Генетичний аналіз раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

УДК 636.576.371:591.31:57.085

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Генетичний аналіз раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней in vitro

03.00.15 - генетика

ЩЕРБАК ОКСАНА ВАСИЛІВНА

с. Чубинське Київської області - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Ковтун Світлана Іванівна,

завідувач лабораторії клітинної інженерії

Інституту розведення і генетики тварин УААН

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

Димань Тетяна Миколаївна,

Білоцерківський національний аграрний університет

Міністерства аграрної політики України,

завідувач кафедри екотрофології

кандидат біологічних наук,

Костенко Світлана Олексіївна,

Національний університет біоресурсів і

природокористування України

Кабінету Міністрів України,

доцент кафедри розведення та генетики сільськогосподарських тварин ім. М.А. Кравченка

Захист відбудеться « 27 » листопада 2009 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська область, Бориспільський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН

Автореферат розісланий « 22 » жовтня 2009 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Ю.В. Мільченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Генетико-біотехнологічні аспекти раннього ембріогенезу, який характеризує етап онтогенезу тварин до закладки органів, створили передумови для розширеного використання їх генетичного потенціалу. Цитогенетичний аналіз у системі вивчення особливостей генетичного контролю ембріогенезу тварин нині є дієвим підходом для розвитку методів ембріологічної генетики (Дыбан А.П., 1988; Кузнєцов В.Є., 2001; Буркат В.П., 2008; Ковтун С.І., 2007; Diskin M., 2003; Dacheux J., 2006). Спадкову обумовленість морфологічних процесів в організмі, яку передбачає генетичний контроль, досліджують під час аналізу реалізації генетичної інформації в ранньому ембріогенезі in vitro.

Привертають увагу технологічні аспекти ембріологічної генетики сільськогосподарських тварин під час вивчення запліднювальної здатності in vitro епідидимальних сперматозоїдів та їх кріоконсервування (Безуглий М.Д., 1998, 2002; Буркат В.П., 2006; Ковтун С.І., 2006). Зокрема, набуває важливого значення метод використання епідидимальних сперматозоїдів ссавців під час селекційної роботи з малочисельними та зникаючими породами і видами. Використання таких гамет забезпечує зростання ефективності новітніх методів біотехнології через здешевлення та зростання рівня формування ембріонів in vitro (Эрнст Л.К., 2001; Буркат В.П., 2005; Ковтун С.І., 2006). Кріоконсервування та комплексна оцінка життєздатності епідидимальних сперматозоїдів різних видів тварин є важливим додатковим методом збереження їх генофонду.

Дослідження хромосомних перетворень на останніх стадіях ембріогенезу в поєднанні з вибором умов кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів самців забезпечують подальше вивчення механізмів реалізації генетичної інформації в процесі індивідуального розвитку. Існує ряд проблем щодо підвищення біологічної повноцінності розвитку ембріонів in vitro. На вирішення цих питань було спрямовано експериментальну частину дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась як складова частина науково-дослідних робіт Інституту розведення і генетики тварин УААН за темами: «Розробити та удосконалити новітні біотехнологічні методи тиражування та конструювання бажаних генотипів сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0101U003121); 2-х завдань підпрограми 2 НТП УААН «Сільськогосподарська біотехнологія 2006 - 2010 рр.» (№№ держреєстрації 0106U005153, 0106U005839), завдання НТП «Збереження генофонду сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0106U005845).

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було розробити на основі морфоцитогенетичних методів елементи комплексного аналізу раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней з використанням епідидимальних сперматозоїдів у системі біотехнологічної селекції та програмах збереження біорізноманіття.

Для її вирішення були поставлені наступні завдання:

встановити фізіологічні показники епідидимальних сперматозоїдів кнурів у процесі дослідження ембріогенезу свиней in vitro;

встановити вплив цитоплазматичної краплини епідидимальних сперматозоїдів кнурів на розвиток ембріонів свиней in vitro;

вивчити вплив різних середовищ для кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів на ефективність ембріонального розвитку свиней in vitro;

встановити вплив віку кнурів-донорів епідидимальних гамет на особливості ембріогенезу поза організмом;

дослідити закономірності формування ембріонів великої рогатої худоби in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів бугаїв для запліднення яйцеклітин;

здійснити цитогенетичний контроль розвитку in vitro ембріонів великої рогатої худоби після їх надшвидкого заморожування.

Об'єкт дослідження - закономірності реалізації генетичної інформації в ранньому ембріогенезі сільськогосподарських тварин.

Предмет дослідження - генетичні механізми запліднення in vitro яйцеклітин та закономірності раннього ембріогенезу поза організмом.

Методи дослідження - цитогенетичний (аналіз стану хромосомних перетворень під час розвитку зародків поза організмом); генетики розвитку (дослідження in vitro гамет великої рогатої худоби та свиней, дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів); експериментальної ембріології (культивування in vitro ембріонів великої рогатої худоби і свиней); біометричний (статистичний аналіз одержаних результатів).

Наукова новизна роботи. Вперше встановлені закономірності ембріогенезу великої рогатої худоби та свиней за умови запліднення яйцеклітин in vitro епідидимальними сперматозоїдами. Вперше встановлено особливості розвитку ембріонів поза організмом залежно від віку та породи кнурів-донорів епідидимальних гамет. Виявлено вплив температури на зберігання епідидимальних сперматозоїдів кнурів. Вставлено роль цитоплазматичної краплини епідидимальних сперматозоїдів кнурів на запліднювальну здатність. Встановлено вплив надшвидкого заморожування ембріонів великої рогатої худоби на їх життєздатність в умовах розвитку in vitro. епідидимальний сперматозоїд ембріогенез селекція

Практичне значення одержаних результатів. Спосіб комплексного використання епідидимальних сперматозоїдів бугаїв та кнурів у ранньому ембріогенезі in vitro підвищує ефективне використання генетичного потенціалу тварин та збереження генофонду. Практична цінність та наукова новизна результатів роботи підтверджена патентом на корисну модель (Пат. 33658 Україна, МПК А 61D 19/02). Детальну цитогенетичну оцінку розвитку in vitro ембріонів після надшвидкого заморожування розроблено для використання у практиці трансплантації ембріонів.

