Одержання, характеристика та біологічна активність кореневих екзометаболітів проростків пшениці

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н Каразіна

УДК 581 .13 : 581 .142

Одержання, характеристика та біологічна активність кореневих екзометаболітів проростків пшениці

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Кузнецова Юлія Олександрівна

Харків 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Божков Анатолій Іванович, НДІ біології Харківського національного університетуімені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, директор НДІ біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доцент Колупаєв Юрій Євгенович, Харківський національний аграрний університет імені В.В. Докучаєва Міністерства освіти і науки України,професор кафедри ботаніки та фізіології рослин

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кричковська Лідія Василівна, Харківський національний технічний університет “ХПІ” Міністерства освіти і науки України, професор кафедри біотехнології та аналітичної хімії

Захист відбудеться “ _27_” ___травня________ 2009 року о _13-00_____годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий _23 квітня__2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 В.М. Дзюба

екзометаболіт кореневий пшениця

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з актуальних проблем сучасної біотехнології є пошук продуцентів біологічно активних речовин з метою їх використання у фармацевтичній та харчовій промисловості, у створенні косметичних засобів та ін. (Tsao D.T., 2003). Нині розвитку набувають так звані кореневі технології, що базуються на екскреторних властивостях коренів вищих рослин (Horn M.E. et al., 2004). Виділяючи кореневі екзометаболіти в навколишнє середовище, корені беруть участь у формуванні фітоценозів (Иванов В.П., 1973; de Weert S. et al., 2002; Burgmann H. et al., 2005; Kamilova F et al., 2006), змінюють хімічні та фізичні властивості ґрунтів (Dakora F.D. et al., 2002) та інгібують ріст конкуруючих рослин (Estabrook E.M. et al., 1998), виявляючи алелопатичну активність. Активність екскреторних процесів та склад речовин, що екскретуються, визначаються видом рослини, фазою її розвитку, а також залежать від низки факторів і сигналів (Божков А.И. и др.,1996.; Lucas Garcнa J. A. et al., 2001; Phillips D.A. et al., 2004). Таким чином, в процесі екскреції виділяються речовини, що виявляють різноманітну біологічну активність і становлять інтерес для біотехнологічних досліджень. У зв'язку з цим ризосекреція є перспективним напрямом біотехнології, оскільки дозволяє одержувати необхідні біологічно активні метаболіти в гідропонних культурах, а залежність складу кореневих екзометаболітів від факторів середовища робить цей процес потенційно керованим (Gagnon H., 1997).

Дотепер більша частина рекомбінантних білків, ненасичених жирних кислот, вітамінів, полісахаридів, що одержують з рослин та використовують в медицині, косметології, сільському господарстві, екстрагуються з рослин за допомогою розчинників. Цей метод потребує дорогого очищення активного компонента від домішок, крім того, екстракція потребує руйнування клітин рослини (Gleba D., 1999). Водночас природна здатність рослин синтезувати і екскретувати в навколишнє середовище велику кількість різних метаболітів впродовж усього періоду вегетації використовується недостатньо. Це зумовлено насамперед нестабільним виходом і складом екзометаболітів, малою вивченістю біологічної активності кореневих екзометаболітів і динаміки екскреторних процесів. Крім того, дослідження механізмів екскреції має велике теоретичне значення, бо ці механізми лежать в основі функціонування всіх біологічних систем. Особливий інтерес в цьому відношенні становить вивчення формування екскреторних систем в перші доби росту кореня. У зв'язку з цим важливим є вивчення механізмів та закономірностей процесів кореневої екскреції і дослідження біологічної активності кореневих екзометаболітів. Знання цих закономірностей дозволить розробляти біотехнології одержання екзометаболітів відомого складу та біологічної активності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в Науково-дослідному інституті біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна в рамках теми «Дослідження екстрацелюлярних ферментів фітопатогенів і їх ролі у формуванні рослинного імунітету» (№ державної реєстрації: 0105U00715).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження якісного і кількісного складу кореневих екзометаболітів проростків пшениці на початкових етапах росту, ролі межових клітин в процесах кореневої екскреції та оцінка біологічної активності кореневих екзометаболітів на модельних системах. Відповідно до цього були поставлені такі завдання:

Визначення якісного та кількісного складу кореневих екзометаболітів 1-3-денних проростків пшениці.

