Виділення та характеристика ферментного комплексу міцеліальних грибів з дріжджелітичною активністю

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Виділення та характеристика ферментного комплексу міцеліальних грибів з дріжджелітичною активністю

Облак В.І.

03.00.20 - біотехнологія

Харків - 2009

Вступ

Актуальність теми. Одними з основних напрямків сучасної біотехнології є отримання та використання продуктів, що являються інтрацелюлярним вмістом клітин рослин та мікроорганізмів. Перспективними об'єктами біотехнології є клітини дріжджів, які, як відомо, містять білки, незамінні амінокислоти, вітаміни та інші цінні речовини (Беррі, 1990; Бірюзова, 1993; Божков и др., 2004). Отримання внутрішньоклітинних компонентів дріжджів, для подальшого їх використання в якості біологічно активних речовин, пов'язане з видаленням клітинної стінки до складу якої входять компоненти, що важко піддаються гідролізу - глюкан, манан, хітин (Kapteyn et al., 2001; Калебина, 2001). Серед засобів видалення клітинної стінки дріжджів відомі механічне руйнування та хімічний гідроліз, але ці процеси є недостатньо ефективними та супроводжуються накопиченням небажаних продуктів. Перевага надається біохімічному засобу руйнування клітинних стінок - ферментативному гідролізу із застосуванням ферментів різної субстратної специфічності - глюканаз, протеаз, хітиназ та мананаз (Wu et al., 2002; Adams, 2004). В якості продуцентів гідролітичних ферментів можуть бути використані міцеліальні гриби, які екскретують в оточуюче середовище велику кількість позаклітинних ферментів. В наш час детально вивчені біохімічні якості та механізм дії багатьох позаклітинних ферментів мікроорганізмів (Peberdy, 1994; Archer, 1997; Conesa et al., 2001; Бойко и др., 2002, 2007; Капрельянц и др., 2002, 2003; Grimm et al., 2005). Однак існує ряд питань, що знаходяться на етапі вивчення, вони стосуються механізмів виділення ферментних білків з грибної клітини та факторів, що впливають на цей процес, пошука нових активних продуцентів серед природних популяцій та розробки засобів підвищення екскреції ферментів.

Для промислового отримання гідролітичних ферментів використовують переважно гриби роду Trichoderma та Aspergillus. Однак, серед речовин, що вони екскретують, є мікотоксини, тому ферментні комплекси цих грибів не можуть бути застосовані у харчових технологіях без попередньої очистки (Pitt, 2000). Це питання може бути вирішено шляхом використання в якості продуцентів нетоксичних грибів - зокрема їстівних базідіальних грибів. Одними з можливих продуцентів є гриби роду Pleurotus, що здатні рости в глибинній культурі, не накопичують токсичних метаболітів та продукують позаклітинні ферменти різної субстратної специфічності (Palmeri et al., 1995; Das, 2001; Bianko, 2001; Baldrian, 2005).

У процесі руйнування клітинних стінок дріжджів велике значення може мати синергізм дії ферментів. У зв'язку з цим доречним є використання комплексу, що складається з декількох ферментів різної специфічності. Тому, інтерес викликає вивчення дії поліферментного комплексу міцеліальних грибів, що формується в умовах глибинного культивування, на клітини дріжджів з метою видалення клітинної стінки та отримання внутрішньоклітинних компонентів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися у Науково-дослідному інституті біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна у рамках науково-дослідних робіт «Дослідження екстрацелюлярних ферментів фітопатогенів та їх ролі у формуванні рослинного

імунітету» (№ державної реєстрації: 0105U00715) та «Дослідження механізмів індукції гідролітичних ферментів рослинних об'єктів (рослини, гриби, водорості)» (№ державної реєстрації: 0103U004281).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи був відбір продуцентів гідролітичних ферментів, здатних руйнувати клітинну стінку дріжджів, та виділення і характеристика екстрацелюлярного ферментного комплексу для отримання дріжджового гідролізату. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

Відібрати продуцентів гідролітичних ферментів із природних джерел, визначити інтенсивність їх росту та динаміку екскреції білку в умовах глибинного культивування.

Вивчити ферментативну активність екстрацелюлярних білків міцеліальних грибів Trichoderma viride, Chaetomium globossum, Рleurotus ostreatus в умовах глибинного культивування.

Визначити здатність ферментних комплексів виділених грибів руйнувати клітинну стінку дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Виділити, очистити та охарактеризувати гідролітичний ферментний комплекс міцеліальних грибів з дріжджелітичною активністю.

Об'єкт дослідження: культури грибів, екстрацелюлярні білки, ферментний комплекс, культура пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Предмет дослідження: накопичення білку та біомаси при вирощуванні грибів у глибинній культурі; показники вмісту білка, вуглеводів, нуклеїнових кислот у гідролізаті дріжджів; гідроліз клітинних стінок дріжджів ферментним комплексом міцеліальних грибів.

