Особливості сомаклональної мінливості унгернії Віктора

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Унгернія Віктора (Ungernіa vіctorіs Vved. ex Artjushenko, Amaryllіdaceae) - рідкісний лікарський вид рослин, ендемік Таджикистану та Узбекистану. Фармакологічна цінність виду обумовлена синтезом ізохінолінових алкалоїдів, препарати з яких використовують при лікуванні захворювань опорно-рухового апарату та органів травної та дихальної систем. На сьогоднішній день актуальною проблемою є не тільки створення альтернативних природній сировині джерел біомаси для одержання біологічно активних речовин, але й збереження генофонду унгернії Віктора. Вирішення цих завдань покладають на культуру in vitro, яка забезпечує прискорене розмноження та нарощування біомаси, що не поступається за своїми властивостями тканинам інтактних рослин. Перепоною для використання цього підходу може стати сомаклональна мінливість, яка, зокрема, може бути однією з причин порушення синтезу вторинних метаболітів у культурі in vitro, що спостерігається в унгернії Віктора. Показано, що рівень та особливості геномних змін в культурі іn vіtro знаходяться під впливом низки чинників - складу живильного середовища, умов вирощування, ступеня відхилення культури від організованого росту, тривалості культивування тощо. Тому дослідження сомаклональної мінливості саме у взаємозв'язку із факторами, що впливають на неї, дозволить глибше зрозуміти сутність цього явища та розробити способи керування ним.

Незважаючи на обмеженість чисельності виду та його значення для фармакології, не було проведено жодних популяційно-генетичних досліджень унгернії Віктора у природі. Такі дослідження дозволять оцінити загрозу генетичної ерозії цього рідкісного виду та створити наукову основу для розробки ефективної стратегії збереження його генофонду і раціональної експлуатації природних заростей - ресурсів лікарської сировини.

Вищевикладене робить проведене дослідження актуальним як з наукової, так і технологічної точки зору.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було вивчити геномну мінливість культури тканин U. victoris при різних умовах та тривалості культивування, провести порівняння рівня та особливостей геномної мінливості U. victoris в природних умовах та в культурі in vitro.

Відповідно до поставленої мети були вирішені такі завдання:

1. Одержання та тривале вирощування морфогенної і неморфогенної культури тканин унгернії Віктора на агаризованих та в рідких живильних середовищах різного складу.

2. Вивчення геномної мінливості одержаних калюсних культур за допомогою RAPD-аналізу.

3. Цитогенетичний аналіз калюсних та суспензійних культур.

4. Дослідження поліморфізму ДНК рослин унгернії Віктора із природної популяції методом RAPD-ПЛР.

5. Порівняння особливостей та рівня мінливості геному U. victoris у природі та в культурі in vitro.

1. Огляд літератури

В огляді літератури представлено характеристику досліджуваного виду U. vіctorіs, зокрема відомості з біології виду, поширення та фармакологічної цінності. Наведено сучасні уявлення про мінливість рослинного геному в культурі in vitro, приділено увагу характеристиці чинників, що впливають на сомаклональну мінливість і практичному значенню останньої.

2. Матеріали та методи досліджень

Культуру тканин U. vіctorіs вирощували на живильних середовищах із різним вмістом макроелементів, сахарози і біологічно-активних добавок. Було проаналізовано калюсні та суспензійні лінії U. vіctorіs, отримані від однієї рослини (рік уведення в культуру in vitro - 1995) (рис. 1); морфогенні й неморфогенні калюсні культури віком 1, 2 та 3 роки (рік уведення в культуру in vitro - 2003, середовища 5C1 і 5C01) і їх рослину-донора; калюсну культуру віком 2 роки (рік уведення в культуру in vitro - 2002, середовище 5C1) та її рослину-донора.

Матеріалом для дослідження генетичного поліморфізму U. vіctorіs у природі слугували цибулини шести довільно обраних рослин віком близько 40-50 років із природної популяції, розташованої на південному схилі Гіссарського хребта (Таджикистан).

