Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

УДК 579.841: 577.114

Біологічні властивості Бацил та лактобактерій, перспективних для створення комплексного пробіотика

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Штанько Таїсія Вікторівна

Київ 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Авдєєва Лілія Василівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу антибіотиків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Курдиш Іван Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Поліщук Олена Іванівна, ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського» АМН України, завідувач лабораторії медичної мікробіології з музеєм патогенних для людини мікроорганізмів

Захист відбудеться "20" травня 2009 року 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154

Автореферат дисертації розіслано " 17 " квітня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В сучасний період відмічається збільшення патології, пов'язаної з порушенням біологічної рівноваги між макроорганізмом та мікроорганізмами, що входять до складу його нормальної мікрофлори (Шардін О.Г., 2008; Федоров С.П., 2006; Барановський А.Ю., 2007). Особливе значення у формуванні та підтриманні гомеостазу макроорганізму відіграє мікрофлора кишечника через чисельність та багатофункціональність мікробних популяцій, які колонізують цей біотоп.

Зміни у видовому та кількісному складі умовно патогенних мікроорганізмів (УПМ), які входять до складу нормальної мікрофлори кишечника є результатом пригнічення імунологічної резистентності макроорганізму, що за наявності факторів ризику з боку макроорганізму, а також реалізації факторів патогенності у мікроорганізмів, які колонізують цей біотоп, можуть стати причиною гнійно-запальних процесів різної локалізації (Шендеров Б.А., 2001). Особливо небезпечними мікроекологічні порушення є для новонароджених, оскільки вони часто обумовлені патологічною колонізацією, перш за все кишечника, госпітальними штамами мікроорганізмів з множинною стійкістю до антибіотиків (Поліщук О.І., 2001, Авдєєва Л.В., 2003). Інфекції, спричинені полірезистентними мікроорганізмами, характеризуються чисельністю клінічних проявів, тяжким перебігом та високою летальністю, яка при генералізованих формах та спалахах сягає 60 % і вище (Бельмер С.В., 2004). Профілактика та лікування цих інфекцій вимагає введення у схеми лікувальних засобів пробіотичних препаратів з метою відновлення кількісного та якісного складу нормальної мікрофлори кишечника.

Однак, в багатьох випадках не вдається вирішити проблему корекції дисбіотичних станів існуючими пробіотичними препаратами. Тому, особливої актуальності набуває створення нових комплексних препаратів з бактерій різних таксономічних груп, кожні з яких можуть доповнювати один одного за спектром антагоністичної активності щодо факультативних УПМ.

Крім того, зважаючи на те, що в сучасний період біотехнологічні аспекти виробництва комплексних пробіотичних препаратів ґрунтуються, як правило, на роздільному способі культивування цих бактерій з подальшим їх поєднанням в заданих співвідношеннях, актуальним є розробка методичних підходів щодо сумісного глибинного культивування пробіотичних штамів, що має наукове та практичне значення, а також дозволить досягти значного економічного ефекту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана згідно плану науково-дослідних робіт відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за темою „Еколого-таксономічні дослідження бактерій та вищих рослин як ресурсів біотехнології” (2002-2004 рр., державний реєстраційний номер № 0101U004324); "Таксономічні та біотехнологічні дослідження продуцентів біологічно-активних речовин " (2005-2008 рр., державний реєстраційний номер 0105U001082).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи: на основі даних щодо біологічних властивостей пробіотичних штамів бацил і лактобактерій експериментально обґрунтувати створення комплексного пробіотичного препарату з широким спектром антагоністичної активності.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішення наступних завдань:

1. Визначити видовий та кількісний склад УПМ, які колонізують кишечник новонароджених з високим перинатальним ризиком.

2. Встановити рівні та профілі антибіотикорезистентності умовно патогенних бактерій (УПБ), виділених у новонароджених.

3. Вивчити антагоністичну активність щодо колекційних та актуальних штамів мікроорганізмів, ізольованих від новонароджених, пробіотичних штамів Bacillus subtilis 3, Bacillus licheniformis 31 та Lactobacillus plantarum 8R-A3, перспективних у складі комплексного препарату.