Матеріали наукових досліджень використані у навчальному процесі Національного університету біоресурсів і природокористування України (кафедра фізіології, патофізіології та імунології тварин), Інституту природничо-географічної освіти та екології Національного педагогічного університету ім. М. Драгоманова (кафедра екології), Національного технічного університету «Київський політехнічний інститут» (факультет біотехнології і біотехніки). Результати науково-дослідної роботи використані під час презентації сучасних біотехнологічних розробок в Україні на Міжнародній виставці «БІО 2006» (квітень, 2006 р., м. Чикаго, США).

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначені напрям досліджень, методологічні підходи та схема досліджень. Викладені у дисертаційній роботі результати експериментальних досліджень отримані особисто автором або за його безпосередньої участі. Дисертантом особисто опрацьовані першоджерела літератури, проведено аналіз та інтерпретацію одержаних результатів, статистичну обробку результатів досліджень, сформульовано висновки та практичні пропозиції. Із загальних наукових експериментів та публікацій дисертант використав тільки свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено і обговорено в доповідях на щорічних розширених засіданнях відділень генетики і біотехнології та вченої ради Інституту розведення і генетики тварин УААН у 2004 - 2007 роках, на наукових конференціях молодих вчених та аспірантів Інституту розведення і генетики тварин УААН (Чубинське, 2004 - 2006, 2008), VIII з'їзді українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова (Алушта, 2007), міжнародній науковій конференції «Гіпобіоз - фундаментальні та прикладні аспекти» (Київ, 2007), IV міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2008), ІХ Польсько-Українському Симпозіумі «Теоретичні і експерементальні дослідження міжфазних явищ та їх технологічні застосування» (Польща, 2007).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертації опубліковано в 5 статтях у наукових журналах, 3 збірниках наукових праць та 6 матеріалах і тезах конференцій, одержано патент на корисну модель. Всього опубліковано 15 друкованих праць (в т.ч. 9 у фахових виданнях), з них 8 одноосібних.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методик досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Роботу викладено на 145 сторінках. Ілюстративний матеріал представлений 19 таблицями і 26 рисунками. Список літератури містить 201 джерело, з яких 112 іноземних авторів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконані в лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин УААН, на базі господарства «Лугівське» Дніпропетровської області, племінного заводу «Більшовик» Донецької області, Сумського селекційного центру та ДСП «Головний селекційний центр України» за схемою (рис.1) на поголів'ї 19 кнурів, 50 свинок, 27 бугаїв і 10 корів різних порід.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Загальна схема досліджень

Сім'яники з придатками відбирали відразу після забою або кастрації кнурів і бугаїв і транспортували за температури +4єС. Сперматозоїди одержували шляхом проведення паралельних щільних розрізань звитих канальців (Ковтун С.І. і ін., 2005). Для довготривалого збереження (+4єС, концентрація сперматозоїдів - 40 млн./мл) епідидимальних сперматозоїдів кнурів використовували середовище «Androstar» і «BTS». Для заморожування у формі відкритих гранул (150 - 200 млн. гамет у гранулі об'ємом 0,2 мл) свіжоотриманих епідидимальних сперматозоїдів бугаїв використовували лактозо-гліцерино-жовткове середовище (ЛГЖ), для зберігання в рідкому азоті таких гамет кнурів застосовували ЛГЖ та «Біоконсан». В усі середовища додавали 10 % жовтка курячого яйця та 10 % гліцерину.

Для одержання in vitro зародків свиней та великої рогатої худоби відбирали яєчники від гінекологічно здорових тварин. Шляхом розсічення антральних фолікулів яєчників здійснювали вилучення ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) із фолікулів. Для культивування відбирали ооцити корів діаметром 140 - 170 мкм, а ооцити свиней - 120 - 130 мкм.

ОКК корів культивували in vitro протягом 24 годин по 25 - 30 ООК у 1 мл середовища 199 на розчині Ерла (Sigma, М 5017) з додаванням 20 % інактивованої нагріванням (56C, 30 хвилин) еструсної сироватки корів, 0,068 мг/мл канаміцин сульфату, 0,11 мг/мл пірувату натрію і 0,1 мг/мл глутаміну та свіжоотриманих клітин гранульози (3 - 5х10⁶ клітин на мл). ОКК свиней культивували поза організмом в подібних умовах протягом 46 годин.

Осіменіння дозрілих in vitro ооцитів свиней та корів проводили з використанням заморожених епідидимальних сперматозоїдів статевозрілих самців. Сперматозоїди бугая та ооцити корів спільно інкубували в середовищі TALP-IVF (Katska L., e.a., 1993) з додаванням 10 мкг/мл гепарину (для капацитації гамет) та суміші РГЕ (20 мкМ пеніциламіну, 10 мкМ гіпотаурину та 1 мкМ епінефрину) упродовж 18 годин з концентрацією рухливих сперматозоїдів 1,5 - 2,0 х 10⁶ сперматозоїдів/мл та температурі 38,5С і 4 % СО₂ в атмосфері повітря і рН 7,8. Спільну інкубацію гамет свиней проводили з використанням вищезгаданих умов та середовища з добавками, але з концентрацією сперматозоїдів кнура 250 тис. клітин на 1 мл упродовж 4 год.

Концентрацію гамет визначали за допомогою камери Горяєва (Ожин Ф.В., и др., 1983). Відмиті від сперматозоїдів зиготи свиней культивували in vitro у середовищі NCSU-23 (Gajda B., 1998), а зиготи великої рогатої худоби в середовищі 199 на розчині Ерла з 10 % ФСТ (фетальна сироватка теляти).

Для надшвидкого заморожування використовували ембріони великої рогатої худоби, вилучені від корів після їх суперовуляції. Заморожування проводили швидким зануренням пайєт із ембріонами в рідкий азот. Застосовували розчин EФС40 (40 % етиленгліколю, 18 % фіколу 70 (poly(sucrose-co-epichlorhydrin) і 0,3М сахароза). Після швидкого розморожування на водяній бані за температури +20С упродовж 8 секунд (близько 1800C/хв.) ембріони розміщували на 5 хв. у 0,5 М розчин сахарози. Ембріони оцінювали за морфологією і переносили для подальшого культивування в середовище 199 на розчині Ерла з 3 мг/мл БСА (Sigma A-4919).

