Особливості морфогенезу та клональне мікророзмноження деяких квітково-декоративних культур

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр

УДК 635.914:57.085.2

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості морфогенезу та клональне мікророзмноження деяких квітково-декоративних культур

Іванова Наталія Миколаївна

Ялта 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Нікітському ботанічному саду - Національному науковому центрі УААН, у відділі біотехнології та біохімії рослин.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Митрофанова Ірина В'ячеславівна, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр, завідувач лабораторії біотехнології та вірусології рослин.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, професор Бугара Олександр Михайлович, Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського МОН України, завідувач кафедри фізіології рослин і біотехнології;

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Єгорова Наталя Олексіївна, Інститут ефіроолійних та лікарських рослин УААН, завідувач лабораторії біотехнології.

Захист відбудеться 01 жовтня 2009 р. о 1000 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 в Нікітському ботанічному саду - Національному науковому центрі УААН, за адресою: 98648, Автономна Республіка Крим, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, м. Ялта, Україна. Факс: (0654) 33-65-50

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці НБС-ННЦ УААН за адресою 98648, Автономна Республіка Крим, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, м. Ялта, Україна.

Автореферат розісланий 27 серпня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, Садогурська С.О., кандидат біологічних наук.

Аннотация

Иванова Н.Н. Особенности морфогенеза и клональное микроразмножение некоторых цветочно-декоративных культур. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Никитский ботанический сад - Национальный научный центр, УААН, Ялта, 2009.

В диссертационной работе рассматриваются результаты исследований морфогенеза в культуре in vitro эксплантов A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum и S. ionantha для разработки биотехнологических приемов клонального микроразмножения цветочно-декоративных культур исследуемых сортов. Выявлены сроки отбора, типы и размеры эксплантов, установлена зависимость морфогенетических реакций от генотипа исследуемых видов и сортов растений. Разработаны эффективные способы стерилизации растительного материала, позволяющие значительно снизить уровень контаминации.

Установлены особенности гормональной регуляции морфогенеза и подобраны оптимальные концентрации регуляторов роста в питательной среде для этапов индукции развития эксплантов, регенерации микропобегов и их укоренения. Показано, что морфогенез в культуре высечек листа и сегментов початка 2 сортов A. andreanum реализовался через непрямой органогенез в присутствии БАП и 2,4-Д. Регенерация микророзеток 2 сортов B. riger elatior в культуре листовых эксплантов осуществлялась путем прямого органогенеза при наличии в питательной среде БАП и ИУК. В культуре сегментов соцветий 5 сортов B. riger elatior отмечено образование адвентивных почек в морфогенном каллусе, полученном на среде, содержащей БАП. Морфогенетический потенциал листовых эксплантов C. hortulanum реализовался путем соматического эмбриогенеза и органогенеза на питательных средах, дополненных кинетином, БАП и НУК. Выявлено, что образование адвентивных почек и микророзеток в культуре листовых эксплантов S. ionantha осуществлялось через прямой органогенез в присутствии в качестве регуляторов роста БАП и НУК. Определены оптимальные физические факторы культивирования эксплантов в условиях in vitro: температура 23-27°С, интенсивность освещения 2-3 клк и 14-16-часовой фотопериод. Установлены оптимальные концентрации ИМК (2,46-4,90 мкМ), индуцирующие процесс ризогенеза микропобегов сортов и видов исследуемых растений. Показано, что ризогенез микророзеток S. ionantha активно происходил на безгормональной среде. Разработаны составы адаптационных субстратов и определены условия адаптации пробирочных растений, что позволило добиться 78-100% приживаемости полученных растений. На основании полученных данных представлены разработанные биотехнологические схемы клонального микроразмножения для исследованных сортов цветочно-декоративных растений, начиная от введения эксплантов in vitro до получения укорененных растений, адаптированных к условиям закрытого грунта.