4. Розробити поживне середовище, найбільш сприятливе для сумісного глибинного культивування бацил та лактобактерій.

5. Визначити оптимальні параметри для росту та накопичення максимальної кількості життєздатних клітин бацил та лактобактерій при їх сумісному глибинному культивуванні.

6. Розробити біотехнологічні основи створення комплексного пробіотичного препарату на основі бацил і лактобактерій методом глибинного культивування.

7. Встановити в дослідах in vitro та in vivo ефективність отриманого методом глибинного культивування комплексного препарату з бацил та лактобактерій.

Об'єкт дослідження: пробіотичні штами бацил і лактобактерій, композиція та змішана культура з пробіотичних штамів бактерій, експериментальні тварини. бактерія бацила клітина культивування

Статистичну обробку кількісних результатів досліджень проводили загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень середньої арифметичної (М), помилки середньої арифметичної (m), критерію Стьюдента (t), рівня значущості (р).

Інформацію щодо виділених штамів мікроорганізмів та їх антибіотикорезистентності вносили в базу даних комп'ютерної програми WHONET 5.1 (Copyright© 1989-2001 World Health Organization), яка рекомендовано ВООЗ для збору та аналізу даних, отриманих в мікробіологічних лабораторіях. Аналіз проводили з використанням критеріїв розподілу за видами виділених мікроорганізмів, чутливістю до антибіотиків, профілями антибіотикорезистентності, гістограмами.

Колонізація умовно патогенними мікроорганізмами кишечника новонароджених з високим перинатальним ризиком. Для обґрунтування необхідності розробки нового пробіотичного препарату нами, перш за все, визначено мікроорганізми, які домінують в сучасний період при дисбіотичних станах. В цьому зв'язку бактеріологічно обстежено 91 новонароджений з високим перинатальним ризиком, що перебували в неонатологічному стаціонарі дитячої лікарні ОХМАТДИТ, оскільки у цього контингенту хворих найбільш виражені дисбіотичні порушення.

Встановлено, що провідну роль в процесі колонізації немовлят відігравали факультативні ентеробактерії, грампозитивні коки, Pseudomonas spp. та дріжджоподібні гриби роду Candida, частота виділення яких становила 52,8; 26,8; 7,5 та 12,7 % відповідно

У більшості, а саме 96,7 %, новонароджених ентеробактерії виділялись з кишкового вмісту в кількості, що перевищувала 10⁶ КУО/г. Кількісний вміст стафілококів, Pseudomonas spp. і дріжджоподібних грибів роду Candida складав 10⁶ - 10⁸ КУО на 1 г фекалій відповідно при зниженні чисельності облігатної мікрофлори, а саме E. coli - до рівня 10³ КУО/г, біфідо- і лактобактерій - до титрів, що дорівнювали 10^-3-10^-4 (рис. 1).

Рис. 1 Рівні мікробної колонізації УПМ кишечника новонароджених (lg)

З кишкового вмісту у більш ніж 54 % новонароджених висівалися асоціації з 2 - 4 видів факультативних УПМ. Найчастіше, а саме у 28,4 % новонароджених, зареєстровано одночасне виділення E.coli із зміненою ферментативною активністю та коагулазонегативних стафілококів, у 13,7 % випадків - E.coli і K.pneumoniae, у 10,8 % - E.coli і Enterobacter spp. Дріжджоподібні гриби роду Candida виділялися, як правило, в асоціаціях, переважно з Pseudomonas spp., K.pneumoniae та E.coli.

Таким чином, у обстежених дітей встановлено патологічну колонізацію кишечника УПМ. Наявність в домінуючих асоціаціях Pseudomonas spp., факультативних умовно патогенних ентеробактерій (УПЕ), а також дріжджоподібних грибів роду Candida, переконливо вказує на глибокі порушення видового складу нормальних мікробіоценозів кишечника обстежених новонароджених.

Антибіотикорезистентність умовно патогенних мікроорганізмів. Враховуючи, що в умовах стаціонару новонароджені колонізуються УПМ, які мають, як правило, госпітальне походження і характеризуються наявністю факторів патогенності, а також множинною стійкістю до антибіотиків, доцільним було встановити рівні та профілі антибіотикорезистентності виділених штамів умовно патогенних бактерій (УПБ).