Кількість хромосом підраховували у метафазних пластинках на декількох препаратах, виготовлених згідно модифікованого методу давлених ацетоорсеїнових препаратів (Кунах, Левенко, 1975) із різних ділянок калюсної тканини.

ДНК виділяли за допомогою ДСН і протеінази К із попередньо виділених клітинних ядер (Генная инженерия растений / Под ред. Дж. Дрeйпера и др., 1991), її якість і концентрацію оцінювали за допомогою гель-електрофорезу, порівнюючи із ДНК фага л відомої концентрації (Маниатис и др., 1984).

Для RAPD-аналізу використали 24 декануклеотидних праймери. Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл містила: 20 нг ДНК, 0,2 мМ дНТФ, 1,25 U Taq-полімерази, 0,6 мкМ праймера, 15 мМ трис-HCl, pН 8,3, 75 мМ KCl, 0,06 мг/мл БСА, 2 мМ MgCl2. На реакційну суміш нашаровували 15 мкл мінеральної олії для запобігання випаровуванню. Як негативний контроль використовували стандартну реакційну суміш без ДНК. Ампліфікацію проводили за наступного температурного режиму: 95°С - 2 хв., 5 Ч (94°С - 30 с, tгібр - 30 с, 72°С - 1 хв.), 35 Ч (94°С - 20 с, tгібр- 20 с, 72°С - 40 с), 72°С - 2 хв. 30 с. Температура гібридизації (tгібр) для праймерів A14, A16 і A17 становила 38 °С, для решти - 36 °С.

Продукти ампліфікації розділяли електрофорезом при напрузі 3-4 В/см у 1,7%-ному агарозному гелі з 0,5 мкг/мл бромистого етидію, в 1Ч трис-боратному (ТВЕ) буфері.

З метою кількісної оцінки RAPD-поліморфізму результати були представлені у вигляді бінарної матриці, у якій наявність або відсутність у RAPD-спектрі однакових за розміром ампліконів позначалася відповідно як стан "1" або "0". На основі отриманої матриці бінарних ознак було розраховано генетичні відстані Нея (Neі, 1978) за допомогою програми POPGENE (Yeh, Boyle, 1997), та генетичні відстані Джаккарда за формулою Dj = -ln Sj, де Sj - коефіцієнт подібності Джаккарда (Jaccard P., 1901), розрахований за допомогою програми FAMD (Schluter P. M., Harris S. A., 2006). На основі обох матриць генетичних відстаней проведено кластерний аналіз незваженим парногруповим методом з арифметичним усередненням (UPGMA) (програми POPGEN і FAMD). Для графічної побудови дендрограм використали програму Treevіew (Page, 1996). Для оцінки внутрішньовидового поліморфізму U. vіctorіs за допомогою програми POPGENE (Yeh, Boyle, 1997) додатково визначали наступні генетичні параметри за Неєм (Nei, 1987): відсоток поліморфних локусів (Р), середнє число алелей на локус (А), генне різноманіття Нея (очікувана гетерозиготність He) та індекс Шеннона (S).

Реакцію гідролізу ДНК ферментами рестрикції проводили в об'ємі 30 мкл протягом 3 год при температурі, рекомендованій для застосовуваної рестриктази. Реакційна суміш містила 10 мкг препарату досліджуваної ДНК, відповідний буфер згідно рекомендацій фірми-виробника (“Fermentas”, Литва), 20 од. фермента та деіонізовану воду. Зупиняли реакцію додаванням 0,5М ЕДТА до кінцевої концентрації 10 мM.

Реакцію мічення проводили методом розсіяної затравки, використовуючи (-32P)- дЦТФ (дезоксицитозин-трифосфат). Блот-гібридизацію проводили згідно стандартної процедури, рекомендованої фірмою “GE Healthcare” (Великобританія). Для отримання радіоавтографів рентгенівську плівку РП-1С (МПТВП “Оніко”, Україна) експонували з мембраною при -20°C.

