Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів Hansenula polymorpha з метою конструювання покращених продуцентів етанолу

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Домінуюче положення у якості поновлювального біопалива займає етанол, який може використовуватися у звичайних двигунах внутрішнього згоряння як бензино-етанольна суміш або у чистому вигляді у спеціалізованих двигунах. Суміші мають підвищене октанове число та підвищену летючість. Наявність у бензині додаткової кисневмісної сполуки, етанолу, дозволяє досягти практично повного окиснення в двигунах чадного газу до вуглекислого, а закису і окису азоту до двоокису азоту, що суттєво зменшує токсичність вихлопних газів. Однак існуючі кількості вихідної сировини не забезпечують зростаючих потреб у біоетанолі. Найбільш оптимальним та перспективним є отримання біопаливного етанолу з поновлювальної та дешевої сировини, особливо з гідролізатів лігноцелюлозних відходів сільського господарства та деревообробної промисловості. Основними цукрами гідролізатів лігноцелюлозних відходів є ксилоза та целобіоза, які не ферментуються пекарськими дріжджами. Значна кількість робіт присвячена спробам сконструювати штами пекарських дріжджів, здатні до алкогольної ферментації ксилози та целобіози, однак значного успіху в цьому напрямку поки що не досягнуто (van Maris et al., 2006). Ведуться роботи щодо виявлення інших видів мікроорганізмів, що є потенційними продуцентами етанолу з гідролізатів лігноцелюлозних відходів. Одним з найкращих претендентів є неконвенційні дріжджі Pichia stipitis, однак, ефективність ферментації ксилози і целобіози природними штамами є недостатньою для забезпечення економічно вигідного промислового процесу (Jeffries et al., 2007). Тому значні зусилля спрямовані на покращення природних штамів цього виду дріжджів за допомогою сучасних методів метаболічної інженерії.

Традиційно при ферментації лігноцелюлози до етанолу на першому етапі здійснюють вивільнення моно - чи дисахаридів, обробляючи вихідну сировину ферментами целюлазами та геміцелюлазами. Цей процес отримав назву «сахарифікація» і проводиться при підвищеній температурі 45-50 С, оптимальній для роботи цих ферментів. Далі за допомогою мікроорганізмів цукри гідролізатів лігноцелюлози ферментуються до етанолу. Важливим є швидке перетворення вивільнених моно - чи дисахаридів до етанолу, адже вони інгібують активність гідролітичних ферментів. Для досягнення ефективного процесу ферментації цукрів лігноцелюлози до етанолу, цей процес слід проводити одночасно з процесом ензиматичного гідролізу лігноцелюлози (так звана одночасна сахарифікація і ферментація). Одночасне проведення процесів гідролізу та ферментації вимагає використання мікроорганізмів, які здатні до ферментації цукрів гідролізатів лігноцелюлози при підвищених температурах. До останнього часу такі дріжджі взагалі не були відомі. Нещодавно в Інституті біології клітини НАН України були виявлені термотолерантні дріжджі Hansenula polymorpha, що здатні активно ферментувати ксилозу при підвищеній температурі - 48 С (Ryabova et al., 2003). Однак ефективність ферментації ксилози у диких штамів цього виду поки що є недостатньою для використання H. polymorpha у промисловості. Однією з основних причин цього є неефективність перших етапів метаболізму ксилози, а саме перетворення цієї пентози до ксилулози, що лімітує процес ферментації в цілому. Модифікація генів, що кодують перші ферменти ксилозного метаболізму у поєднанні з іншими підходами, дозволить в майбутньому створити ефективні організми - продуценти етанолу з поновлювальної рослинної сировини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України за темами: «Конструювання штамів дріжджів, здатних до алкогольної ферментації лігноцелюлозних відходів сільського господарства та деревообробної промисловості» (№ держреєстрації 0104U007457, шифр теми 2.2.9.4, 03.2004-12.2004), «Розробка нових позитивних методів селекції суперпродуцентів етанолу з глюкози, ксилози та інших цукрів лігноцелюлози» (№ держреєстрації 0107U008200, шифр теми 09.09.14, 07.2007-12.2009), «Метаболічна інженерія пентозофосфатного шляху та транспорту глюкози і ксилози для конструювання штамів термотолерантних дріжджів, здатних до ефективної алкогольної ферментації основних цукрів рослинної сировини» (№ держреєстрації 0107U008201, шифр теми 09.09.15, 07.2007-12.2009). Окремі розділи дисертаційної роботи виконувалися у рамках індивідуального гранту DAAD A/07/71669 «Metabolic engineering of the initial stages of xylose catabolism of yeast Hansenula polymorpha for construction of efficient ethanol producers from lignocellulosics». Автор дисертаційної роботи є одним із виконавців вищеназваних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було отримання штамів термотолерантних дріжджів H. polymorpha з підвищеним рівнем алкогольної ферментації ксилози, шляхом модифікацій перших етапів метаболізму цієї пентози, її відновлення до ксиліту та окиснення до ксилулози. Відповідно до мети, були поставлені наступні завдання:

1. Сконструювати рекомбінантні штами дріжджів H. polymorpha з делеціями генів перших етапів метаболізму ксилози - XYL1 (кодує ксилозоредуктазу, КР), XYL2-А і XYL2-В (кодують ксилітолдегідрогенази, КДГ).

2. Надекспресувати гени xylA та XYL3 (кодують бактерійні ксилозоізомерази, КІ та гомологічну ксилулокіназу, КК, відповідно) у делеційних штамах H. polymorpha.