Встановлено, що виділені у новонароджених УПБ мали високий рівень стійкості до антибіотиків (табл.1).

Таблиця 1

Стійкість до антибіотиків умовно патогенних бактерій, виділених з кишечника новонароджених

Активним щодо ентеробактерій були лише меропенем та іміпенем (85,7 ± 1,3 і 83,7 ± 1,3 % чутливих штамів відповідно); щодо псевдомонад - офлоксацин та меропенем (55,6 ± 2,1 і 66,7 ± 3,1 % чутливих штамів відповідно). Стафілококи були у 61,1 - 83,3 % випадків чутливими до амікацину, нетилміцину, доксицикліну, хлорамфеніколу і іміпенему. Ванкоміцин пригнічував ріст всіх досліджуваних штамів стафілококів.

Ріст ентерококів затримували лише ванкоміцин і хлорамфенікол у 88,2 ± 3,7 і 52,9 ± 5,4 % випадків відповідно. Однак, навіть до тих препаратів, які в сучасний період залишаються активними щодо домінуючих колонізуючих агентів, на підставі аналізу гістограм розподілу досліджуваних штамів УПБ за зонами затримки росту навколо дисків з наведеними вище антибіотиками, встановлено позитивну тенденцію наростання стійкості.

Для підтвердження госпітального походження штамів УПБ, які колонізували кишечник новонароджених, нами проаналізовано їх профілі антибіотикорезистентності.

Аналіз профілів антибіотикорезистентності досліджуваних штамів УПБ свідчить про їх множинну стійкість до антибіотиків. Так, 96 % штамів ентеробактерій мали одночасну стійкість до 7 - 16 антибіотиків, включаючи цефалоспоринові антибіотики І-ІІІ покоління, аміноглікозиди, карбапенеми та фторхінолони.

Всі штами Pseudomonas spp. були стійкими до 5-10 антибіотиків, стафілококів - до 2-18, ентерококів - до 4-8 досліджуваних антибіотиків одночасно.

Таким чином, УПБ, які колонізували кишечник новонароджених з високим перинатальним ризиком, мали високий рівень і множинний характер стійкості до антибіотиків, що свідчить про досить обмежений вибір антимікробних препаратів, які можуть бути використані в разі розвитку інфекційних захворювань у дітей, колонізованих цими штамами. Цей факт переконливо свідчить про необхідність використання в схемах лікувально-профілактичних заходів комплексних пробіотичних препаратів з широким спектром антагоністичної активності щодо госпітальних штамів УПМ.

Біотехнологічні основи створення комплексного пробіотичного препарату з бацил та лактобактерій. За основу комплексного препарату нами обрано штами спороутворюючих бактерій B.subtilis 3 та B.licheniformis 31 та штам молочнокислих бактерій - L.plantarum 8R-A3, які входять до складу відомих пробіотиків біоспорину та лактобактерину відповідно. Вибір саме цих штамів базувався на тому, що бацилам характерна висока антагоністична активність щодо патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, висока ферментативна активність, а також продукція амінокислот. Щодо лактобактерій, а саме L.plantarum 8R-A3, то вони в процесі зброджування глюкози продукують до 85 % молочної кислоти, завдяки якій, в першу чергу, здійснюється їх антагоністична активність. Крім того, лактобацилам характерна висока адгезивна властивість.

Встановлено, що штами L.plantarum та B.subtilis проявляли високу антагоністичну активність щодо колекційних тест-культур, зони затримки росту яких становили від 16 ± 0,6 мм до 32 ± 0,7 мм.