3. Результати досліджень та їх обговорення

Цитогенетична мінливість культури тканин. Проведено підрахунок хромосом п'яти калюсних і трьох суспензійних ліній U. vіctorіs, які були отримані від однієї рослини у 1995 році й протягом близько 10 років вирощувалися на живильних середовищах різного складу.

Згідно літературних даних, диплоїдна кількість хромосом для U. vіctorіs 2n = 22 (Агапова и др., 1990). Проведений нами аналіз показав, що вивчені клітинні лінії являли собою міксоплоїдні клітинні популяції. Розмах за кількістю хромосом у них становив від гаплоїдного до гіпероктаплоїдного набору. Зустрічалися окремі високоплоїдні клітини з набором хромосом, що досягав 36 n. Значну кількість становили анеуплоїдні клітини всіх рівнів плоїдності, їхня сумарна частка в усіх ліній досягала 50 %.

Результати аналізу структури клітинних популяцій калюсних ліній, що зростали на агаризованих середовищах різного складу, наведено на рис. 3. Лінії № 2 і № 9а достовірно не відрізнялися між собою, вони характеризувалися наявністю чітко вираженого модального класу з ди- і білядиплоїдною кількістю хромосом (82,3 % і 85,4 % відповідно). Модальний клас ліній № 6 і № 7 становили тетра- і білятетраплоїдні клітини (57,8 % і 49,5 % відповідно), за кількістю білядиплоїдних, білятриплоїдних і біляпентаплоїдних мітозів лінії достовірно відрізнялися. У лінії № 3 були присутні три ведучі класи: ди- і білядиплоїдні клітини становили 41,5 %, три- і білятриплоїдні - 32,1 %, тетра- і білятетраплоїдні - 17,9 %.

Порівняння трьох пар калюсних і суспензійних ліній, живильні середовища яких відрізнялися лише наявністю або відсутністю агару (пари ліній: №3 - №11, №6 -№12 і №7 - №10) дозволило простежити вплив способу вирощування на структуру клітинних популяцій ліній U. victoris. У лінії № 11 більшість клітин, що діляться, були білядиплоїдними (86,7±3,3 %), розмах за кількістю хромосом склав від гаплоїдного до гіперпентаплоїдного набору. Суспензійні лінії № 10 і № 12 сформували практично ідентичні за частотою клітин різної плоїдності популяції. У популяціях переважали біляди-, білятри- і білятетраплоїдні метафази. Кількість хромосом досягала 18n у лінії № 10 і 36n у лінії № 12. Тобто кожна із суспензійних ліній відрізнялася від калюсного аналога більш високою частотою білядиплоїдних метафаз, та меншою часткою класів вищої плоїдності.

Таким чином, при підрахунку хромосом були виявлені значні відмінності структури клітинних популяцій різних калюсних ліній U. victoris, отриманих із однієї цибулини. За співвідношенням метафаз різної плоїдності можна виділити чотири групи:

· лінії №2, № 9а й № 11 із чітко вираженим білядиплоїдним модальним класом,

· лінії № 6 і № 7 із білятетраплоїдним модальним класом,

· лінії № 10 і № 12 із перевагою білядиплоїдних і білятетраплоїдних метафаз,

· лінія № 3 із перевагою білядиплоїдного й білятриплоїдного класів.

Тобто виявлено невідповідність групування ліній за розподілом хромосомних чисел і групування за живильними середовищами, на яких вони вирощуються, або їх генеалогією (рис. 1). Отже виникнення певних змін геному не модулювалося компонентами живильних середовищ, у тому числі наявністю, концентрацією і співвідношенням фітогормонів (ауксинами й цитокиніном у дозах 0 - 2 і 0 - 1 мг/л відповідно), і, очевидно, носило випадковий характер. Отримані дані можна пояснити дивергентною еволюцією генетичної структури клітинних ліній на основі стохастичних процесів мінливості іn vіtro.