3. Сконструювати модифіковану форму КР зі зменшеною кофакторною спорідненістю до NADPН(H⁺).

4. Сконструювати рекомбінантні штами дріжджів з посиленою експресією генів, залучених у початкові етапи метаболізму ксилози (модифікований або нативний ген XYL1, гени XYL2 та XYL3).

5. Здійснити молекулярно-генетичний та біохімічний аналіз сконструйованих рекомбінантних штамів, визначити та порівняти рівні алкогольної ферментації ксилози.

Об'єкт дослідження. Об'єктом дослідження даної роботи є перші етапи метаболізму ксилози у термотолерантних дріжджів H. polymorpha.

Предмет дослідження. Предметом дослідження даної роботи є гени та відповідні білкові продукти, що залучені у початкових етапах метаболізму ксилози у дріжджів та бактерій (XYL1, кодує КР; XYL2, кодує КДГ; xylA, кодує КІ; XYL3, кодує КК).

Наукова новизна роботи. У результаті проведених досліджень вперше було надекспресовано гени xylA, що кодують КІ E. coli і Streptomyces coelicolor у термотолерантних дріжджів H. polymorpha. Сконструйовано рекомбінантний штам H. polymorpha з одночасною надекспресією генів xylA E. coli і XYL3 H. polymorpha, що характеризується підвищеним у 3,5-4 рази рівнем алкогольної ферментації ксилози при підвищеній температурі (48°С), порівняно з диким штамом. За допомогою сайт-специфічного мутагенезу було створено модифіковану форму КР, в якої лізин і аспарагін було замінено на аргінін і аспарагінову кислоту в амінокислотних положеннях 341 і 343, відповідно. В результаті модифікації спорідненість КР до NADPН(H⁺) зменшилась у 17 разів, порівняно з нативною формою фермента, тоді як спорідненість до NADH(H⁺) залишилась без змін. Одержано рекомбінантні штами H. polymorpha, які надекспресують нативну або модифіковану форму КР, КДГ і КК. Штам з посиленою експресією модифікованої форми КР та надекспресією нативних КДГ і КК характеризувався підвищеним у 7,4 рази рівнем алкогольної ферментації ксилози та зниженою у 5 разів кількістю нагромадженого ксиліту. Отримані результати мають важливе значення для розуміння особливостей генетичного контролю катаболізму ксилози в мікроорганізмів, фізіології H. рolymorpha, скерованого конструювання мутантів дріжджів зі змінами метаболізму цукрів та алкогольної ферментації. Дані роботи дають змогу порівняти перспективність різних підходів до метаболічної інженерії катаболізму цукрів у дріжджів і вибрати з них найоптимальніші.

Практичне значення роботи. В результаті проведеної роботи сконструйовано нові штами термотолерантних дріжджів H. polymorpha з суттєво підвищеним рівнем алкогольної ферментації ксилози. Створені рекомбінантні штами H. polymorpha при зброджуванні ксилози можуть використовуватись як вихідні на наступних етапах метаболічної інженерії для подальшого підвищення ефективності ферментації цієї пентози, а також бути основою для створення промислових продуцентів етанолу, здатних використовувати гідролізати лігноцелюлози. Опрацьовані у роботі підходи можуть бути використані для метаболічної інженерії інших практично важливих у штамів дріжджів.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом спільно з науковим керівником розроблено програму проведення досліджень, відібрано методи розв'язання поставлених завдань та самостійно, або в деяких випадках спільно з іншими працівниками, виконано викладені в роботі експерименти. Конструювання плазмід p19L2LRA і pEC здійснено Дмитруком К.В., конструювання плазміди pGLG61/EcXylA здійснено Іщук О.П., модифікацію КР проведено за участю Вороновського А.Я. Результати згаданих досліджень опубліковано у спільних публікаціях. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізовано наукову літературу за темою дослідження. Аналіз та обговорення планів та результатів досліджень, а також підготовку публікацій за темою дослідження проведено разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені у вигляді стендових та усних доповідей на наступних наукових конференціях: Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004), Міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Ханасаарі, Фінляндія, 2006), 2-му з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, Україна, 2007), ІХ з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. Н.І. Вавилова (м. Алушта, АР Крим, Україна, 2008), 12-му міжнародному дріжджовому конгресі (Київ, Україна, 2008), Міжнародній конференції «Досягнення клітинної біології і біотехнології» (Львів, Україна, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових виданнях та 7 тез доповідей у матеріалах конференцій, наукових з'їздів та конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, розділу, у якому викладено отримані результати та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 125 сторінках машинописного тексту. Вона містить 40 рисунків та 8 таблиць. Список використаної літератури охоплює 127 джерел.

Основний зміст

рекомбінантний штам дріжджі метаболізм

Матеріали та методи. У роботі використовували штами дріжджів Hansenula polymorpha генетичної лінії CBS4732 leu2-2 (Wickerham, 1951) і сконструйовані автором делеційні штами Dxyl1, Dxyl1Dxyl2-A, Dxyl1Dxyl2-ADxyl2-B. Дріжджові штами вирощували на багатому середовищі (YPD, 1% дріжджовий екстракт, 2% пептон, 1% глюкоза), або на стандартному мінімальному середовищі (YNB, 0,67% Yeast Nitrogen Base («Difco», США), 0,5% сульфат амонію). Джерела вуглецю додавались у концентрації 2%, якщо не вказано інакше. Методи культивування бактерій E. сoli, ампліфікації та виділення плазмідної ДНК, а також використані молекулярно-генетичні методи описані в роботах Sambrook et al., 1989, із застосуванням модифікацій, згідно з інструкціями виробників ферментів та аналітичних наборів.