Після морфологічної оцінки ембріони та нероздроблені яйцеклітини фіксували за модифікованим методом Тарковського (Tarkowski A.K., 1966) з наступним фарбуванням сухоповітряних препаратів 2%-ним розчином барвника Гімза. Аналізували препарати під світловими мікроскопами Jenaval, Carl Zeiss з фотовиводом «Axiostar Plus».

Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критерію ч² (Лакин Г.Ф., 1990).

Особливості епідидимальних сперматозоїдів кнурів за різних температурних режимів зберігання. Критичним періодом під час збереження життєздатності сперматозоїдами плідників поза організмом є перехід їх із активного в неактивний стан або тимчасову інактивацію життєвих процесів. Розріджену еякульована сперму кнурів рекомендують зберігати за температури +16 - 20єС, а також за зниженої температури від +6єС до +10єС згідно «Інструкції із штучного осіменіння свиней» (2003).

Нами досліджено влив на активність епідидимальних сперматозоїдів кнурів температури їх зберігання +20єС, +13єС і +4єС. Гамети розбавляли (330 млн./мл) середовищем для тривалого збереження сперми кнурів «Androstar» і збалансованим середовищем для зберігання до 3 діб «BTS» (фірма «Minitьb»). Встановлено, що через 3 год. зберігання найвищу рухливість епідидимальні сперматозоїди кнурів проявляли за температури +20єС (табл. 1). Хоча початкова активність гамет, збережених за температури +4єС, була на 2 бали нижчою, порівняно із активністю за температури +20єС, виживаність сперматозоїдів за більш низької температури становила в середньому 10,2 доби, що на 154 год. довше, порівняно із виживаністю гамет за температури +20єС.

Показники життєздатності епідидимальних сперматозоїдів кнурів за різних температурних режимів зберігання

Температура зберігання	Активність після 3 год. зберігання, бали	Виживаність Тn, години	Середнє значення активності за період виживання, бали
+20єС	7,0±0,58	90±18,7	3,2±0,57
+13єС	5,0±0,58	36,2±14,5	2,1±0,39
+4єС	5,0±0,58	244±35,7	2,7±0,46

Найбільш негативно на активність епідидимальних сперматозоїдів кнурів впливала температура зберігання +13єС. Середнє значення активності гамет за період виживання за температури +13єС було на 1,1 бали нижчим, порівняно із +20єС і на 0,6 бали, порівняно із +4єС. За виживаністю сперматозоїдів температура зберігання +13єС суттєво поступалась +20єС і +4єС і становила лише 1,5 доби (3,8 діб за температури +20єС і 10,2 доби за температури +4єС). Знижена температура (+4С) забезпечує ефективніший гіпобіотичний стан епідидимальних сперматозоїдів кнурів, що проявляється у збереженні досить високої рухливості гамет не менше 10 діб.

Вплив різних середовищ для кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів на розвиток ембріонів свиней in vitro. Збереженість сперматозоїдів під час кріоконсервування переважно залежить від складу синтетичних середовищ для розрідження сперми. Для визначення умов кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів ми порівняли ефективність використання середовища ЛГЖ і багатокомпонентного середовища «Біоконсан» (автор. свідоцтво №82839 Держкомвинаходів СРСР).

Гамети в середньому проявляли активність на рівні 6,7 балів в разі розрідження середовищем ЛГЖ, а після розрідження середовищем «Біоконсан» активність сперматозоїдів була вищою і становила 7 балів (табл. 2). Після розморожування була відмічена активність на рівні 1,7 балів.

Придатність епідидимальних сперматозоїдів кнурів до глибокого заморожування

Середовище для розбавлення сперматозоїдів	Активність епідидимальних сперматозоїдів, бали	Різниця, %	Виживаність після розморожування, години
	свіжовилучені сперматозоїди	після розморожування
ЛГЖ	6,7±0,33	1,7±0,33	- 74,6	3±0,58
«Біоконсан»	7,0±1,0	1,7±0,33	- 75,7	3±0,58

Про збереження запліднювальної здатності розмороженими епідидимальними сперматозоїдами свідчить ембріональний розвиток in vitro після запліднення дозрілих поза організмом яйцеклітин свиней. Нами встановлено, що рівень формування зигот свиней in vitro є подібним, коли для осіменіння яйцеклітин використовували епідидимальні сперматозоїди, які були заморожені в середовищі ЛГЖ і «Біоконсан» (табл. 3).

Розвиток ембріонів свиней in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів

Середовище для розбавлення сперматозоїдів	Кількість осіменених яйцеклітин, n	Кількість (%)
		зигот	2-4-клітинних зародків	ранніх морул - бластоцист
ЛГЖ	156	81a(51,9±4,0)	68b(43,6±4,0)	26c(16,6±3,0)
«Біоконсан»	668	369a(55,2±1,9)	296b(44,3±1,9)	140c(21,0±1,6)

a:a - P > 0,05, критерій ч2. В цій та наступних таблицях однакові суперскрипти у межах однієї колонки вказують на відсутність вірогідної різницю між показниками

Виявлено, що ефективність дроблення ембріонів поза організмом вище в разі використання групи сперматозоїдів, які розбавляли середовищем «Біоконсан», що забезпечило розвиток ембріонів до стадії морули-бластоцисти на 4,4 % вище, коли для осіменіння яйцеклітин використовували групу сперматозоїдів, які заморожували з використанням цього середовища. Ефективність кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів залежить від прояву їх початкової рухливості і може бути досить високою з використанням середовища ЛГЖ і «Біоконсан».

