Генетика митохондрий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетика митохондрий



1. Формальная генетика митохондрий

В отличие от пластид, митохондрии содержатся у всех эукариот: у растений, животных и грибов. Митохондрии всех трех царств выполняют одну и ту же функцию, и структура у них в целом сходна. Митохондрии представляют собой округлые структуры размером от 1 мкм (рис. 1).

Рис. 1 Электронная микрофотография митохондрий листового мезофилла

Однако, в ряде случаев митохондрии могут быть объединены в достаточно длинную трубчатую изогнутую структуру. Внутреннее содержимое митохондрий называется матрикс. Матрикс содержит тонкие фибриллы и гранулы. Было выяснено, что гранулы -- это митохондриальные рибосомы, отличающиеся по размеру и плотности от рибосом цитоплазмы. Митохондрии, как и другие органеллы, окружены наружной двойной мембраной. Наружная мембрана митохондрий сходна с наружной мембраной пластид, ядра и с мембраной эндоплазматического ретикулума. Внутренняя мембрана митохондрий образует впячивания -- кристы. Именно на поверхности внутренней мембраны расположены все основные ферментные ансамбли, обеспечивающие функции митохондрий. Существуют методы разделения внутренней и внешней мембраны митохондрий. Поскольку наружная мембрана митохондрий менее плотная и необратимо набухает в растворе фосфата, это приводит к ее разрыву и отделению от внутренней. После обработки фосфатом изолированных митохондрий при помощи центрифугирования можно разделить внешние и внутренние мембраны этих органелл. Если посмотреть на них в электронный микроскоп, то они выглядят как прозрачные полые сферы, причем объем сферы, образованной внутренней мембраной, намного выше, чем объем сферы внешней мембраны. Поэтому объемную структуру митохондрий легко представить себе как большой шар, помещенный внутри маленького шара. В этом случае у внутренней мембраны возникнут многочисленные складки, так называемые кристы. Активность процессов, протекающих в митохондриях, непосредственно связана с количеством и размером крист. Чем больше поверхность крист и, следовательно, поверхность внутренней мембраны, тем активнее идут эти процессы. Следовательно, внутренняя мембрана митохондрий изменяется в размерах в зависимости от функционального состояния органелл.

Внутренние и наружные мембраны различаются между собой по плотности (внутренняя более плотная), по проницаемости (внутренняя обладает высокоспецифичной проницаемостью, наружная неспецифичной), разным составом ферментов и разным соотношением белков к липидам.

Внутренняя мембрана митохондрий уникальна по своему строению. Она содержит многокомпонентные комплексы белков-ферментов, которые осуществляют перенос электронов, окислительное фосфолирование, синтез цепи жирных кислот, а также белки, которые регулируют перенос небольших молекул во внутреннюю полость митохондрий.

Митохондрии так же, как и пластиды, никогда не возникают «de novo». Даже у организмов, живущих в анаэробных условиях, структуры, подобные митохондриям, есть. Если, например, выращивать один и тот же штамм дрожжей в аэробных и анаэробных условиях, то в клетках, выросших в анаэробных условиях, изменяется размер митохондрий, но не снижается их количество.

Деление митохондрий так же, как и пластид, осуществляется при помощи амитоза, с образованием гантелевидных фигур и их последующей перешнуровкой.

В некоторых случаях удалось показать синхронность деления митохондрий с ядром клетки и достаточно точное их распределение по дочерним клеткам у некоторых биологических объектов. Так, у инфузорий показана полная синхронность деления митохондрий вместе с ядром клетки. В митотически делящихся клетках растений и делящихся сперматоцитах аскариды было показано, что митохондрии достаточно точно распределяются вдоль веретена деления.

Исторически, почти вся формальная генетика митохондрий была изучена на грибах и, главным образом, на дрожжах. У остальных организмов имеются только отдельные факты связи тех или иных признаков с митохондриями. Жизненный цикл дрожжей представлен на рисунке

Рис. 2 Жизненный цикл Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи -- одноклеточный, но многоядерный организм. Значительную часть своей жизни они находятся в гаплофазе и, следовательно, их ядра гаплоидны. Гаплоидные клоны, обладающие противоположными половыми факторами (или типами скрещиваемости), А и а, могут сливаться друг с другом. Гаплоидные клоны с одинаковыми типами скрещиваемости не могут участвовать в оплодотворении. После оплодотворения ядра сливаются и образуются диплоидные клоны. В диплоидных клонах происходит споруляция и мейоз, образуется аск, дающий начало гаплоидным клонам двух противоположных типов скрещиваемости А и а в равных пропорциях. Естественно, что простые менделевские гены будут расщепляться точно так же, как и ген, контролирующий половой фактор, т.е. будут давать расщепление 1:1.

Дрожжи в зиготной фазе являются гетерозиготными и могут размножаться двояко: вегетативным и генеративным путем. При вегетативном размножении они просто делятся, и в образовавшиеся клетки попадает несколько диплоидных ядер. Кроме того, вегетативное размножение может происходить и при помощи почкования. В образовавшихся почках ядра тоже, диплоидные. Естественно, что при вегетативном размножении никакого расщепления ядерных генов не происходит -- гетерозиготы остаются гетерозиготами.

При генеративном размножении происходит мейоз и образуются клетки с гаплоидными ядрами, называемые аскоспорами. Аскоспоры гаплоидны, и расщепление у них происходит на равное количество аскоспор с доминантным и рецессивным аллелями, т.е. 1:1.

Таким образом, если расщепления 1:1 не наблюдается, то это могло бы указывать нам на то, что эти гены, возможно, неменделевские и, следовательно, возможно, цитоплазматические.

Существование внеядерного мутанта у дрожжей впервые продемонстрировал французский исследователь Б. Эффрусси еще в 1949 г. Эти мутанты проявляли дефекты дыхания и слабый рост. Они не содержали некоторые цитохромы. Такие мутанты можно было получить в большом количестве (иногда до 100 %) под действием акридиновых красителей. Но и спонтанно они могут возникать с частотой до 1 %. Эти мутанты получили название «petite», от французского слова «маленький».