При цитологічному аналізі спостерігали також наявність у метафазах від 1 до 6 мікрохромосом. Більш високим відсотком метафаз із мікрохромосомами, характеризувалася лінії № 6, № 10 і № 12, у решти ліній цей показник був достовірно нижчим.

Геномна мінливість культури тканин U. victoris за результатами RAPD-ПЛР. Було проведено дослідження морфогенних і неморфогенних калюсів унгернії Віктора різної тривалості культивування, які вирощувалися на агаризованих живильних середовищах із різним вмістом біологічно-активних добавок.

Для тривалокультивованих калюсних ліній віком 9 років, отриманих від однієї рослини в 1995 р., загальна кількість врахованих ампліконів склала 238, з яких відмінності між лініями виявили 9 ампліконів, тобто 3,8). Поліморфними були спектри ампліфікації 9 праймерів, кожен з яких містив по одному варіабельному фрагменту. Кількість поліморфних фрагментів, які виявили відмінності між лініями, варіювала від двох до семи. Поліморфізм спектрів ампліфікації проявлявся як у відмінностях, пов'язаних із наявністю або відсутністю окремих ампліконів (якісна мінливість) (рис. 4), так і у варіаціях їх кількісної представленості в спектрах.

Рис. 4. Якісні відмінності спектрів ампліфікації ДНК у інтактних рослин та різних за віком калюсних ліній U. vіctorіs: а) фракціонування RAPD-фрагментів, отриманих із праймером А16; б) блот-гібридизація фракціо-нованих продуктів ампліфікації із поліморфним фрагментом ~ 580 п.н. (позначений стрілкою): 1 - однорічна культура тканин 2003 року; 3 - її материнська рослина; 2 - дворічна культура тканин 2002 року; 4 - її материнська рослина; 5 - 10 - калюсні лінії 1995 року, отримані від однієї рослини - № 2, № 3, № 5, № 6, № 7, № 9а відповідно; М - маркер молекулярної маси “100 bp DNA Ladder”.

На підставі результатів RAPD-аналізу були розраховані генетичні відстані за Неєм (Neі, 1978) - їх значення варіювало в діапазоні від 0,84 до 2,99 %. Значення генетичних відстаней за Джаккардом (Jaccard P., 1901) були дуже близькими до наведених, а взаємне розміщення об'єктів на дендрограмі - таким ж як і для відстаней Нея, тому тут і надалі, для інших груп об'єктів, матриці генетичних відстаней за Джаккардом та побудовані на їх підставі дендрограми не наведено.

Дендрограма генетичної подібності, побудована за генетичними відстанями Нея, в групі дев'ятирічних калюсних ліній виявила два кластери, у перший з яких увійшли лінії № 2, № 5, № 6 і № 7, у другий - лінії № 3 і № 9а, тобто закономірностей групування ліній залежно від умов вирощування і складу середовищ не спостерігалося. Аналіз відмінностей ліній за кожним окремим фрагментом також не виявив подібності характеру змін геномів калюсних ліній за комплексного впливу компонентів середовища. Це підтверджує попередній висновок, зроблений за результатами цитогенетичного аналізу, про відсутність помітного впливу складу живильного середовища й умов культивування на встановлення певної структури клітинних популяцій ліній U. victoris і випадковий характер цього процесу.

Також було проаналізовано групу калюсних культур віком 1 рік (6-8-й пасаж), 2 (16-19-й пасаж) та 3 (28-30-й пасаж) роки (рік уведення в культуру in vitro - 2003) і їх рослину-донора. Калюси отримали та вирощували в подальшому на середовищах, що відрізнялися за вмістом фітогормонів: 5С1 та 5С01 (табл. 1) На обох середовищах були отримані калюси, які за морфологією можна розділити на два типи: морфогенний і неморфогенний. Трирічні морфогенний калюс із середовища 5С1 та неморфогенний - з 5С01 не представлені у дослідженій вибірці, оскільки загинули після двох років культивування, внаслідок втрати життєздатності.