Дослідження впливу цитоплазматичної краплини у епідидимальних сперматозоїдах кнура на ембріональний розвиток in vitro. Цитоплазматична краплина на еякульованих сперматозоїдах плідників ідентифікується рідко і її наявність вказує на прискорений сперматогенез в епідидимісі (Данилова Л.В., 1983). Нами встановлено, що всі епідидимальні сперматозоїди кнурів містять цитоплазматичну краплину. Доведена відсутність негативного впливу присутності у еякульованих сперматозоїдах бугаїв цитоплазматичної краплини на ефективність штучного осіменіння корів (Наук В.А., 1991).

Для оцінки рівня одержання ембріонів свиней поза організмом з використанням епідидимальних сперматозоїдів ми підібрали двох кнурів із подібними показниками рухливості епідидимальних сперматозоїдів до заморожування (6 балів і 5 балів, відповідно) та після розморожування (3 бали). Встановлено, що запліднювальна здатність in vitro сперматозоїдів, які містять цитоплазматичну краплину, обох кнурів забезпечила формування 58,5 % зигот (117 зигот із 200 осіменених яйцеклітин). Не виявлено вірогідної різниці у рівні дроблення ембріонів свиней поза організмом і цей показник сягав 42 %, а рівень розвитку зародків до стадії морули-бластоцисти в середньому становив 19 % від загальної кількості осіменених яйцеклітин. Цитогенетичним контролем розвитку ембріонів свиней in vitro встановлено, що наявність залишку сперматидної цитоплазми на хвостиках епідидимальних сперматозоїдах кнурів не має негативного впливу на формування зародків поза організмом. Такі сперматозоїди забезпечують запліднювальну здатність яйцеклітин на високому рівні.

Вплив віку кнурів-донорів епідидимальних сперматозоїдів на формування ембріонів свиней in vitro. Постембріональний розвиток кнурів характеризується інтенсивним ростом статевих залоз і його закінченням у 10 - 12-місячному віці, а фізіологічне старіння кнурів відбувається у віці 5 - 6 років. Для осіменіння яйцеклітин in vitro були використані епідидимальні сперматозоїди кнурів різних вікових груп для визначення життєздатності та запліднювальної здатності таких гамет.

Результати запліднення поза організмом дозрілих в умовах in vitro яйцеклітин свиней свідчать, що із збільшенням віку кнурів (1,5; 2; 3,5; 4 роки) спостерігається тенденція розвитку ембріонів до стадії ранньої морули-бластоцисти (табл. 4). Рівень дроблення ембріонів поза організмом був найвищим, коли осіменяли яйцеклітини гаметами 3,5-річного кнура і цей показник був вірогідно вищим, порівняно з використанням сперматозоїдів 4-річного самця. Найбільшу кількість ембріонів in vitro на стадії морули-бластоцисти виявлено в разі осіменіння яйцеклітин in vitro гаметами 4-річного кнура. Цей показник був вищим в 2,5 рази, ніж в разі використання сперматозоїдів 1,5-річного кнура і на 8 % перевищував 2-річного плідника.

Таким чином, із збільшенням віку кнурів-донорів епідидимальних сперматозоїдів зростає результативність формування in vitro ембріонів свиней (9,7 %; 15,8 %; 19,4 %; 23,5 %), але відсутність вірогідної різниці між показниками свідчить про можливість використання гамет, вилучені із хвостових частин придатків сім'яників кнурів різних вікових груп для генетичних досліджень та як метод збереження генофонду тварин.

Ефективність ембріонального розвитку свиней in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів, заморожених у «ЛГЖ»

Вік кнурів, роки	Кількість осіменених яйцеклітин, n	Кількість (%)
		зигот	2-4-клітинних зародків	ранніх морул - бластоцист
1,5	62	32a(51,6±6,3)	28b(45,2±6,3)	6e(9,7±3,8)
2	120	59a(49,2±4,6)	48b(40,0±4,5)	19e(15,8±3,3)
3,5	72	44a(61,1±5,7)	40bc(55,6±5,9)	14e(19,4±4,7)
4	81	37a(45,7±5,5)	29bd(35,8±5,3)	19e(23,5±4,7)

b:c - P = 0,05; c:d - P < 0,05, критерій ч².

Ефективність ембріонального розвитку свиней in vitro залежно від породи кнурів. Відомо, що запліднювальна здатність еякульованих сперматозоїдів кнурів породи велика біла і ландрас за результатами штучного осіменіння суттєво не відрізняється (Рибалко В.П., 1999). Для оцінки впливу породної належності кнурів на стійкість епідидимальних сперматозоїдів до заморожування і ефективність формування ембріонів свиней in vitro використали гамети статевозрілих кнурів породи ландрас і велика біла. Встановлено, що з використанням гамет кнура породи ландрас одержано вищий рівень формування зигот і дроблення ембріонів (табл. 5), порівняно із кнуром великої білої породи (на 2,4 % і 5,2 %, відповідно), хоча різниця невірогідна.

Ефективність ембріонального розвитку свиней in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів кнурів різних порід

Епідидимальні сперматозоїди кнура	Кількість осіменених яйцеклітин, n	Кількість (%)
		зигот	2-4-клітинних зародків	ранніх морул-бластоцист
Ландрас	62	32a(51,6±6,3)	28b(45,2±6,3)	6c(9,7±3,8)
Велика біла	120	59a(49,2±4,6)	48b(40,0±4,5)	19c(15,8±3,3)

Розвиток ембріонів до доімплантаційних стадій був на 6 % вище із використанням гамет кнура великої білої породи для in vitro осіменіння яйцеклітин, порівняно з породою ландрас. Вірогідної різниці під час формування in vitro ембріонів свиней з використанням гамет кнурів породи ландрас і велика біла не виявлено. Отже можна для досліджень з ембріологічної генетики застосовувати епідидимальні сперматозоїди різних порід кнурів.

Формування in vitro ембріонів великої рогатої худоби з використанням епідидимальних сперматозоїдів бугаїв

Фізіологічні характеристики епідидимальних гамет бугаїв, які не використовувались. Відомо, що епідидимальні сперматозоїди дорослих бугаїв-плідників проявляють високі показники життєздатності після заморожування-розморожування (Ковтун С.І., та ін., 2002; Буркат В.П., та ін., 2005). З епідидимісів 6 - 8-річних бугаїв можна вилучити біля 1,5 мл суміші сперматозоїдів, яка містить у середньому 7 млрд. гамет з проявом активності 7 - 9 балів (Кузнєцова І.Б., 1997).