Дослідження впливу різних факторів (строку збереження насіння, системи збору екзометаболітів та щільності пророщування проростків) на інтенсивність екскреції та склад кореневих екзометаболітів.

Дослідження впливу різноманітних хімічних сполук (фториду натрію, етилового спирту) на інтенсивність росту проростків, їх екскреторну активність та склад кореневих екзометаболітів проростків пшениці.

Визначення ролі межових клітин кореня в екскреції кореневих екзометаболітів та оцінка їх функціональної активності.

Оцінка альгіцидної, антибактеріальної та антиоксидантної активності кореневих екзометаболітів 1-3-денних проростків пшениці.

Проведення пілотних експериментів з одержання кореневих екзометаболітів в гідропонній культурі.

Об'єкт дослідження: кореневі екзометаболіти 1-3-денних проростків пшениці Triticum aestivum сорту «Донецька-46».

Предмет дослідження: показники вмісту білка, вуглеводів, амінокислот, ліпідів в кореневих екзометаболітах, інтенсивність росту проростків, кількість межових клітин, антибактеріальні та антиоксидантні властивості кореневих екзометаболітів.

Методи дослідження: спектрофотометричні (вміст загальних вуглеводів, загального білка, амінокислот, визначення вмісту ТБК-активних продуктів), мікроскопічні (кількість межових клітин), електрофоретичний метод розділення білків, метод паперових дисків для визначення антибактеріальних властивостей екзометаболітів, капілярний метод визначення в'язкості гелевого чохлу, статистичні методи обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що екскреція метаболітів коренями проростків пшениці починається з ранніх етапів формування кореневої системи проростка. Мікрооточення кореня остаточно формується до 24 години росту. До складу мікрооточення входять вуглеводи, амінокислоти, низько- та високомолекулярні білки. Крім того, в складі кореневих екзометаболітів виявляється протеазна активність, яка зумовлює деградацію білків в середовищі.

Розроблено метод препаративного видалення межових клітин. Вперше показано, що межові клітини відділяються з поверхні кореневого апексу вже в перші 24 години росту кореня і їх кількість складає 30-40 клітин/корінь при морфологічному підрахунку і 80-90клітин/корінь при препаративному виділенні.

Вперше показано зворотній зв'язок між інтенсивністю росту кореня і активністю кореневої екскреції білків та амінокислот, тобто екскреторна система коренів функціонує за принципом авторегуляції.

Показано, що склад кореневих екзометаболітів та їх кількість залежать від системи збору. Виявлено, що при накопиченні екзометаболітів в середовищі до певного рівня їх екскреція уповільнюється, тобто діє принцип авторегуляції.

Виявлено, що внесення фтористого натрію в систему росту супроводжується інгібуванням росту коренів, збільшенням кількості межових клітин в кореневому апексі та зміною їх метаболічної активності, що призводить до зміни інтегральних характеристик ризосфери, зокрема, збільшення в'язкості ризосфери. Однак не виявлено прямої кореляції між кількістю межових клітин та екскрецією метаболітів в середовище культивування.

Сформульовано гіпотезу про функціональну систему «корінь-мікрооточення», суть якої полягає в тому, що між екзометаболітами і коренем формуються прямі та зворотні зв'язки, які забезпечують регуляцію інтенсивності росту кореня, його захист від несприятливих факторів середовища і «взаємодію» кореневої системи з трофічними факторами середовища.

Встановлено, що одержані в гідропонній культурі кореневі екзометаболіти проростків пшениці виявляють високу антибактеріальну та антиоксидантну активність і можуть використовуватися як біологічно активні речовини.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати про закономірності екскреції екзометаболітів коренями, про динаміку екскреторних процесів, про вплив різних індукторів на ці процеси є основою для розробки в НДІ біології ХНУ імені В.Н. Каразіна кореневих біотехнологій для спрямованого одержання продуктів відомого складу та біологічної активності.

Виявлена антибактеріальна активність кореневих екзометаболітів проростків пшениці порівнювана або навіть перевищує активність деяких антибіотиків. Крім того, екзометаболіти не виявляють побічних ефектів і можуть бути рекомендовані для використання у профілактичній медицині. Виявлена антиоксидантна та альгіцидна активність кореневих екзометаболітів відкриває можливості для їх використання при розробці біологічно активних добавок широкого спектра дії.