При скрещивании этих мутантов с нормальными штаммами все потомство было без исключения нормальным. Хотя по другим генетическим маркерам, таким, как потребность в аденине, тиамине, расщепление по факторам полового типа было нормальным -- 1:1.

Если из первого поколения гибридов случайно выбирать клетки и скрещивать их опять с мутантами petite, все потомство было опять нормальным, правда, иногда появлялись и редкие мутантные выщепенцы с частотой менее 1%. Т.е. они появлялись практически с той же частотой, что и спонтанное возникновение этих мутантов. Можно было опять отбирать эти гибриды и скрещивать с нормальными с тем же результатом. Если исходить из того, что это мутации ядерных генов, то это можно было бы представить, как результат расщепления по 20 независимым локусам. Возникновение мутанта с одновременной мутацией в 20 локусах событие практически невероятное.

Р. Райт и Д. Ледерберг получили убедительные доказательства того, что данные мутанты не являются ядерными. Схема их эксперимента была следующей. При слиянии клеток дрожжей ядра сливаются не сразу, и в этот момент можно отсадить почки, содержащие еще гаплоидные ядра как одного, так и другого родителя. Такие гаплоидные почки спонтанно диплоидизируются (А --> АА; а --> аа). Если один штамм, например, с мутацией petite помечен неспособностью расти на аргинине, а второй -- не petite, помечен неспособностью расти на триптофане, то, отбирая почки у таких гибридов, мы отбираем родительские штаммы по ядерным генам. Что же происходит с цитоплазматическими? В результате эксперимента Р. Райта и Д. Ледерберга было выявлено следующее. Из 91 клона было обнаружено 6 клонов, у которых ядро было такое же, как и у не petite мутанта, а фенотип типичный petite. Следовательно, данный фенотип определяется не ядром, а независимо от него, и данную мутацию можно было назвать неядерной.

В дальнейшем были обнаружены и ядерные мутации petite. Всего таких мутантов было обнаружено около 20. Все они нормально менделировали и потомство аскоспор давало нормальное расщепление 2:2, хотя фенотипически они были очень схожи с цитоплазматическими мутантами. При скрещивании цитоплазматических petite с ядерными было обнаружено, что у зигот появляется способность к нормальному дыханию, а затем происходит расщепление 2: Таким образом, тест на комплементарность доказывал то, что мы имеем дело с мутантами разной локализации. Обнаружение ядерных и цитоплазматических мутантов с нарушенной функцией митохондрий указывало также и на то, что не все функции этих органелл кодируются цитоплазматическими генами. Часть из них кодируют ядерные гены.

В дальнейшем Б. Эффрусси обнаружил еще один такой же фенотип, как petite, но наследование данной мутации происходило другим образом. При скрещивании мутантов petite с нормальными клетками все потомство приобретало свойство медленно расти, а расщепление было 0:4. Первый тип цитоплазматических мутантов, который давал только нормальное потомство, в связи с этим был назван нейтральным, а второй, который давал только мутантное, был назван супрессивным, или доминантным, petite. Супрессивность в данном случае это своего рода доминирование. Но это доминирование особого рода, когда рецессивный аллель не просто скрывается в гетерозиготе, он попросту исчезает совсем. Многочисленные опыты показали, что и супрессивные мутанты petite также являются цитоплазматическими, так как факторы, обуславливающие их появление, не наследуются вместе с ядром.

В дальнейшем молекулярные исследования выявили, что супрессивные мутанты petite в отличие от нейтральных обладают более короткими молекулами митохондриальной ДНК, состоящими практически только из АТ-пар. Вероятнее всего, эффект супрессивности основан на более быстром размножении таких митохондриальных ДНК и вследствие этого вытеснением нормальных митохондриальных ДНК.

Таким образом, в цитоплазматических мутантах типа petite имеют место либо сравнительно небольшие делеции в митохондриальной ДНК (нейтральные мутанты petite), либо тотальные перестройки митохондриального генома -- (супрессивные мутанты petite).

Кроме того, были обнаружены мутанты с неполной супрессивностью, т.е. способностью давать определенный процент особей нормального типа 10, 20, 30 и даже около 50 процентов.

Оказалось, что степень супрессивности зависит от воздействий внешней среды -- температуры, субстрата и т.д. Ядерные мутанты не проявляли такой зависимости, что позволило отличать неполно супрессивные цитоплазматические petite от ядерных.

После получения данных о цитоплазматических мутантах устойчивости к антибиотикам у хламидомонады, стали получать мутации устойчивости к антибиотикам и у дрожжей. Целый ряд таких мутантов - также оказался цитоплазматическим. При скрещивании, например, эритромицинчувствительных с эритромицинустойчивыми ERs х ERr, все потомство было эритромицинчувствительным Ers (т.е. таким же, как и дикий тип) и не происходило никакого расщепления. Такой же результат был продемонстрирован и с мутантами устойчивости к другим антибиотикам. Однако, если сразу после образования зиготы отбирать почки, то среди них можно найти и мутантные фенотипы.

При дигибридном скрещивании, т.е. при скрещивании двух цитоплазматических мутантов, чувствительных к разным антибиотикам, например устойчивых к хлорамфениколу, но чувствительных к эритромицину с чувствительными к хлорамфениколу, но устойчивыми к эритромицину CrERs х CsERr, в потомстве преобладал фенотип только одного из родителей -- CrERs. Вместе с тем, при отборе из почек сразу после оплодотворения были обнаружены не только родительские классы фенотипов, но и рекомбинанты: CrERr и CsERs, т.е. чувствительные или устойчивые к обоим антибиотикам. Наличие рекомбинантов впервые показало, что и митохондриальные гены могут рекомбинировать так же, как и ядерные. Вместе с тем, в отличие от экспериментов по рекомбинации пластидных генов у хламидомонады, у дрожжей была обнаружена полярность рекомбинации, т.е. неравное количество рекомбинантных фенотипов в зависимости от направления скрещивания. Полярность рекомбинации была объяснена как наличие специального генетического фактора пола в геноме митохондрий. Этот фактор был обозначен как щ+ и щ-. Родительская форма, имеющий фактор щ+, т.е. женский родитель, обеспечивает преимущественную передачу (более высокую частоту передачи) своих маркеров. При скрещивании однополых по этому митохондриальному фактору родителей полярности рекомбинации не наблюдается и получается равное число рекомбинантов. Сам половой фактор митохондрий наследуется независимо от пола организма.