Нами встановлено, що від бугаїв 2-річного віку (25 гол.), які не використовувались для взяття сперми, можливо отримати від одного самця в середньому 0,33 мл суміші з близько 1,5 млрд. гамет із активністю від 2 до 7 балів. Лише у 9 досліджуваних бугаїв епідидимальні сперматозоїди мали бальну оцінку. А активності гамет решти 16 бугаїв не виявлено.

Згідно ДСТУ 3535 - 97 рекомендованими вимогами до якості нативної сперми бугаїв, яка призначена для кріоконсервування, є використання еякулятів з проявом активності гамет не менше 6 балів. Епідидимальні сперматозоїди лише у 1/3 досліджуваних бугаїв проявляли активність 6 - 7 балів. Тому кріоконсервування сперматозоїдів із придатків сім'яників, одержаних від бугаїв, які не використовувались для регулярного взяття еякульованої сперми, є малоефективним. Глибоке заморожування тестикулярних сперматозоїдів ссавців та із різних частин епідидиміса нині відкриває нові можливості ефективного збереження і раціонального використання генетичних ресурсів, розвитку сучасних методів ембріологічної генетики (Ернст Л.К., 2008).

Аналіз морфологічних показників отриманих гамет проведений на 17 бугаях м'ясних порід (абердин-ангус, волинська, герефордська; 1-ша група) і 6 бугаях сірої української породи (2-га група). Встановлено (табл. 6), що більший середній об'єм суміші гамет із придатка сім'яника можна отримати від тварин сірої української породи.

Вилучення епідидимальних сперматозоїдів бугаїв

Група досліду	Кількість бугаїв	Об'єм (мл) суміші сперматозоїдів, M ± m	Сv, %
1	17	0,28±0,029	3,4
2	6	0,37±0,051	4,2

Аналізуючи активність сперматозоїдів слід відмітити, що гамети бугаїв сірої української породи проявляли її лише на рівні 2 балів, а група бугаїв м'ясних порід - 6 - 7 балів. Це можна пояснити відмінностями у скороспілості тварин різних груп. Сіра українська порода великої рогатої худоби не скороспіла і в разі вирощування досліджуваних бугаїв навіть у 2-річному віці проявляє знижені показники спермопродуктивності.

Оцінка ембріонального розвитку великої рогатої худоби в умовах in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів бугаїв. Нами проведено порівняння ефективності одержання in vitro зародків великої рогатої худоби з використанням для осіменіння яйцеклітин поза організмом свіжоодержаних і кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів бугаїв голштинської породи (Океан 2163 та Араб 1985). За результатами цитогенетичного аналізу встановлено, що вищий на 21,6 % рівень запліднення яйцеклітин корів після осіменіння забезпечують свіжоодержані епідидимальні сперматозоїди бугаїв (табл. 7).

Ембріональний розвиток in vitro в разі використання епідидимальних сперматозоїдів бугаїв

Епідидимальні сперматозоїди	Кількість осіменених яйцеклітин, n	Кількість (%)
		зигот	2-4-клітинних зародків	ранніх морул - бластоцист
Свіжоодержані	64	55a(85,9±4,4)	49c(76,6±5,3)	16e(25,0±5,4)
Кріоконсервовані	143	92b(64,3±4,0)	87d(60,8±4,1)	17f(12,0±2,7)

c:d, e:f - P < 0,05; a:b c - P < 0,01, критерій ч².

Суттєві відмінності встановлені у рівні дроблення ембріонів. В разі використання кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів цей показник на 15,8 % нижче, ніж в разі використання свіжоодержаних епідидимальних сперматозоїдів. Розвиток ембріонів до доімплантаційних стадій (рис. 2) на 13 % вище в експериментах із використанням свіжоодержаних гамет, порівняно з кріоконсервованими.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Сформовані in vitro зародки великої рогатої худоби на стадії пізньої морули (> 32 - > 64 бластомерів)

Вплив надшвидкого заморожування зародків великої рогатої худоби на їх розвиток in vitro

Морфологічний контроль розвитку поза організмом одержаних in vivo ембріонів після їх надшвидкого заморожування. Відомо, що стадія розвитку впливає на чутливість ембріонів до надшвидкого заморожування - найбільш життєздатними після розморожування є сформовані in vitro зародки великої рогатої худоби на стадії бластоцисти (Кузнєцова І.Б., 1999). Вилучені нами від корів-донорів 42 повноцінні зародки на стадії компактної морули культивували поза організмом 12 годин. Для визначення ефективності надшвидкого заморожування ембріони, які досягли стадії ранньої бластоцисти (95,2 %), піддавали надшвидкому заморожуванню в розчині EФС40.

Після 2-хвилинного перебування зародків у ЕФС40 перед заморожуванням у понад 30 % заморожено-розморожених бластоцист відбувалась відновлення структури і вони розвинулись до стадії бластоцисти, що розширюється (рис. 3). Після додаткового 24-годинного культивування поза організмом такі зародки не здатні до досягнення стадії експандованої (розширеної) бластоцисти, тобто їх розвиток припинився відразу після розморожування. Застосування 1,5-хвилинної еквілібрації ембріонів у розчині ЕФС40 забезпечило 82 % життєздатних ембріонів після розморожування і розвиток до стадії розширеної бластоцисти на рівні 63,6 %. 5- та 10-хвилинна еквілібрація зародків в наших дослідженнях виявилась не ефективною - всі ембріони (по 8 шт.) після розморожування не проявляли ознак життєздатності.

Надшвидкий метод заморожування ембріонів у рідкому азоті підвищує ефективність комерційного застосування методу трансплантації ембріонів, оскільки дає можливість проводити кріоконсервування ембріонів у практичних умовах відразу після вимивання зародків на місці з мінімальними трудовими і фінансовими витратами.