Ключевые слова: A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum, S. ionantha морфогенез, каллусная культура, соматический эмбриогенез, регенерация, ризогенез, адаптация.

Анотація

Іванова Н.М. Особливості морфогенезу та клональне мікророзмноження деяких квітково-декоративних культур. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр, УААН, Ялта, 2009.

У дисертаційній роботі розглянуто результати досліджень морфогенезу в культурі in vitro експлантів A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum і S. ionantha для розроблення біотехнологічних прийомів клонального мікророзмноження квітково-декоративних культур досліджуваних сортів. Виявлені терміни відбору, типи та розміри експлантів, залежність морфогенетичних реакцій від генотипу. Розроблені ефективні способи стерилізації рослинного матеріалу, які дозволяють значно знизити рівень контамінації. Встановлені особливості гормональної регуляції морфогенезу в культурі висічок листків, сегментів початка й суцвіття. Показано роль БАП, кінетину, 2,4-Д, НОцК та ІОцК у процесах прямого й непрямого органогенезу та соматичного ембріогенезу. Визначені оптимальні фізичні фактори культивування експлантів в умовах in vitro: температура 23-27°С, інтенсивність освітлення 2-3 клк і 14-16-годинний фотоперіод. Встановлені оптимальні концентрації ІОлК, що індукують процес ризогенезу. Показано, що ризогенез мікророзеток S. ionantha активно відбувався на безгормональному середовищі. Розроблено склад адаптаційних субстратів і визначені умови адаптації пробіркових рослин, що дозволило досягти 78-100% приживаності отриманих рослин. Представлені розроблені біотехнологічні схеми клонального мікророзмноження для досліджуваних сортів квітково-декоративних рослин, починаючи від введення експлантів in vitro до отримання вкорінених рослин, адаптованих до умов закритого ґрунту.

Ключові слова: A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum, S. ionantha, морфогенез, калюсна культура, соматичний ембріогенез, регенерація, ризогенез, адаптація.

Abstract

Ivanova N.N. Peculiarities of morphogenesis and clonal micropropagation of some ornamental plants. - Manuscript.

Thesis for a candidate of science degree in Biology, speciality 03.00.20 - biotechnology. - Nikitsky Botanical Gardens - National Scientific Center, Ukrainian Academy of Agricultural Science, Yalta, 2009.

The results of complex researches of morphogenesis in culture in vitro of A. andreanum, B. riger elatior, S. ionantha and C. hortulanum for working out the biotechnological methods of clonal micropropagation of some ornamental plants have been shown in the thesis. The selection periods, types and sizes of explants, dependence of morphogenetic reactions from genotypes have been established. The effective sterilization methods of plant material allowed to reduce considerably the level of contamination have been worked out. The peculiarities of hormonal regulation of morphogenesis in culture of leaf disks, segment of spadix and inflorescence have been determined. The role of BAP, kinetin, 2,4-D, NAA and IAA in organogenesis and somatic embryogenesis processes has been shown. The optimal physical factors of explant cultivation in vitro as temperature 23-27°C, light intensity 2-3 klk, and photoperiod 14-16 hours have been determined. The optimal IBA concentrations induced the rhizogenesis process has been established. It is show that the microrosettes rooting of S. ionantha is actively done on the medium without hormones. The composition of adaptation condition of tube plants have been determined. All these allowed to reach 86-100% of rooting of obtained plants. The developed biotechnological schemes of clonal micropropagation for studied cultivars of flowers and ornamental plants beginning with explant introduction in vitro up to the obtaining of rooted plants adapted to green houses have been given.

Key words: A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum, S. ionantha, morphogenesis, callus culture, somatic embryogenesis, regeneration, rhizogenesis, adaptation.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед квітково-декоративних рослин особливий інтерес становлять Anthurium andreanum Lind., Begonia riger elatior, Caladium hortulanum Birdsey. і Saintpaulia ionantha Wendl., що вирізняються високою декоративністю, тривалістю цвітіння, великою різноманітністю форм і забарвлень. В результаті успішної селекції останнім часом отримано безліч гібридних форм цих рослин, що також сприяло їх широкому поширенню (Shibata, 2008). Для задоволення попиту на квітково-декоративні рослини недостатньо використовувати лише традиційні підходи до розмноження та селекції цих культур.