Одержані результати використовуються при читанні лекцій та проведенні практичних занять з біотехнології на кафедрі молекулярної біології та біотехнології біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Самостійно проведено аналіз літератури та експериментальні дослідження. Визначення кількості та морфологічних параметрів межових клітин були проведені спільно з к.б.н. Н.Г. Мензяновою. Визначення антибактеріальної активності кореневих екзометаболітів проведено спільно з лабораторією крапельних інфекцій НДІ мікробіології і імунології імені І.І. Мечникова. Визначення антиоксидантних властивостей кореневих екзометаболітів проведено спільно з к.б.н. Ю.В. Нікітченком. Статистична обробка одержаних результатів проведена самостійно. Аналіз та інтерпретація одержаних результатів проведені спільно з науковим керівником д.б.н. А.І. Божковим.

Апробація результатів дисертації. Результати та основні положення роботи доповідалися на ІХ конференції молодих вчених «Биология -- наука XXI века» (Пущіно, 2005), ІІІ Міжнародній конференції «Актуальні проблеми сучасної альгології» (Харків, 2005), II Міжнародній конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2006), VII Міжнародному симпозіумі «Биологические механизмы старения» (Харків, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Біотехнологія. Освіта. Наука. Практика» (Харків, 2006) та наукових семінарах НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 4 статті у виданнях, що входять до переліку видань, затвердженого ВАК України, та 7 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Результати дисертаційної роботи викладені на 154 сторінках друкованого тексту, з них 126 - основний текст. Дисертаційна робота складається зі вступу, 3 розділів: огляд літератури, матеріали та методи дослідження, результати дослідження та їх обговорення; заключення, висновків, списку використаної літератури, і ілюстрована 28 рисунками і 15 таблицями. Список використаної літератури складається з 242 найменувань, з них 185 - іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Огляд літератури складається з 4 підрозділів, в яких наведено аналіз наукової літератури щодо кореневих екзометаболітів вищих рослин: механізмів кореневої екскреції, характеристики кореневих екзометаболітів, межових клітин кореня, а також фітотехнологій, заснованих на явищі кореневої екскреції.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на проростках пшениці Triticum aestivum сорту Донецька-48.

Вміст загальних вуглеводів в кореневих екзометаболітах визначали за методом Моліша (Герхардт Ф., 1983). Вміст загального білку визначали за методом Лоурі в модифікації Міллера (Lowry O.B., 1957). Вміст амінокислот в кореневих екзометаболітах визначали нінгідриновим методом (Ермаков А.И. и др., 1987). Розділення білків екзометаболітів здійснювали методом ступінчастого електрофорезу за Лемлі (Остерман Л.А., 1981). Вміст фторид-іона в коренях визначали за допомогою фтор-селективного електрода, в'язкість гелевого чохлу апексу коренів проростків оцінювали капілярним методом. Кількість межових клітин, виділених препаративним методом, визначали мікроскопічно в камері Горяєва. Для визначення кількості клітин, що оточують корінь in situ, корені фарбували барвником 0,6% трипановим синім. Антибактеріальні властивості кореневих екзометаболітів оцінювали методом паперових дисків, використовуючи як тест-об'єкти Staphylococcus aureus і Streptococcus pyogenes (Егоров Н.С., 1979). Загальну антиокиснювальну активність оцінювали за здатністю кореневих екзометаболітів гальмувати накопичення тіобарбітурова кислота (ТБК)-активних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) в суспензії жовткових ліпопротеїдів, концентрацію яких визначали спектрофотометрично (Клебанов Г.И. и др., 1988). Ефективність гасіння ОН^·-радикалів кореневими екзометаболітами визначали за їхньою здатністю гальмувати руйнування дезоксирибози ОН^·-радикалами, яке визначали за накопиченням ТБК-активних продуктів (Halliwell B. et al., 1987). Всі експерименти проводили не менш як 3 рази з 3 біологічними повтореннфми. Порівняння середніх значень у вибірках проводили за допомогою U-критерію Манна-Уитни (Гублер Е.В. и др., 1973).

Основні результати та їх обговорення

Характеристика екскреторної системи проростків пшениці на початкових стадіях росту. Підрахунок кількості межових клітин (МК), що оточують корінь in situ, показав, що до закінчення першої доби росту кореня вона була невеликою (30-40 клітин/корінь) (рис. 1).