Рис. 3. Вплив різного часу еквілібрації у розчині ЕФС40 на життєздатність ембріонів, вилучених від корів-донорів

Цитогенетичний аналіз стану хроматину ембріонів великої рогатої худоби після надшвидкого заморожування. Відпрацювання умов чіткого аналізу відповідності морфологічного стану ембріонів за результатами візуальної оцінки в комплексі з цитогенетичними характеристиками підвищує ефективність відбору найбільш життєздатних зародків після біотехнологічних маніпуляцій з ними. Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів ембріонів після розморожування та культивування поза організмом протягом 5 - 6 год. дозволяє об'єктивно оцінити життєздатність ембріонів і передбачити їх морфологічний стан.

В результаті дослідження після попереднього перебування ембріонів великої рогатої худоби в розчині ЕФС40 протягом 5 та 10 хв. з наступним заморожуванням-розморожуванням структура майже всіх зародків не відновлювалась і більша частина ядер перебувала у вираженому пікнотичному стані з проявом злиття у темну гомогенну масу.

Відомо, що швидке відновлення вихідної структури ембріонів на стадії ранньої бластоцисти після їх розморожування характеризується утворенням трофобласту, формуванням порожнини і свідчить про їх життєздатність (Кауффольд П., 1990). Встановлено, що найбільш ефективною для одержання таких характеристик зародків після розморожування виявилась попередня еквілібрація їх в розчині ЕФС40 1,5 та 2 хв. Прояв ембріонами повноцінних морфологічних характеристик після їх розморожування відповідає цитогенетичній оцінці ядер на стадії інтерфази мітозу (табл. 8).

Отже, між морфологічними характеристиками стану кожного ембріона, що оцінений за результатами візуальної оцінки та станом ядер, вираженого після аналізу цитогенетичних препаратів, існує взаємозв'язок. Після детальної ідентифікації стану хромосомного матеріалу ембріонів на різних стадіях розвитку зажиттєва оцінка зовнішніх ознак ембріонів є найбільш ефективною для відбору найбільш життєздатних.

Характеристика життєздатності ембріонів після заморожування в ЕФС40

Час еквілібрації, хв.	Кількість ембріонів, шт.	Стан ембріонів після розморожування і короткотривалого культивування in vitro
		морфологічна характеристика	цитогенетична характеристика
1,5 і 2	17	відновлення вихідної структури	ядра всіх бластомерів повноцінні з ідентифікованими ядерцями
5 і 10	12	відсутність відновленої структури, руйнування окремих бластомерів	більша частина ядер у вираженому пікнотичному стані з проявом злиття у гомогенну масу

ВИСНОВКИ

1. Для розробки комплексної оцінки епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і кнурів опрацьовано підходи щодо їх кріоконсервування та перевірена їх запліднювальна здатність під час одержання ембріонів поза організмом. Одержано нові наукові дані щодо генетичних аспектів гаметогенезу ссавців за комплексної характеристики епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і кнурів. Узагальнено роль методів ембріологічної генетики, які ґрунтувались на вивченні реалізації генетичної інформації під час формування ембріонів великої рогатої худоби і свиней in vitro і аналізі цитогенетичних характеристик їх розвитку.

2. Встановлено, що гіпобіотичний стан та збереження цілісності акросоми епідидимальним сперматозоїдам кнурів забезпечує середовище «Androstar» і температура +4єС. Такі умови дозволяють запобігти деструктивним змінам гамет і забезпечити їх виживаність не менше 10 діб із середнім значенням активності 3,5 бали.

3. Цитогенетичним контролем розвитку ембріонів свиней in vitro виявлено, що наявність залишку сперматидної цитоплазми на хвостиках епідидимальних сперматозоїдах кнурів не має негативного впливу на формування зародків поза організмом. Такі сперматозоїди забезпечують запліднювальну здатність яйцеклітин на рівні 58,5 %, одержання роздроблених ембріонів не нижче 42 %.

4. За результатами цитогенетичного аналізу встановлено, що рівень формування зигот свиней in vitro є подібним коли для осіменіння поза організмом яйцеклітин використовували епідидимальні сперматозоїди, які були заморожені в середовищі «ЛГЖ» і «Біоконсан» (51,9 % і 55,2 %, відповідно). Відсоток розвитку придатних для імплантації зародків суттєво не відрізнявся (16,6 % і 21,0 % для «ЛГЖ» і «Біоконсан», відповідно).

5. Шляхом комплексного морфо- та цитогенетичного аналізу ефективності розвитку ембріонів свиней in vitro з використанням епідидимальних сперматозоїдів кнурів різного віку встановлена тенденція, що середовище «Біоконсан» і «ЛГЖ» для їх заморожування забезпечують високий рівень формування зигот (61,2 % для 2-річного плідника та 56,1 % для 4-річного і 49,2 % для 2-річного плідника та 45,7 % для 4-річного, відповідно).

6. Доведено, що із збільшенням віку кнурів-донорів епідидимальних сперматозоїдів (1,5; 2; 3,5; 4 роки) закономірно зростає результативність формування in vitro ембріонів свиней (9,7 %; 15,8 %; 19,4 %; 23,5 %). Відсутність вірогідної різниці між показниками свідчить про ефективне використання гамет, вилучених із хвостових частин придатків сім'яників кнурів різних вікових груп, у біотехнологічних дослідженнях на основі генетики розвитку та як метод збереження генофонду тварин.

7. Розроблено комплексний підхід досліджень епідидимальних сперматозоїдів бугаїв на основі якого встановлено, що гамети самців, які не використовувались як плідники, проявляють активність на рівні 6 - 7 балів лише у 1/3 досліджуваних тварин. Встановлено, що транспортування епідидимісів разом із сім'яниками забезпечує активність сперматозоїдів від 3 до 6 балів у 55,6 % досліджуваних тварин, а в разі відокремлення придатка сім'яника подібна активність гамет виявлена лише у 25 %.

8. За результатами цитогенетичного аналізу встановлено, що використання свіжовилучених епідидимальних сперматозоїдів бугаїв для осіменіння in vitro яйцеклітин забезпечує вищий рівень формування зигот (85,9 %), порівняно із кріоконсервованими (64,3 %, Р < 0,01). Це забезпечує більш ефективний розвиток поза організмом утворених ембріонів, що проявлялось суттєво вищим рівнем дроблення зародків (76,6 % проти 60,8 %, відповідно, Р < 0,05) та формуванням ембріонів (25,0 % проти 12,0 %, відповідно, Р < 0,05).

