем, зокрема на активність Ca²⁺, Mg²⁺-АТФаз мембран ЕПР, як показано у роботах Більмана, Ахена (Bilmen et al., 2002; Ahern et al., 1999). Останніми дослідженнями було ідентифіковано у фракціях бластодерм зародків в'юна функціонування двох систем транспорту Ca²⁺ - це Ca²⁺, Mg²⁺-АТФази ПМ та мембран ЕПР (Целевич та ін., 2007). Відмічено, що коливні зміни активності Ca²⁺, Mg²⁺-АТФази, як ПМ, так і мембран ЕПР, узгоджуються з періодичними осциляціями вільного кальцію в цитоплазмі зародків протягом синхронних поділів бластомерів (Гойда, 1993).

Тому, для врахування більш комплексного впливу авермектинів було досліджено зміни сумарної Ca²⁺, Mg²⁺-АТФазної активності мембран бластомерів. У дослідженнях in vivo сумарна Са²⁺, Mg²⁺-АТФазна активність ПМ зародків на стадії 2 бластомерів за наявності у середовищі інкубації авермектину та івермектину (0,1 мкг/мл) зменшувалась на 30,4±0,1%, та 29,3±0,2 %, відповідно. У дослідженнях in vitro зменшення становило 28,5±0,1%, та 21,4±0,1 % останнє не було статистично достовірним. За наявності у середовищі інкубації авермектину у концентрації 1 мкг/мл відмічено подібну тенденцію зниження активності ферментів на стадії 2 бластомерів, яке в середньому становило 50-70%. Авермектин у концентрації 1 мкг/мл на стадії 10 поділу бластомерів не викликав значних відмінностей у зниженні активності ферментів у порівнянні з попередньою концентрацією, аналогічні зміни спостерігаємо і для івермектину. Таким чином, дія авермектинів на системи активного транспорту кальцію є менш вираженою і має свій вклад у взаємодії препаратів з клітиною.

Інгібіторний аналіз впливу авермектинів. Відома здатність авермектинів реалізувати свій вплив на різний спектр ферментів, шляхом інгібування реакції гідролізу АТФ. Зокрема показано, що івермектин та інші авермектини пригнічують АТФ-гідролізну активність Р-глікопротедів (Kwei et al., 1999), а також Са²⁺-АТФази м'язів та мозку кролика (Bilmen et al., 2002). Встановлено, що івермектин та авермектин у концентрації 0,1 мкг/мл призводить до зниження активності на 40-50% у порівнянні з контролем. Тип інгібування визначали за методом Діксона (Келети, 1990), шляхом лінеаризації концентраційних залежностей інгібування активності Na⁺, К⁺-АТФази івермектином за наявності АТФ у концентрації 1,5 та 3 ммоль. Згідно з інтерпретацією такого аналізу отримані результати свідчать про умовно конкурентний тип інгібування (Келети, 1990). Тобто івермектин не заміщає субстрат в активному центрі ферменту, однак, ймовірно, змінює конформацію білкових молекул у стані E₁, а це зумовлює зменшення кількості форм, які здатні зв'язувати Р_і, такі дані узгоджуються з даними отриманими Більманом на прикладі Са²⁺-АТФази (Bilmen et al., 2002). Однак, такий ефект не є постійним і може зменшуватись внаслідок зміни ліпідного оточення молекул ферменту, які можуть пояснювати коливний характер змін за умов проведення досліджень in vitro та in vivo. Ймовірними причинами такого явища може бути змінний склад ліпідного оточення, час впливу так і зміни, які відбуваються у зародках in vivo.

Таблиця 2 Значення констант напівінгібування І₅₀ (мкг/мл) Na⁺, K⁺-ATфази мембран зародків в'юна авермектинами in vitro та in vivo

Порівняльний аналіз впливу авермектину та івермектину на активність Na⁺, К⁺-АТФази проводили на основі констант напівінгібування (І₅₀), які визначали за модифікованим рівнянням Хілла в логарифмічних координатах (Векліч та ін., 2006). Згідно отриманих даних встановлено, що найбільш чутливою до дії авермектину є Na⁺, K⁺-ATФаза на стадії 16 бластомерів та на стадії 10 поділу бластомерів (І₅₀=0,016 та І₅₀=0,001 мкг/мл, відповідно), тоді як у випадку дії івермектину найбільш чутливими є стадії 64 бластомерів та 8 поділу бластомерів (І₅₀=0,019 та І₅₀=0,015 мкг/мл, відповідно) (табл. 2).