Методи дослідження: методи культивування грибів та визначення показників росту, методи визначення ферментативної активності, хроматографічний та електрофотометричний метод розділення білків, спектрофотометричні (вміст нуклеїнових кислот, вуглеводів, білку), мікроскопічні (кількість клітин дріжджів), статистичні (непараметричні) методи.

Наукова новизна одержаних результатів. З природних джерел було виділено міцеліальні гриби - потенціальні продуценти гідролітичних ферментів - T. viride, Ch. globossum, Р. ostreatus.

Встановлено, що у екстрацелюлярному ферментному комплексі грибів T. viride, Ch. globossum, Р.ostreatus містяться протеолітичні, амілолітичні та целюлозолітичні ферменти. У ферментному комплексі T. viride присутні переважно целюлази та в-амілази, у ферментному комплексі Ch. globossum - в-амілази, у P. ostreatus - целюлази та в-амілази.

Було встановлено, що гідролітичні ферменти, що містяться у культуральному фільтраті грибів, здатні руйнувати клітинну стінку дріжджів Saccharomyces cerevisiaе. Однак виявлено, що дріжджелітична активність залежить від виду грибів. Так, після інкубації клітин дріжджів з ферментним комплексом грибів T. viridе було зруйновано 37% клітин дріжджів, після інкубації з ферментним комплексом ізоляту Ch. globossum зруйнованих клітин виявилося у два рази більше - 84%, а при інкубації з ферментним комплексом Р. ostreatus виявлено 70% клітин зі зруйнованою клітинною стінкою.

Показано, що динаміка активності гідролітичних ферментів, що екскретуються в культуральне середовище не співпадає з динамікою екскреції білку. Так, при культивуванні у глибинній культурі ізоляту Р. ostreatus максимальна кількість білку накопичується к 18 добі культивування, а максимальна дріжджелітична активність спостерігається на 14 добу культивування.

Встановлено, що термін зберігання ферментних комплексів Ch. globossum та Р. ostreatus при температурі 4єС складає 48 годин. Інкубація ферментних комплексів Ch. globossum та Р. ostreatus при температурі 94єС протягом години приводить до зниження ферментативної активності на 90% та 100% відповідно.

Білки, що екскретуються у культуральне середовище Р. ostreatus, були виділені за допомогою висолювання сульфатом амонію різного ступеня насиченості (від 45 до 80%) та очищені за допомогою діалізу. Виявлено, що білки, які мають дріжджелітичну активність, містяться у фракції, що була осаджена сульфатом амонію 45% ступеня насиченості. Ця фракція складається з п'яти білків з молекулярною масою від 10 до 40 кДа.

Встановлено, що при інкубації клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae з ферментними комплексами міцеліальних грибів Ch. globossum та Р. ostreatus у інкубаційній суміші зменшується початкова кількість клітин - у 17 та 4 рази відповідно, накопичуються зруйновані та мертві клітини, знижується інтенсивність дихання клітинної суспензії дріжджів. При мікроскопуванні залишків нерозчинної фракції дріжджового гідролізату, що утворюється після інкубації з ферментними комплексами, виявлена наявність зруйнованих та позбавлених клітинної стінки дріжджів та залишків клітинної стінки. Інкубація клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae з ферментними комплексами приводить також і до руйнування внутрішньоклітинних компонентів - спостерігається вивільнення з клітин дріжджів білку та нуклеїнових кислот. Таким чином, у результаті гідролізу біомаси дріжджів Saccharomyces cerevisiae ферментними комплексами міцеліальних грибів Ch. globossum та Р. ostreatus утворюються розчинна та нерозчинна фракції гідролізату, що є різними за складом продуктами, які можуть бути використані у наукових дослідженнях та промисловості.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи були використані при розробці технічних умов ТУ У 15.8-020712-05-001:2006 «Добавки диетические. Гидролизат пивных дрожжей пищевой. Технические условия». Результати використовуються при підготовці спеціалістів на кафедрі молекулярної біології та біотехнології та кафедрі мікології та фітоімунології біологічного факультету ХНУ імені В.Н. Каразіна. Результати роботи можуть бути використані при розробці технологічних процесів отримання ферментів міцеліальних грибів. Виділені ферменти можуть бути використані для гідролізу, отримання протопластів та видалення клітинних стінок дріжджів.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником обрано об'єкт і предмет дослідження, визначено мету, завдання і тему дисертаційної роботи. Експериментальну роботу, аналіз літератури, аналіз та узагальнення отриманих даних, статистичну обробку результатів проведено самостійно. Дослідження руйнування нуклеїнових кислот дріжджів проведені разом з н.с. І.С. Леоновою.

Апробація результатів дисертації. Результати та основні положення дисертаційної роботи доповідалися на Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених-ботаніків «Актуальні питання ботаніки та екології» (Канів, 2002), Міжнародній науково-практичній конференції «Методологічні основи пізнання біологічних властивостей грибів-продуцентів фізіологічно активних речовин та харчових продуктів» (Донецьк, 2002), Міжнародній науково-практичній конференції «Досягнення, проблеми та перспективи культивування грибів. Сучасні технології» (Донецьк, 2005).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 7 наукових робіт, із них 4 - статті у фахових виданнях, 3 - тези доповідей у збірниках матеріалів конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Результати дисертаційної роботи викладені на 137 сторінці друкованого тексту. Дисертаційна робота складається зі вступу, 3 розділів: огляд літератури, матеріали та методи дослідження, результати досліджень та їх обговорення; заключення, висновків, списку використаної літератури. Роботу ілюстровано 5 таблицями і 39 рисунками. Список використаної літератури складається з 210 найменувань, з них 156 --іноземних авторів.