У роботі використовували методи класичної і молекулярної генетики дріжджів, а також біохімічні методи дослідження. Для трансформації H. polymorpha сконструйованими векторами використовували метод електропорації, як описано в Faber et al., 1994. Для аналізу рекомбінантних штамів дріжджів використовували метод ПЛР-аналізу та гібридизації ДНК за Саузерном. Визначали активність низки ферментів у безклітинних екстрактах; рівень алкогольної ферментації ксилози (Gonchar et al., 2001) та ін. У роботі широко використовували методи комп'ютерного аналізу та комп'ютерні бази даних відомих генів та геномів.

Результати досліджень та їх обговорення

Створення рекомбінантних штамів H. polymorpha з підвищеним рівнем алкогольної ферментації ксилози шляхом посилення експресії генів xylA (кодує бактерійну КІ) і XYL3 (кодує власну КК)

Одним із можливих шляхів усунення дисбалансу нікотинамідних кофакторів при алкогольній ферментації ксилози, що може створюватися двома першими ферментами ксилозного метаболізму, КР і КДГ, є заміна власних генів XYL1 і XYL2 на бактерійний ген xylA, що кодує КІ. Оскільки КІ безпосередньо перетворює ксилозу до ксилулози, оминаючи етап утворення небажаного ксиліту, і не потребує кофакторів, надекспресія такого бактерійного гена у H. polymorpha може сприяти підвищенню виходу етанолу під час ферментації ксилози.

Конструювання штаму з делецією гена XYL1 H. polymorpha. Роботу по отриманню штаму з делецією гена XYL1 H. polymorpha було розпочато з конструювання делеційної касети p19L2LRA, схема якої представлена на рисунку 1. Цією плазмідою було трансформовано штам H. polymorpha CBS4732 leu2-2. В результаті було відібрано стабільні трансформанти, нездатні рости на середовищі з ксилозою. Проведений біохімічний аналіз отриманих штамів не виявив специфічної активності КР, тоді як активність КДГ залишилася незмінною порівняно з вихідним штамом. Отримані дані свідчать про пошкодження гена XYL1. Розрив гена XYL1 було підтверджено за допомогою методу гібридизації за Саузерном. Сконструйований делеційний штам Дxyl1, використовувався для подальшої гетерологічної експресії прокаріотичних КІ.

Отримання та біохімічна характеристика рекомбінантних штамів, що надекспресують ORF xylA E. coli або S. coelicolor. Для конструювання відповідних штамів були сконструйовані плазміди для надекспресії генів xylA E. coli або S. coelicolor. Рекомбінантні плазміди, що несуть ORF гена xylA E. coli або S. coelicolor під контролем сильного конститутивного промотора гена, що кодує гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу H. polymorpha (HpGAP), отримали назви pEc (містить E. coli xylA) і pScoel (містить S. coelicolor xylA) і представлені на рисунку 1. Цими плазмідами було протрансформовано штам Дxyl1. Отримані трансформанти Дxyl1 (pEc) і Дxyl1 (pScoel) відновлювали здатність рости на середовищі з ксилозою, що вказує на функціональну активність бактерійної КІ у H. polymorpha. Присутність бактерійних xylA генів у геномній ДНК ізольованих дріжджових трансформантів була підтверджена за допомогою ПЛР. Для демонстрації присутності білка бактерійної КІ в клітинах трансформантів було проведено денатуруючий електрофорез їх безклітинних екстрактів в ПААГ. У трансформантів Дxyl1 (pEc) і Дxyl1 (pScoel) була показана присутність додаткової смуги молекулярною масою приблизно 46 кДа, маса якої чітко узгоджується з теоретично обрахованою масою КІ. Ця смуга була відсутня у реципієнтного штама Дxyl1 (рис. 2).

Активність КІ в безклітинних екстрактах трансформантів Дxyl1 №4 (pEc) і Дxyl1 №4 (pScoel) становила 18 - 23% активності фермента в E. coli (табл. 1). Активність ферменту в реципієнтного штаму Дxyl1 №4 визначити не вдалося. Отримані результати свідчать про функціональну активність бактерійного гена у дріжджів H. polymorpha. Проте активність КІ була досить низькою, порівняно з її активністю у бактерій, що може бути зумовлено неоптимальними умовами для функціонування.

гетерологічної КІ, неточним формуванням просторової активної форми ферменту, а також інгібуванням КІ ксилітом, що утворюється в результаті активності КДГ. За рівнем алкогольної ферментації ксилози трансформанти Дxyl1 №4 (pEc) і Дxyl1 №4 (pScoel) не відрізнялися від вихідного штаму CBS4732 leu2-2 (табл. 1). Продуктивності етанолу при ферментації сконструйованими та вихідним штамами становила 0,73 - 0,83 мг/(лЧгод) або 0,3 - 0, 35 мг/(лЧгЧгод). Відсутність покращення ферментації ксилози трансформантами Дxyl1 №4 (pEc) і Дxyl1 №4 (pScoel) ми пояснюємо тим, що ксиліт, утворений внаслідок зворотної реакції КДГ із ксилулози, може конкурентно інгібувати КІ. Із збільшенням внутрішньоклітинної концентрації ксиліту, зменшується спорідненість КІ до ксилози і, як результат, відбувається неефективне перетворення ксилози в етанол. Для подолання цієї проблеми було створено штам з додатковою делецією гена, що кодує КДГ, з метою уникнення формування ксиліту. Такий штам з делеціями КР та КДГ був би перспективним для ефективної експресії КІ, оминаючи негативний вплив утвореного ксиліту.