Крім того, штами L.plantarum та B.subtilis характеризувалися різним ступенем та спектром антагоністичної активності щодо актуальних штамів УПМ. Особливо виражений вплив L.plantarum проявляв щодо E.coli, цитробактерів та клебсієл, зони затримки росту яких дорівнювали 20,5 ± 1,3, 24,6 ± 0,7 та 19,5 ± 0,9 мм відповідно. Штам B.subtilis проявляв виражену антагоністичну активність щодо бактерій родів Proteus spp. (зона затримки росту 22,5 ± 1,9 мм) та Enterobacter spp. (зона затримки росту 23,3 ± 1,5 мм). Слід відзначити, що L.plantarum на відміну від B.subtilis характеризувався антагоністичною активністю щодо Pseudomonas spp. (зона затримки росту 16,1 ± 1,2 мм), а B.subtilis на відміну від L.plantarum пригнічував ріст грибів роду Candida з утворенням зони затримки росту 20,1 ± 4,1 мм.

Отримані дані стали підставою припустити, що у складі комплексного біопрепарату дані штами будуть доповнювати один одного за спектром антагоністичної активності.

Введення B.licheniformis до складу комплексного препарату, на наш погляд, було доцільним через його високу ферментативну активність, яка проявляється у тонкому кишечнику.

Розробка поживного середовища для культивування L.plantarum 8R-A3. Створення комплексного пробіотичного препарату можливе за наявності відповідної ефективної технології його отримання. Це потребує розробки складу поживного середовища, підбір оптимальних технологічних режимів та умов ферментації.

Серед різних груп мікроорганізмів молочнокислі бактерії, з точки зору потреби в різноманітних поживних речовинах, відносяться до одних з найбільш вибагливих бактерій. Тому, перш за все, за допомогою математичних методів планування експерименту нами було розроблено складне поживне середовище для культивування L.plantarum, яке відрізняється доступністю компонентів оскільки містить: зелену патоку - 80 мл/л (або 2% за РР), кукурудзяний екстракт - 60 мл/л, сульфат марганцю - 0,17 г/л, цитрат натрію - 7 г/л, ацетат кальцію - 0,8 г/л, вода до одного літра, рН - 6,2-6,4.

На цьому середовищі спостерігалося активне накопичення кількості життєздатних клітин L.plantarum, а саме 3,4 ± 1,3 х 10⁹ КУО/мл, при титруючій кислотності 186 ± 21 ⁰Т (табл.2).

Таблиця 2

Порівняльний аналіз показників росту та кислотоутворення L. plantarum 8R-A3 на різних середовищах

Крім того, встановлено, що бактерії роду Bacillus на розробленому середовищі також активно накопичували понад 10⁹ життєздатних клітин в мл (табл. 3).

Отримані результати дозволили використати при створенні комплексного біопрепарату розроблене поживне середовище для сумісного глибинного культивування бацил та лактобактерій.

Таблиця 3

Показники росту штамів L. plantarum 8R-A3, B. subtilis 3 та B. licheniformis 31 на розробленому поживному середовищі

Підтвердженням цього було встановлений факт симбіотичного типу взаємодії між досліджуваними пробіотичними культурами, про що свідчить і симбіотичний індекс, який становив для L.plantarum - 1,18; для B.subtilis - 1,24 і для B.licheniformis - 1,03.

Вплив фізико-хімічних факторів на ріст L.plantarum 8R-A3, B.subtilis 3 та B.licheniformis 31. Велике значення для продуктивного культивування має комплекс фізичних і фізико-хімічних факторів (рН, температури та аерації). Тому нами було вивчено їх вплив на ріст і накопичення біомаси життєздатних клітин досліджуваних пробіотичних штамів бактерій як в моно-, так і в змішаній культурі в умовах глибинного вирощування.

Встановлено, що оптимальними умовами для росту і розвитку пробіотичних штамів бактерій в розробленому середовищі були рН - 6,3 - 7,0 для L.plantarum, 6,5 - 7,5 - для бактерій роду Bacillus та 7,0 -7,5 для асоціації з цих культур. Найкращий розвиток бактерій як в монокультурі, так і в їх асоціації забезпечувалось при температурі 35-37⁰ С та коефіцієнті масопереносу кисню К_v = 2,1 г О₂/ л год. за сульфітним числом (табл.4).