Було встановлено, що за препаративного способу виділення виявлялося в 2 рази більше МК порівняно з кількістю, що фіксується in situ - 80-90 клітин/корінь (рис. 1). Це може бути пов'язане з тим, що достатньо велика кількість МК прилягала до меристеми гелевого чохлу і при їх підрахунку in situ не визначалася, принаймні, на ранніх етапах формування ризосфери (рис. 2).

Через те, що основною функцією межових клітин є екскреція метаболітів, їх наявність в апексі на першу добу росту проростків дозволяє припустити, що формування мікрооточення кореня відбувається в першу добу росту. Загальний білок в складі кореневих екзометаболітів проростків пшениці виявлявся з 12 години росту коренів, і його вміст в середовищі культивування проростків залишався сталим до 24 години росту. При цьому довжина коренів проростків з 12 до 24 години росту збільшилася в 3,3 раза.

На наступному етапі роботи визначали якісний та кількісний склад кореневих екзометаболітів 1-денних проростків пшениці. Виявили, що в складі кореневих екзометаболітів 1-денних проростків пшениці переважали вуглеводні компоненти, які складали 62% від усіх компонентів, що виявлялися у складі екзометаболітів. Загальні амінокислоти складали 28% від усіх екзометаболітів, а загальні та високомолекулярні білки - 9% та 1% від усіх кореневих екзометаболітів відповідно. Електрофоретичне розділення високомолекулярних білків показало, що молекулярна маса цих білків варіює від 12 кDa до 43 кDa (рис. 3).

Такий низький вміст високомолекулярних білків можна пояснити високим рівнем неспецифічної протеазної активності (1,36 мкг гліцину/корінь), яка виявлялася в складі кореневих екзометаболітів вже на початкових етапах росту.

Таким чином, протягом перших 12 годин росту мікрооточення кореня представлене переважно МК і лише через 12 годин в складі мікрооточення виявляються вуглеводи, амінокислоти, низькомолекулярні та високомолекулярні білки, а також ферменти, що виявляють протеазну активність.

Вплив системи збору екзометаболітів і щільності посадки проростків на інтенсивність системи екскреції. Дослідження на проростках зерна пшениці врожаю 2003 та 2004 рр. показали, що до закінчення першої доби росту корені проростків зерна врожаю 2003 року досягали довжини 0,9 см, а корені проростків зерна врожаю 2004 року - 1,8 см (в 2 рази більше). Таким чином, корені проростків зерна врожаю 2003 року характеризуються низькою інтенсивністю росту (НІР), а корені проростків зерна врожаю 2004 року - високою інтенсивністю росту (ВІР). Виявили, що інтенсивність екскреції білкових компонентів і амінокислот кореневих екзометаболітів тим вища, чим нижча природна швидкість росту коренів, тобто спостерігалася зворотна кореляція між інтенсивністю росту кореня і активністю кореневої екскреції білків і амінокислот. Рівень екскреції вуглеводних компонентів не розрізнявся для коренів з різною інтенсивністю росту.

Виявили, що кількість МК, які оточують корінь in situ, і тих, що видаляються препаративним методом, практично не відрізнялася для коренів з ВІР і НІР. Таким чином, посилена екскреторна функція, що спостерігалася у коренів з НІР порівняно з коренями з ВІР, ймовірно, пов'язана не з посиленою продукцією МК в оточуюче середовище, а з посиленням їх функціональної активності або з участю інших типів клітин в екскреції метаболітів.

Однією з найбільш важливих функцій клітинної екскреції є забезпечення зв'язку клітин кореня з середовищем і через «потреби» середовища регуляція внутрішньоклітинного метаболізму. Якщо це так, то безперервно видаляючи екскретовані в середовище екзометаболіти і, таким чином, змінюючи оточення кореня, можна впливати на інтенсивність екскреції та можливий склад екзометаболітів. Виходячи з цього, визначали динаміку екскреції білків, ліпідів, вуглеводів, активності протеаз кореневих екзометаболітів проростків пшениці за умов проточного та накопичувального збору з 1 по 3 добу росту кореня.

Виявили, що з 1 по 3 добу росту 100 зернівок, що проросли, екскретували 20,7 мг екзометаболітів, при цьому інтенсивність екскреції була найменшою на 1 добу, потім вона зростала більш, ніж в 2 рази на 2 добу і в подальшому не змінювалася (табл. 1).