Отримання подвійного делеційного штаму H. polymorpha Дxyl1 Дxyl2-А. Для отримання штаму з делецією гена XYL2-А попередньо отриманий за допомогою методу УФ-мутагенезу мутантний штам, ауксотрофний за аденіном, Дxyl1 ade2, було трансформовано делеційною касетою рLV2. Відповідна касета містить ген ADE2 C. albicans, фланкований 5' - та 3' - ділянками, що не транслюються, та частинами ORF XYL2-А (рис. 1). Отримані трансформанти були нездатні до росту на мінімальному середовищі з ксилозою і росли гірше, ніж штам CBS4732 leu2-2 на середовищі з ксилітом, як єдиним джерелом вуглецю. Коректність делеції гена HpXYL2-A була перевірена за допомогою гібридизації за Саузерном. Несподівано виявилося, що питома активність КДГ в отриманого подвійного делеційного штаму Дxyl1Дxyl2-А становила приблизно 70% від активності цього фермента у вихідного мутанта Дxyl1 (табл. 2). Отримані результати свідчать про те, що делеція гена HpXYL2-A лише частково знижує активність КДГ. Окрім того, здатність подвійного делеційного штаму Дxyl1Дxyl2-А до хоча і послабленого, але помітного росту на середовищі з ксилітом, вказує на наявність додаткового паралога чи паралогів КДГ. В результаті аналізу бази даних H. polymorpha було ідентифіковано додатковий ген (XYL2-В), що виявляв значну гомологію до гена XYL2 P. stipitis.

Отримання потрійного делеційного штаму H. polymorpha Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В. Роботу було розпочато з конструювання касети для делеції гена XYL2-В. Делеційна касета pLR-260-Z містила ген стійкості до зеоцину (Zeo^r), фланкований 5ґ - та 3ґ-ділянками, що не транслюються, з частинами ORF гена HpXYL2-B (рис. 1). Делеційний штам H. polymorpha Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В було отримано шляхом електротрансформації вихідного штаму Дxyl1Дxyl2-А плазмідою pLR-260-Z. В результаті було відібрано трансформанти, які росли на середовищі з ксилітом значно гірше у порівнянні із вихідним штамом Дxyl1Дxyl2-А. Коректність делеції гена HpXYL2-B була підтверджена за допомогою ПЛР-аналізу та гібридизації за Саузерном. На жаль, повністю позбутись активності КДГ у сконструйованого штаму так і не вдалось. У потрійного делеційного штаму Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В активність

Продуктивність утворення етанолу на другу добу ферментації при температурі 37^оС і питома активність КІ у рекомбінантних штамів

КДГ значно знизилась, порівняно з вихідним штамом і складала приблизно 23% від активності КДГ у штаму Дxyl1 (табл. 2). Залишкова активність свідчить про те, що у H. polymorpha наявні й інші гени, які кодують ферменти з активністю КДГ.

Експресія бактерійної КІ в делеційних штамах Дxyl1Дxyl2-А і Дxyl1Дxyl2-А Дxyl2-В. Для надекспресії гена xylA E. coli в делеційних штамах Дxyl1Дxyl2-А і Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В було сконструйовано плазміду для мультикопійної інтеграції pGLG61/EcxylA, що несе бактерійний ген під контролем сильного промотора гена HpGAP (рис. 1). Цією плазмідою було протрансформовано подвійний та потрійний делеційні штами. Присутність у трансформантів гена xylА Е. соli під контролем промотора HpGAP була підтверджена за допомогою ПЛР-аналізу. За допомогою гібридизації за Саузерном була показана наявність в геномі обох типів мутантів 3-4 копій гена xylА. На відміну від реципієнтних штамів Дxyl1Дxyl2-А і Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В, трансформанти з КІ відновлювали здатність до росту на мінімальному середовищі з ксилозою як єдиним джерелом вуглецю. Активність КІ в безклітинних екстрактах штаму Дxyl1Дxyl2-А(xylА) становила близько 22% від активності фермента у бактерій (табл. 3). Таку низьку активність можна пояснити негативним впливом другого гомолога КДГ на КІ. Активність КІ в безклітинних екстрактах штаму Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В(xylА) була значно вищою і становила приблизно 80% від активності в Е. соli (табл. 3). Проте ні подвійні Дxyl1Дxyl2-А(xylА), ні потрійні Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В(xylА) мутанти за рівнем алкогольної ферментації ксилози не відрізнялися від штаму CBS4732 leu2-2. Можливо, це зумовлено недостатньо високою активністю КІ, що є результатом малої кількості копій гетерологічного гена xylА в геномі трансформантів. Не виключається і негативний вплив залишкової активності КДГ, що призводить до утворення ксиліту з ксилулози, який в свою чергу конкурентно інгібує КІ, зменшуючи спорідненість КІ до ксилози.