Таблиця 4

Умови росту штамів L. plantarum 8R-A3, B. subtilis 3 та B. licheniformis 31 на розробленому середовищі

Добір композиційних співвідношень пробіотичних штамів L.plantarum 8R-A3, B.subtilis 3 та B.licheniformis 31 для комплексного препарату. При конструюванні препаратів з двох чи більше бактеріальних культур необхідною умовою для їх подальшого ефективного застосування є правильний добір їх композиційних співвідношень.

Встановлено, що показники антагоністичної активності композиції 2:1:1, отриманої в процесі роздільного культивування штамів бактерій з подальшим поєднанням двох об'ємів лактобацил і по одному об'єму кожного з штамів бацил, були достовірно вищі за активність композиції з співвідношенням культур 1:1:1 щодо колекційних штамів S.aureus, E.coli та P. aeruginosa, зони затримки росту яких становили 19 0,7, 24 1,4 та 20 0,7 мм відповідно (р<0,05). Однак влив композиції 2:1:1 на ріст C.albicans (зона затримки росту 10 1,4 мм) був достовірно меншим (р 0,05) в порівнянні з активністю композиції культур 1:1:1, де доля кожного штаму була однаковою (зона затримки росту становила 16 0,7 мм).

Подальше збільшення кількості молочнокислих бактерій (композиція 4:1:1) призводило до послаблення антагоністичної дії цієї композиції, особливо щодо колекційних штамів C.albicans, S.flexneri та S.aureus, зони затримки росту яких дорівнювали 7 1,4, 15 0,5 та 15 2,1 мм відповідно, через зниження рН середовища.

Таким чином, у створених нами композиціях, крім останньої, досліджувані штами пробіотичних культур взаємодоповнювали одна одну за спектром специфічної активності щодо тест-культур мікроорганізмів. При цьому антагоністична активність, яка характерна для кожного окремо взятого штаму, не втрачалася при їх поєднанні, що може забезпечити більш широкий спектр антагоністичної активності створених композицій.

Дослідження антагоністичної активності змішаної культури з пробіотичних штамів бактерій, отриманої в процесі глибинного культивування. В процесі сумісного глибинного культивування штамів L.plantarum 8R-A3, B.subtilis 3 та B.licheniformis 31 у розробленому середовищі протягом 24 год. утворювалась змішана культура, яка в порівнянні з композицією 2:1:1 виявилася більш активною (р<0,05) щодо колекційних штамів E.coli, P.vulgaris, S.flexneri та C.albicans (рис. 2).

Рис. 2 Антагоністична активність композицій та змішаної культури з пробіотичних штамів бактерій щодо колекційних штамів мікроорганізмів

Відносно колекційних штамів S.aureus, E.coli та S.enterica активність змішаної культури була такою ж як і композиції 2:1:1(р>0,05). Це вказує на те, що отримана змішана культура, може бути запропонована як один із варіантів при розробці комплексного пробіотичного препарату.

Ефективність комплексного пробіотичного препарату на основі бактерій роду Bacillus та Lactobacillus в дослідах in vivo. Одним з етапів вивчення ефективності пробіотичних препаратів є визначення в дослідах in vivo темпів відновлення нормальних мікробіоценозів кишечника. Тому нами було застосовано отримані змішану культуру та композицію з штамів L.plantarum 8R-A3, B.subtilis 3 та B.licheniformis 31, в дослідах на мишах з експериментальним дисбактеріозом, який відтворювали шляхом перорального ведення ампіоксу протягом 7 діб. На кінець застосування ампіоксу в кишковому вмісті лабораторних тварин реєструвалось зниження популяційного рівня нормальної мікрофлори до 10⁴-10⁵ КУО/г та зростання кількості факультативних УПМ до 10⁷-10⁸ КУО/г.

Застосування протягом 10 діб, після введення ампіоксу, змішаної культури та композиції з бацил і лактобактерій для корекції мікрофлори кишечника лабораторних тварин з експериментальним дисбактеріозом призводило до відновлення кількісного складу індигенної мікрофлори. У тварин, яким вводили змішану культуру спостерігалося більш виражене зниження кількості ентерококів, УПЕ та дріжджоподібних грибів роду Candida в порівнянні з біоспорином та лактобактерином. Застосування композиції 2:1:1, було найбільш ефективним для відновлення кількості лактобактерій та кишкової палички, а також для зниження титру Pseudomonas spp., що свідчить про перевагу комплексного препарату над монопрепаратами (рис. 3).

