Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет біоресурсів і природокористування України

УДК 579.864+616-095+579.61:615.27

03.00.20 біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Особливості відбору пробіотичних культур роду lactobacillus для створення препаратів і продуктів різного призначення

Дехтяренко Наталія Віталіївна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Національному технічному університеті України "Київський політехнічний інститут" Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор Дуган Олексій Мартем'янович, Національний технічний університет України "Київський політехнічний інститут", декан факультету біотехнології і біотехніки

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Постоєнко Володимир Олексійович, Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, заступник директора з наукової роботи

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Головач Тетяна Миколаївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, старший науковий співробітник відділу фізіології промислових мікроорганізмів

Захист відбудеться 4 грудня 2009 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.15 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус 4, к. 28

Автореферат розісланий 3 листопада 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Коломієць Ю.В.

Анотації

Дехтяренко Н.В. Особливості відбору пробіотичних культур роду lactobacillus для створення препаратів і продуктів різного призначення. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено вивченню закономірностей прояву специфічних біологічних властивостей штамів роду Lactobacillus при створенні пробіотиків різних типів, згідно з регламентованими FAO/WHO guidelines for evaluation of probiotics in food, та із залученням додаткових критеріїв відбору.

Базові робочі культури L. delbrueckii subsp. lactis LE і L. rhamnosus LB3 реідентифіковано з використанням біохімічного тесту (АРІ-система). З огляду на широкий спектр антимікробної активності субстанцій на основі ліофілізованих клітин базових штамів щодо збудників запальних захворювань, високу адгезивну активність та антибіотикостійкість їх рекомендовано для створення пробіотичних препаратів та продуктів.

Показано переважно стимулюючий вплив "Йодіс" води і твіну 80 на ряд пробіотичних властивостей лактобактерій. Рекомендовано додаткові критерії відбору пробіотичних культур: аналіз літичної чутливості їх клітинних стінок, стійкості до цитостатиків та врахування сезонних змін біологічної активності. біологічний пробіотик лактобактерія

Виявлено суттєві відмінності в чутливості до дії гідролітичного ферментного препарату між термо- та стрептобактеріями.

Для різних видів лактобактерій встановлено факт значної стійкості до цитостатичних препаратів і зміну біологічних властивостей після обробки.

Для дванадцяти представників роду Lactobacillus виявлено високу фізіологічну стабільність протягом року і чіткий розподіл за ростовою активністю на видові групи. Показано, що рівень накопичення біомаси в різні сезони залежить від виду лактобактерій.

Ключові слова: пробіотик, продуцент, критерії відбору, антимікробна активність, адгезія, імуногенність, літична чутливість, цитостатик, сезонність.

Дехтяренко Н.В. Особенности отбора пробиотических культур рода Lactobacіllus для создания препаратов и продуктов разного назначения. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 биотехнология. Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена изучению закономерностей проявления специфических биологических свойств штаммов рода Lactobacіllus при создании пробиотиков разных типов, согласно регламентированных FAO/WHO guіdelіnes for evaluatіon of probіotіcs іn food и с привлечением дополнительных критериев отбора. Базовые рабочие культуры L. delbrueckіі subsp. lactіs LE и L. rhamnosus LB3 идентифицированы с использованием биохимического теста (АРI-система).

Установлена высокая антимикробная активность клеток указанных культур относительно условно-патогенных микроорганизмов возбудителей болезней теплокровных. Штамм L. rhamnosus LB3 проявляет высокую антагонистическую активность к дрожжам рода Candіda. Подобран криопротектор сахароза-10%, желатин-1% для микробных субстанций на основе лиофилизированных клеток базовых штаммов. Учитывая широкий спектр антимикробной активности субстанций относительно возбудителей воспалительных заболеваний и высокую адгезивную активность, они рекомендованы для создания пробиотических препаратов и продуктов.

Показано преимущественно стимулирующее влияние "Йодис" воды (концентрация йода 2,5 мг/л) и твина 80 (0,1%) на антагонистическую активность продуктов метаболизма и иммунологическую активность представителей видов L. rhamnosus, L. acіdophіlus, L. delbrueckіі, L. plantarum.

Рекомендованы дополнительные критерии отбора пробиотических культур: анализ литической чувствительности их клеточных стенок, устойчивости к цитостатикам и учет сезонных изменений биологической активности.

Выявлено существенные изменения в чувствительности к действию гидролитического ферментного препарата между термо- и стрептобактериями. Показано, что литическая чувствительность и иммуногенность ферментолизатов клеток лактобактерий являются индивидуальными свойствами для каждого штамма и поддаются управлению путем изменения условий культивирования.

Базовые продуценты проявляют устойчивость к представителям цефалоспоринових антибиотиков практически всех поколений, аминогликозидам, фторхинолонам. Штамм L. rhamnosus LB3 устойчив к пенициллиновым антибиотикам.

Установлен факт значительной устойчивости и изменения биологических свойств после культивирования представителей вида L. delbrueckіі с цитостатическими препаратами трех разных химических групп Tegafur, Cіsplatіn и Cytophosphan, МПК которых на третьи сутки составляла 500 мкг/мл. МПК препарата Тhіophosphamіde была значительно меньшей (7,8 мкг/мл), но в то же время в 2 раза превышала ТЭК препарата.

Показано, что культивирование с препаратом Сisplatin в дальнейшем стимулирует рост представителей вида L. delbrueckіі. Иммунологическая активность ферментолизатов после обработки Cisplatin и Cytophosphan у штамма LE увеличивается, а у типового представителя вида L. delbrueckii subsp. delbrueckii DSM 20074 уменьшается.

Еще семь видов лактобактерий также обнаружили устойчивость к цитостатикам Cisplatin, Doxorubicin, Methotrexate, Vinblastin в широком диапазоне концентраций с превышением ТЭК в 8256 раз.