Питома активність КДГ у мутантних та контрольних штамів H. polymorpha

При культивуванні сконструйованого штама Дxyl1Дxyl2-А(xylА) на агаризованому середовищі з ксилозою як єдиним джерелом вуглецю було помічено цікаву особливість. Після кількаразових послідовних пасажів на мінімальне середовище з 1% ксилозою мутанти Дxyl1Дxyl2-А(xylА) утворювали спонтанні колонії більшого розміру. У відібраних штамах визначали рівень алкогольної ферментації ксилози при температурі 37°С і 48°С. Продуктивність ферментації спонтанного мутанта Дxyl1Дxyl2-А(xylА) №4В/3 при 37°С становила 10,6 мг/(лЧгод) (табл. 3), що у 7 разів вище, ніж в контрольного штаму CBS4732 leu2-2. При 48°С продуктивність становила 6,1 мг/(лЧгод), що в 4,4 раза вище, ніж у CBS4732 leu2-2. У штамів з покращеною здатністю до росту на середовищі з ксилозою активність КІ залишалася такою ж, як і активність у штамів Дxyl1Дxyl2-А(xylА). Це свідчить про те, що в отриманого штаму відбулися певні зміни, які суттєво покращують продуктивність алкогольної ферментації ксилози. Надалі у мутанта №4В/3 було визначено активність наступного після КР і КДГ ферменту, КК, що фосфорилює ксилулозу до ксилулозо-5-фосфату. Виявилось, що активність КК підвищилася в 2,3 раза порівняно з активністю КК дикого типу (табл. 3). Було висунуто припущення, що причиною кращого росту на середовищі з ксилозою і підвищення виходу етанолу у штаму, що формує великі колонії, є підвищення активності КК.

Надекспресія гена xylА Е. соli і гомологічного гена XYL3 у потрійному делеційному штамі Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В. Щоб з'ясувати, чи справді КК є лімітуючою ланкою в метаболізмі ксилози у дріжджів H. polymorpha, було вирішено надекспресувати два гени одночасно: xylА Е. соli і XYL3 H. polymorpha під контролем промотора HpGAP у потрійному делеційному мутанті Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В. Для цього потрійний делеційний штам Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В було трансформовано кільцевою плазмідою pGLG61/EcxylA/HpXYL3 (рис. 1). Присутність у стабільних трансформантів генів xylА Е. соli і HpXYL3 було підтверджено за допомогою ПЛР. Отримані трансформанти, на відміну від вихідного делеційного штаму, були здатні рости на мінімальному середовищі з 4% ксилозою. Трансформанти Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В (EcxylА/HpXYL3) виявляли активність КІ, що була приблизно на рівні активності штаму Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В(xylА), що вказує на функціональну активність КІ. Активність КК у трансформантів підвищилася і була приблизно такою ж, як і у штамів, що утворюють великі колонії (№4В/3) (табл. 3). В результаті, у потрійного мутанта H. polymorpha було посилено експресію бактерійного гена xylА та власного гена XYL3, шляхом мультикопійної інтеграції відповідних експресійних касет в

Продуктивність утворення етанолу на четверту добу ферментації, питома активність КК і КІ у рекомбінантних і контрольних штамів

геном реципієнта, що призвело до підвищення активності КІ до рівня 80% від активності цього фермента в Е. соli та до більш ніж двократного підвищення активності КК, порівнюючи з активністю даного фермента у штаму дикого типу.

Визначення рівня алкогольної ферментації ксилози у трансформантів Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В(xylА), Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В (EcxylА/HpXYL3) і CBS4732 leu2-2. Показано, що у штамів Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В (EcxylА/HpXYL3), які одночасно надекспресують КІ і КК, продуктивність алкогольної ферментації підвищилась у 3,5-4 рази при 37°С і 48°С в порівнянні з CBS4732 leu2-2 (табл. 3). Отже, гени EcxylА і HpXYL3 є важливими для підвищення алкогольної ферментації ксилози у H. polymorpha. Усі штами погано споживали ксилозу, що може бути спричинено недостатньою ефективністю транспорту цього цукру в клітини дріжджів. Під час ферментації у всіх штамів відбувалося незначне збільшення біомаси. Результати продуктивності етанольної ферментації ксилози представлені в таблиці 3. Для найкращого штама Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В (EcxylА/HpXYL3) продуктивність становила 2,1 мг/(лЧгЧгод) при температурі 37°С і 2,5 мг/(лЧгЧгод) при температурі 48°С, що відповідно в 3,5 і 4,3 раза більше, ніж у CBS4732 leu2-2.

Отже, отримані результати вказують на те, що у H. polymorpha делеції трьох генів XYL1, XYL2-A і XYL2-B сприяють ефективній експресії бактерійної КІ. Трансформанти H. polymorpha є здатними рости в середовищі з ксилозою, як єдиним джерелом вуглецю і проявляють високу активність КІ, що складає близько 80% від активності фермента в E. coli. Одночасна надекспресія двох генів, EcxylА і HpXYL3, значно підвищує продуктивність утворення етанолу при ферментації ксилози рекомбінантними штамами.

Створення рекомбінантних штамів H. polymorpha з підвищеним рівнем алкогольної ферментації ксилози шляхом надекспресії гомологічних нативних і модифікованих генів XYL1/XYL1-М, XYL2 і XYL3

Оскільки КР і КДГ H. polymorpha мають різну кофакторну специфічність, КР використовує переважно NADPН(H⁺) і лише в незначній мірі NADН(H⁺), а КДГ - NAD⁺, то це призводить до накопичення NADP⁺ та NADН(H⁺) і, як результат, створення дисбалансу кофакторів у дріжджовій клітині. Усунути дисбаланс кофакторів можна шляхом пошкодження генів, ферменти яких забезпечують перші дві реакції катаболізму ксилози, замінивши їх активність активністю бактерійного фермента КІ, що не потребує кофакторів та перетворює ксилозу безпосередньо у ксилулозу, оминаючи етап утворення ксиліту. Проте, існує й інша можливість усунення дисбалансу кофакторів, створеного КР і КДГ, яка полягає у зменшенні спорідненості КР до NADPН(H⁺) шляхом модифікації кофактор-зв'язуючого домену. Надекспресія модифікованої КР разом з КДГ і КК може суттєво підвищити рівень алкогольної ферментації ксилози та водночас зменшити формування ксиліту у дріжджів H. рolymorpha.