Сьогодні в багатьох наукових лабораторіях світу, у тому числі й в Україні, розроблені та застосовуються біотехнології отримання та розмноження для цілого ряду видів культурних рослин (Черевченко, Кушнір, 1981; Катаева, 1983; Черевченко, 1986; Митрофанова, 1992; Калінін та ін., 1992; Митрофанова та ін., 2008; Pierik, 1976; Novak, Nepustil, 1980; Lo et al., 1977; Bigot, 1981; Hohe et al., 2001; Kim et al., 2003; Basal, 2007).

Поряд з тим необхідно відзначити, що квітково-декоративні культури, як правило, належать до різних, віддалених один від одного ботанічних таксонів, і значно відрізняються за рівнем тотипотентості клітин і регенераційним потенціалом. Це зумовлює необхідність диференційованого підходу до застосування та вдосконалення способів клонального мікророзмноження. При оптимізації біотехнології масового виробництва рослин важливо забезпечити їх економічну ефективність за рахунок здешевлення складу живильних середовищ, скорочення етапів розмноження і збільшення виходу адаптованих рослин високої якості. Враховуючи викладене, вважаємо, що виявлення особливостей морфогенезу in vitro і розробка способів клонального мікророзмноження таких видів рослин, як A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum і S. ionantha є актуальним і становить науковий і практичний інтерес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами і планами. У дисертаційній роботі узагальнені результати наукових досліджень, виконаних у відповідності з науково-тематичними планами відділу біотехнології та вірусології рослин в рамках науково-технічних програм УААН за темами "Інтродукувати й вивчити генофонд декоративних, плодових і технічних рослин, удосконалити методи селекції і біотехнології та на їх основі створити нові сорти інтенсивного типу" (№ держреєстрації 0192U034076), "Розробити теоретичні основи біотехнології отримання нових селекційних форм рослин з підвищеною продуктивністю і адаптивністю до стресових факторів середовища, створення калюсної біомаси та мікророзмноження субтропічних і кісточкових плодових, лікарських і декоративних культур" в рамках проблеми "Поповнення і вивчення генофонду плодових, субтропічних, горіхоплідних, декоративних, ефіроолійних, лікарських, пряноароматичних і барвних рослин; створення продуктивних і стійких сортів з використанням сучасних методів фізіології, біохімії та біотехнології" (№ держреєстрації 0197U004324). З 2006 р. робота триває за науковою темою відділу біотехнології та біохімії рослин НБС-ННЦ УААН 09.02/017 "Створити в умовах in vitro колекції цінного рослинного генофонду на основі вивчення біотичних і абіотичних факторів безпересадочного культивування регенерантів плодових, субтропічних і декоративних культур" (№ держреєстрації 0106U006808).

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - виявити особливості регенерації рослин у культурі органів і тканин і розробити біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження Anthurium andreanum, Begonia riger elatior, Caladium hortulanum і Saintpaulia ionantha для масового тиражування важко розмножуваних видів і сортів квітково-декоративних культур та збереження in vitro цінних генотипів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

розробити способи отримання асептичної культури і введення в умови in vitro різних типів експлантів;

виявити залежність морфогенезу in vitro від біотичних і абіотичних факторів;

підібрати оптимальний склад живильних середовищ і умови культивування експлантів;

вивчити особливості росту й розвитку досліджуваних рослин у культурі in vitro на різних етапах клонального мікророзмноження;

встановити оптимальні концентрації регуляторів росту для ризогенезу мікропагонів in vitro та надати ефективні способи адаптації пробіркових рослин до ґрунтових субстратів;

надати схеми клонального мікророзмноження A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum, S. ionantha.