Для двенадцати представителей рода Lactobacіllus выявлена высокая физиологическая стабильность на протяжении года и четкое распределение по ростовой активности на три видовые группы: высокоактивные (L. plantarum 213, L. rhamnosus LB3, L. rhamnosus LB4, L. acidophilus + L. rhamnosus (Canada), L. rhamnosus (Canada)), среднеактивные (L. murinus DSM 20452, L. acidophilus (Canada), L. acidophilus Ер 317/402) и слабоактивные (L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB51, L. delbrueckii subsp. lactis LE, L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB86, L. delbrueckii subsp. delbrueckii DSM 20074). Показано, что уровень накопления биомассы в разные сезоны зависит от вида лактобактерий: для представителей первых двух групп максимальные показатели прироста биомассы характерны для летне-осеннего, минимальные для зимне-весеннего периода.

Ключевые слова: пробиотик, продуцент, критерии отбора, антимикробная активность, адгезия, иммуногенность, литическая чувствительность, цитостатик, сезонность.

Dekhtyarenko N.V. Features of selection of probiotics cultures of the genus Lactobacillus for creation of preparations and products of the different setting. - The manuscript.

Thesis for a candidate's degree by a speciality 03.00.20 - biotechnology.- National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Dissertation is devoted the study of features display of specific biological properties of cultures of the genus Lactobacillus at creation of probiotics of different types, in obedience to regulated FAO/WHO of guidelines for evaluation of probiotics in food and with bringing in of additional criteria of selection.

Base workings cultures of L. delbrueckii subsp. lactis LE and L. rhamnosus of LB3 it is reidentified with the use of biochemical test (ARI-system). Taking into account the wide spectrum of antimicrobial activity of substances on the basis of living freeze-drying cells of base cultures in relation to the exciters of inflammatory diseases and high adhesion activity they is recommended for creation of preparations and products.

The additional criterions of selection probiotic cultures are recommended: the analysis of lytic sensitivity of their cell walls, stability to citostatics and count of seasonal changes of a biological activity.

A mainly stimulant influencing of "Yodis" of water and twin 80 on antagonism activity of products of metabolism of representatives of four types of LAB is shown. It is discovered that a lytic sensitiveness and immunogenysity of fermentolizativ of cells of LAB is individual a sign for every culture and added a management by the change of terms of cultivation.

Base producents display resistance to the wide spectrum of antibiotics. For various species of LAB the fact of considerable resistance to citostatics preparations and saving of biological properties after treatment is set.

For twelve representatives of the genus Lactobacillus found out high physiology stability for a year and clear division for growth activity on specific groups. It is shown that the level of accumulation of biomass in different seasons depends on the species of LAB.

Key words: probiotic, producent, criteria of selection, antimicrobial activity, adgezion, immunogennisity, lytic sensitiveness, citostatic, seasonality.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Молочнокислі бактерії роду Lactobacillus уже протягом кількох десятиріч привертають посилену увагу дослідників. Встановлено їх домінуючу роль у забезпеченні нормального функціонування мікробіоценозів людини і тварин (Шендеров, 1998; Kruisselbrink, 2001), що дає змогу віднести лактобактерії до групи GRAS (generally regarded as safe) мікроорганізмів (Kruger, 2002).

Стрімке збільшення кількості факторів, які призводять до руйнування нормобіоценозів (Шендеров, 1987; Коршунов, 1995; Смирнов, 2002), призвело до виникнення такого поняття, як "пробіотична терапія", що засноване на концепції нормальної здорової мікрофлори. Забезпечити останню покликані пробіотики і продукти функціонального харчування (годівлі) пробіотичного походження (Isolauri, 2002; Stanton, 2001).

Рекомендації щодо єдиної поетапної системи оцінки пробіотиків і пробіотичних продуктів розроблені у 2002 році робочою групою Продовольчої і сільськогосподарської організації ООН (FAO) та Всесвітньою організацією охорони здоров'я (WHO). Згідно з цими рекомендаціями, на етапі досліджень in vitro штам проходить ідентифікацію, перевірку на стійкість до факторів шлунково-кишкового тракту, дослідження антагоністичних й адгезивних властивостей.

Разом з тим, для створення сучасних пробіотичних препаратів і продуктів виникає необхідність поглиблення та розширення критеріїв відбору продуцентів. Кожна з властивостей пробіотичного штаму повинна розглядатися через призму впливу на неї умов культивування, з подальшим з'ясуванням сили впливу і встановленням умов максимального прояву кожної з ознак. Перелік критеріїв відбору продуцента має визначатися терапевтичною спрямованістю пробіотичного препарату. Слід враховувати сезонність змін біологічних властивостей продуцента, а, отже, і варіювання значень критеріїв відбору в різні пори року.

Таким чином, пошук перспективних продуцентів пробіотичних препаратів і продуктів функціонального харчування (годівлі) пробіотичного походження з використанням відомих і залученням додаткових критеріїв відбору дозволить максимально виявити потенціал продуцента та реалізувати його при створенні високоефективного препарату (продукту).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалася в рамках науково-дослідних робіт кафедри промислової біотехнології факультету біотехнології і біотехніки НТУУ "КПІ": "Граніт" (програма розроблена на виконання Указу Президента України від 17 січня 1995 р. за № 53/95 "Про систему прогнозування генетичного ризику, впровадження нових технологій та забруднення навколишнього середовища"), підпрограма "Біотерапія" "Розробка методів корекції мутагенних впливів на організм людини з використанням біотерапевтичних препаратів із генопротекторними властивостями" (2002-2003 рр.); № 4/01 "Оптимізація технології отримання субстанції для нового вітчизняного препарату Бластен" (державний реєстраційний номер 0101U006113, 2001-2003 рр.); № 8/89-01-2001 "Розробка технології нового пробіотичного препарату для отоларингології" (державний реєстраційний номер 0101U004427, 2001-2005 рр.); № М/454-2003 "Розробка технологій нових пробіотиків, імунокоректорів, ад'ювантів" (державний реєстраційний номер 0103U007799, 2003-2005 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - розробити критерії відбору пробіотичних культур для створення препаратів різних типів на основі з'ясування закономірностей прояву специфічних біологічних властивостей штамів роду Lactobacillus.

Завдання дослідження:

1. Ідентифікувати базові робочі культури лактобактерій.

2. Визначити антагоністичний та адгезивний потенціал клітин лактобактерій.