Показано, як чутливість ферменту до авермектину змінюється відповідно до досліджуваної стадії, зокрема значення констант напівінгібування зменшуються до стадії 64 бластомерів за наступним збільшенням на стадії 8 поділу бластомерів та зменшенням на останній стадії, така змінна значень коефіцієнтів співвідноситься зі змінами кооперативності. Подібні дані спостерігаємо за дії івермектину, зокрема зменшення значень коефіцієнтів Хілла до стадії 64 бластомерів і з наступним зростанням їхніх значень на двох останніх досліджуваних стадіях (див. табл. 2).Враховуючи кінетичні параметри Na⁺, K⁺-ATФази, які вказують на існування регуляторних центрів та ефекти впливу авермектинів in vivo, які свідчать про збільшення чутливості до ліків зі стадії 16 бластомерів. Припускаємо, що молекулярним механізмом їхньої дії є зв'язування молекул препаратів саме з цими центрами. Переважання високоафінних центрів на стадії 2 бластомерів, свідчить про меншу чутливість до дії препаратів, а поява низькоафінних центрів у наступних стадіях є причиною збільшення чутливості до ліків від стадії 16 бластомерів до стадії 10 поділу, за умов постійної дії препарату. Припускаємо, що стійкість ферменту на стадії 2 бластомерів зумовлена тим, що клітини на даній стадії знаходяться у неактивному стані стосовно синтетичних процесів. Зростання чутливості на подальших стадіях (in vitro) зумовлюється умовами збільшення синтетичних процесів у клітинах та реінтерналізацією ферментів у мембрану зародків. На це вказують більш сталі коефіцієнти Хілла для івермектину та авермектину, яка свідчить про високу негативну кооперативність ферменту та авермектинів за умов in vitro. Враховуючи здатність івермектину впливати на реінтерналізацію Р₂Х₄ рецепторів (Toulme, et al., 2006) не виключено що такий механізм дії препаратів матиме місце за умов активних поділів клітин.

Зміни ТМП мембран зародків в'юна за умов впливу авермектинів. Показано, що ТМП різних клітин є достатньо чутливим параметром, який реагує на зовнішні фізичні та хімічні чинники. Зокрема, при внесенні у середовище інкубації таких речовин, як гормони, фактори росту (Гойда, 1993), антибіотики (Санагурський, 1983) та хлориди важких металів (Бойко, Санагурський, 2000), у першу чергу змін зазнають амплітуда та період коливань ТМП. Встановлено, що за наявності у середовищі інкубації зародків у авермектину та івермектину (0,1 мкг/мл) зміни ТМП мають неоднозначний характер. Для івермектину встановлено такі рівні деполяризації мембрани до -40 мВ (стадія 64 бластомерів) та -55 мВ (стадія 8 поділу бластомерів), тоді як у контролі наростання ТМП на стадії 8 поділу бластомерів становило -65 мВ. Наявність авермектину викликало виражену деполяризацію мембрани до рівня +7 мВ з наступним зниженням потенціалу до -20 мВ, та збереженням його на даному рівні впродовж усього досліду. Відомо, що абсолютні значення ТМП значною мірою залежать від активності Na⁺, K⁺-ATФази, як показано у роботах Гойди (Гойда, 1993; Гойда и др., 1989) додавання у середовище інкубації зародків оуабаїну (у концентрації 10-⁴ моль) у момент утворення 4 чи 32 бластомерів супроводжувалась поступовою деполяризацією мембрани. Однак провідність різних іонних каналів теж має вклад у зміни ТМП, яка стає очевидною на фоні інгібування помпи. Для авермектинів, як відомо, мішенню дії є глутамат-чутливі рецептори хлорних каналів (Campbell et al., 1983; Zufall et al., 1989),а також ГАМК-рецептори хлорних каналів у ембріональних нейронах мишей (Krusek, Zemkovб, 1994), а при високих концентраціях препаратів вони здатні безпо-середньо їх активувати (Zufall et al., 1989). Отже, зміни рівня деполяризації ТМП виявлені для івермектину можна пояснити активацією хлорних каналів на фоні зниження активності Na⁺, K⁺-ATФази, а також загальним перерозподілом інших іонів. Тоді як авермектин, ймовірно, активує катіонні канали, що пояснює значно вищий рівень деполяризації мембрани.