Об'єкт дослідження: пряма і непряма регенерація рослин у культурі ізольованих листкових експлантів, сегментів початка і суцвіть in vitro.

Предмет дослідження: морфогенетичні реакції та показники регенераційної здатності in vitro експлантів A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum, S. ionantha.

Методи дослідження: культура ізольованих органів і тканин рослин, метод світлової мікроскопії, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в результаті вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин двох сортів A. andreanum, п'яти сортів B. riger elatior, чотирьох сортів C. hortulanum, шести сортів S. ionantha виявлені особливості їх морфогенезу in vitro через органогенез і соматичний ембріогенез. Встановлено, що частота регенерації рослин залежить від генотипу, строків відбору, типу й розміру експланта, способу стерилізації, складу живильного середовища та умов культивування. Виявлено високий морфогенетичний потенціал висічок листків A. andreanum у віці 2-4 тижнів, відібраних з рослин-донорів у період осінь-весна (сорт Iga-Gold) та протягом усього періоду вегетації (сорт Porzellan), сегментів початка A. andreanum і сегментів суцвіть B. riger elatior у період цвітіння, висічок листків C. hortulanum - з травня по серпень та листкових експлантів B. riger elatior і S. ionantha - з січня по грудень.

Вперше розроблені ефективні способи ступінчастої стерилізації, які дозволяють знизити рівень контамінації рослинного матеріалу та отримати 85% стерильних експлантів A. andreanum, 80% B. riger elatior, 96% C. hortulanum и 94% S. ionantha.

Модифіковано склад живильних середовищ Піріка (Pierik, 1976) для культури листка й початка A. andreanum, Мурасіге та Скуга (Murashige, Skoog, 1962) для листкових експлантів B. riger elatior, C. hortulanum, S. ionantha і Буржен-Ніча (Bourgen-Nitsch, 1967) для культури суцвіть B. riger elatior та показано індукуючу роль регуляторів росту в процесах калюсогенезу (2,4-Д, НОцК, БАП), органогенезу (НОцК, IОцК, БАП) та соматичного ембріогенезу (кінетину, НОцК) експлантів досліджуваних культур.

Вперше виявлені особливості ризогенезу in vitro мікропагонів A. andreanum, C. hortulanum і мікророзеток B. riger elatior, S. ionantha та встановлено, що присутність у живильному середовищі ІОлК індукувало активне коренеутворення у A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum. Мікророзетки S. ionantha формували корені на безгормональному живильному середовищі. Визначені умови адаптації in vivo пробіркових рослин. Підібрано ефективний склад адаптаційних сумішей, що забезпечує 78-100% приживаності пробіркових рослин.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблені й запропоновані біотехнологічні схеми клонального мікророзмноження A. andreanum сортів Porzellan і Iga-Gold, B. riger elatior сортів Krefeld, Lorrenie, Nixi red і Nixi rose, Schwabenland, S. ionantha сортів Apachi Midnight, Margery's Melody, Ness Orange Pekoe, Alocha Orchid, Ruffled Skyes, Ruffles Snow Rose, C. hortulanum сортів Triumphe de Compte, Frieda Hemple, Candidum, Gipsy Rose, що включають послідовні етапи від введення експлантів у культуру in vitro до адаптації регенерантів in vivo. Вдосконалені прийоми клонального мікророзмноження для A. andreanum, що дозволяють скоротити цикл регенерації рослин у культурі in vitro з чотирьох етапів до трьох. Отримані рослини A. andreanum, C. hortulanum, S. ionantha передано до Державного підприємства "Торговий дім "Нікітський сад". Результати роботи використовуються в навчальних програмах з підготовки студентів та аспірантів біологічного факультету Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського і Південної філії Національного університету біоресурсів та природокористування України "Кримський агротехнологічний університет".