В действительности имеется ли пол у органелл цитоплазмы -- митохондрий в общепринятом смысле? Можно считать, что имеется, если мы считаем, что у кишечной палочки он есть.

Но главное заключалось в том, что при помощи множества полученных мутаций и обнаружения рекомбинации митохондриальных генов стало возможным их картирование.

В экспериментах по скрещиванию мутаций типа petite с мутациями устойчивости к антибиотикам было выяснено, что, по крайней мере, все супрессивные мутации petite в скрещиваниях утрачивают гены устойчивости к антибиотикам. Как было выяснено, это происходит потому, что супрессивные petite имеют обширные области поражения митохондриальной ДНК, и в этом случае ожидать рекомбинации просто невозможно. При индукции мутаций дыхательной недостаточности у мутантов с устойчивостью к тем или иным антибиотикам оказывалось, что иногда маркеры устойчивости утрачивались. При получении мутантов с дыхательной недостаточностью, используя в качестве исходной формы мутантов с двойной устойчивостью к антибиотикам, у полученных дефектных по дыханию мутантов могли быть потеряны оба маркера устойчивости или только один из них. Это свидетельствовало о том, что мутанты с дыхательной недостаточностью представляют собой ту или иную степень делетирования митохондриальной ДНК, и, следовательно, это также можно было использовать для картирования генома митохондрий.

У нейроспоры в 1952 г. К. Митчелом был обнаружен первый медленно растущий мутант, названный впоследствии MI-1 (сокращение от английского «материнское наследование» -- maternal inheritance). Наследование этой мутации происходило в зависимости от направления скрещивания, и все потомство было таким же по фенотипу, как и материнская форма. Вероятно, это происходит потому, что при оплодотворении мужская гамета у нейроспоры не привносит цитоплазмы. На связь этой спонтанно возникшей мутации с митохондриями указывало не только материнское наследование и различия в реципрокных скрещиваниях, но и то, что у них отсутствовали цитохромы a и b в системе переноса электронов.

Впоследствии были получены и другие медленно растущие штаммы у нейроспоры, связанные с дыхательной недостаточностью митохондрий. Некоторые из них, например, мутанты MI-3 и MI-4, как оказалось, наследовались так же, как и мутант MI-1, в то время как другая часть, например, мутанты С115 и С117 проявляли обычное менделевское моногибридное наследование. Это напоминает и о других аналогичных случаях, когда фенотип органелл, и хлоропластов, и митохондрий изменяется при возникновении как ядерных, так и цитоплазматических мутаций, что свидетельствует, что и цитоплазматические и ядерные генетические системы совместно контролируют их функции.

В дальнейшем было обнаружено несколько генов супрессоров, введение которых восстанавливало скорость роста у медленно растущих мутантов. Интересно отметить, что каждый из этих супрессоров восстанавливал скорость роста только у одного из мутантов. Например, ген супрессор, названный f, восстанавливал скорость роста у цитоплазматичкого мутанта MI-1, но не у другого цитоплазматического мутанта MI-3 или MI-4, и не у ядерных мутантов С115 и С117. Аналогичным образом действовали и другие супрессоры. Если через множество поколений путем скрещиваний вывести гены супрессоры из грибов, то мутантный цитоплазматический фенотип снова проявится. Аналогичное взаимодействие ядерных и цитоплазматических генов можно наблюдать и у высших растений, например, при наследовании признака мужской стерильности у многих растений.

При скрещивании ядерных и цитоплазматических медленно растущих мутантов между собой было показано независимое наследование ядерных и цитоплазматических генов.

Например, при скрещивании дикий тип х (MI-1 х С115) потомство F₁ (MI-1 х С115) было фенотипически однородным -- все особи были медленно растущими, а потомство возвратных или анализирующих скрещиваний дикий тип х (MI-1 х С115) уже не содержало мутаций MI-1 и расщеплялось по ядерному гену С-115 в соотношении 1:1.

Скрещивание цитоплазматических мутантов между собой не давало каких-то новых результатов, так как цитоплазматические мутанты, по крайней мере, у нейроспоры при половом воспроизведении демонстрируют строго материнское наследование. Между тем разные цитоплазматические мутанты, хотя и обладали в принципе одинаковым фенотипом -- замедленным ростом -- фенотипические различия между ними все же можно было выявлять, так как они обладали разной степенью замедления этого роста. Однако строгое материнское наследование при половом воспроизведении не позволяло объединить в цитогету (цитоплазматическую гетерозиготу) две цитоплазматические мутации, что делало невозможным рекомбинации цитоплазматических генов и, следовательно, их картирование.

Выход из этого положения был найден при помощи слияния гифов нейроспоры, что позволило соединять в одной клетке различные как ядерные, так и неядерные геномы.

При создании различных цитогет были получены следующие результаты:

MI-1 / дикий тип -- все потомство только дикого типа;

MI-3 / дикий тип -- часть потомства дикого типа, а другая часть растет со скоростью, свойственной мутанту MI-3;

MI-1 / MI-З -- большая часть потомства с фенотипом MI-3 и небольшая часть потомства с фенотипом MI-1;

MI-1 / MI-4 -- первоначально фенотип, свойственный дикому типу, а затем расщепление на фенотипы MI-1 и MI-4.

Таким образом, в последнем случае была обнаружена комплементация цитоплазматических мутаций, что свидетельствует, что эти мутации произошли в разных участках митохондриального генома.