Морфологічні зміни розвитку зародків та личинок в'юна. Наступні дослідження спрямовані на виявлення рівня токсичності авермектинів та змін морфології зародків за впливу препаратів у різних концентрацій. Так, при візуальному контролі розвитку зародків в'юна виявлено, що інгібування оуабаїном Na⁺, K⁺-АТФази призводить до змін тривалості клітинних поділів і зовнішньої морфології зародків (Гойда и др., 1989; Санагурский, 1983). Подібні аномалії розвитку було отримано при інкубації зародків у середовищі за додавання авермектинів. Зокрема затримка розвитку була очевидна уже на першу добу і мала дозозалежний характер. При невисоких концентраціях препаратів (0,01 мкг/мл) було помітно зміни у розвитку серцево-судинної системи у частини личинок та аномальний розвиток хребта та інші відхилення (Мандзинець та ін., 2006). При збільшенні концентрації у десять разів (0,1 мкг/мл) аномалії були більш виражені та різко зростала смертність личинок. Показано, що наявність у середовищі інкубації івермектину та авермектину у концентрації 1 мкг/мл призводить до скорочення життя личинок до 5 діб у порівнянні з контролем (15 діб). Причиною смертності зародків є ймовірне виснаженням депо кальцію (інгібування Са²⁺-АТФази ЕПР (Bilmen et al., 2002) та активація кальцієвих каналів (Ahern et al., 1993)), яке викликає збільшення цитозольного кальцію, що може запускати механізми клітинної смерті. Іншим наслідком впливу досліджуваних препаратів є зміна активності Nа⁺, К⁺-АТФази, яка відіграє значну роль у підтриманні іонного гомеостазу та у формуванні серцево-судинної системи, зокрема у роботі Шу (2003) встановлено роль функціонування Na⁺, K⁺-ATФази протягом ембріогенезу у розвитку серцево-судинної системи у Danio rerio (Shu et al., 2003), Встановлені аналогічні аномалії розвитку і у зародків в'юна, тому інгібуючий вплив ліків викликає недорозвинення даної системи та швидку смерть зародків та личинок.

Вплив авермектинів на ультраструктуру бластомерів. Результати щодо інгібування Na⁺, K⁺-АТФази, а також інгібування Са²⁺, Mg²⁺-АТФази, за впливу авермектинів, у значній мірі підтверджуються змінами ультраструктури бластомерів зародків в'юна, які були інкубовані за присутності досліджуваних чинників. Доказом дії авермектинів на мембранному рівні є розпушення контурів мембрани при високій концентрації 1 мкг/мл на першу годину розвитку зародків. Проникаючи через ПМ зародкових клітин авермектини здатні вбудовуватись у мембрани своєю циклічною основою, що призводить до дестабілізації мембранної структури, зміни її електрофізіологічних характеристик (Campbell et al., 1983), порушення роботи мембранних ферментів, і, в кінцевому результаті, до пошкоджень та загибелі клітини.

Слід зазначити, що за умов впливу досліджуваних препаратів, характерною ознакою їх дії є розвиток некрозу клітин на різних стадіях. Некроз клітини розпочинається зі змін агранулярного ендоплазматичного ретикулуму (АЕР) розширенням та збільшенням їхніх везикул, а також кількості лізосом, які перетворюються у автофаголізосоми. Спостерігаються зміни мембранних структур мітохондрій. Відмічено їх набряк та руйнівні процеси на внутрішній мембрані (зменшення кількості та чіткості мембран мітохондріальних крист). Ймовірною причиною деструкції цих органел є зміни щільності мембрани, яка у свою чергу викликає зміни у активності мембранозв'язаних ферментів, активацію іонних каналів, які присутні у мембранах мітохондрій, та вплив на Na⁺, K⁺- та Са²⁺-АТФазну активність мембран (Bilmen et al., 2002), що й викликає зміни некротичного характеру. Як на стадії 2 бластомерів, так і на стадії 10 поділу бластомерів спостерігається розширення цистерн гранулярного ендоплазматичного ретикулуму (ГЕР), дезорганізація їх мембран, яка веде до збільшення кількості поодиноких рибосом (моносом) у гіалоплазмі, а в кінцевому результаті призводить до порушення синтезу білка. Препарати у концентрації 0,1 мкг/мл викликало збільшення розмірів мультивезикулярних тілець. За наявності авермектину у концентрації 0,01 мкг/мл не виявлено мультивезикулярних тілець, але відмічено розвиток протеолітичних процесів, набряки клітини, розгладження ПМ. Слід зазначити, що при дії авермектинів у високій концентрації (1 мкг/мл) у більшості випадків ПМ втрачає свою хвилястість і перебуває у натягнутому стані, це свідчить про набряк клітини. У зародків, які розвивалися за нормальних умов, ПМ характеризується наявністю випинань та інвагінацій (Бойко та ін., 2002; Целевич та ін., 2005; Целевич та ін., 2004). Така характеристика ПМ узгоджується з отриманими даними при дослідженні диференціації клітин протягом ранніх поділів бластомерів та на стадіях бластули та гаструли у Fundulus heteroclitus (Lentz et al., 1967). Подібні пошкодження, такі, як набряк, вакуоляризація органел, розпушення та руйнування цілісності плазматичних та мітохондріальних мембран, спостерігали при дії івермектину на тестикулярні клітини у кліща Argas (Persicargas) persicus (Montasser et al., 2005). Набряк та вакуоляризація клітин свідчить про некроз і є наслідком порушення входження Na⁺, K⁺ та молекул води у цитоплазму, виходом іонів Ca²⁺ з депо та блокуванням його транспорту у клітинні депо бластомерів, що призводить до збільшення цитозольного кальцію. Ці зміни зумовлені порушенням активного транспорту іонів, а також їх перерозподілом у цитоплазмі, внаслідок змін функціонального стану мембран за дії авермектинів.