Загальна кількість врахованих ПЛР-продуктів для цієї групи об'єктів склала 262, із них 8 (3,1 %) виявили відмінності між рослиною-донором експлантів та калюсними культурами (табл. 2). Варіабельні амплікони спостерігали в спектрах продуктів шести праймерів. У більшості випадків поліморфізм RAPD-спектрів проявлявся у відмінностях за інтенсивністю флуоресценції окремих ампліконів. Лише один амплікон виявив кількісний характер мінливості. У чотирьох поліморфних фрагментів характер мінливості виявився подібним для всіх культур - при збільшенні тривалості культивування на обох середовищах відбувалося поступове підвищення інтенсивності флуоресценції цих фрагментів, досягаючи максимального значення у трирічної морфогенної калюсної культури на середовищі 5С01. Варіабельність решти ампліконів спостерігали лише у культур певного морфотипу на одному з середовищ.

Розрахунки генетичних відстаней за Неєм (Nei, 1978), які були проведені на основі даних обробки електрофореграм ПЛР-продуктів, показали, що в цілому ступінь генетичних змін у неморфогенного калюсу є вищим, ніж у морфогенного. Ці відмінності були більш виразними на середовищі 5С01. У процесі культивування генетичні дистанції між двома типами калюсних культур зростали, внаслідок більш швидкого накопичення змін у неморфогенній культурі. Отримані результати вказують на існування оберненої залежності між рівнем диференціації культури тканин і рівнем сомаклональної мінливості.

Для всіх культур, незалежно від типу калюсу та середовища, виявлено тенденцію до накопичення генетичних змін в процесі культивування. Поряд зі зростанням рівня генетичних відмінностей культивованих тканин від рослини-донора експлантів, із часом відбувалася також їх дивергенція. Отримані результати вказують на існування прямої залежності між рівнем сомаклональної мінливості та тривалістю культивування in vitro.

Третім із змінних факторів досліду, поряд із розглянутими типом культури та тривалістю вирощування, є склад живильного середовища. Хоча генетичні зміни спостерігали вже після першого року культивування на обох середовищах, накопичення відмінностей від рослини у калюсних тканин, які вирощували на 5С1, в цілому відбувалося швидше, що було особливо помітним у випадку морфогенної культури. Це може бути пов'язано із тим, що у вивчених концентраціях 2,4-Д володіє більшою мутагенною дією щодо цих культур, ніж б-НОК.

Було проведено RAPD-аналіз морфогенної культури тканин, яка була отримана у 2002 р. від однієї рослини й вирощувалася до моменту вивчення (протягом 18 пасажів - близько двох років) на середовищі одного складу (5С1). Загальна кількість врахованих ампліконів склала 244, три з яких (1,2 %) виявилися поліморфними за інтенсивністю флуоресценції. Генетичні відстані за Неєм (Neі, 1978) між дворічним калюсом і його рослиною-донором склали 1,24 %.

У досліді було виявлено RAPD-фрагменти, поліморфні в усіх груп досліджених калюсних тканин, які вірогідно відповідають ділянкам геному унгернії Віктора з підвищеною схильністю до змін у культурі іn vіtro. Ці фрагменти можуть представляти нестабільні райони геному з підвищеною здатністю до виникнення мутацій.

Таким чином, відмінності між калюсними лініями U. vіctorіs виявилися більш значними на цитогенетичному, ніж на молекулярно-генетичному рівні. Така невідповідність може бути обумовлена тим, що зміна кількості хромосом не супроводжувалася перебудовами послідовностей ДНК. Також не виключено, що різні хромосомні мутації окремих клітин нівелювалися при дослідженні сумарної ДНК зразка. Не було виявлено зв'язку і між особливостями сомаклональних змін калюсних ліній, визначених цитогенетичним та молекулярно-генетичним методами - у цілому лінії, які мали спільні молекулярно-генетичні зміни, відрізнялися значною мірою за співвідношенням класів клітин із різною кількістю хромосом, і навпаки, лінії, що були подібні за структурою клітинних популяцій не були генетично близькими за результатами RAPD-аналізу.