Рис. 3 Кількісний вміст мікроорганізмів в товстому кишечнику мишей на 10-ту добу застосування змішаної культури та композиції бацил та лактобактерій

Таким чином, показано ефективність застосування композиції та змішаної культури з бацил та лактобактерій при відновленні нормальних мікробіоценозів кишечника лабораторних тварин. Отримані дані підтверджують доцільність застосування при дисбіотичних станах комплексного препарату, що поєднує бактерії різних таксономічних груп, оскільки, займаючи в кишечнику свою нішу, вони сприяють елімінації факультативних УПМ, які зазвичай знаходяться в асоціаціях і можуть бути причиною різних патологічних станів.

ВИСНОВКИ

В роботі вирішено актуальну наукову задачу - на основі даних щодо біологічних властивостей пробіотичних штамів бацил та лактобактерій, експериментально обґрунтовано створення комплексного пробіотичного препарату з широким спектром антагоністичної активності.

1. Доведено, що у 96,7 % новонароджених з високим перинатальним ризиком, які знаходились на лікуванні у відділенні виходжування недоношених новонароджених дітей відбувалась патологічна колонізація кишечника факультативними умовно патогенними мікроорганізмами. Ентеробактерії, грампозитивні коки, Pseudomonas spp. і дріжджоподібні гриби роду Candida, виділялися в кількості 10⁶ КУО/г і більше на фоні зниження кількості облігатної мікрофлори до 10³-10⁴ КУО/г.

2. Умовно патогенні мікроорганізми, які колонізували кишечник новонароджених, мали високий рівень і множинну стійкість до антибіотиків, що є показником госпітального походження штамів. Активними були лише меропенем та іміпенем для ентеробактерій, офлоксацин та меропенем для псевдомонад, амікацин, нетилміцин, доксициклін, хлорамфенікол, ванкоміцин та іміпенем для стафілококів, ванкоміцин та хлорамфенікол для ентерококів.

Понад 96 % штамів умовно патогенних бактерій мали одночасну стійкість до 7 - 16 антибіотиків.

3. Визначено антагоністичну активність досліджених штамів бацил та лактобактерій по відношенню до колекційних і актуальних штамів УПМ. Найбільшу антагоністичну активність штами L.plantarum 8R-A3 та B.subtilis 3 проявили щодо тест-культур S.aureus та S.flexneri. Штам L.plantarum 8R-A3 був активнішим щодо P.aeruginosa, а B.subtilis 3 щодо штаму C.albicans.

4. Вперше розроблено поживне середовище як для роздільного, так і сумісного культивування L.plantarum 8R-A3, B.subtilis 3 та B.licheniformis 31 на основі зеленої патоки, кукурудзяного екстракту та мінеральних солей. На цьому середовищі бактерії росли і активно накопичували значну кількість життєздатних клітин: L.plantarum 8R-A3 - 3,4 х 10⁹ КУО/мл, B.subtilis 3 до 5,1 х 10⁹ КУО/мл та B.licheniformis 31 - 6,3 х 10⁹ КУО/мл.

5. В процесі сумісного глибинного культивування між бацилами та лактобактеріями утворюється симбіотичний тип взаємодії. При цьому, симбіотичний індекс для L.plantarum 8R-A3 складав 1,18, B.subtilis 3 - 1,24 та B.licheniformis 31 - 1,03.

6. Підібрано оптимальні умови для росту пробіотичних штамів бактерій на розробленому середовищі: рН 6,3 - 7,0 для лактобактерій, 6,5 - 7,5 - для бактерій роду Bacillus та 7,0 -7,5 для асоціації з цих культур. Найкращий розвиток досліджуваних бактерій як в монокультурі, так і в їх асоціації забезпечувалось при температурі 35-37 ⁰С та коефіцієнті масопереносу кисню 2,1 г О₂/ л год. за сульфітним числом.