1. Основний зміст роботи

Огляд літератури. Огляд літератури складається з 6 підрозділів, в яких наведено аналіз наукової літератури щодо складу клітинної стінки дріжджів та особливостей її руйнування за допомогою гідролітичних ферментів, а також особливостей екскреції гідролітичних ферментів у міцеліальних грибів та переваги їх використання в якості продуцентів.

Матеріали та методи дослідження. В дослідженнях використовували ізоляти грибів Ch. globossum та T. viride, що були виділені з рослинних залишків, та ізоляти P. оstreatus, що були виділені з плодових тіл. Гриби культивували у поверхневій культурі, на агаризованих поживних середовищах, та у глибинній культурі, на рідких середовищах, при постійних температурі та перемішуванні. Використовували синтетичні живильні середовища Чапека-Докса, Вольтґє, Гетчинсона та середовища з додаванням різних рослинних екстрактів (Семенов, 1990). Інтенсивність росту визначали за лінійним ростом колонії та по накопиченню біомаси (Дудка и др., 1982).

Для отримання ферментного комплексу ізоляти вирощували у глибинній культурі. Екстрацелюлярні білки отримували з культурального фільтрату висолюванням сульфатом амонію, використовуючи різні ступені насиченості - від 45 до 80%. Обессолювання проводили за допомогою діалізу (Скоупс, 1985).

Хроматографічне розділення білків проводили на колонці із сефадексом G-75, урівноваженій 0,02 М трис-HCl буфером рН 7,4. Електрофорез проводили в градієнті поліакриламідного гелю, використовуючи апарат для пластинчатого електрофорезу. Білки фіксували 5%-м розчином трихлороцтової кислоти. Для виявлення білкових зон пластини поміщали у 0,11% розчин барвника СВВ (Coomassie brilliant blue) G - 250. В якості стандартних маркерів використовували цитохром С (М=12,4 кДа) та яєчний альбумін (М=36 кДа) (Остерман, 1981).

Вміст нуклеїнових кислот визначали за методом, описаним (Спірин, 1958). Вміст розчинних вуглеводів визначали фенол-сірчаним методом (Dubois et al., 1956). Вміст загального білку визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1957).

Целюлазну активність ферментного комплексу визначали по накопиченню розчинних вуглеводів, використовуючи в якості субстрату целюлозу (Дудка и др., 1982). Амілазну активність визначали, використовуючи у якості субстрату крохмаль. Визначення б-амілази було проведено після інгібування в-амілази в присутності оцтовокислого кальцію при 70єС (Єрмаков, 1985). Протеолітичну активність ферментного комплексу визначали, використовуючи в якості субстрату казеїн, по накопиченню амінного азоту, який вимірювали нінгідриновим методом (Дудка и др., 1982).

При проведенні гідролізу дріжджів використовували клітини Saccharomyces cerevisiae, що культивували глибинним засобом, культуру дріжджів, отриману з лабораторії ВАТ «Пивзавод «Рогань», та сухі клітини дріжджів. Автоліз дріжджів проводили при температурі 37? та 50?С. Для визначення кількості клітин дріжджів у суспензії використовували камеру Горяєва, кількість мертвих клітин дріжджів визначали після забарвлення 0,8% трипановим синім. Інтегральну активність метаболізму клітин дріжджів оцінювали за інтенсивністю ендогенного дихання (Аливердиева, 2001, Рихванов, 2001), яку визначали полярографічно за швидкістю споживання кисню з використанням закритого платинового електроду Кларка (Зеленский, 1986). Експерименти були проведені в 3 - 5 повтореннях. Статистичну обробку результатів проводили, використовуючи непараметричні статистичні методи та вираховуючи стандартну помилку середнього (Гланц, 1998).