Особистий внесок претендента. Безпосередньо претендентом виконано: розроблення схеми дослідів, проведення експериментів, їх аналіз і обговорення отриманих результатів. Спільно з науковим керівником проведені вибір об'єктів дослідження, планування експериментів, освоєння методик, розробка структури дисертаційної роботи і підготовка наукових публікацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на міжнародніх наукових конференціях: "Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства" (Ялта, 1994), II Intl. Symp. on plant Biotechnology (Київ, 1998), Intl. Meeting of Young Scientists in Horticulture, (Lednicе, Czech Republic, 1999), міжнародному симпозіумі "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources" (Ялта, 2002), V міжнародній конференції "Цветоводство без границ" (Харків, 2006), VII з'ізді українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова (Алушта, 2007), III міжнародній конференції "Фактори експериментальної еволюції організмів" (Алушта, 2008), IX міжнародній конференції "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008); V міжнародній конференції "Геном рослин" (Одеса, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 робіт, з них 5 статей у фахових наукових виданнях, 11 - статті, матеріали й тези наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 196 сторінках і складається зі вступу, 6 розділів, висновків, практичних рекомендацій, додатку, списку використаної літератури (285 джерел, зокрема 199 іноземних) і включає 27 таблиць і 58 рисунків.

2. Основні результати досліджень

Мікророзмноження квітково-декоративних рослин в умовах in vitro (огляд літератури)

У розділі подано інформацію про стан біотехнологічних досліджень квітково-декоративних культур в Україні та за кордоном. Особлива увага приділена клональному мікророзмноженню, розглянуті його принципи й теоретичні основи. Показано вплив трофічних, гормональних і фізичних факторів на ефективність клонального мікророзмноження. Проте низька ефективність методів культивування органів і тканин для ряду видів і сортів квітково-декоративних рослин насьогодні вимагає проведення досліджень, що дозволяють розробити нові та удосконалити існуючі способи клонального мікророзмноження або їх окремі етапи.

3. Матеріали та методи досліджень

У дослідженнях використані рослини A. andreanum сортів Porzellan і Iga-Gold, B. riger elatior сортів Krefeld, Lorrenie, Nixi red і Nixi rose, Schwabenland, S. ionantha сортів Apachi Midnight, Margery's Melody, Ness Orange Pekoe, Alocha Orchid, Ruffled Skyes, Ruffles Snow Rose, C. hortulanum сортів Triumphe de Compte, Frieda Hemple, Candidum, Gipsy Rose з колекційного генофонду НБС-ННЦ. Як експланти для введення в культуру in vitro були узяті висічки листків, сегменти початків і суцвіть.

При проведенні експериментальних робіт використовували загальноприйняті методи культури ізольованих клітин, органів і тканин рослин in vitro (Бутенко, 1964; Калінін та ін., 1980; Калінін та ін.,1992; Митрофанова та ін., 1999).

Для отримання асептичної культури первинних експлантів нами розроблені способи стерилізації для кожного досліджуваного виду рослин. Експозицію й концентрацію стерилізуючої речовини підбирали залежно від типу експланта, що вводився. Як стерилізуючі агенти були використані 70%-ний етанол (С2Н5ОН, Медасепт, Україна), 1-2%-ні розчини гіпохлориту натрію (NaClO, Merck, Німеччина), 0,08%-ний розчин нітрату срібла (AgNO3, Merck, Німеччина), 1%-ний розчин Thimerosal (Merck, Німеччина) та їх комбінації, що дозволило звільнити експланти, що вводилися, від ендогенної та екзогенної інфекції.