9. Шляхом детального цитогенетичного аналізу вилучених від корів-донорів ембріонів, які піддавали надшвидкому заморожуванню, оцінено їх життєздатність за станом ядер. Встановлено, що прояв ембріонами повноцінних морфологічних характеристик після їх розморожування відповідає цитогенетичній оцінці ядер на стадії інтерфази мітозу.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Для підвищення рівня використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин застосовувати метод кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів. Враховуючи вивчені закономірності сперматогенезу епідидимальних гамет застосовувати їх у селекційному процесі та для збереження генофонду неконкурентоспроможних племінних ресурсів.

2. На основі методики надшвидкого заморожування ембріонів великої рогатої худоби впровадити в практику трансплантації детальну цитогенетичну оцінку зародків у програмах збереження генофонду тварин.

3. Враховуючи генетичний механізм раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней під час розвитку зародків in vitro застосовувати цей метод для аналізу спермопродукції плідників.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Щербак О. В. Використання методу вітрифікації при заморожуванні ембріонів великої рогатої худоби / О. В. Щербак // Вісн. аграр. науки. - 2005. - № 2. - С. 77-78.

2. Куновський Ю. В. Отримання зародків свиней in vitro з використанням гамет самиць різного віку / Ю. В. Куновський, О. В. Щербак // Вісн. аграр. науки. - 2006. - № 6. - С. 78-79. (Дисертантом заплановані дослідження, виконана експериментальна частина роботи, підготовлено текст статті до друку).

3. Ковтун С. И. Использование эпидидимальных сперматозоидов для сохранения генофонда / С. И. Ковтун, О. Д. Бирюкова, О. В. Щербак // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології : Зб. наук. пр. - К. : ЛОГОС, 2007. - Т. 1. - С. 249-252. (Дисертантом зібраний і проаналізований експериментальний матеріал).

4. Щербак О. В. Епідидимальні сперматозоїди кнурів та ефективність ембріогенезу свиней in vitro / О. В. Щербак // Наук. - техн. бюл. / УААН, Ін-т тваринництва. - Х., 2008. - № 96. - С. 469-472.

5. Щербак О. В. Морфологічна оцінка епідидимальних сперматозоїдів бугаїв / О. В. Щербак // Вісник аграрної науки. - 2008. - № 6. - С. 81-82.

6. Щербак О. В. Біотехнологічні методи одержання і зберігання гамет сільськогосподарських тварин / О. В. Щербак, П. А. Троцький, А. Б. Зюзюн // Фактори експериментальної еволюції організмів : Зб. наук. пр. - 2008. Т. 5. - С. 463-467. (Дисертантом узагальнено матеріали досліджень, сформульовано висновки, підготувала текст статті).

7. Пат. 33658 Україна, МПК А 61D 19/02. Спосіб кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів / Ковтун С. І., Щербак О. В., Мелешко Н. Я.; заявник і патентовласник Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - u 2008 00502; заявл. 15.01.08; опубл. 10.07.08, Бюл. № 13. (Дисертант виконала експериментальну частину, сформулювала висновки).

8. Щербак О. В. Кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби методом вітрифікації // Матеріали конф. молодих вчених та аспірантів / О. В. Щербак // Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - Чубинське, 2004. - С. 53-54.

9. Щербак О. В. Нові підходи при кріоконсервуванні гамет сільськогосподарських тварин / О. В. Щербак // Конференція молодих вчених та аспірантів / Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - с. Чубинське, 2005. - С. 71-73.

10. Ковтун С. І. Методика отримання, короткотривалого зберігання і кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів бугаїв та кнурів / С. І. Ковтун, Н. Я. Мелешко, О. В. Щербак // Методики наукових досліджень із селекції, генетики та біотехнології у тваринництві : наук. зб. - К., 2005. - С. 200-204. (Дисертант приймала участь у розробці методики отримання і кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів бугаїв та кнурів, готувала текст до друку).

11. Ковтун С. І. Заморожування методом вітрифікації ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vivo та in vitro / С. І. Ковтун, О. В. Щербак // Методики наукових досліджень із селекції, генетики та біотехнології у тваринництві : наук. зб. - К., 2005. - С. 204-209. (Дисертантом висвітлені теоретичні і методичні аспекти вітрифікації ембріонів великої рогатої худоби).

12. Щербак О. В. Дослідження епідидимальних сперматозоїдів бугаїв // Матеріали ІV конф. молодих вчених та аспірантів / О. В. Щербак // Ін-т розведення і генетики тварин УААН. - с. Чубинське, 2006. - С. 93-94.

13. Nanocomposites in biotechnology for prolonged preservation of gene pool (synthesis and application) / N. P. Galagan, I.V. Siora, S. I. Kovtun, O. V. Scherbak // ХІ Polish - Ukrainian Symposium «Theoretical and experimental studies of interfacial phenomena and their technological applications», August 22 - 26, 2007. - Krasnobrod - Zamosc, 2007. - P. 27. (Дисертант приймала участь у проведенні експериментів, узагальненні одержаних результатів).

14. Щербак О. В. Епідидимальні сперматозоїди кнурів і формування ембріонів in vitro // Матеріали VІ конф. молодих вчених та аспірантів / О. В. Щербак // Ін-т розвед. і генет. тварин УААН. - с. Чубинське, 2008. - С. 99-100.

15. Щербак О. В. Вплив температури на гіпобіотичний стан епідидимальних сперматозоїдів кнурів // Тези міжнародної наукової конференції, що була проведена на базі кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М. Ф. Гулого Національного аграрного університету «Гіпобіоз - фундаментальні та прикладні аспекти». - К., 2008. - С. 35-36.

АНОТАЦІЇ

Щербак О.В. Генетичний аналіз раннього ембріогенезу великої рогатої худоби і свиней in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, с. Чубинське, Київської обл., 2009.