В дальнейшем были получены и другие цитоплазматические мутации нейроспоры. Метод слияния гиф и получения при этом цитогет позволял надеяться на получение различных рекомбинантов и последующего построения генетической карты нейроспоры. Однако этому воспрепятствовало то обстоятельство, что у нейроспоры не было получено большого разнообразия цитоплазматических мутаций такого, как у хламидомонады или дрожжей.

Впоследствии различные нехромосомные мутации, полученные у нейроспоры, исследовали при помощи методов молекулярной биологии, и их удалось связать с митохондриальным геномом.

У другого гриба подоспоры была обнаружена мутация, вызывающая феномен преждевременного старения. У мутантов постепенно снижалась жизнеспособность культуры при пересеве. При реципрокных скрещиваниях был выяснен материнский характер наследования феномена старения. Вместе с тем, материнское наследование было неполным. Передача признака осуществляется как половым путем, так и путем соединения мицелиев. Наличие расщепления, хотя и нерегулярного, указывает на корпускулярную природу наследования признака. Было проведено достаточно много исследований, которые позволили показать, что это неинфекционный агент, а митохондриальный ген. Хотя в настоящее время нет полных молекулярных данных, уже ясно, что это также мутации митохондриального генома. Наличие гена старения в митохондриальном геноме породило массу спекуляций на геронтологические темы, и некоторые медики считают, что старение и у человека связано не только с изменением функций митохондрий, но и с изменением их генома.

Несмотря на спекулятивность идеи о связи геронтологических процессов у человека с изменениями митохондриальной ДНК, новые данные по изучению изменчивости генома митохондрий человека это подтверждают.

Издавна у человека было известно достаточно большое количество заболеваний, наследующихся по материнской линии -- от матери ко всем потомкам. Эти болезни достаточно редко распространены, вероятно, и в силу того, что передаются только женским полом. Кроме того, большие делеционные изменения в митохондриальной ДНК, конечно, чаще всего приводят либо к летальному исходу еще в эмбриональном периоде, либо к нарушению репродукционных функций. В любом случае они эффективно отметаются естественным отбором.

Формальный генетический подход, который был достаточно хорошо применен для исследования цитоплазматических генов у модельных объектов (хламидомонада, дрожжи и др.), не был столь успешным для анализа цитоплазматически наследуемых признаков у человека и поэтому самое большее, что удалось выяснить из анализа родословных, это то, что такие наследственные болезни все же существуют.

Кроме хорошо известного синдрома -- атрофии зрительного нерва (болезнь Лебера или наследственная оптическая невропатия) существуют и другие болезни, наследующиеся по внеядерному типу. Эти болезни связаны, прежде всего, с нарушением функционирования мышц, работы мозга, сердца, эндокринных систем и связаны с недостаточно активной функцией митохондрий в тех или других органах. Существует даже митохондриально обусловленная форма диабета.

Только с помощью молекулярных методов удалось выявить природу этих болезней. Исследование различных семей с болезнью Лебера показало, что в разных случаях имеют место мутации в различных участках митохондриального генома.

Чаще всего семьи с наследственными цитоплазматическими болезнями проявляют гетероплазмию и матери имеют как нормальные, так и мутантные митохондриальные ДНК, в результате чего выщепляются потомки как с мутантным, так и нормальным плазматипом.

Связь между возрастом человека и митохондриальной ДНК также была показана при помощи методов молекулярной биологии. Исследования митохондриальной ДНК у людей различного возраста показали, что у пожилых людей быстро увеличивается процент мутантной митохондриальной ДНК в клетках мозга и сердца. Кроме того, исследования некоторых наследственных синдромов показывают, что обладающие ими пациенты имеют и повышенную частоту мутаций митохондриальной ДНК, что возможно и является причиной сокращения продолжительности жизни.

Кроме мутаций митохондриального генома, приводящих к серьезным патологиям организма, было обнаружено множество, в достаточной степени, нейтральных мутаций митохондриального генома среди различных популяций рас человека. Эти обширные исследования тысяч людей со всех континентов помогают восстанавливать происхождение и эволюцию человека. Сравнивая митохондриальную ДНК человека с ДНК человекообразных обезьян (горилла, орангутанг, шимпанзе) и исходя из того, что дивергенция человека и человекообразных приматов произошла примерно 13 миллионов лет назад, можно рассчитать количество лет, необходимых для изменения одной пары оснований. В дальнейшем, сравнивая дивергенцию митохондриальной ДНК у различных человеческих рас, можно было определить место рождения первой женщины, можно сказать Евы, и время расселения человека по различным континентам (рис. 3).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3 Расселение человека, согласно данным Д. Уоллеса, по анализу изменчивости митохондриальных ДНК. Цифрами обозначено время заселения данной территории в тысячах лет тому назад

Поскольку самая изменчивая митохондриальная ДНК была обнаружены среди аборигенов Африки, то можно предположить, что «праматерью» человеческого рода была африканская женщина. Произошло это приблизительно 100 000 лет тому назад. Приблизительно 70 000 лет тому назад человек начал заселять центральную Азию через Ближний Восток и Саудовскую Аравию, чуть позже Юго-Восточную Азию, Индонезию и Австралию. Около 50 000 лет тому назад люди появились в Европе. Эти же данные показали, что заселение Американского континента происходило в два этапа: сначала 30 000 лет тому назад через Беренгию (существовавшую в то время сушу, связывающую Америку и Азию) с Севера до самого юга Американского континента, а затем 8 000 лет тому назад также из Северо-Восточной Азии на восток Северной Америки. Переселенцы на островах Тихого океана появились сравнительно недавно -- несколько тысяч лет тому назад.

Следует отметить, что эти данные, основанные на сравнительном анализе митохондриальной ДНК, достаточно хорошо согласуются как с археологическими данными, так и с данными лингвистического анализа.

Использование именно митохондриальной ДНК для анализа истории человечества стало возможным потому, что митохондриальный геном имеет сравнительно небольшой размер, наследуется исключительно по материнской линии и в отличие от ядерных генов не рекомбинирует.