Конструювання модифікованої форми КР H. рolymorpha за допомогою методу сайт-специфічного мутагенезу. КР ксилозо-утилізуючих дріжджів і особливо домен, що відповідає за зв'язування кофактора, мають високий ступінь гомології. Використовуючи метод сайт-специфічного мутагенезу, було здійснено спробу змінити кофакторну спорідненість КР H. polymorpha, по аналогії з успішною модифікацією КР C. tenuis (Petschacher et al., 2005), яка призвела до зменшення спорідненості КР до NADPН(H⁺). Завдання полягало у заміні амінокислотних залишків лізину та аспарагіну на аргінін і аспарагінову кислоту в положеннях 341 і 343, відповідно. Модифікацію було здійснено за допомогою ПЛР, використовуючи праймери, в які попередньо були внесені відповідні нуклеотидні заміни. Коректність внесеної заміни було підтверджено шляхом визначення послідовності нуклеотидів відповідного клонованого гена.

Отримання та біохімічний аналіз рекомбінантних штамів H. polymorpha, що надекспресують нативний XYL1-N та модифікований XYL1-M гени. Штами що несуть гени XYL1-N або XYL1-M, було одержано шляхом трансформації вихідного штама Дxyl1 плазмідами pX1N-Z або pX1M-Z, що містять нативний або модифікований ген XYL1, відповідно, під контролем промотора гена HpGAP (рис. 3). Наявність у геномі одержаних трансформантів експресійних касет, що містять ORF XYL1-N або XYL1-M під контролем промотора HpGAP була підтверджена за допомогою ПЛР. Кількість копій експресійної касети ORF XYL1-N або XYL1-M в геномі відповідних рекомбінантних штамів визначали за допомогою гібридизації за Саузерном. В результаті було відібрано два типи рекомбінантних штамів, що містять однакову кількість копій (1-2 копії) експресійної касети з генами XYL1-N або XYL1-М.

При використанні ксилози як субстрату К_М для NADPН(H⁺) у модифікованої КР становила 152 мкМ, що в 17 разів вище, ніж К_М для NADPН(H⁺) у нативної КР (9 мкМ). К_М модифікованої КР для NADН(H⁺) залишилась практично незмінною (112 мкМ) (табл. 4). Спостерігалось зменшення специфічної активності КР з NADPН(H⁺) в 9 разів у штамів з КРм, порівняно зі штамами, що надекспресують нативну КР. В обох штамів специфічна активність КР з NADН(H⁺) залишилася без змін (табл. 4). Отже, шляхом заміни двох амінокислотних залишків в кофактор-зв'язуючому домені вперше вдалося сконструювати КР H. рolymorpha з бажаними кінетичними КР до NADPН(H⁺). Використовуючи методи білкової інженерії нам параметрами. Було показано, що продуктивність алкогольної ферментації при 48°С у штама КРм становила 9,8 мг/(л год), що в 1,5 і в 1,3 раза вище, ніж продуктивність штамів КРн і CBS4732 leu2-2, відповідно (табл. 4). За кількістю нагромаджуваного ксиліту ці штами суттєво не відрізнялись (табл. 4). Отримані результати свідчать про те, що надекспресія лише КР (нативної або модифікованої) є недостатньою для суттєвого підвищення продуктивності етанольної ферментації у H. polymorpha. Однак, незначне півтора-разове покращення алкогольної ферментації ксилози у штама КРм у порівняння з диким типом все-таки вдалося досягти. Очевидно, подальшого покращення етанольної ферментації слід сподіватися при пропорційному посиленні ферментативної активності наступних ферментів метаболізму ксилози, а саме КДГ та КК.

Отримання та біохімічний аналіз рекомбінантних штамів H. polymorpha, що одночасно надекспресують гени XYL1-N або XYL1-M та XYL2-А. Було сконструйовано плазміди, що містять HpXYL1 ORF або HpXYL1-М ORF і HpXYL2 ORF під контролем промотора гена HpGAP (рис. 3). Штами, що несуть гени XYL1-N/XYL1-M та XYL2-А було одержано шляхом трансформації вихідного штама Дxyl1 плазмідами pX1N-Z-X2 або pX1M-Z-X2. Отримані трансформанти стабілізували і за допомогою ПЛР підтвердили наявність в них експресійних касет, що містять ORF XYL1-N/XYL1-M і ORF XYL2-А під контролем промотора HpGAP.

Рекомбінантні штами з надекспресією КДГ характеризувалися підвищенням активності цього фермента в 2 рази порівняно зі штамом дикого типу, що свідчить про ефективне посилення експресії гомологічної КДГ. Продукція етанолу у штама КРм/КДГ становила 18,4 мг/(лЧгод), що у 1,5 і 2,4 рази вище порівняно зі штамами

Питомі активності КР, КДГ і КК та продуктивності утворення етанолу і ксиліту у рекомбінантних штамів H. polymorpha на першу добу ферментації

КРн/КДГ і CBS4732 leu2-2, відповідно (табл. 4). При цьому кількість нагромаджуваного ксиліту у КРм/КДГ зменшилась у 1,3 і 2,6 раза порівняно з КРн/КДГ і CBS4732 leu2-2, відповідно (табл. 4). Підвищення виходу етанолу та зниження кількості нагромаджуваного ксиліту у штамів з надекспресією КРм і КДГ свідчить про важливу роль КДГ в процесі метаболізму ксилози у H. polymorpha, а також у регуляції співвідношення відновленої та окисленої форми NAD⁺ у дріжджовій клітині.