Поліморфізм рослин із природної популяції за RAPD-маркерами. З метою дослідження рівня генетичної варіабельності U. victoris у природі було проведено RAPD-аналіз геномів шести рослин із природної популяції. У досліді їм було надано номери від 1 до 6, одна з рослин складалася із двох цибулин, що росли на спільному денці, їх було позначено, як 5а і 5b.

Використовуючи ті ж праймери, що і для аналізу культури тканин, отримали 288 ампліконів, відсоток поліморфних локусів (Р) склав 72,6 % (209 поліморфних локусів, із яких 43 (20,6 %) були варіабельними за інтенсивністю флуоресценції). Показники генетичного поліморфізму для дослідженої вибірки рослин, розраховані на підставі алельних частот, склали: середнє число алелей на локус (А) 1,726 ± 0,447, генне різноманіття Нея (очікувана гетерозиготність He) 0,267 ± 0,186, індекс Шеннона (S) 0,399 ± 0,264, генетичні відстані за Неєм (DN) між інтактними рослинами варіювали в діапазоні від 26,9 % до 47,0 %.

Генетичні дистанції між окремими рослинами досить близькі, що також ілюструє дендрограма, побудована за методом UPGMA - на дендрограмі об'єкти не сформували яскраво виражених кластерів.

Високі показники генетичного поліморфізму рослин із природної популяції свідчать про високу мінливість геному унгернії Віктора в природі. Рівень генетичного поліморфізму U. victoris є порівняно високим для ендемічного виду, який розмножується вегетативно і насінням, що утворюється шляхом агамоспермії і самозапилення.

Високий рівень варіабельності U. victoris може бути пов'язаний з особливостями біології виду - тривалими періодом життя та репродуктивним періодом, значною мобільністю насіння.

Неочікувано висока мінливість також може бути пов'язана із суворими умовами зростання виду - аридною зоною, високогірними районами з високим рівнем УФ випромінювання і різким коливанням температур, як добових, так і річних - адже відомо, що зростання в екстремальних умовах може приводити до підвищення рівня мутацій і генетичної гетерогенності, яка ймовірно забезпечує виживання виду. Вірогідний сценарій формування генетичного поліморфізму виду - накопичення рецесивних мутацій за розмноження шляхом агамоспермії в результаті мутаційного процесу та їх перехід у гомозиготний стан у результаті самозапилення.

Порівняно із поліморфізмом рослин із природної популяції рівень сомаклональної мінливості U. vіctorіs за RAPD-маркерами був досить низьким - він був майже на два порядки нижчим, що може свідчити про близькість підібраних для культивування іn vіtro умов до оптимальних для даної культури й можливість їхнього використання з метою збереження генофонду цієї рідкісної рослини. Характер сомаклональних змін, виявлених методом RAPD-ПЛР у більшості випадків повторював відмінності між індивідуальними представниками природної популяції рослин, що може свідчити про здатність клітинної популяції іn vіtro реалізувати, принаймні, деяку частину генетичної мінливості виду.

Висновки

калюсний суспензійний поліморфний унгернія

Досліджено особливості сомаклональної мінливості культури тканин унгернії Віктора (U. vіctorіs) на цитогенетичному та молекулярно-генетичному рівнях за різних умов і тривалості культивування, проведено порівняння особливостей та рівня змін в культурі іn vіtro та відмінностей між рослинами із природної популяції.

1. Тривале вирощування культури тканин U. vіctorіs призводить до кількісних і якісних змін поодиноких RAPD-фрагментів (до 3,8 % із числа проаналізованих), а також до міксоплоїдії, значного ступеня поліплоїдизації клітин (до 36n, при модальному класі 2n-4n), дивергенції генетичних структур клітинних популяцій калюсних ліній, отриманих із однієї цибулини.