Основні результати та їх обговорення

Виділення продуцентів дріжджелітичних ферментів з природних джерел. Першим етапом роботи було виділення міцеліальних грибів - потенційних продуцентів дріжджелітичних ферментів з рослинних залишків на середовище Чапека-Доксу з глюкозою та середовище Чапека-Доксу з клітинами дріжджів. Передбачалось, що на середовищі, до складу якого входять дріжджі, будуть переважно рости види грибів, що екскретують ферменти з дріжджелітичною активністю. Серед багатьох видів грибів, що були виділені на середовище з глюкозою, тільки види Aspergillus niger, Trichoderma viride, Chaetomium globossum та Fusarium graminearum були здатні рости на середовищі, що містить клітини дріжджів. Було проведено напівкількісне та кількісне визначення дріжджелітичної активності виділених грибів. Під час напівкількісного визначення активності ізоляти A. niger, T. viride, Ch. globossum та F. graminearum вирощували у глибинній культурі та визначали здатність руйнувати клітини дріжджів за інтенсивністю накопичення біомаси продуцентами (вимірювали за 5 бальною шкалою) та за наявністю залишків субстрату - клітин дріжджів у середовищі після закінчення культивування. Було виявлено, що всі виділені гриби мають здатність руйнувати клітини дріжджів, але в різних ступенях. Так, найменша здатність руйнувати дріжджі була виявлена у ізоляту F. graminearum, було відмічено слабкий ріст міцелію в культурі, порівняно з іншими ізолятами, та залишки клітин дріжджів у середовищі після культивування. Ізоляти Ch. globossum, T. viride, A. niger проявляли порівняно високу здатність до руйнування клітин дріжджів - про це свідчить як інтенсивне накопичення біомаси ізолятами, так і відсутність клітин дріжджів у середовищі після закінчення культивування, крім ізоляту T. viride, у середовищі культивування якого було зафіксовано незначну кількість залишків субстрату. Під час кількісного визначення дріжджелітичної активності ізоляти культивували у глибинній культурі, отримували культуральний фільтрат, інкубували з клітинами дріжджів та за показниками оптичної щільності дріжджової суспензії, до та після інкубації, визначали здатність грибів руйнувати клітини дріжджів. Зниження оптичної щільності дріжджової суспензії після інкубації з культуральним фільтратом свідчить про зменшення кількості клітин дріжджів внаслідок їх руйнування. Виявлено, що найменша здатність руйнувати клітини дріжджів була у ізоляту F. graminearum, показники активності грибів T. viride та Ch. globossum практично не відрізнялись між собою, а найвища здатність була виявлена у ізоляту A. niger (рис. 1).

У подальших експериментах використовували ізоляти T. viridе та Ch. globossum, ізолят A. niger, незважаючи на виявлену високу здатність руйнувати клітини дріжджів, не використовувався у зв'язку з наявністю в культуральній рідині

токсичних метаболітів, що може стати перешкодою при виділенні та очищенні ферментів. Однак, згідно з деякими дослідженнями, гриби роду Trichoderma та Chaetomium також продукують деякі сполуки, що можуть заважати застосуванню гідролізатів, отриманих за допомогою ферментів цих грибів, у харчових цілях (Cole, 2001; Bhatnagar, 2002: Pieckova, 2003). Враховуючи, що гідролізати дріжджів, які отримуються за допомогою грибних ферментів, можуть використовуватися не тільки в харчовій, а також у інших галузях промисловості, вивчення ферментів цих грибів було продовжено, а для отримання дріжджового гідролізату у харчових цілях

було вибрано ізолят Pleurotus ostreatus, що є їстівним грибом та не містить токсичних сполук.

Визначення динаміки інтенсивності росту та накопичення позаклітинного білку в умовах глибинного культивування грибів T. viride, Ch. globossum та P. ostreatus. Важливим етапом у технологічному процесі отримання позаклітинних ферментів міцеліальних грибів є розробка умов культивування, які забезпечують накопичення оптимальної кількості біомаси та білку, а також вивчення динаміки росту та екскреторної активності продуцента.

На підставі проведених експериментів було встановлено, що для росту ізоляту T. viride найбільш оптимальним є середовище, до складу якого входять мікроелементи (Mn, Zn, Fe, Co). Культивування T. viride на цьому середовищі сприяло більш інтенсивному спороутворенню, та накопиченню біомаси порівняно з мінеральними середовищами Чапека-Докса, Вольтґє та Гетчинсона. Оптимальним для росту ізоляту Ch. globossum виявилось середовище, до складу якого входить рослинний екстракт. Найбільшу кількість біомаси P. оstreatus було отримано при культивуванні на середовищі з екстрактом ячменю та середовищі з пептоном.

При внесенні біомаси дріжджів у поживне середовище в якості компоненту субстрату, спостерігалось збільшення біомаси грибів T. viride, Ch. globossum та P. оstreatus.

Виходячи з того, що накопичення біомаси грибів відрізнялось під час культивування на різних поживних середовищах, то, імовірно, що і екскреторна активність грибів також буде залежати від складу середовища. У зв'язку з цим, вивчали вміст екстрацелюлярного білку в культуральній рідині продуцентів. Виявлено, що динаміка виділення білку ізолятом T. viride мала S-подібний характер, максимум накопичення позаклітинного білку спостерігався на шосту добу росту у глибинній культурі на всіх живильних середовищах, що співпадало з максимумом накопичення біомаси. Найбільшу кількість позаклітинного білку було зафіксовано при вирощуванні на середовищі Чапека, при цьому продуктивність складала 60 %, найменшу - на середовищі з мікроелементами.