Отримання та біохімічний аналіз рекомбінантних штамів H. polymorpha, що одночасно надекспресують гени XYL1-N або XYL1-M, XYL2-А і XYL3. Роботу було розпочато з конструювання плазміди pGLG61/HpXYL3, що містить ORF HpXYL3 під контролем промотора гена HpGAP (рис. 3). Штами, що містять ген XYL3, було отримано шляхом трансформації вихідних штамів XYL1-N-XYL2 і XYL1-М-XYL2 плазмідою pGLG61/HpXYL3. У стабільних трансформантів присутність гена XYL3 під контролем промотора HpGAP підтверджена за допомогою ПЛР. Використовуючи ДНК-гібридизацію за Саузерном, була визначена кількість копій експресійної касети в геномі рекомбінантних штамів. В результаті відібрано два типи рекомбінантних штамів, що містять експресійні касети з генами XYL1-N або XYL1-М, XYL2 а також однакову кількість копій (2-3 копії) експресійної касети, що складається з ORF XYL3 під контролем промотора HpGAP.

Посилення експресії КК у штамів КРн/КДГ/КK і КРм/КДГ/КK призводило до підвищення активності КК в 2,4 раза, порівняно зі штамом дикого типу CBS4732 leu2-2. Зростання активності КК свідчить про ефективне функціонування експресійної касети і утворення активної форми ферменту. Продуктивність етанольної ферментації у штама КРм/КДГ/КК становила 54,7 мг/(л год), що в 4 і 7,4 раза вище, ніж у КРн/КДГ/КК (13,8 мг (лЧгод)) і CBS4732 leu2-2 (7,5 мг/(лЧгод)), відповідно (табл. 4). Кількість нагромаджуваного ксиліту у штама КРм/КДГ/КК зменшилась до 0,9 мг/(л год), що в 4,7 і 3 рази нижче, ніж у КРн/КДГ/КК і CBS4732 leu2-2, відповідно (табл. 4). Такі результати свідчать про те, що саме перші три ферменти метаболізму ксилози є лімітуючими у процесі конверсії ксилози до етанолу у дріжджів H. polymorpha. Модифікація та надекспресія КР, КДГ і КК значно підвищує рівень ферментації ксилози і зменшує кількість нагромаджуваного ксиліту. Цікавим виявився факт суттєвого зменшення кількості нагромаджуваного ксиліту при додатковому посиленні експресії XYL3 у сконструйованих штамів. Ймовірно, підвищення активності КК призводить до зменшення кількості ксилулози, що примушує КДГ активно працювати у напрямку перетворення ксиліту до ксилулози, зменшуючи кількість цього небажаного метаболіту.

Порівняння ефективності двох альтернативних шляхів первинного метаболізму ксилози (КІ/КК і КР/КДГ/КК) для етанольної ферментації у дріжджів H. polymorpha

Метаболізувати ксилозу здатні бактерії та дріжджі. Перші етапи перетворення ксилози у цих організмів суттєво відрізняються і представлені різними ферментами. Так, у дріжджів ксилоза спочатку відновлюється до ксиліту за допомогою NADPН(H⁺) - залежної КР з наступним окисленням до ксилулози за допомогою NAD⁺-залежної КДГ. У бактерій замість КР і КДГ функціонує лише один фермент - КІ, який безпосередньо перетворює ксилозу до ксилулози і не потребує кофакторів. Наступний етап ксилозного метаболізму є спільним для дріжджів і бактерій та полягає у фосфорилюванні ксилулози до ксилулозо-5-фосфату, який через пентозофосфатний шлях і гліколіз перетворюється до етанолу. Отже, бактерійний шлях метаболізму ксилози є простішим, КІ не потребує кофакторів і в середовищі не нагромаджується побічний продукт - ксиліт, який суттєво інгібує активність КІ.

Завданням цієї роботи було створити штами H. polymorpha з підвищеним рівнем ферментації ксилози до етанолу, використовуючи гетерологічний бактерійний (КІ/КК) та модифікований гомологічний (КРм/КДГ/КК) шляхи метаболізму цього цукру та порівняти їхню ефективність за умов ферментації при високій температурі (48°С).

В результаті проведеної роботи було створено два рекомбінантні штами H. polymorpha з підвищеним рівнем алкогольної ферментації ксилози:

1) штам з посиленою експресією бактерійної КІ разом з власною КК (Дxyl1Дxyl2-АДxyl2-В (EcxylА/HpXYL3));

2) штам з посиленою експресією модифікованої форми КР разом з КДГ і КК (КРм/КДГ/КК), одержаний на основі делеційного мутанта Дxyl1.

Було показано, що як у штаму КІ/КК, так і у штаму КРм/КДГ/КК відбулося підвищення рівня алкогольної ферментації ксилози, порівняно з вихідним штамом. Проте трансформанти, що містили гомологічні гени (КРм/КДГ/КК) в лабораторних умовах ферментували ксилозу краще. Але, не зважаючи на більшу ефективність дріжджового шляху метаболізму, бактерійний шлях має значні перспективи щодо вдосконалення, а вихід етанолу у штамів, одержаних в даній роботі, ще далекий від теоретично можливого. Перспективним є використання методів білкової та еволюційної інженерії для створення КІ, здатних ефективно перетворювати ксилозу до етанолу при підвищених температурах. Суттєво підвищити функціональну активність КІ в клітинах H. polymorpha і, як результат, покращити ефективність алкогольної ферментації ксилози можна за допомогою оптимізації кодонів гена xylА. Потребує вдосконалення і дріжджовий шлях ксилозного метаболізму. Можливою є модифікація інших амінокислотних залишків КР для зміни кофакторної спорідненості фермента, яка одночасно залишає високою швидкість ферментативної реакції (V_max).