Таблиця 1

Вихід сухої біомаси кореневих екзометаболітів на 1, 2 і 3 добу росту при проточній та накопичувальній системах збору екзометаболітів

Час культивування, доба	Суха біомаса кореневих екзометаболітів (мг/100 зернівок)
	Спосіб збору
	проточний	накопичувальний
1	3,2±0,4	3,2±0,4
2	9,9±0,7*	11,5±0,6*
3	11,9±0,5*	20,7±0,7*,**
Загальна кількість екзометаболітів	25,0±0,6	20,7±0,7

Примітки: * - Р<0,05 порівняно з першою добою; ** - Р<0,05 порівняно з другою добою

Можна припустити, що вихід кількості екзометаболітів на певний стаціонарний рівень до третьої доби зумовлений авторегуляторним уповільненням екскреторної функції кореня та виходом цього процесу на стаціонарний рівень.

При проточному зборі загальний вихід екзометаболітів склав 25 мг/100 зернівок, що майже на 5 мг більше порівняно з накопичувальним режимом збору (табл. 1). Ці результати підтверджують висловлене припущення про функціонування авторегуляції екскреторної системи кореня у водній культурі та перспективність промислового використання проточної системи збору екзометаболітів.

Виходячи з цього, можна припустити, що чим швидше екзометаболіти накопичуються в середовищі до певного рівня, тим меншою стає екскреторна активність проростків. Швидкість накопичення екзометаболітів в середовищі можна змінювати штучно, змінюючи щільність культивування проростків (різна кількість проростків в реакторі).

У зв'язку з цим на наступному етапі роботи досліджували вплив щільності пророщування насіння на інтенсивність росту коренів, екскрецію та склад кореневих екзометаболітів. Збір кореневих екзометаболітів проводили за накопичувальною схемою та вимірювали довжину головного кореня у 1-, 2- та 3-денних проростків пшениці.

Виявили, що довжина коренів не залежала від щільності пророщування для 1- та 2-денних проростків, а до закінчення третьої доби росту спостерігалося нелінійне інгібування росту кореня зі збільшенням щільності культивування проростків.

Виявили, що зміна вмісту білків та вуглеводів в кореневих екзометаболітах зі збільшенням щільності пророщування носить нелінійний характер. Нелінійний характер змін вмісту загального білку та вуглеводів в умовах різної щільності культивування проростків передбачає існування порогових концентрацій екзометаболітів, за яких екзометаболіти ризосфери починають інгібувати власну екскрецію або зазнають хімічних перетворень в самій ризосфері. Вміст високомолекулярного білка в складі кореневих екзометаболітів нелінійно зростав зі збільшенням щільності пророщування для всіх проростків. Вміст загальних вуглеводів в кореневих екзометаболітах 1-денних проростків пшениці залишався на постійному рівні незалежно від щільності культивування, а для 2- та 3-денних проростків спостерігалося зниження вмісту цих компонентів зі збільшенням щільності культивування.

Нелінійний характер залежності вмісту різних компонентів кореневих екзометаболітів від щільності культивування проростків свідчить про те, що виділені в середовище метаболіти самі стають регуляторами функції в системі екскреції. Щільність культивування проростків є фактором регуляції екскреції, що легко контролюється, і тому його використання в ризосферних технологіях є досить перспективним.

Були проведені пілотні експерименти з одержання кореневих екзометаболітів проростків пшениці в гідропонній культурі. В пілотному експерименті були враховані всі закономірності, виявлені в лабораторних дослідженнях: було використане насіння, що зберігалося 18 місяців, щільність пророщування відповідала 50 проросткам на чашку Петрі (1 проросток/см²), збір екзометаболітів здійснювали на 1, 2 і 3 добу росту в проточному режимі. Судячи з даних, отриманих в пілотних експериментах, при створенні технології на основі гідропонної культури проростків пшениці за 3 доби росту проростків при проточному режимі збору з 1 кг пшениці можна одержати кореневі екзометаболіти, що містять 1,052 г білка і 2,126 г глюкози. Проведені пілотні експерименти дозволяють заключити, що виявлені в лабораторних експериментах закономірності екскреторних процесів зберігаються і при збільшенні обсягів культивування, а розроблені рекомендації можуть бути використані для створення ефективної кореневої технології в промисловому масштабі.