Викладено результати комплексного аналізу генетичних аспектів ембріогенезу великої рогатої худоби та свиней in vitro на основі комплексної характеристики епідидимальних сперматозоїдів. Опрацьовано підходи щодо кріоконсервування таких гамет бугаїв та кнурів, перевірено їх запліднювальну здатність під час одержання ембріонів поза організмом. Встановлено, що зниження температури зберігання до +4С запобігає деструктивним змінам у епідидимальних сперматозоїдах кнурів і забезпечує виживаність не менше 10 діб із середньою активністю гамет 35 %. Не виявлено негативного впливу наявності залишку сперматидної цитоплазми на хвостиках епідидимальних сперматозоїдів кнурів на формування зародків поза організмом. Встановлено, що з використанням середовищ «Біоконсан» і «ЛГЖ» для заморожування епідидимальних сперматозоїдів кнурів рівень формування зигот та розвиток ембріонів in vitro досягає 51,9 % і 55,2 % та 16,6 % і 21,0 %, відповідно. Одержано високий рівень розвитку ембріонів in vitro після використання сперматозоїдів, вилучених із придатків сім'яників кнурів різних вікових груп (1,5; 2; 3,5; 4 роки). Розроблено комплексний підхід під час дослідження епідидимальних сперматозоїдів бугаїв і доведена низька ефективність використання їх для заморожування, коли такі гамети вилучали у бугаїв, які не використовувались як плідники. Після осіменіння in vitro яйцеклітин корів свіжовилученими епідидимальними сперматозоїдами рівень формування зигот (85,9 %) є вищим, порівняно із кріоконсервованими сперматозоїдами (64,3 %). Обґрунтовано доцільність застосування цитогенетичного контролю оцінки біологічної повноцінності ембріонів великої рогатої худоби після надшвидкого заморожування.

Ключові слова: епідидимальні сперматозоїди, ооцити, запліднення in vitro, ранній ембріогенез, ембріологічна генетика

Щербак О.В. Генетический анализ раннего эмбриогенеза крупного рогатого скота и свиней in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское, Киевской обл., 2009.

Изложены результаты комплексного анализа генетических аспектов эмбриогенеза крупного рогатого скота и свиней in vitro с использованием комплексной характеристики эпидидимальных сперматозоидов. Отработаны подходы криоконсервирования таких гамет быков и хряков, проверена их оплодотворяющая способность при получении эмбрионов вне организма. Установлено, что сниженная температура до +4С предотвращает деструктивные изменения эпидидимальных сперматозоидов хряков и обеспечивает выживание не менее 10 суток со средней активностью гамет 35 %. Не обнаружено негативного влияния наличия остатка сперматидной цитоплазмы на хвостиках эпидидимальных сперматозоидов хряков на формирование зародышей вне организма. Установлено, что при использовании сред «Биоконсан» и «ЛГЖ» для замораживания эпидидимальных сперматозоидов хряков уровень формирования зигот и развитие эмбрионов in vitro составляет 52,9 % и 55,2 % и 16,6 % и 21 %, соответственно. Получен высокий уровень развития эмбрионов in vitro после использования сперматозоидов, полученных из придатков семенников хряков различных возрастных груп (1,5; 2; 3,5; 4 года). Разработан комплексный подход при исследовании эпидидимальных сперматозоидов быков. Установлена низкая эффективность использования их для замораживания, когда такие гаметы получали от быков, которых не использовали в качестве производителей. После осеменения in vitro яйцеклеток коров свежеполученными эпидидимальными сперматозоидами уровень формирования зигот более высокий (85,9 %), сравнительно с криоконсервированными сперматозоидами (64,3 %). Обоснована целесообразность использования цитогенетического контроля для оценки биологической полноценности эмбрионов крупного рогатого скота после сверхбыстрого замораживания. Установлена взаимосвязь между прижизненной морфологической характеристикой in vivo полученных эмбрионов крупного рогатого скота и состоянием хроматина ядер. Разработаны элементы технологии получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота и свиней с использованием эпидидимальных сперматозоидов быков и хряков. При этом получены дополнительные научные данные о закономерностях раннего эмбриогенеза животных, что способствует усовершенствованию методов использования генетического потенциала животных для сохранения генофонда неконкурентоспособных племенных ресурсов.

Ключевые слова: эпидидимальные сперматозоиды, ооциты, оплодотворение in vitro, ранний эмбриогенез, эмбриологическая генетика.

Shcherbak, O.V. Cattle and Porcine Early Embryogenesis in vitro: Genetic Analysis. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree for Agricultural Sciences on a specialty 03.00.15 - Genetics - Institute for Animal Breeding and Genetics UAAS, v.Chubinske, Kyiv Region, 2009.

Combined genetic analysis of cattle and porcine embryogenesis in vitro was done considered the complex characteristic of epididymal spermatozoa. After working out the approaches to cryopreservation of bull and boar epididymal spermatozoa, their fertilizing ability was checked based on in vitro embryo production. It was shown, that preservation at +4^oC prevents the destructive alterations in epididymal spermatozoa and maintains their survival for up to 10 days with 35 % of average sperm motility. Any negative impact on in vitro porcine embryo development was noticed when boar epididymal spermatozoa with the tails bearing cytoplasmic residues were used for in vitro fertilization. With the use of cryopreservation solutions «Biokonsan» and lactose-glycerol-egg yolk buffer, rates of following in vitro fertilization and embryo development were 51.9, 55.2, and 16.6, 21.0 % correspondingly. In vitro fertilization with epididymal spermatozoa obtained from bulls of different age (1.5, 2, 3.5, and 4 years old) resulted in high rate of the following in vitro embryo development. Complex analysis developed for bull epididymal spermatozoa revealed the low efficacy of cryopreservation for epididymal spermatozoa retrieved from bulls not used as sires. After in vitro insemination, fertilization rate of cow oocytes was significantly higher for fresh epididymal bull spermatozoa in comparison with the frozen-thawed ones (85.9 versus 64.3 % correspondingly). Cytogenetic analysis was proven to be effective for assessment of cattle embryos viability after the ultra-speed freezing.

...