2. Характер молекулярних змін культури тканин відтворював відмінності між індивідуальними представниками природної популяції рослин - більшість RAPD-ампліконів, поліморфних у культурі іn vіtro, були варіабельними і у рослин із природної популяції. Виявлено RAPD-фрагменти, поліморфні у всіх досліджених клітинних ліній, що, вірогідно, представляють ділянки геному унгернії Віктора з підвищеною схильністю до змін у культурі іn vіtro.

3. Виявлено вплив фітогормонального складу живильного середовища на рівень молекулярно-генетичних змін культури тканин, але не на специфічність сомаклональних змін U. vіctorіs - не відмічено виникнення однакових змін, як цитогенетичних, так і молекулярно-генетичних, у різних ліній, які вирощували на одному середовищі. Встановлено збільшення частки метафаз із диплоїдним набором хромосом за зміни поверхневого на глибинне вирощування.

4. Виявлено пряму залежність рівня сомаклональної мінливості від тривалості культивування in vitro - виникнення змін RAPD-спектрів калюсних культур протягом першого року вирощування і подальше накопичення цих змін протягом другого та третього років.

5. За результатами RAPD-аналізу генетичні зміни у неморфогенних калюсів були у декілька разів (до 2,5 разів) вищими, ніж у морфогенних, що вказує на існування оберненої залежності між рівнем сомаклональної мінливості й рівнем диференціації культури тканин.

6. Мінливість у культурі іn vіtro за результатами RAPD-аналізу була майже на два порядки нижчою порівняно із відмінностями між рослинами із природної популяції (генетичні відстані за Неем склали 0,38-2,99 % для культури тканин та 26,9-47,0 % для рослин), що свідчить про можливість використання підібраних для культивування in vitro умов з метою збереження генофонду цього рідкісного виду.

Рекомендації.

· З метою зниження рівня генетичної мінливості культури тканин U. vіctoris для збереження генофонду рідкісного ендемічного виду та його прискореного розмноження перевагу слід віддавати короткотривалому (до одного року) культивуванню морфогенного типу калюсу, використовуючи як ауксин б-НОК.

· Пролонговане культивування, використання як ауксину 2,4-Д та неморфогенний тип калюсу рекомендовані для отримання підвищеного рівня сомаклональних змін з метою отримання матеріалу для клітинної селекції.

· Для надійної детекції сомаклональних змін рекомендується одночасне застосування цитогенетичного та молекулярно-генетичного методів, оскільки зміни рівня плоїдності культури тканин не завжди супроводжуються появою RAPD-поліморфізму і навпаки.

Література

1. Бублик О.М. Вивчення геномної мінливості культури тканин Ungernia victoris за допомогою RAPD-маркерів / О.М. Бублик, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, Л.П. Moжилевська, В.А. Кунах // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006. - Т. 4, № 1. - С. 3 -11.

2. Бублик Е.Н. Цитогенетическая изменчивость клеточных линий Ungernia victoris при выращивании на питательных средах различного состава / Е.Н. Бублик, В.И. Адонин, В.А. Кунах // Цитология и генетика. - 2008. - Т. 42, № 1. - С. 29-36.

3. Бублик О.М. Мінливість морфогенної та неморфогенної культури тканин Ungernіa vіctorіs за результатами RAPD-аналізу / О.М. Бублик, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, В.А. Кунах // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2008. - Т. 6, № 1. - С. 44-51.

4. Бублик О.М. Генетична гетерогенність рідкісного ендемічного виду Ungernіa vіctorіs (Amaryllіdaceae): RAPD-аналіз / О.М. Бублик, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, В.І. Музика, І.В. Колоніна, В.А. Кунах // Український ботанічний журнал. - 2008. - Т. 65, № 3. - С. 445-452.

Размещено на Allbest.ru