3. Встановити антагоністичний потенціал продуктів метаболізму лактобактерій у вигляді супернатантних рідин і його залежність від складу поживного середовища з огляду на можливість створення пробіотиків "метаболітного" типу.

4. Вивчити літичну чутливість та імунологічний потенціал клітин лактобактерій і залежність цих показників від складу поживного середовища, для створення "лізатних" форм пробіотиків.

5. Визначити чутливість лактобактерій до хіміотерапевтичних препаратів: антибіотиків і цитостатиків.

6. Виявити сезонні зміни фізіолого-біохімічних властивостей культур лактобактерій.

Об'єкт дослідження - критерії відбору пробіотичних штамів лактобактерій.

Предмет дослідження - культури бактерій роду Lactobacillus, виділені з кисломолочних продуктів, комерційних пробіотичних препаратів і колекційні.

Методи дослідження: біотехнологічні, мікробіологічні, біохімічні, імунологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано як критерії відбору пробіотичних культур аналіз літичної чутливості їх клітинних стінок, стійкості до цитостатиків та сезонних змін фізіолого-біохімічних властивостей.

Показано суттєві відмінності в чутливості до дії гідролітичного ферментного препарату між термо- та стрептобактеріями і зміну літичної чутливості під впливом "Йодіс" води і твіну 80.

Вперше встановлено стійкість представників видів L. delbrueckii, L. rhamnosus, L. acidophilus, L. plantarum, L. murinus до цитостатичних препаратів і характер зміни їх біологічних властивостей після культивування з цитостатиками. Мінімальна інгібуюча концентрація цитостатиків, залежно від їх хімічної структури, в 2-256 разів перевищує терапевтичну еквівалентну концентрацію, що створюється в організмі хворого.

Проаналізовано сезонність зміни фізіолого-біохімічних властивостей штамів лактобактерій. Виявлено збільшення ростової активності представників видів L. rhamnosus, L. plantarum, L. murinus, L. acidophilus в літньо-осінній період і стабільність їх біосинтетичної здатності в різні пори року.

Вперше показано закономірності комплексного впливу складу поживного середовища на основні пробіотичні властивості лактобактерій: антагоністичну та імунологічну активності. Встановлено, що "Йодіс" вода і твін 80 активізують антимікробну активність представників видів L. delbrueckii, L. rhamnosus, L. acidophilus,

L. plantarum до умовно-патогенних мікроорганізмів та фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів при введенні лізатів клітин культур L. delbrueckii subsp. lactis LE (LE) і L. rhamnosus LB3 (LB3).

Практичне значення одержаних результатів. За результатами досліджень закономірностей прояву специфічних біологічних властивостей культур LE і LB3 у рамках регламентованих FAO/WHO guidelines for evaluation of probiotics in food, та із залученням додаткових критеріїв відбору встановлено перспективність використання вказаних культур для створення препаратів і продуктів з пробіотичною активністю.

На основі одержаних результатів розроблено рекомендації щодо критеріїв відбору штамів роду Lactobacillus для створення пробіотиків ветеринарного призначення.

Матеріали досліджень покладено в основу розробки рекомендацій для організації виробництва низки дієтичних добавок до раціону харчування на основі штамів LE і LB3, виробником яких є ТОВ "ГЕОРГ БІОСИСТЕМИ" (акт впровадження №257/12 від 5.04.2007 р.). Добавки отримали дозвіл Державної санітарно-епідеміологічної служби МОЗ України на використання (висновок державної cаніторно-епідеміологічної експертизи № 05.03.02-04/32719 від 12.07.2006 р.).

Спільно з Інститутом отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка АМН України розроблено препарати на основі клітин штамів LE і LB3 під робочими назвами Лактолор, Ацидолор, Ацидолак. Проведено лабораторні випробування технології виробництва (акт випробувань від 26.01.2006 р.). Препарати отримали дозвіл МОЗ України на обмежене застосування для лікування хворих на неспецифічні запальні захворювання верхніх дихальних шляхів (протокол №51 засідання Вченої медичної ради МОЗ України від 30.03.2001 р.).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою здобувача. Ним проаналізовано наукову літературу за темою дисертації, визначено мету і задачі роботи, вибрано методи дослідження. Дисертантом особисто поставлено більшість експериментів, написано наукові статті та тези доповідей на конференціях. Спільно з д.б.н., професором О.М. Дуганом і к.б.н., доцентом Л.М. Шинкаренко проведено аналіз і узагальнення первинних експериментальних матеріалів, зформульовано основні положення і висновки дисертації.

Розшифровку результатів ідентифікації культур лактобактерій з використанням програмного забезпечення APILAB Plus версії 3.3.3. здійснено у відділі фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України к.б.н. В.В. Лащевським. Експерименти з визначення антагоністичних і адгезивних властивостей виконувалися на базі Інституту отоларингології ім. проф.

О.С. Коломійченка АМН України. Препарат Циторецифен і методика лізису клітин лактобактерій надані к.т.н., доцентом кафедри промислової біотехнології ФБТ НТУУ "КПІ" Т.С. Тодосійчук. Імунологічні дослідження виконано на базі Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за сприяння к.м.н., с.н.с. відділу механізмів протипухлинної терапії С.І. Шпильової.

Самостійно проведено культивування лактобактерій для дослідних партій препаратів і дієтичних добавок на ферментаційному обладнанні, сконструйованому к.м.н. В.Ю. Черненком.

Апробація результатів дисертації. Теоретичні положення і практичні результати дисертації були висвітлені у доповідях і тезах чотирнадцяти всеукраїнських і міжнародних наукових конференцій: І Всеукраїнська науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих учених "Біотехнологія. Освіта. Наука" (Київ, 2003); ІІІ Міжнародна науково-практична конференція "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003); Міжнародна науково-практична конференція "Пробіотики - ХХІ століття. Біологія. Медицина. Практика" (Тернопіль, 2004); Х з'їзд Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004);

ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція "Біотехнологія. Освіта. Наука" (Львів, 2004); Перша Міжнародна конференція студентів та аспірантів "Молодь і поступ біології" (Львів, 2005); VI Національний з'їзд фармацевтів України (Харків, 2005); European conference on probiotics and their applications (Краків, 2005); VII Міжнародна конференція молодих онкологів "Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології" (Київ, 2006); Друга міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів (Львів, 2006); конференція-конкурс робіт молодих учених, присвячена 100-річчю від Дня народження В.О. Бєліцера "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології 2006" (Київ, 2006); ІІІ Всеукраїнська науково-практична конференція за міжнародною участю "Біотехнологія. Освіта. Наука. Практика" (Харків, 2006); VIIІ Конференция молодых онкологов с международным участием "Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии" (Киев, 2007), Международный конгресс "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 2007).