Якими ж є основні причини, що перехилили чашу терез на користь штаму КРм/КДГ/КК у підвищенні рівня алкогольної ферментації ксилози у порівнянні зі штамом КІ/КК? Основна причина полягає в першу чергу у посиленні експресії гомологічних генів, які еволюційно пристосовані до оптимальної роботи у певному організмі. Немає сумнівів, що при заміні кодонів у гені xylА E. coli на оптимальні для дріжджів H. polymorpha, можна було б суттєво посилити активність КІ і, як результат, підвищити рівень алкогольної ферментації ксилози. Друга причина полягає в інгібуючому впливі ксиліту на активність КІ. Незважаючи на делецію двох генів XYL2-A та XYL2-B, повністю позбавитись активності КДГ у сконструйованого штаму так і не вдалось. Ймовірно залишкова активність КДГ, що становила 23% від активності вихідного штаму, достатня для утворення мінорної кількості ксиліту, який в свою чергу не дозволяє КІ досягти максимального рівня активності.

Слід також зазначити, що хоча штами природних ксилозо-ферментуючих дріжджів P. stipitis і рекомбінантних S. cerevisiae ферментують ксилозу краще, ніж отримані в даній роботі дріжджі, все ж таки H. polymorpha залишається перспективним організмом, який здатний метаболізувати та ферментувати ксилозу при високих температурах (48 С), що є неможливим для інших дріжджів. Така особливість дає можливість використовувати штами H. polymorpha в процесі одночасної сахарифікації і ферментації, який на сьогодні є найбільш оптимальним для економічно вигідного перетворення лігноцелюлози до етанолу в промислових умовах.

Висновки

В результаті виконання дисертаційної роботи було сконструйовано рекомбінантні штами термотолерантних дріжджів H. polymorpha з бактерійним або модифікованими власними генами початкових етапі катаболізму ксилози, здатні до утворення збільшеної кількості етанолу при ферментації цієї пентози при підвищеній температурі (48°С). Головні наукові результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Сконструйовано та охарактеризовано штами H. polymorpha з делеціями генів XYL1, XYL2-A і XYL2-B, що кодують КР та два паралоги КДГ.

2. Вперше здійснено успішну надекспресію генів xylA, що кодують КІ E. coli і S. сoelicolor у дріжджів, забезпечуючи формування функціонально активного ферменту.

3. Сконструйовано рекомбінантний штам H. polymorpha з одночасною надекспресією генів xylA E. coli і XYL3 H. polymorpha, що характеризується підвищеним у 3,5-4 рази рівнем алкогольної ферментації ксилози при підвищеній температурі (48°С), порівняно з диким штамом.

4. За допомогою сайт-специфічного мутагенезу створено модифіковану форму КР, в якої лізин і аспарагін було замінено на аргінін і аспарагінову кислоту в амінокислотних положеннях 341 і 343, відповідно. В результаті модифікації спорідненість КР до NADPН(H⁺) зменшилась у 17 разів, порівняно з нативною формою фермента, тоді як спорідненість до NADН(H⁺) залишилась без змін.

5. Одержано рекомбінантні штами H. polymorpha, які надекспресують нативну або модифіковану форму КР, КДГ і КК. Штам з посиленою експресією модифікованої форми КР та надекспресією нативних КДГ і КК характеризувався підвищеним у 7,4 раза рівнем алкогольної ферментації ксилози та зниженою у 5 разів кількістю нагромадженого ксиліту.

6. При ферментації ксилози рекомбінантний штам H. polymorpha з посиленою експресією гомологічних генів початкових етапів катаболізму ксилози суттєво переважав за кількістю синтезованого етанолу рекомбінантний штам H. polymorpha з посиленою експресією бактерійної КІ і гомологічної КК.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Voronovsky A.J. Expression of xylA genes encoding xylose isomerases from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha / A.J. Voronovsky, O.B. Ryabova, O.V. Verba [et al.] // FEMS Yeast Res. - 2005. - V. 5. - P. 1055-1062. (Дисертант опрацював дані літератури та власні результати, йому належить участь в експериментальній роботі та написанні статті).

2. Dmytruk O.V. Overexpression of bacterial xylose isomerase and yeast host xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha / O.V. Dmytruk, A.Y. Voronovsky, C.A. Abbas [et al.] // FEMS Yeast Res. - 2008. - V. 8. - P. 165-173. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь в експериментальній роботі та написанні статті).

3. Dmytruk O.V. Engineering of xylose reductase and overexpression of xylitol dehydrogenase and xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha / O.V. Dmytruk, K.V. Dmytruk, C.A. Abbas [et al.] // Microb. Cell Fact. - 2008. - V. 7. - P. 21. (Дисертантом особисто отримано рекомбінантні штами дріжджів, які надекспресують нативну та модифіковану форми КР, проведено молекулярно-генетичний та біохімічний аналіз цих мутантів, дисертант також брав участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, оформленні та написанні статті).

4. Дмитрук О.В. Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози / О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський та ін. // Цитологія і генетика. - 2008. - Т. 42, №2. - С. 127-138. (Дисертанту належить аналіз літературних даних по темі роботи, а також написання та оформлення оглядової статті).