Геном митохондрий

Митохондрии содержатся не только в клетках растений, но также и в клетках животных и грибов. Эти органеллы более универсальны, чем пластиды. Впервые ДНК в митохондриях были открыты в 1963 году (М. Наас) сразу же после открытия ДНК в пластидах. Несмотря на сходство функций и структуры митохондрий всех трех царств эукариот, их генетическая организация достаточно сильно различается, поэтому обычно организацию геномов митохондрий у этих царств рассматривают отдельно, выявляя при этом общие черты организации генома.

Физико-химический состав ДНК митохондрий у различных царств различен. У растений он довольно постоянен: от 45 до 47 % ДНК состоит из ГЦ-пар. У животных и грибов -- варьирует более значительно: от 21 до 50 % ГЦ-пар.

У многоклеточных животных размеры генома митохондрий колеблются от 14.5 до 19.5 т.п.н. Практически, это всегда одна кольцевая молекула ДНК. Например, ДНК митохондрий человека -- кольцевая молекула размером 16 569 пар нуклеотидов. Этот размер можно выразить и в других единицах -- в виде молекулярной массы -- 10⁶ дальтон или в виде длины контура молекулы -- 5 мкм. Первичная структура этой молекулы полностью определена. В митохондриях содержится собственный аппарат трансляции -- т.е. собственные рибосомы 70S, похожие на хлоропластные или прокариотические и состоящие из двух субъединиц, собственные матричные РНК, необходимые ферменты и белковые факторы. В их геноме закодированы 12S- и 16S - рибосомальные РНК, а так же 22 транспортные РНК. Кроме того, митохондриальная ДНК кодирует 13 полипептидов, из которых 12 идентифицированы. Все кодирующие последовательности расположены прямо друг за другом. В крайнем случае, они разделены лишь несколькими нуклеотидами. Некодирующие последовательности, т.е. интроны отсутствуют. Вслед за кодирующей последовательностью почти всегда находится ген транспортной РНК. Например, порядок таков: транспортная РНК фенилаланина -- ген 12S рибосомальной РНК -- транспортная РНК валина -- ген 16S рибосомальной РНК -- транспортная РНК лейцина и т.д. Такой порядок характерен не только для митохондрий человека, он очень консервативен и характерен для всех животных: дрозофилы, быка, мыши, птиц, рептилий и др. животных.

Большая часть генов расположена в тяжелой цепи, в легкой цепи только гены восьми транспортных РНК и один структурный ген. Таким образом, в отличие от всех других геномов, в геноме митохондрий обе цепи смысловые.

Хотя порядок генов у митохондрий животных и одинаков, выяснено, что сами гены обладают различной консервативностью. Наиболее вариабельна последовательность нуклеотидов участка начала репликации и ряд структурных генов. Наиболее консервативные последовательности расположены в генах рибосомальных РНК и некоторых структурных генах, в том числе в кодирующей последовательности АТФ-азы.

Следует отметить, что универсальность генетического кода нарушена в геноме митохондрий. Например, митохондрии человека используют триплет AUA в качестве кодона для метионина, а не для изолейцина, как у всех, а триплет UGA, используемый в стандартном генетическом словаре как терминирующий кодон, у митохондрий кодирует триптофан.

В целом митохондриальная ДНК человека выглядит так же, как и других млекопитающих: мыши и быка. Несмотря на то, что это далеко не близкие виды -- размеры их митохондриальных ДНК довольно близки между собой: 16 569; 16 295; и 16 338 пар оснований, соответственно. Гены транспортной РНК разделяют некоторые смысловые гены. Наиболее важные из структурных генов -- гены цитохромоксидазы, NADH-дегидрогеназы, цитохром-С оксидоредуктазы и АТФ-синтетазы (рис. 4).

На карте митохондриального генома человека, кроме генов показано и пять хорошо известных болезней человека, наследующихся по материнской линии и вызванных мутациями в митохондриальном геноме.

Так, например, болезнь Лебера -- атрофия зрительного нерва -- вызвана мутацией в гене NADH дегидрогеназы. Эта же болезнь может быть вызвана и мутацией в гене цитохрома b и других локусов. Всего известно нарушение четырех локусов, способных вызвать тот же мутантный фенотип. Кроме того, на этой же карте показано еще четыре болезни, связанные с дефектами мозга, мышц, сердца, почек и печени. Все эти болезни наследуются по материнской линии, и если мать имеет не только дефектные, но и нормальные митохондриальные ДНК и митохондрии, то, происходит сортировка мутантных и нормальных органелл, и потомство может иметь и те, и другие органеллы в различных пропорциях, и мы можем наблюдать также и соматическое расщепление, когда отдельные части тела не будут иметь этих дефектов.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4 Структура митохондриального генома млекопитающих, основанная на полном сиквенсе митохондриальной ДНК человека, мыши и быка

Таким образом, небольшой по размерам митохондриальный геном животных может кодировать чрезвычайно важные функции организма и в значительной степени определять его нормальное развитие.

Так же, как и геном пластид, геном митохондрий кодирует только часть митохондриальных полипептидов (табл. 1) и наблюдается феномен двойного кодирования. Например, часть субъединиц АТФ-азного комплекса кодируется ядром, в то время как другая часть -- геномом митохондрий. Большая часть генов, кодирующих рибосомальные миохондриальные РНК и белки, а также ферменты транскрипции и трансляции, кодируется ядром клетки.