На ІІ конкурсі науково-технічних проектів молодих вчених під девізом "Інтелектуальний потенціал молодих вчених - місту Києву" (Київ, 2002), робота "Створення медичних препаратів нового покоління з широким спектром біотерапевтичної дії на основі клітин молочнокислих бактерій", одним з авторів якої був дисертант, була відзначена першою премією Київської міської державної адміністрації.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи здійснено 36 публікацій, що включають 14 статей (з них 5 - у фахових виданнях), 1 матеріали наукових досліджень у збірнику наукових праць, 20 тез у збірниках матеріалів конференцій, 1 методичні рекомендації.

Структура і обсяг дисертації. Повний обсяг дисертації 210 сторінок. Дисертація складається зі списку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали і методи досліджень", чотирьох розділів з описом та аналізом результатів особистих досліджень, обговорення, висновків, пропозицій виробництву, 7 додатків, списку використаних джерел з 312 найменувань (із них 115 іноземних авторів). Робота містить 23 таблиці, 39 рисунків.

Основний зміст роботи

Огляд літератури

Огляд літератури складається з семи підрозділів. У першому наведено сучасні принципи оцінки продуцентів пробіотичних препаратів та продуктів перелік критеріїв відбору; в подальших розглянуто стан і глибину розробки основних і додаткових критеріїв: ідентифікація, антагоністична, адгезивна та імунологічна активності, стійкість до хіміопрепаратів, сезонна активність. На основі здійсненого аналізу обгрунтовано актульність і перспективність проведення досліджень.

Матеріали і методи досліджень

У роботі використовували культури роду Lactobacillus з музею кафедри промислової біотехнології ФБТ НТУУ "КПІ", який створений і підтримується здобувачем особисто. Дві з них належали до базових L. delbrueckii subsp. lactis LE (LE) та L. rhamnosus LB3 (LB3). При ідентифікації штамів LE, LB3 вивчали їх морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки (Квасников, 1975). Спектр вуглеводів, що зброджується, визначали з використанням біохімічної системи АРІ 50 СН (виробник ВioMerieux, Франція).

Антагоністичну активність клітин лактобактерій до колекційних тест-культур досліджували методом перпендикулярних штрихів (Егоров, 2004). Ступінь чутливості тест-культур оцінювали за розмірами зон затримки росту: 5-15 мм - малочутливі, 15-20 мм помірно чутливі, 20-30 мм - чутливі, 30- 40 мм - високочутливі. Відповідно, штами лактобактерій володіли наступним рівнем антагоністичної активності: низьким, помірним, достатнім, високим (Смирнов, 1995; Борщ, 2004; Ермоленко, 2004).

За методикою визначення бактерицидної та бактеріостатичної дії (Навашин, 1982) аналізували антимікробну дію ліофілізованої біомаси складу 5109 КУО/дозі LE; 5109 КУО/дозі LB3; 11010 КУО/дозі LE та LB3 у співвідношенні 1:1, яку було одержано з використанням різних кріопротекторів; антагоністичну активність супернатантів культуральних рідин лактобактерій та молочної кислоти.

Ліофільне висушування біомаси проводили на установці УЗВ-10 (конструкція в модифікації Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України). Титр клітин визначали за ГОСТ 9225.

Залежність пробіотичних показників лактобактерій від складу поживного середовища вивчали на середовищі MRS (de Man, Rogosa, Sharpe, 1960) з вилученим з його складу емульгатором твіном 80 (MRS-2, MRS-3) або внесеною "Йодіс" водою мінеральна лікувально-столова йодована вода з концентрацією йоду 2,5мг/л (MRS-1, MRS-2) або внесеними обома компонентами (MRS-1).

Адгезивні властивості базових культур і мікроорганізмів збудників запальних захворювань вивчали за методом, запропонованим Брілісом, 1986. Як моделі використовували: еритроцити О(I) Rh(+) групи крові, лімфоїдні тканини піднебінних мигдаликів, носоглотки та аденоїдів. У дослід брали концентрацію клітин 106 кл/мл. Розраховували індекс адгезивності мікроорганізмів (ІАМ).

Лізис клітин лактобактерій проводили препаратом Циторецифен на основі літичного ферментного комплексу Streptomyces recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 (Тодосійчук, 2000). Були підібрані навантаження препарату на 1 мл суспензії клітин різних штамів. Вихідна концентрація розчину Циторецифену з активністю 140000 од/г становила 60 мг/мл. До 4 мл суспензії біомаси лактобактерій додавали 0,11-1,14 мл розчину.

Імунологічні властивості ферментних гідролізатів клітин лактобактерій визначали за рівнем стимуляції фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів. Використовували нелінійних білих мишей вагою 1820 г. Лізати стандартизували за вмістом білка (0,2±0,02 мг/мл) методом Лоурі (Досон, 1991). Дослідним тваринам вводили по 0,3 мл лізату інтраперитонеально. Контрольним - 1) 0,3 мл ізотонічного розчину; 0,3 мл розчину Циторецифену в концентрації 2) 0,6 мг/мл; 3) 3 мг/мл; 4) 6 мг/мл. Через три доби мишам обох груп вводили по 0,5 мл суспензії інактивованих клітин Saccharomyces cerevisiae. Через 30 хв мишей умертвляли, із змиву перитонеальної рідини готували мазки, які фарбували за модифікованим методом Паппенгейма-Крюкова (Кост, 1968).

Чутливість культур до антибіотиків визначали методом дифузії в агар із застосуванням стандартних паперових дисків (НИЦФ, г. Санкт-Петербург) на щільному середовищі МRS (Навашин, 1982).