Для ізоляту Ch. globossum виявлено, що компоненти синтетичних середовищ Чапека і Гетчинсона не забезпечують високий вміст позаклітинного білку порівняно із середовищами, що містять рослинні екстракти. Найбільш сприятливими для накопичення білку були середовища з екстрактом жита (продуктивність 12%) та з екстрактом пшениці та пивним суслом (продуктивність 27%). Ізолят P. ostreatus культивували на середовищі з екстрактом ячменю та визначали динаміку накопичення білку порівняно з накопиченням біомаси. Виявлено, що між інтенсивністю росту та екскреторною активністю існує пряма кореляція. Інтенсивне виділення позаклітинного білку починалося на 10-ту добу культивування і під час виходу росту міцелію на плато (20 - 24 доба культивування), екскреторна активність також стабілізувалася.

Ферментативна активність позаклітинних білків ізолятів T. viride Ch. globossum та P. ostreatus. Високий рівень екскреції білку під час культивування на різних середовищах зумовлює наявність великої кількості ферментів в культуральному фільтраті продуцентів. При визначенні ферментативної активності позаклітинних білків продуцентів T. viride, Ch. globossum та P. ostreatus було виявлено целюлозолітичну, протеолітичну та амілолітичну активність. Найбільша целюлозолітична активність була виявлена в культуральній рідині T. viridе - у 2 рази вища, ніж у ізолятів Ch. globossum та P. ostreatus. Також у ізоляту T. viridе виявлено високий рівень протеолітичної активності, у 2 рази більше, ніж у ізоляту Ch. globossum та у 4 рази, ніж у P. ostreatus. Найвища амілазна активність спостерігалась у ізолята Ch. globossum.

При вивченні впливу ферментних комплексів міцеліальних грибів на клітини дріжджів S. сerevisiae використовували такі показники дріжджової культури, як кількість цілих клітин, кількість нежиттєздатних (мертвих) клітин, що забарвлюються трипановим синім, та інтенсивність ендогенного дихання клітин. В якості контролю використовували показники інтактної культури або культури після проведення автолізу при температурі 37? та 50?С.

Після інкубації клітин дріжджів з ферментними комплексами ізолятів Ch. globossum та P. ostreatus в суспензії налічується відповідно 84 та 70% клітин забарвлених трипановим синім, що виявилося у два рази більше порівняно з варіантом, де було використано ферментний комплекс T. viride (рис. 2).

Характеристика дріжджелітичного ферментного комплексу міцеліального гриба Ch. globossum. Визначено, що при інкубації дріжджової суспензії з ферментним комплексом Ch. globossum загальна кількість клітин дріжджів у суспензії зменшувалась у 6 разів після 12 годин інкубації, та у 17 разів після 24 годин інкубації, порівняно з початковим вмістом клітин, а також у 17 та 10 разів порівняно з автолізом протягом 24 годин при 37 та 50?С відповідно (табл. 1). При цьому кількість мертвих клітин, що забарвлювалася трипановим синім, зростала у 36 та 70 раз через 12 та 24 годин інкубації відповідно порівняно з початковим вмістом мертвих клітин у інтактній суспензії. При порівнянні з автолізом, який проводили протягом 24 годин при 37 та 50?С, кількість мертвих клітин після інкубації з ферментним комплексом виявилася більшою у 10 та 1,6 рази відповідно. Інтенсивність ендогенного дихання культури дріжджів після інкубації з ферментним комплексом знизилася у 5 разів через 12 годин, та у 12 разів після 24 годин інкубації у порівнянні з інтактною культурою, та у 12 і 4 рази у порівнянні з культурою після 24-годинного автолізу при температурі 37 та 50?С відповідно.

Руйнування клітинної стінки дріжджів приводить до висвободження в інкубаційну суміш внутрішньоклітинних компонентів, значну частину серед яких займає білок. У зв'язку з цим, для визначення інтенсивності руйнування клітин дріжджів вимірювали вміст білку у розчинній фракції інкубаційної суміші після інкубації дріжджів протягом 12 та 24 годин з ферментним комплексом Ch. globossum, в якості контролю використовували показники вмісту білку після проведення автолізу при 37? та 50єС.

Було показано, що проведення автолізу при 37? та 50єС протягом 12 та 24 годин супроводжується висвободженням білку із клітин дріжджів в середовище інкубації. Протягом 24 годин автолізу було висвободжено 0,120 та 0,177 мг/мл білку при 37? та 50єС відповідно (табл. 2). Після інкубації клітин дріжджів з ферментним комплексом Ch. globossum вміст білку у розчинній фракції інкубаційній суміші був у 12 (після 12 годин) та у 15 (після 24 годин) разів більше, ніж при проведенні автоліза при 50єС, що складало 1,2 та 1,5 мг/мл білку відповідно (табл. 2). Висвободження позаклітинного білку з клітин дріжджів у розчинну фракцію гідролізату свідчить про руйнування клітин ферментним комплексом Ch. globossum.

Для вивчення глибини гідролізу визначали вивільнення з клітин дріжджів нуклеїнових кислот після 12 та 24 годин інкубації з ферментним комплексом Ch. globossum та після проведення автолізу при 37° та 50°С. Виявлено, що у осаді дріжджів (нерозчинна фракція) спостерігалося зменшення вмісту РНК та ДНК у всіх варіантах експерименту, порівняно з контролем, та збільшення їх вмісту у розчинній фракції, що свідчить про руйнування внутріклітинних компонентів клітин дріжджів (рис. 3).