Таблица 1

Гены митохондриальных ДНК животных

Компоненты митохондрий	Гены
Рибосомальные РНК	rns(16S), rnl(12S)
Транспортные РНК	22
Цитохром b (комплекс III)	cyt b
Цитохром с оксидаза (комплекс IV)	cox 1, cox 2, coxd 3
АТФ-синтаза	atp6, atp8
Дыхательная цепь NADHдегидрогеназы	Nd1, nd2, nd3, nd4l, nd4, nd5, nd6

митохондрия геном нейроспора мезофилл

Характерные черты организации и экспрессии митохондриального генома животных:

1. компактное расположение генов на мтДНК;

отсутствие в генах интронов;

3. отсутствие некодирующих участков в мтДНК, кроме областей ORI;

4. расположение генов тРНК между другими генами;

5. высокое сходство в размерах генома и в расположении генов у различных видов;

6. наличие одного ORI для каждой нити мтДНК;

7. симметричная транскрипция обеих нитей;

8. наличие одной, в принципе, области инициации транскрипции для каждой нити ДНК;

9. отсутствие 5^/- и 3^/- концевых некодирующих последовательностей в мРНК;

10. созревание мРНК в результате расщепления первичного транскрипта по последовательностям тРНК.

У грибов размеры генома митохондрий в среднем значительно больше и колеблются от 17,3 до 101 т.п.н. Причем в дополнении к основной, как правило, кольцевой молекуле ДНК обнаруживают и от одной до 4-х плазмидоподобных кольцевых или линейных молекул размером от 1 до 13 т.п.н. Размеры митохондриального генома у дрожжей варьируют не только между различными видами, но и даже между различными штаммами. Основные причины существенных различий в геноме митохондрий у грибов заключаются в наличии - отсутствии интронов. У разных видов дрожжей, например, размер митохондриальной ДНК колеблется от 57 до 85 т.п.н.

Наличие интронов и молекул митохондриальной ДНК различного размерного класса является наиболее характерной чертой, отличающей митохондрии грибов от митохондрий животных. Интроны разрывают многие последовательности -- гены рибосомальной РНК, гены некоторых структурных белков, кодирующих митохондриальные ферменты. Наличие большинства интронов не является обязательным для нормального функционирования митохондрий. Искусственно сконструированы штаммы дрожжей, полностью лишенные митохондриальных интронов.

Многие интроны митохондриальной ДНК дрожжей содержат открытые рамки считывания, которые кодируют мутуразы, участвующие в сплайсинге, тогда как другие интроны содержат кодирующие последовательности эндонуклеаз и даже обратных транскиптаз.

Все гены, обнаруженные в митохондриальной ДНК животных, присутствуют и у грибов. Кроме того, у грибов обнаружены и другие гены: у них большее число генов тРНК, обнаружены гены 6-й, 8-й и 9-й субъединиц АТФ-азного комплекса, ряд новых структурных генов и ряд генов с неизвестной функцией (табл. 2).

Таблица 2

Гены митохондриальных ДНК дрожжей

Компоненты митохондрий	Гены
Рибосомальные РНК	rns(21S), rnl(15S)
Рибосомальные белки: малая субъединица	var1
Транспортные РНК	24
Цитохром b (комплекс III)	сob (или cyb)
Цитохром с оксидаза (комплекс IV)	cox 1, cox 2, coxd 3
АТФ-синтаза	atp6, atp8, atp9
Интрон-кодируемые off: РНК-матуразы Эндонуклеазы Белки, подобные обратной трансриптазе	mat ? aI1, aI2
Неидентифицированные рамки считывания	3

В митохондриальной ДНК дрожжей обнаружено только 2 гена рибосомальной РНК и только 1 ген рибосомальных белков. Этот белок расположен в малой субъединице рибосомы. Ген рибосомального белка достаточно вариабелен по размерам даже у разных штаммов, за что и получил название вариабельного (Var l). Остальные белки и РНК митохондриальных рибосом кодируются ядерными генами. 24 гена транспортной РНК обеспечивают транспорт всех аминокислот к месту синтеза белка и только одна транспортная РНК, транспортирующая лизин, импортируется из цитоплазмы и кодируется ядром. Все транспортные РНК митохондрий дрожжей кодируются одной и той же нитью ДНК и только одна из них -- противоположной нитью. Ни один из генов транспортной ДНК не имеет интронов. Гены белков цитохрома b и гены белков цитохрома С могут иметь множество интронов -- от 5 до 9.

Из приведенных данных следует, что кодируемых митохондриальным геномом дрожжей структурных белков явно недостаточно для функционирования этих органелл и большая часть из них кодируется ядерным геномом.

Характерные черты организации и экспрессии митохондриального генома грибов:

1. значительное разнообразие в наборах и расположении митохондриальных генов у различных видов;

большое разнообразие способов организации генетического материала - от компактной организации генома до свободного распределения генов по мтДНК при протяжённых некодирующих последовательностях между генами;

3. мозаичное строение ряда генов;

4. значительные внутривидовые вариации размеров мтДНК, связанные с наличием "необязательных" интронов;

5. способность отдельных сегментов мтДНК к выщеплению и амплификации с образованием дефектного митохондриального генома;

6. наличие одного или нескольких ORI, в каждом из которых репликация инициируется двунаправлено;

7. расположение всех митохондриальных генов на одной нити мтДНК и асимметричная транскрипция мтДНК;

8.множественность транскрипционных единиц мтДНК;

9. разнообразие сигналов процессинга первичных транскриптов, в качестве которых могут использоваться и тРНК, и олигонуклеотидные блоки другого типа - в зависимости от вида;

10. в большинстве случаев мРНК содержат протяжённые концевые некодирующие последовательности.

Наиболее сложная организация митохондриального генома у высших растений. У них митохондриальный геном представляет собой набор суперскрученных двуцепочечных кольцевых и/или линейных молекул. Все последовательности митохондриального генома могут быть организованы в одну крупную кольцевую «хромосому», а наблюдаемые различные размерные классы митохондриальных ДНК, скорее всего, являются результатом рекомбинационных процессов. По крайней мере, на шпинате, видах двух родов Brassica и Raphanus, сахарной свекле и пшенице было показано, что причина такой диспергированности митохондриального генома заключается в рекомбинации гомологичных участков митохондриальной ДНК. Благодаря наличию прямо ориентированных двух-трех семейств повторов размером от 1 до 14 т.п.н., молекулы митохондриальной ДНК способны к активным меж- и внутригеномным перестройкам. В результате таких перестроек митохондриальная ДНК может присутствовать в виде молекул различного размерного класса.