Дослідження можливості росту культур лактобактерій в присутності цитостатиків проводили методом двократних серійних розведень на капустяному поживному середовищі та середовищі MRS (Егоров, 2004). Для кожного препарату розраховували ТЕК терапевтичну еквівалентну концентрацію (Фрешни, 1989) і обирали експериментальний діапазон в її межах. Посівні суспензії культур (0,5 McFarland) вносили в кількості 0,2 мл. Культури пересівали (45%) на середовище без цитостатика для дослідження динаміки росту (КФК-3, 540 нм, 3 мм) та рН (рН-150МА). На другу добу культивування проводили лізис клітин та визначали імунологічну активність одержаних ферментолізатів.

Під час аналізу сезонності для дванадцяти культур лактобактерій кожної пори року фіксували динаміку ростової активності і зміни рН на середовищі MRS. Посівний матеріал додавали в кількості 5% за об'ємом.

Статистична обробка результатів. Усі досліди проводили у 35 повторностях. Для визначення достовірностей відмінностей показників використовували t-критерій Ст'юдента. Відмінності вважали значимими при р0,05 (Лапач, 2002).

Ідентифікація, визначення антагоністичних і адгезивних властивостей потенційних продуцентів

Пробіотичні властивості потенційних продуцентів було проаналізовано відповідно до першочергових критеріїв відбору, висвітлених у багатьох літературних джерелах з проблематики конструювання пробіотиків.

Ідентифікація продуцентів. Перший робочий штам під видовою назвою L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 (ВКПМ В-5788) одержано у 1996 р. від Ладижинського об'єднання "Ензим". У 2001 р. його реідентифіковано як L. murinus LE (IMB В-7037). Одночасно ідентифіковано другий робочий продуцент (одержаний з кисломолочного продукту) як L. rhamnosus LB3 (ІMB В-7038). У 2005 р. здійснено реідентифікацію продуцентів за допомогою біохімічної системи АРІ 50 СН.

Результати попередньої ідентифікації були повністю підтверджені для LB3. Для LE не одержано повної подібності профілю. Тому було проведено комплексний порівняльний аналіз результатів ідентифікації 2001р., АРІ-тестування та даних 9-го видання визначника бактерій Бергі. Враховуючи те, що штам LE виявив більшу (але не повну) подібність до L. delbrueckii, його слід віднести до даного виду. На рівні підвиду штам ідентифікувати не вдалося через часткову невідповідність у вуглеводному спектрі. Найближчий підвид L. delbrueckii subsp. lactis.

Визначення спектра антимікробної дії. Спрямованість пригнічуючої дії штаму LE грампозитивні і грамнегативні аеробні та факультативно анаеробні мікроорганізми збудники хвороб теплокровних. Антимікробна дія штаму LB3 висока або достатньо висока практично до всіх досліджених тест-культур, у тому числі й до представників роду Candida (зони затримки росту 25-30 мм).

Антагоністична активність ліофілізованої біомаси при використанні різних кріопротекторів. За критерій ефективності кріопротектору обрано відсоток клітин, що вижили після ліофілізації та максимальне розведення біомаси, за якого спостерігається бактерицидна активність. Результати наведено в табл. 1.

Таблиця 1 Вплив кріопротектору на антагоністичну активність ліофілізованої біомаси

Тест-культура	глюкоза-2%, декстран-0,5%	глюкоза-2%, поліетилен-гліколь-2%	глюкоза-10%, желатин-1%	сахароза-10%, желатин-1%
	% клітин, що вижили
	LE	LB3	LE+LB3	LE	LB3	LE+LB3	LE	LB3	LE+LB3	LE	LB3	LE+LB3
	5	32	27	11	56	39	17	74	62	71	124	108
	Розведення ліофілізованої біомаси з бактерицидною дією
1	-	-	-	1:10	-	-	-	-	-	1:320	1:320	1:640
2	1:5	1:5	1:5	1:20	1:20	1:20	1:40	1:40	1:40	1:160	1:160	1:320
3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1:160	1:160	1:320
4	-	-	-	1:10	1:10	1:10	1:40	1:40	1:40	1:160	1:160	1:320
5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1:160	1:160	1:320

Примітки: 1 Enterobacter cloacae DSM 3264; 2 Escherichia coli УКМ В-906; 3 Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900; 4 Staphylococcus aureus subsp. aureus УКМ В-904; 5 Candida albicans УКМ Y-1918; "-" бактерицидна дія не спостерігалася.

За цими показниками найефективнішим кріопротектором є сахароза-10%, желатин-1%. Він же забезпечує антагонізм біомаси LE до Candida albicans, що, напевно, реалізується за рахунок синтезу так званих "стрес-білків" бактеріоциногенної природи при регенерації клітин з анабіотичного стану.

Антагоністичні властивості продуктів метаболізму і вплив на них складу поживного середовища. Найбільшу активність виявила суміш (1:1) супернатантів 48-год культуральних рідин штамів LE, LB3. З'ясована присутність бактеріоциногенної складової в загальній антимікробній активності базових культур порівнянням значень рН, які зумовлюють дію молочної кислоти і супернатантів LE, LB3 до збудників запальних захворювань. Показано, що бактеріостатична активність супернатантів виявляється за вищих значень рН порівняно з молочною кислотою.

Модифікаторами середовища в низці досліджень були "Йодіс" вода і твін 80. Першу було обрано виходячи з припущення щодо можливості накопичення йоду в біомасі лактобактерій, що важливо в разі використання пробіотичних препаратів або продуктів як лікувально-профілактичних засобів для населення України, яке мешкає та для сільськогосподарських тварин, яких вирощують в ендемічних за зобом регіонах. При цьому важливо, що йодні сполуки є визнаними стимуляторами нормального клітинного розвитку еукаріотичних організмів. У разі позитивного впливу на біологічні властивості пробіотичних продуцентів можливе отримання подвійного ефекту - як у технологічному процесі одержання препарату (продукту), так і при лікувальних заходах з його використанням.