Вміст ДНК та РНК у дріжджовому осаді при 24 годинній інкубації зменшився у 5 та 3 рази відповідно, при цьому у розчинну фракцію (надосад) перейшло - 60% ДНК та 78% РНК з нерозчинної фракції (осад) (рис. 3). Таким чином, гідроліз клітин дріжджів ферментним комплексом Ch. globossum приводить до інтенсивного руйнування клітинних компонентів.

Відомо, що активність ферментних комплексів залежить від умов культивування, а саме від складу живильного середовища. Тому на наступному етапі роботи визначали найбільш оптимальне середовище культивування для виділення дріжджелітичних ферментів Ch. globossum. Встановлено, що дріжджелітична активність проявлялась під час культивування на всіх використаних середовищах. Мінімальна активність була отримана при культивуванні на середовищі Чапека, максимальна - на середовищі, до складу якого входили рослинний екстракт та біомаса дріжджів. Слід зазначити, що внесення біомаси дріжджів у синтетичні середовища Чапека і Гетчинсона приводили до підвищення дріжджелітичної активності ферментного комплексу Ch. globossum.

Було вивчено динаміку руйнування клітин дріжджів ферментним комплексом Ch. globossum. Встановлено, що динаміка вивільнення дріжджового білку має S- подібний характер. Зменшення інтенсивності виходу білку наприкінці інкубації пов'язане з вичерпанням кількості субстрату, що може бути гідролізовано ферментами, це було підтверджено при проведенні експериментів, що передбачали багаторазову обробку ферментним комплексом дріжджової біомаси.

Було визначено, що ферментний комплекс Ch. globossum після інкубації при температурі С зберігає 100% активності протягом 48 годин, більшу стабільність ферментативної активності забезпечує зберігання при заморожуванні. Встановлено, що ферменти Ch. globossum є стабільними при інкубації протягом години при температурі 37 та 45єС, а при температурі 65є та 94єС - активність зменшується на 90%.

Характеристика дріжджелітичного ферментного комплексу міцеліального гриба P. ostreatus. Дріжджелітичну активність ферментного комплексу P. ostreatus визначали після інкубації з клітинами дріжджів за зменшенням початкової кількості клітин дріжджів, наявністю мертвих клітин та висвободженню дріжджового білку у інкубаційну суміш порівняно з інтактною культурою (контроль) та автолізом.

Було виявлено, що після інкубації клітин дріжджів з ферментним комплексом P. ostreatus протягом 24 годин початкова кількість клітин знижувалась у 4 рази порівняно з контролем, та у 2 рази порівняно з автолізом (рис. 4А). При цьому після інкубації з ферментним комплексом 70% клітин дріжджів виявилися нежиттєздатними, що перевищувало показники контролю та автолізу у 20 та у 3,5 рази відповідно (рис. 4Б). Отримані дані свідчать по наявність серед екстрацелюлярних білків міцеліального гриба P. оstreatus ферментів, що здатні руйнувати клітинну стінку дріжджів з утворюванням дріжджового гідролізату.

У наступній серій експериментів визначали залежність дріжджелітичної активності ферментного комплексу ізоляту P. ostreatus від складу поживного середовища. Найменш активний ферментний комплекс був отриманий при культивуванні продуцента на середовищі Гетчинсона, середовищі з глюкозою та пивним суслом, а найбільш активний - на середовищі, до складу якого входять екстракт ячменю та пивне сусло.

Визначення динаміки висвободження білку із клітин S. cerevisiae при інкубації з ферментним комплексом P. ostreatus виявило, що динаміка має S-подібний характер, що співпадає з даними, які були отримані для ізоляту Ch. globossum.

Активність ферментного комплексу P. ostreatus зберігається при температурі 4єС протягом 48 годин. При визначенні термостабільності дріжджелітичних ферментів P. ostreatus було з'ясовано, що інкубація ферментного комплексу при температурі 37? та 45єС протягом однієї години істотно не впливає на ферментативну активність, інкубація при 65єС протягом однієї години приводить до зниження здатності руйнувати клітини дріжджів на 30 %, а після інкубації при 94є С було виявлено повну втрату активності ферментного комплексу.

При вивченні динаміки дріжджелітичної активності P. ostreatus було встановлено, що максимальна активність спостерігається на 14 добу культивування ізоляту у глибинній культурі.

Здатність ферментних комплексів Ch. globossum та P. ostreatus руйнувати клітини дріжджів підтверджується мікроскопічними дослідженнями нерозчинної фракції гідролізату. Встановлено, що після проведення інкубації дріжджовий осад складається переважно з клітин, що позбавленні клітинної стінки, зруйнованих клітин та залишків клітинної стінки (рис. 5).