7. Композиція з лактобактерій і бацил у співвідношенні 2:1:1, а також змішана культура, яка утворюється через 24 год. сумісного культивування B.subtilis 3, B.licheniformis 31 та L.plantarum 8R-A3, in vitro мають високий рівень антагоністичної активності щодо колекційних та актуальних штамів умовно патогенних і патогенних мікроорганізмів.

8. Доведено ефективність застосування змішаної культури та композиції на основі бацил та лактобактерій для корекції кишкової мікрофлори in vivo на моделі експериментального дисбактеріозу. На 10-у добу їх застосування найбільш ефективною щодо умовно патогенних ентеробактерій, ентерококів та дріжджоподібних грибів роду Candida виявилася змішана культура, а композиція 2:1:1 сприяла більш швидшому відновленню кількості лактобактерій та кишкової палички, а також зниженню кількості Pseudomonas spp.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сорокулова И.Б. Разработка питательной среды для культивирования Lactobacillus plantarum 8R-A3 / Сорокулова И.Б., Осадчая А.И., Хилько Т.В.*⁾ // Микробиол. журн. 2003. Т. 65, № 3. С. 39-45. (Здобувачем разом з співавторами проведено підбір та оптимізацію середовища для культивування молочнокислих бактерій)

2. Хілько Т.В.*⁾ Ростові характеристики Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis та Bacillus licheniformis при глибинному культивуванні в монокультурі та в умовах сумісного вирощування / Хілько Т.В.*⁾, Осадча А.І. // Мікроб. журн. 2004. Т. 66, № 2. С. 63-68. (Здобувачем самостійно вивчено ріст моно- та змішаної культури бактерій в глибинних умовах культивування)

3. Авдєєва Л.В. Антибіотикорезистентність ентеробактерій, виділених у новонароджених з високим перинатальним ризиком / Авдєєва Л.В., Штанько Т.В., Приходько В.О. // Архив клин. и экспер. медицины. 2008. Т.17, № 2. С. 150-155. (Здобувачем проведено дослідження антибіотикорезистентності та оформлено статтю).

4. Авдєєва Л.В. Експериментальне обґрунтування ефективності комплексного біопрепарату на основі бактерій родів Bacillus та Lactobacillus / Авдєєва Л.В., Штанько Т.В. // Таврический мед.-биол. вестник. 2008. Т. 11, № 4 (44). С. 102-106. (Здобувач брав участь у заборі біологічного матеріалу, дослідженні кількісного та якісного складу мікрофлори кишечника мишей, оформленні статті)

5. Штанько Т.В. Вплив фізико-хімічних факторів на ріст пробіотичних культур бацил та лактобактерій / Штанько Т.В., Авдєєва Л.В., Осадча А.І. // Львівський медичний часопис. 2009. Т. 15, № 1. С. 83-87. (Здобувачем проведено дослідження по впливу рН, температури та аерації на ріст моно- та змішаної культури в глибинних умовах вирощування).

6. Сорокулова І.Б. Корекція біоспорином порушень мікробіоценозу кишечника у новонароджених дітей / Сорокулова І.Б., Сафронова Л.А., Виноградов В.П., Тишкевич В.М., Хілько Т.В.*⁾ та інші. // Перинатологія та педіатрія. 2003. № 2. С. 23-26. (Здобувачем проведено визначення видового та кількісного складу мікрофлори кишечника новонароджених)

7. Хілько Т.В.*⁾ Біологічні властивості пробіотичних штамів бактерій, перспективних для створення нового комплексного біопрепарату / Хілько Таїсія Вікторівна // Вісник наукових досліджень. 2005. № 1. С. 157 - 158.

8. Хилько Т.В.*⁾ Антагонистическая активность бактерий, перспективных для создания нового комплексного пробиотика / Хилько Т.В.*⁾, Осадчая А.И. // Анали Мечниківського інституту. 2003. № 4-5. С. 148.

9. Хилько Т.В.*⁾ Изучение возможности получения смешанной культуры с целью разработки технологии нового комплексного препарата / Хилько Т.В.*⁾, Осадчая А.И. // Актуальные вопросы инфекционных болезней: науч.-практ. конф. статья. 2003. С. 104-106.