Щодо другого компоненту, відомо лише, що емульгатор твін 80 у складі поживного середовища у кількості 1 г/л посилює антагоністичну активність супернатантів культуральних рідин ряду бактеріоциногенних штамів за рахунок збільшення розчинності їх антимікробного компоненту (Ganzle, 2000).

Для базових культур і п'яти штамів порівняння проведено аналіз залежності рівня антимікробної активності від складу поживного середовища. Показано переважно стимулюючий вплив "Йодіс" води і твіну 80. При цьому, кожна культура володіє індивідуальною реакцією на додавання модифікатора в середовище. Рівень лабільності, як і активності антагоністичного комплексу штаму LB3, дещо вищий, порівняно зі штамом LE.

Адгезивні властивості. До еритроцитів, як універсальної моделі, що несе на своїй поверхні глікофорин - речовину, ідентичну глікокаліксу епітеліальних клітин, штам LE виявив високу (ІАМ 4,51,2), а LB3 - середню (ІАМ 4,00,5) адгезивність. До лімфоцитів ЛОР-органів адгезивність штамів LE, LB3 була переважно високою (ІАМ 4,85,6).

Таким чином, згідно з основними критеріями відбору, викладеними у FAO/WHO guidelines for evaluation of probiotics in food (2002), культури LE, LB3 можуть бути рекомендовані для створення препаратів на основі ліофілізованої біомаси для ветеринарії, отоларингології, пробіотичних продуктів (дієтичних добавок до раціону харчування/годівлі) і препаратів "метаболітного" типу, за приклад яких може слугувати Хілак.

Літична чутливість та імунологічна активність клітин лактобактерій, вирощених на різних середовищах

Структура клітинної стінки лактобактерій забезпечує вплив на імунну систему організму людини і тварин (Herich, 2002). Можна припустити, що під час лізису у культур з високою літичною чутливістю вивільняється більше імуноактивних компонентів. Тому одним з додаткових критеріїв відбору пробіотичних штамів було запропоновано аналіз літичної чутливості їх клітинних стінок.

Встановлено, що клітини кожного виду лактобактерій мають різний рівень чутливості до дії літичного агенту. Так, можна виділити високочутливі види, термобактерії - L. delbrueckii, L. acidophilus (відсотки лізису 55-69% на MRS) і низькочутливі, стрептобактерії L. rhamnosus, L. plantarum (13-24%). Ці статистично значимі розбіжності можна пояснити відмінностями в структурі клітинних стінок. Літична чутливість збільшується на середовищах з добавками "Йодіс" води та/або твіну 80 у термобактерій (на 3-31%) і зменшується у стрептобактерій (на 8-25%).

Для визначення імуногенності ферментних лізатів клітин лактобактерій було обрано моноцитарно-макрофагальну систему, як основний механізм неспецифічного захисту організму. Експериментальні дані (табл. 2, ліва частина) вказують на стимуляцію фагоцитарної активності макрофагів перитонеального ексудату ферментолізатами клітин лактобактерій, вирощених як на MRS-3, так і на середовищах з добавками, порівняно з контролем - фізрозчином (фагоцитарне число 449). Для аналізу ступеня стимуляції фагоцитозу лізатами відносно ферментного препарату (фагоцитарне число 575) розраховано відсоток збільшення фагоцитозу (табл. 2, права частина).

Таблиця 2 Фагоцитарна активність макрофагів при введенні лізатів клітин лактобактерій і вплив на неї "Йодіс" води і твіну 80

Фагоцитарне число при введенні лізатів клітин штамів, вирощених на середовищах	Штам	Відсоток збільшення фагоцитозу порівняно з ферментним препаратом Циторецифеном
MRS	MRS-1	MRS-2	MRS-3		MRS	MRS-1	MRS-2	MRS-3
6611	726*	719*	486	1	16	26	25	16
6115	653*	851**	465	2	7	14	49	19
616*	6317	686*	708*	3	7	11	19	23
5414	5015	6336*	6710*	4	5	12	11	18
5132	7411*	756**	567	5	11	30	32	2
738**	6510	666*	583*	6	66	48	50	32
5315	3110	777**	589	7	7	46	35	2

Примітки: 1 L. delbrueckii subsp. lactis LE; 2 L. rhamnosus LB3; 3 L. rhamnosus LB4; 4 L. acidophilus+L. rhamnosus (Canada); 5 L. acidophilus Ер 317/402; 6 L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB51; 7 L. plantarum 213; * р<0,05 порівняно з фізрозчином, ** р<0,05 порівняно з Циторецифеном.

Внесення "Йодіс" води і твіну 80 до середовища MRS індивідуально впливає на імуногенність лізатів досліджених штамів, посилюючи для більшості з них рівень фагоцитозу на 766%. Максимальний індукційний вплив добавки виявили на імуногенність базових культур, тобто ця властивість піддається керуванню через зміни умов культивування.

Проведені дослідження вказують на доцільність створення пробіотиків-імуномодуляторів на основі ферментолізатів клітин базових штамів.

Також показано, що найчутливіший до Циторецифену штам L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB51 виявив найбільшу імуногенність, що доводить припущення про вивільнення більшої кількості імуноактивних компонентів під час лізису, а, отже, і необхідність перевірки літичної чутливості культур для прогнозування їх імунологічної активності.

Вплив хіміотерапевтичних препаратів на клітини лактобактерій

На сьогодні існує практика перевірки стійкості пробіотичних продуцентів до тих препаратів (антибіотики, сперміциди), паралельно з курсами прийому яких призначають пробіотики.

Дослідження дії цитостатиків. Критерій перевірки стійкості продуцентів до цитостатиків ми рекомендуємо з огляду на можливість використання пробіотиків в онкології (підтримуюча терапія, терапія супроводу) для запобігання чи послаблення дії цитотоксичних засобів.

Нами вперше проведено серію робіт зі встановлення особливостей взаємодії пробіотичних мікроорганізмів і цитостатичних препаратів. Робота зі штамами LE та L. delbrueckii subsp. delbrueckii DSM 20074 показала принципову можливість росту лактобактерій в широкому діапазоні концентрацій цитостатиків різних хімічних груп: Тegafur, Сisplatin, Сytophosphan, Тhiophosphamide (табл. 3).