Висновки

У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження впливу авермектинів на функціонування Na⁺, K⁺- та Са²⁺-помп зародків в'юна Misgurnus fossilis L., а також з'ясовано ймовірні механізми їх впливу на іонтранспортні системи зародків, та наслідки їх впливу на морфогенетичному та клітинному рівні.

Визначено кінетичні характеристики Na⁺, K⁺-ATФазної активності ПМ зародків в'юна Misgurnus fossilis L. упродовж раннього ембріогенезу, показано наявність центрів різної спорідненості до АТФ, які змінюються впродовж синхронних поділів. Розраховано максимальну швидкість та конcтанти Міхаеліса-Ментен для реакції гідролізу АТФ на кожній з досліджуваних стадій розвитку.

Авермектин та івермектин у діапазоні концентрацій (0,001-10 мкг/мл) за умов проведення досліджень in vitro та (0,01-1 мкг/мл) in vivo дозозалежно інгібують оуабаїнчутливу АТФазу зародкових мембран у порівнянні з контролем. Значення констант напівінгібування І₅₀ свідчать про те, що зміни Na⁺, K⁺-АТФазної активності пов'язані з різним ступенем чутливості даної АТФази до дії авермектинів та умовами проведення досліджень.

Авермектини у концентрації 0,1 та 1 мкг/мл інгібують сумарну Са²⁺, Mg²⁺-АТФазну активність. Ступінь інгібування, якої залежить від умов проведення дослідження та стадії розвитку. Найбільш чутливою до дії препаратів є остання стадія синхронних поділів за умов проведення дослідження in vivo.

Інгібіторний аналіз дії івермектину на Na⁺, K⁺-АТФазу показав наявність умовно конкурентного типу інгібування, який може здійснюватись за механізмом зв'язування івермектину та авермектину з молекулами Na⁺, K⁺-АТФази, з подальшою зміною конформації і затриманням ферментів у стані Е₁ та зміною ліпідного оточення, характерною для клітин у стані активного поділу.

Дисперсійний аналіз впливу концентрації препаратів та фактору часу на зміни активності Na⁺, K⁺-ATФази зародків встановив, що їхній внесок у мінливість активності мембранного ферменту є більш істотним на стадії 8 поділу і дещо знижується на стадії 10 поділу бластомерів.

Зміни у динаміці коливань ТМП зародків в'юна протягом синхронних поділів вказують на зменшення абсолютних значень ТМП, які свідчать про зниження в основному активності Na⁺, K⁺-АТФази, а також ймовірної зміни іонної проникності мембран бластомерів. Збільшення періоду коливань та порушення синхронності коливань вказують на сповільнення процесів розвитку зародків.

Морфологічні зміни свідчать про високу чутливість організмів зі слабкою системою захисту. За дії авермектинів у зародків виявлено такі аномалії: відставання у розвитку, деформацію кісток скелету, затримку та аномалії у закладанні серцево-судинної системи, недорозвинення зябер та плавців.

Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури бластомерів зародків на першій годині розвитку при дії авермектинів виявило суттєві пошкодження мембранних органел зародкових клітин. На першу годину розвитку відмічено ознаки некрозу клітин і значну вакуоляризацію клітинного вмісту при наявності препаратів у інкубаційному середовищі у концентрації 1 мкг/мл. На шостій годині розвитку зафіксовано протеоліз та ділянки некрозу за дії івермектину у концентрації 0,1 мкг/мл.

Отримані результати дають підставу вважати, що дія авермектинів на зародки в'юна Misgurnus fossilis L. здійснюється через дестабілізацію структур і функцій мембран та інгібування ферментативної активності системи активного транспорту іонів (Na⁺, K⁺, Са²⁺), які у свою чергу запускають механізми некротичної загибелі клітин.

Список публікацій за темою дисертації

1. Зміни морфологічного розвитку зародків та личинок в'юна Misgurnus fossilis L. за умов впливу івермектину / С.М. Мандзинець, М.В. Целевич, Д.І. Санагурський, Д.В. Янович // Науковий Вісник львівської національної академії ветеринарної медицини імені с.з. ґжицького. - 2006. - Т.8, №2 (29). - С. 91-95.

2. Зміна ферментативної активності Na⁺, K⁺-помпи зародків риб за умов впливу івермектину / Мандзинець С.М., Целевич., М.В., Янович Д.В., Санагурський Д.І. // Біологія тварин. - 2006. - Т 9, № 1-2. - С. 217-221.