Так, например, у крестоцветного Brassica campestris митохондриальная ДНК присутствует в виде кольцевых молекул трех типов. Первый тип содержит полный геном -- 218 т.п.н., второй - 135 и третий -- 83 т.п.н. Субгеномные кольца образуются в результате рекомбинации геномных колец, имеющих пару прямых повторов длиной 2 т.п.н.

У пшеницы размер митохондриального генома значительно больше -- 430 т.п.н., и имеется более 10 прямых рекомбинационных повторов, в результате при электронно-микроскопическом наблюдении удается увидеть множество колец различного размера, но никто не наблюдал одну большую кольцевую молекулу, возможно, в этом состоянии митохондриальный геном пшеницы никогда и не присутствует. У мха маршанции и другого крестоцветного Brassica hirta прямые рекомбинационные повторы отсутствуют и, возможно, именно поэтому митохондриальная ДНК находиться в виде кольцевых молекул одного размерного класса. Однако для митохондриальной ДНК высших растений это скорее исключение, чем правило. У большинства высших растений в митохондриальном геноме присутствуют как рекомбинационные повторы, так и молекулы митохондриальной ДНК различного размерного класса.

Количество молекул одного размерного класса может различаться очень значительно в различных тканях растения, в зависимости от состояния растений и условий окружающей среды. Отмечено изменение численных соотношений молекул митохондриальной ДНК разного размерного класса при культивировании растений in vivo и in vitro. Возможно, изменение численных отношений между молекулами различных размерных классов отражает адаптивность растений путем повышенной амплификации нужных генов.

Кроме того, в митохондриальной геноме могут присутствовать и плазмиды как линейные, так и кольцевые, как с ДНК-ми, так и РНК-ми последовательностями, размером от 1 до 30 т.п.н. Митохондриальные плазмиды, вероятно, произошли от других клеточных геномов или даже других организмов. Иногда их наличие или отсутствие удается связать с цитоплазматической мужской стерильностью растений, но, правда, не всегда. Плазмиды у некоторых видов присутствуют, а стерильности не наблюдается. По крайней мере, в одном случае достаточно четко продемонстрировано, что в митохондриях линий с так называемым S-типом стерильности кукурузы обнаружена корреляция между присутствием плазмидоподобной митохондриальной ДНК и проявлением феномена цитоплазматической мужской стерильности. Была отмечена способность митохондриальных плазмид встраиваться, как в геном митохондрий, так и в хромосомы ядра. Однако, в других случаях присутствие плазмидной ДНК не всегда вызывает стерильность пыльцы.

Размер митохондриального генома растений наиболее вариабелен -- от 200 до 2500 т.п.н. Размер митохондриального генома высших растений больше, чем размер их хлоропластного генома.

Значительное варьирование размеров митохондриального генома является второй особенностью митохондриального генома растений. Геном не только очень велик, но и может быть различным, даже у близкородственных видов, причем в одних случаях может наблюдаться низкая вариабельность -- виды рода Brassica, в других -- очень большая. Самая высокая вариабельность размеров наблюдается у тыквенных. В пределах этого семейства размер митохондриального генома наиболее изменчив -- от 330 т.п.н. у арбуза до 2500 т.п.н. у дыни. Поэтому доля митохондриальной ДНК в общем объеме генома растений также может значительно изменяться -- порядка 1 % у большинства растений, до 15 % в клетках гипокотиля дыни.

Наличие у митохондриальных геномов больших размеров пытаются объяснить различными причинами.

Наличие дополнительных генов или особых последовательностей, необходимых для функционирования митохондрий.

Присутствие ДНК, которая используется растением, но не в качестве кодирующей, а какой-то другой функции.

ДНК, которая не используется для функционирования митохондрий, так называемая «эгоистичная» ДНК.

По-видимому, существует еще одна возможность для увеличения размеров митохондриального генома -- это последовательности, гомологичные ядерной и хлоропластной ДНК. Последовательности, гомологичные ядерной ДНК, например, у арабидопсис составляют до 5 % митохондриального генома. Первоначально последовательность хлоропластного генома, инкорпорированная в митохондриальный, была обнаружена у кукурузы. Она включала участок около 14 т.п.н., содержащий измененные хлоропластные гены 16S-рибосомальной РНК и участок большой субъединицы РДФК/О. Впоследствии хлоропластные вставки были обнаружены в митохондриальном геноме многих видов высших растений. Обычно, они составляют 1 -- 2 % от митохондриальных последовательностей и включают три главные последовательности.

Последовательность длиной 12 т.п.о. из обратного повтора хлоропластной ДНК. Она содержит последовательности для 3' экзона четырех транспортных РНК и последовательность 16 S рибосомальной РНК.

Последовательность длиной от 1,9 до 2,7 т.п.н., которая полностью кодирует большую субъединицу РБФК/О.

Последовательность длиной не более 2 т.п.о. В хлоропластом геноме этот участок кодирует 3' -- конец 23S-pибоcoмальной РНК, 4,5S- и 5S-pPHK, а также три транспортные РНК. Из всех последовательностей хлоропластного генома, которые присутствуют в митохондриальном геноме растений, только последовательности транспортной РНК действительно транскрибируются.

Поскольку у многих видов растений в митохондриальном геноме присутствуют одни и те же хлоропластные последовательности, можно предположить, что они имеют какое-либо функциональное значение. В то же время их роль, механизм переноса и время этого переноса остаются неизвестными. Произошел ли этот перенос в отдаленное в эволюции время становления эукариотической клетки или же наличие хлоропластных вставок в митохондриальном геноме свидетельствует о том, что это нормальный процесс обмена информации между органеллами, происходящий и сейчас, либо он происходит периодически в относительно недавнем эволюционном времени становления конкретных видов и родов растений?

Кроме того, часть последовательностей митохондриального генома представляет собой последовательности, гомологичные вирусным.