В процесі вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин досліджуваних культур використані базові живильні середовища Піріка (Pierik, 1976), МС (Murashige, Skoog, 1962), Кнопа (Knop, 1865) і Буржен-Ніча (Bourgen-Nitsch, 1967), які були модифіковані нами в ході проведення експериментів: АЛ 1, АП 1, А 3, А 4, А, Б, С, S 1, S 2, S 3, Cl 1, Cl 2, Cl 3. Як регулятори росту використані БАП, кінетин, зеатин, 2,4-Д, ІОцК, НОцК, ІОлК. Умови регенерації рослин у культуральній кімнаті: температура 21-29°С, 12-20-годинний фотоперіод, інтенсивність освітлення 1-5 клк і відносна вологість повітря 70%. Частину експлантів вміщували до термостату з температурою 25°С і 28°С. Субкультивування експлантів здійснювали за 3-4 тижні. експлант клональний мікророзмноження ризогенез

Вкорінення мікропагонів проводили на модифікованих живильних середовищах А 4, С, S 3, Cl 3, доповнених 0,98-4,40 мкМ ІОлК. Вкорінені мікропагони висаджували на адаптацію in vivo в стерильні субстрати: торф; перліт; мікропарник (торф, збагачений мікроелементами); торф:перліт (1:1, 2:1); мікропарник:перліт (1:1, 2:1); торф:пісок (1:1, 2:1, 3:1); перліт:торф:пісок (1:6:4); торф:листкова земля:пісок (1:1:1). Адаптовані рослини далі вирощували в теплиці.

Статистичну обробку результатів експериментальних досліджень проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Лакін, 1990), послуговуючись прикладними програмами "Математична статистика" версія 6.0. Вірогідність відмінностей між отриманими експериментальними даними встановлювали за допомогою F-критерію Фішера.

Особливості отримання стерильної культури A. andreanum, B. riger elatior, S. ionantha і C. hortulanum. Використання для стерилізації рослинного матеріалу 70%-ного етанолу (С2Н5ОН), 1-2%-них розчинів гіпохлориту натрію (NaClO), 0,08%-ного розчину нітрату срібла (AgNO3), 1%-ного розчину Thimerosal та їх комбінацій дозволило визначити оптимальні способи стерилізації рослинного матеріалу досліджуваних культур. Ефективність стерилізації підвищували за рахунок додавання до кожного стерилізуючого агента детергенту Tвін-80. Так, кращі результати були отримані за ступінчастої стерилізації листків і молодих ювенільних початків A. andreanum у 70%-ному С2Н5ОН з експозицією 60 сек, з подальшим вміщенням до 1%-ного розчину NaClO. Тривалість стерилізації залежала від типу експланта й становила 5 хв. для листкових експлантів і 7 хв. для початка, після чого рослинний матеріал ретельно промивали 4 рази в стерильній дистильованій воді. Це дозволило отримати 86% висічок листка і 85% сегментів початка A. andreanum, вільних від контамінації. Для суцвіть і листків B. riger elatior ефективнішою виявилася стерилізація в 70%-ному С2Н5ОН 1 хв., 1%-ному розчині NaClO з експозицією 10 хвилин і 4-разовим промиванням у стерильній дистильованій воді. За такого способу стерилізації вдалося досягти не тільки низького рівня зараження експлантів B. riger elatior (20%), але й отримати достатньо високий ступінь регенерації мікропагонів (80%). Листки C. hortulanum стерилізували в 1,8%-ному розчині гіпохлориту натрію протягом 5 хв., потім занурювали до 70%-ного етилового спирту. При цьому рівень контамінації був низький і складав 4-5%. Всі вільні від інфекції експланти мали високий морфогенетичний потенціал. Застосування 0,08% розчину AgNO3 і 1% розчину Thimerosal також сприяло виходу стерильних експлантів B. riger elatior і C. hortulanum. Проте їх послідовне використання мало помітний фітонцидний вплив на рослинні тканини, що далі викликало зниження морфогенетичного потенціалу й регенерації рослин. Асептична культура S. ionantha була отримана при послідовному зануренні листка до 1%-ного розчину Thimerosal з експозицією 25 хв., потім до 70%-ного С2Н5ОН - 1 хв. та до 0,08%-ного розчину AgNO3 - 3-5 хв. Після стерилізації рослинний матеріал тричі промивали в стерильній дистильованій воді. При такому способі стерилізації тканини листка на модифікованому середовищі S1 залишалися зеленими та надалі виявляли високу здатність до морфогенезу й регенерації (75-94%). Подальше збільшення експозиції стерилізації в 0,08%-ному розчині AgNO3 до 6-8 хв. сприяло 100%-ному виходу експлантів, вільних від контамінації, проте сильна фітотоксична дія на листки знижувала регенераційний потенціал до 12%. З огляду на отримані експериментальні дані, уся робота з впровадження експлантів досліджуваних квітково-декоративних культур грунтувалася на використанні ступінчастої стерилізації рослинного матеріалу.