Виділення та очистка дріжджелітичного ферментного комплексу P.ostreatus. Для виділення екстрацелюлярного білку з культурального фільтрату P.ostreatus використовували етанол та сульфат амонію різного ступеня насиченості (ст. нас.). Виявлено, що найбільша кількість позаклітинного білку осаджується при використанні етанолу, при використанні сульфату амонію осаджувалося менша кількість білку, при чому кількість білку залежала від насиченості культурального фільтрату сульфатом амонію (рис. 6).

У різних фракціях білків, що були виділені за допомогою сульфату амонію, визначали дріжджелітичну активність у порівнянні з активністю культурального фільтрату. Виявлено, що білки, які були осаджені при 45% ступені насиченості сульфату амонію (45 ст. нас.), у два рази активніше руйнували клітини дріжджів, ніж культуральний фільтрат з тим же вмістом білку (рис. 7).

Після інкубації клітин дріжджів з білковою фракцією, що була отримана при використанні сульфату амонію 80% ступені насиченості (80% ст. нас.) дріжджелітична активність виявилася у 2,5 рази більшою ніж активність культурального фільтрату. У тому разі, коли білки осаджені при 45 % насиченості видалялися, а до рідини додавався сульфат амонію до 80 % насиченості (45 % > 80%) був отриманий ферментативний комплекс, активність якого вірогідно не відрізнялась від активності культуральної рідини (рис. 7).

Таким чином, гідролітичні ферменти, що екскретуються у культуральне середовище P.ostreatus, займають достатньо велику долю серед екстрацелюлярних білків та осаджуюються сульфатом амонію до 45% ступені насиченості, при цьому зберігаючи ферментативну активність за здатністю руйнувати клітини дріжджів.

Наступним етапом роботи було фракціонування позаклітинних білків P.ostreatus. Для цього гриб культивували у глибинній культурі протягом 14 діб, білки культуральної рідини осаджували сульфатом амонію. Білковий осад розчиняли у 0,02 М Тріс-HCl буфері та наносили на хроматографічну колонку з сефадексом. У результаті розділення білків показано, що білки представлені двома піками. Перший пік був визначений від 25 до 45 мл елюату, другий - від 45 до 70 мл (рис. 8).

Після хроматографічного розділення білків у кожній фракції визначали дріжджелітичну активність. Виявлено, що активність була присутня у 6 та 7 фракціях. Розділення методом електрофорезу У ПААГ виявило, що ферментативний молекулярною масою від 10 до 40 кДа (рис. 9).

Таким чином, в результаті проведених досліджень, було виділено ізоляти грибів, що є потенційними продуцентами дріжджелітичних ферментів. З'ясовано, що виділені ізоляти характеризуються здатністю рости на середовищах різного складу, встановлені оптимальні для накопичення біомаси та позаклітинного білку середовища культивування. Закономірності, що були виявлені при цьому мають не тільки прикладний аспект, що пов'язаний з розробкою умов культивування продуцента, а і фундаментальний, який стосується взаємозв'язку накопичення біомаси та екскреторної активності міцеліальних грибів в умовах глибинного культивування, та залежність цих показників від складу поживного середовища.

У результаті інкубації біомаси дріжджів з ферментними комплексами грибів Chaetomium globossum та Рleurotus ostreatus утворюються гідролізати, що складаються з розчинної та нерозчинної фракції. Розчинна фракція гідролізата дріжджів містить білки, вуглеводи, нуклеотіди, вітаміни, амінокислоти та інші внутрішньоклітинні компоненти дріжджової клітини, нерозчинна фракція гідролізата складається з напівгідролізованих та негідролізованих ферментними комплексами грибів залишків біомаси дріжджів. При використанні для гідролізу дріжджів ферментного комплексу міцеліального гриба Рleurotus ostreatus гідролізати характеризуються відсутністю токсичних сполук. Отримані гідролізати можуть бути використані у медицині, фармакологїї, тваринництві та харчових технологіях у якості джерела біологічно активних компонентів, при створенні функціональних продуктів, продуктів з лікувальними властивостями, сорбентів, поживних середовищ для культивування мікроорганізмів та інших цільових продуктів.

гідролітичний ферментативний міцеліальний гриб

Висновки

Підібрані оптимальні живильні середовища для накопичення біомаси в умовах глибинного культивування міцеліальних грибів Trichoderma viride, Chaetomium globossum, Рleurotus ostreatus, які були виділені з природних джерел, вивчено динаміку росту та показано, що гриби Trichoderma viride і Chaetomium globossum характеризуються швидким накопиченням біомаси та коротким терміном культивування: 6 та 4 діб відповідно, а гриби Рleurotus ostreatus характеризуються повільним ростом у глибинній культурі - для досягнення максимального накопичення біомаси необхідно 20 діб.

Встановлено, що у екстрацелюлярному ферментному комплексі грибів Trichoderma viride, Chaetomium globossum, Рleurotus ostreatus містяться протеолітичні, амілолітичні та целюлозолітичні ферменти. У ферментному комплексі Trichoderma viride переважно присутні целюлази та в-амілази, у ферментному комплексі Chaetomium globossum - в-амілази, у P. ostreatus - целюлази та в-амілази.