Таблиця 3 Мінімальна інгібуюча концентрація цитостатиків (мкг/мл) на першу та третю добу культивування лактобактерій

Штам	Tegafur	Cisplatin	Cytophosphan	Тhiophosphamide
	1	3	К	1	3	К	1	3	К	1	3	К
LE	250	500	16	250	500	176	500	32	1,95	15,6	4
DSM 20074	250	500	16	62,5	500	176	500	32	1,95	7,8	2

Примітка. К - коефіцієнт перевищення ТЕК на 3-ю добу.

Показано, що попереднє культивування з похідним платини Сisplatin, основною мішенню дії якого в ракових клітинах є ДНК, у подальшому стимулює ріст обох культур. Імуногенність ферментолізатів після обробки Cisplatin та Cytophosphan у штаму LE збільшується, а у типового представника виду L. delbrueckii знижується.

Результати роботи з дев'ятьма штамами виявили, що триденне культивування з Cisplatin, Doxorubicin, Methotrexate, Vinblastin у подальшому, здебільшого, пригнічує біологічні властивості лактобактерій. Не зважаючи на відсутність прямої мішені дії цитостатиків на пробіотичну клітину не виключено, що вона накопичує певні концентрації препарату. Попереднє культивування штамів як при ТЕК цитостатику, так і при обраній нами максимальній концентрації призводить до пригнічення ростової активності і кислотоутворення в перші 1224 год росту. Подальша стабілізація оптичної густини і досягнення показників контрольної культури пов'язані, на нашу думку, з дифузією препарату в середовище та адаптацією популяції клітин до дії цитостатика.

Цікаво, що саме для представників виду L. delbrueckii спостерігається стимуляція фізіологічної активності після культивування з окремими цитостатиками. Тобто, врахування штамозалежного впливу цитостатиків дозволить певною мірою коригувати дози пробіотичних препаратів, які використовуються в терапії супроводу.

Дослідження дії антибіотиків. Перевірено чутливість штамів LE, LB3 до антибіотиків десяти різних хімічних груп. Спектр антибіотиків, до яких виявив стійкість штам LB3, більший, ніж у штаму LE. Максимальну відмінність між штамами встановлено у групі пеніцилінів, до всіх представників якої, крім карбеніциліну, штам LB3 стійкий, а LE чутливий. Обидва штами виявляють стійкість до представників цефалоспоринів практично всіх поколінь, аміноглікозидів, фузідіну. В той же час, вони чутливі до макролідів і тетрациклінів, а також чутливі або малочутливі до лінкоміцину, іміпенему, меропенему, азітроміцину, левоміцетину. Отже, широкий спектр антибіотикорезистентності властивий обом штамам і, здебільшого, сильному антагоністу штаму LB3.

Сезонні зміни фізіолого-біохімічних властивостей лактобактерій

Багаторічні спостереження за поведінкою музейних культур лактобактерій в однотипних умовах експерименту дозволили нам виявити певну сезонну залежність рівня їх біологічної активності. З огляду на це, було проведено комплексний експеримент з дванадцятьма культурами лактобактерій з метою виявлення сезонних відмінностей в динаміці зміни таких показників, як накопичення біомаси (табл. 4) і рН.

Таблиця 4 Сезонні зміни максимального приросту біомаси лактобактерій

Група	Штам	Максимальний приріст біомаси, од.OD
		Літо	Осінь	Зима	Весна
І	L. plantarum 213	1,26±0,01	1,43±0,01	1,02±0,01	0,88±0,01
	L. rhamnosus LB3	1,20±0,02	1,40±0,01	1,01±0,01	0,89±0,00
	L. rhamnosus LB4	1,24±0,01	1,41±0,01	1,03±0,01	0,90±0,00
	L. acidophilus + L. rhamnosus (Canada)	1,15±0,02	1,32±0,01	0,98±0,00	0,87±0,01
	L. rhamnosus (Canada)	1,12±0,01	1,24±0,01	0,89±0,00	0,87±0,00
ІІ	L. murinus DSM 20452	0,98±0,01	0,90±0,01	0,83±0,00	0,78±0,01
	L. acidophilus (Canada)	0,93±0,01	1,00±0,01	0,80±0,01	0,74±0,00
	L. acidophilus Ер 317/402	0,87±0,01	1,05±0,03	0,72±0,02	0,77±0,01
ІІІ	L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB51	0,84±0,01	0,66±0,01	0,52±0,02	0,64±0,00
	L. delbrueckii subsp. lactis LE	0,74±0,02	0,59±0,01	0,50±0,01	0,63±0,01
	L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB86	0,71±0,01	0,57±0,01	0,55±0,01	0,60±0,01
	L. delbrueckii subsp. delbrueckii DSM 20074	0,25±0,01	0,29±0,00	0,26±0,00	0,22±0,00

І-ІІІ групи культур сформовані в порядку зменшення значень максимального приросту біомаси, що властиво практично для кожної пори року і характеризує високу фізіологічну стабільність культур.

Для кожної з трьох груп лактобактерій простежується залежність показника накопичення біомаси від пори року. Для всіх культур першої групи вищі показники приросту біомаси характерні для літньо-осіннього періоду (1,431,12 од. OD), нижчі - для зимово-весняного (1,030,87 од. OD). Аналогічна сезонна залежність спостерігається і для культур другої групи, для яких максимальний приріст біомаси влітку і восени становить 1,050,87 од. OD, а взимку і навесні 0,830,72 од. OD. Поведінка ж представників виду L. delbrueckii, що характеризуються низькою ростовою активністю, відзначається більшою індивідуальністю.

Статистично значимі відмінності між показниками оптичної густини для всіх штамів, крім DSM 20074, який відзначався найменшою швидкістю росту, виявлені між діаметрально протилежними порами року літом і зимою. Достовірність відмінностей між іншими сезонами характерна для 42-58% досліджених штамів.

На наш погляд, сезонні біоритми музейних культур лактобактерій можна віднести до "залишкових річних ритмів" (Ашофф, 1984). Встановлені закономірності мають бути враховані під час створення рекомендацій для підвищення економічної ефективності виробництва пробіотичних препаратів.