Вплив генотипу і термінів відбору на індукцію розвитку первинних эксплантів A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum і S. ionantha. Дослідження показали, що здатність введених експлантів до морфогенезу і регенерації мікропагонів в умовах in vitro значною мірою залежали від термінів відбору вихідного матеріалу. Відбір експлантів A. andreanum сорту Porzellan проводили протягом усього року. При цьому 91-96% експлантів проліферували калюс. Найкращою порою для введения в культуру in vitro висічок листка та сегментів початка A. andreanum сорту Iga-Gold була осінь-весна. При цьому частота калюсогенезу сягала 95%. У експлантів, відібраних з травня по жовтень, цей показник не перевищував 50%. Встановлено, що високий морфогенетичний потенціал мали висічки листка A. andreanum 2-4-тижневого віку, що перебувають у стадії виходу з трубки, і сегменти ювенільного початка.

Відбір листків C. hortulanum і їх введення в культуру in vitro проводили з травня по вересень включно. Встановлено, що висічки листків, відібрані в період з травня по серпень мали високий морфогенетичний потенціал. При цьому частота утворення мікропагонів сягала 78-100%. У листкових експлантів, введених в умови in vitro в вересні, частота регенерації мікропагонів не перевищувала 45%. Кращий розвиток мікророзеток B. riger elatior у культурі in vitro спостерігали при ізоляції експлантів у період з серпня по жовтень. Разом з тим, було встановлено, що високий морфогенетичний потенціал мали висічки листків 2-3-річних рослин S. ionantha, що вводяться в умови in vitro, протягом всього року. Зі збільшенням віку рослини-донора до 4-5 років спостерігали значне зменшення здатності до морфогенезу і регенерації рослин сортів, що вивчалися. Подальші дослідження проводилися з урахуванням виявлених закономірностей.

Вивчення регенераційного потенціалу A. andreanum. Для розроблення біотехнологічних прийомів клонального мікророзмноження двох досліджуваних сортів A. andreanum були вивчені особливості органогенезу та встановлені основні фактори, що впливають на морфогенетичний потенціал органів і тканин досліджуваних видів рослин. Виявлено, що ними є генотип рослини, концентрація регуляторів росту в живильному середовищі, температура, інтенсивність освітлення і фотоперіод. В процесі досліджень модифіковано склад живильних середовищ Піріка і підібрано ефективні концентрації регуляторів росту для індукції калюсоутворення в культурі висічок листка і сегментів початка двох сортів A. andreanum. Показано, що застосування 4,40 мкМ БАП і 0,9 мкМ 2,4-Д в середовищі АЛ 1 для висічок листка A. andreanum 2-4-тижневого віку розміром 1х1 см і 4,40 мкМ БАП і 0,45 мкМ 2,4-Д в середовищі АП 1 для сегментів початка розміром 2-3 мм дозволило індукувати активне калюсоутворення двох сортів в умовах in vitro. Максимальна вага калюсу за 60 діб культивування у висічках листків сорту Iga-Gold сягала 70-75 мг, у сорту Porzellan - 85-90 мг.