Показано, що гідролітичні ферменти міцеліальних грибів здатні руйнувати клітинну стінку дріжджів Saccharomyces cerevisiae, але активність відрізняється в залежності від виду грибів. Після інкубації клітин дріжджів з ферментним комплексом Trichoderma viridе було зруйновано 37% клітин дріжджів, після інкубації з ферментними комплексами ізолятів Chaetomium globossum та Рleurotus ostreatus виявлено відповідно 84 та 70 % клітин зі зруйнованою клітинною стінкою.

Вивчено динаміку екскреції білку при культивуванні грибів Trichoderma viride, Chaetomium globossum, Рleurotus ostreatus в умовах глибинної культури, та показано, що динаміка накопичення білку не співпадає з динамікою ферментативної активності.

Встановлено, що термін зберігання ферментних комплексів Chaetomium globossum та Рleurotus ostreatus при температурі 4є С складає 48 годин; інкубація ферментного комплексу Chaetomium globossum при температурі 65є та 94є С протягом години приводить до зниження активності на 90%, інкубація ферментного комплексу Рleurotus ostreatus при 65єС протягом однієї години приводить до зниження активності на 30%, інкубація при 94єС - на 100%.

Встановлено, що ферментний комплекс, що екскретується у культуральне середовище Рleurotus ostreatus на 14 добу росту в умовах глибинного культивування, осаджується сульфатом амонію 45% ступеня насиченості, зберігає здатність руйнувати клітини дріжджів Saccharomyces cerevisiae та складається з п'яти білків з молекулярною масою від 10 до 40 кДа.

Встановлено, що після інкубації клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae з ферментними комплексами міцеліальних грибів Chaetomium globossum та Рleurotus ostreatus протягом 24 годин у інкубаційній суміші зменшується початкова кількість клітин дріжджів - у 17 та 4 рази відповідно, накопичуються зруйновані та мертві клітини, знижується інтенсивність дихання клітинної суспензії та спостерігається вивільнення з клітин дріжджів білку та нуклеїнових кислот.

Дріжджовий гідролізат, що утворюється в результаті гідролізу дріжджової біомаси Saccharomyces cerevisiae ферментними комплексами міцеліальних грибів Chaetomium globossum, Рleurotus ostreatus та складається з розчинної та нерозчинної фракції, було охарактеризовано за вмістом білків, вуглеводів та нуклеїнових кислот.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Божков А.И. Удаление клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae ферментным комплексом Chaetomium globossum Kunze / А.И. Божков, И.С. Леонова, В.И. Облак // Биотехнология. - 2004. - № 6. - С. 46-53. (Облак В.І. особисто виконала 50% експериментальної роботи по вивченню гідролітичного руйнування клітинної стінки дріжджів, проаналізувала одержані дані, зробила аналіз наукової літератури та підготувала статтю до друку).

2. Облак В.И. Условия культивирования Chaetomium globossum Kunze и активность экскреции гидролитических ферментов в культуральную среду / В.И. Облак, А.И. Божков // Биологический вестник. - 2006. - Т. 10, № 1. - C. 115-118. (Облак В.І. особисто виконала експериментальну роботу, зробила аналіз наукової літератури та підготувала статтю до друку).

3. Облак В.И. Степень гидролитического разрушения клеточных стенок дрожжей ферментным комплексом Chaetomium globossum Kunze / В.И. Облак, А.И. Божков // Биологический вестник. - 2006. - Т. 10, № 2. - С. 109-112. (Облак В.І. особисто виконала експериментальну роботу, зробила аналіз наукової літератури та підготувала статтю до друку).

4. Божков А.И. Экскреторная активность гидролитических ферментов Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm в глубинной культуре / А.И. Божков, В.И. Облак // Биотехнология. - 2007. - № 1. - С. 41-46. (Облак В.І. особисто виконала експериментальну роботу, зробила аналіз наукової літератури, зробила статистичні розрахунки та підготувала статтю до друку).

5. Облак В.И. Влияние гидролитических ферментов Trichoderma viride на интенсивность автолиза клеток Saccharomyces cerevisiae / В.И. Облак // II международная научно-практическая конференция «Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов», 25-27 ноября 2002 г.: тезисы докл. - Донецк, 2002. - С. 135-138.

6. Облак В.И. Разработка схемы культивирования Chaetomium globossum Kunze / В.И. Облак // Конференція молодих учених-ботаників «Актуальні проблеми ботаніки та екології», 7-10 вересня, 2004 р.: тези доп. - Канів, 2004. - С. 21-22.

7. Облак В.И. Ферментативная активность Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm в условиях глубинного культивирования / В.И. Облак, А.А. Божков // Международная научно-практическая конференция «Достижения, проблемы и перспективы культивирования грибов. Современные технологии», 29 сентября - 2 октября 2005 г.: тезисы докл. - Донецк, 2005. - С. 81-86. (Облак В.І. особисто виконала експериментальну роботу, проаналізувала одержані дані та підготувала статтю до друку).

Размещено на Allbest.ru