Висновки

На основі з'ясування закономірностей прояву специфічних біологічних властивостей перспективних продуцентів роду Lactobacillus рекомендовано додаткові критерії відбору пробіотичних культур: аналіз літичної чутливості їх клітинних стінок, стійкості до цитостатиків та врахування сезонних змін біологічної активності.

1. Реідентифіковано перспективні пробіотичні продуценти як L. delbrueckii subsp. lactis LE і L. rhamnosus LB3. Показано широкий спектр антимікробної активності культур, яка максимально реалізується на 48-му год культивування, до умовно-патогенних мікроорганізмів, а також до грибів роду Candida у L. rhamnosus LB3.

2. Встановлено, що вказані культури є переважно високоадгезивними до тканин ЛОР-органів та еритроцитів. Культури стійкі до більшості цефалоспоринів, аміноглікозидів, фторхінолонів (L. rhamnosus LB3 також до пеніцилінів). Ферментолізати їх клітин стимулюють фагоцитарну активність макрофагів перитонеального ексудату.

3. Рекомендовано ефективний кріопротектор для виробництва ліофілізованих мікробних субстанцій на основі культур L. delbrueckii subsp. lactis LE і L. rhamnosus LB3, який забезпечує високі життєздатність клітин-продуцентів та антимікробну дію проти широкого кола збудників запальних захворювань. Комплексна субстанція має синергічний ефект і виявляє максимальну антагоністичну активність.

4. Вперше показано, що компоненти поживного середовища "Йодіс" вода і твін 80 мають комплексний штамозалежний вплив на антимікробну активність продуктів метаболізму лактобактерій, літичну чутливість до Циторецифену, імуногенність ферментолізатів клітин. Рекомендовано використовувати ці компоненти як індуктори пробіотичної активності лактобактерій.

5. Виявлено відмінності в чутливості клітинних стінок до дії літичного ферментного препарату Циторецифену між різними таксономічними підгрупами роду Lactobacillus термо- та стрептобактеріями. При відборі штамів для створення пробіотиків "лізатного" типу на основі імуноактивних компонентів клітинної стінки доцільно використовувати високочутливі термобактерії.

6. Вперше показано, що культивування з цитостатиками має штамоспецифічний фізіологічний вплив на культури лактобактерій, який виявляється і після дії цитостатиків та має плейотропний ефект на ріст, кислотоутворення, імуногенність клітин.

7. Встановлено, що представники роду Lactobacillus відзначаються високою фізіологічною стабільністю протягом року. За ростовою і кислотоутворюючою активністю їх можна поділити на три групи (високоактивні L. rhamnosus, L. plantarum, середньоактивні L. murinus, L. acidophilus, слабоактивні L. delbrueckii). Рівень накопичення біомаси в різні сезони залежить від виду лактобактерій для представників перших двох груп максимальні показники характерні для літньо-осіннього періоду, мінімальні для зимово-весняного; для виду L. delbrueckii ці закономірності є індивідуальними для кожного штаму.

Пропозиції виробництву

1. Розроблено методичні рекомендації "Критерії відбору штамів роду Lactobacillus для створення пробіотиків ветеринарного призначення".

2. Запропоновано ліофілізовану біомасу штамів L. delbrueckii subsp. lactis LE та L. rhamnosus LB3 в дозі 11010 КУО (1:1), яка володіє високим антагоністичним та адгезивним потенціалом, застосовувати для профілактики і терапії гострих шлунково-кишкових захворювань молодняку сільськогосподарських тварин і птиці. Можливий прийом після курсів антибіотико- або хіміотерапії. Обгрунтовано застосування при виробництві біомаси середовища MRS без додавання твіну 80, кріопротектора сахароза-10%, желатин-1%. Оптимальним для вирощування біомаси є осінній період.

3. Рекомендовано супернатантні рідини вказаних штамів, що містять не лише молочну кислоту, а й бактеріоциногенні сполуки, використовувати для оздоровлення поголів'я, як пробіотики "метаболітного" типу. Умовами їх отримання є вирощування штамів на середовищі MRS з додаванням "Йодіс" води (2,5 мг/л йодиду калію), без твіну 80, протягом 48 год, супернатанти культуральних рідин об'єднувати 1:1.

4. Перспективними для практичного застосування є пробіотики-імуномодулятори "лізатного" типу на основі штамів LE, LB3 з огляду на стимуляцію ферментолізатами їх клітин фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів. Для збільшення літичної чутливості та імуногенності штаму LE запропоновано вирощувати його на середовищі MRS з "Йодіс" водою, імуногенність штаму LB3 на 49% збільшується на середовищі MRS з додаванням "Йодіс" води, без твіну 80.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Антагоністична активність як критерій відбору про біотичних штамів / Н.В. Дехтяренко, Л.М. Шинкаренко, О.М. Дуган, О.І. Яловенко // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2007. - Вип. 107, Ч. 1. - С. 20-29. (Підбір і аналіз літератури, підготовка статті до друку).

2. Підбір умов культивування пробіотичних культур перспективних для застосування в онкології / К.В. Типлинська, О.В. Совєтова, Н.В. Дехтяренко, В.Ю. Горчаков // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2007. - Вип. 117. - С. 122-133. (Постановка експерименту, обробка та аналіз результатів, написання статті).

3. Дехтяренко Н.В. Особливості ідентифікації потенційних продуцентів пробіотиків роду Lactobacillus / Н.В. Дехтяренко // Аграрна наука і освіта. - 2008. - Т.9, № 5-6. - С. 29-36.

4. Azizpour K.H. Principles of selection for the probiotics of LAB for the production of drugs / K.H. Azizpour, N. Dehtyarenko, L. Shynkarenko // Агроекологічний журнал. - 2003. - № 4. - С. 82-86. (Збір і аналіз літератури, підготовка матеріалів до публікації).

5. Дехтяренко Н.В. Аналіз впливу клітин лактобактерій та їх компонентів на імунітет людини / Н.В. Дехтяренко, Л.М. Шинкаренко, О.М. Дуган // Агроекологічний журнал. - 2007. №2. - С. 81-87. (Підбір і аналіз літератури, написання статті).

...