Для установления числа генов в геноме митохондрий растений, которые действительно функционируют, рядом исследователей было определено количество продуктов трансляции. Было показано, что число обнаруживаемых белковых полос было одинаковым даже для растений с 10-кратными различиями по величине генома. Хотя использованные методы и не дают прямого ответа на вопрос об общем числе генов митохондриального генома, тем не менее, интересно, что одно и то же число продуктов трансляции было выявлено у анализируемых видов покрытосеменных и было близко к числу генов, кодирующих белки у митохондрий животных и дрожжей.

Впервые полная нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК у растений была определена в 1986 г. у одного вида -- маршанции (Marchantia polymorpha), а позже у арабидопсиса и у нескольких видов водорослей.

Молекула митохондриальной ДНК у маршанции имеет размер 186 608 п.н. Она кодирует гены 3 рРНК, 29 генов для 27 тРНК и 30 генов известных функциональных белков (16 рибосомальных белков, 3 субъединицы цитохром С оксидазы, цитохрома b, 4 субъединицы АТФ-синтетазы и 9 субъединиц НАДН-дегидрогеназы). Геном также содержит 32 неидентифицированные открытые рамки считывания. Кроме того, обнаружено 32 интрона, расположенных в 16 генах. У разных растений количество генов того или иного комплекса может варьировать, поскольку один или более генов этого комплекса могут быть перенесены в ядро. Среди неидентифицированных генов, по крайней мере, 10 постоянно встречаются практически у всех видов растений, что свидетельствует о важности их функций.

Число митохондриальных генов, кодирующих транспортные РНК митохондрий растений, в значительной степени изменчиво. У многих видов собственных митохондриальных транспортных РНК явно недостаточно, и поэтому они экспортируются из цитоплазмы (кодируются ядром или пластидным геномом). Так, например, у арабидопсиса 12 транспортных РНК имеют митохондриальное кодирование, 6 -- хлоропластное и 13 -- ядерное; у маршанции 29 -- митохондриальное и 2 -- ядерное, и ни одна из транспортных РНК не имеет хлоропластного кодирования; у картофеля 25 -- митохондриальное, 5 -- хлоропластное и 11 -- ядерное; у пшеницы, 9 -- митохондриальное, 6 -- хлоропластное и 3 -- ядерное (табл. 3).

В отличие от митохондриальной ДНК животных и хлоропластных генов, гены митохондриальной ДНК растений дисперсно распределены в геноме. Это касается как генов, кодирующих транспортные РНК, так и генов, кодирующих белки.

Таблица 3

Природа митохондриальных транспортных РНК у растений

	Количество транспортных РНК, кодируемых геномами
Вид		органелл
	митохондрий	хлоропластов	ядра
Арабидопсис	12	6	13
Маршанция	29	-	2
Картофель	5	5	11
Пшеница	9	6	>3
Бобы	Не определено	Не определено	>8
Подсолнечник	11	6	Не определено
Петуния	12	5	Не определено
Кукуруза	10	6	Не определено

Как и геном митохондрий грибов, геном митохондрий растений имеет интроны, которых не имеют геномы митохондрий животных.

У некоторых видов ряд генов в геноме продублирован. Так, у кукурузы и кормовых бобов гены рРНК не повторены, а у пшеницы они повторены несколько раз. Гены, кодирующие белки митохондрий, также могут быть повторены в их геноме.

Естественно, что митохондрии так же, как и хлоропласты, содержат гораздо больше белков-ферментов, чем их геном генов. И, следовательно, большинство белков контролируются ядерным геномом, собираются в цитоплазме на цитоплазматических, а не на митохондриальных рибосомах и транспортируются в митохондриальные мембраны.

Таким образом, митохондриальный геном растений представляет собой крайне изменчивую по структуре, но достаточно стабильную по числу генов систему. В отличие от компактного генома хлоропластов, в митохондриальном геноме растений гены составляют менее 20 % генома. Увеличение генома митохондрий по сравнению с грибами или животными вызвано наличием интронов, различных повторяющихся последовательностей, вставок из генома хлоропластов, ядра и вирусов. Функции примерно 50 % митохондриального генома растений пока не выяснены. Кроме того, что многие структурные гены, контролирующие функцию митохондрий, находятся в ядре, там же находятся и многие гены, контролирующие процессы транскрипции, процессинга, трансляции митохондриальных генов. Следовательно, митохондрии являются даже менее автономными органеллами, чем пластиды.



Литература

Основная:

1. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др. Физиология растений. Учебник для студ. Вузов. М.: Академия. 2005. 640 с.

Давыденко О.Г. Нехромосомная наследственность. Минск: БГУ. 2001. 189 с.

3. Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Минск: Техналогия. 2003. 494 с.

4. Иванов В.И. и др. Генетика. М.: Академкнига. 2006. 638 с.

5. Жимулев И.С. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сиб. унив. 2007. 479 с.

6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир. 1998. Т. 1-

7. Ченцов Ю. С. Введение в клеточную биологию. М.: Академкнига. 2004. 495 с.

Дополнительная:

1. Даниленко Н.Г. РНК-редактирование: генетическая информация корректируется после транскрипции // Генетика. 2001. Т. 37. №3. С. 294-316.

Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. М.: Мир, 1983.

3. Одинцова М. С., Юрина Н. П. Геном митохондрий протистов // Генетика. 200 Т. 38. №6. С. 773-778.

4. Одинцова М. С., Юрина Н. П. Геном пластид высших растений и водорослей: структура и функции // Мол. Биол. 2003. Т. 37. № 5. С. 768-783.

5. Юрина Н. П., Одинцова М. С. Общие черты организации генома хлоропластов. Сравнение с геномами про- и эукариот // Мол. Биол. 199 Т. 36. № 4. С. 757-771.

6. Юрина Н. П., Одинцова М. С. Сравнительная характеристика структурной организации геномов хлоропластов и митохондрий растений// Генетика. 1998. Т. 34. №1. С. 5-2.

Размещено на Allbest.ru

...