Вплив етилового спирту на екскреторну активність і склад кореневих екзометаболітів 1-3-денних проростків пшениці. Відомо, що процес кореневої екскреції і склад екзометаболітів можуть визначатися присутністю у середовищі культивування різних речовин. Як один з потенційних регуляторів екскреторних процесів нами був обраний етиловий спирт в низьких концентраціях (Андрианова Ю.Е. и др., 1996). Інкубація проростків з етиловим спиртом в різних концентраціях призводила до інгібування росту коренів, яке не мало чіткої дозової залежності від концентрації етилового спирту в середовищі культивування і було різним для коренів з ВІР та НІР. Присутність етилового спирту в середовищі в концентрації 1% інгібувала ріст коренів з ВІР в 1,7 раза, а коренів з НІР - в 2,4 раза порівняно з контролем. Через те, що раніше була виявлена зворотна залежність між інтенсивністю росту коренів і екскреторною активністю у випадку з природною затримкою росту, то становило інтерес з'ясувати, чи зберігається ця залежність у разі індукованої внесенням етилового спирту затримки росту кореня. Виявили, що для коренів з НІР активність екскреції як білків, так і вуглеводів, мала зворотну залежність від індукованого внесенням етилового спирту інгібування росту коренів практично в усьому досліджуваному діапазоні концентрацій.

Для коренів з ВІР спостерігалася зворотна залежність між інтенсивністю росту і активністю екскреції вуглеводів, але не загального білка. Крім того, при внесенні етилового спирту екскреторна активність коренів з ВІР була нижчою, ніж коренів з НІР в усьому досліджуваному діапазоні.

Вплив фтористого натрію на екскреторну активність і склад кореневих екзометаболітів 1-3-денних проростків пшениці. Відомо, що фтористий натрій чинить комплексний вплив на фізіологічні процеси в рослинних клітинах, який виявляється в інгібуванні росту рослин (Илькун Г.М., 1978). Внесення фтористого натрію в експериментах дозволяє контролювати інтенсивність росту коренів, що може розглядатися як модель для вивчення системи екскреції.

Інкубація проростків з різними концентраціями фтористого натрію впродовж доби призводила до пригнічення швидкості росту коренів, причому ступінь інгібування була більшою для коренів з ВІР. Визначення вмісту фторид-іона в коренях проростків з ВІР через добу після їх росту на середовищі з різними концентраціями фториду натрію показало, що при внесенні фториду натрію в середовище пророщування в концентрації 1, 5 і 10 мМ вміст фторид-іона в коренях збільшувався в 8 разів, незалежно від його концентрації в середовищі, а внесення 20 мМ NaF супроводжувалося збільшенням вмісту фторид-іона в коренях в 40 разів (табл. 2).

Таким чином, фторид проникає в клітини коренів та здійснює інгібуючий вплив на ростові процеси. Стрибкоподібний характер збільшення вмісту фтору в клітинах кореня при внесенні 20 мМ NaF вказує на існування механізму «утримання» іонів фтору в ризосфері. Можна припустити, що компоненти ризосфери забезпечують захист кореня від хімічних токсикантів.

Таблиця 2

Концентрація фторид-іона (моль F^-/мг сухої маси коренів) в коренях 1-денних проростків пшениці при їх рості впродовж доби на середовищі, що містить 0, 1, 5, 10 і 20 мМ фтористого натрію

Концентрація NaF в середовищі росту, мМ	Концентрація F- в коренях 1-денних проростків, моль/мг сухої маси коренів · 10-8
0	0,05±0,01
1	0,34±0,03*
5	0,42±0,04*
10	0,38±0,03*
20	2,01±0,04*,**

Примітки: * - Р<0,05 порівняно з контролем; ** - Р<0,05 порівняно з 1, 5 і 10 мМ фториду натрію

Визначення в'язкості гелевого чохла показало, що при концентрації NaF в середовищі від 1 до 5 мМ вона збільшувалася однаково в 3 рази, а при концентрації NaF в середовищі від 10 до 20 мМ - в 5 разів порівняно з контролем (рис. 4).

Таким чином, внесення в середовище культивування фтористого натрію не тільки інгібує ріст кореня, але й в 3-5 разів збільшує в'язкість гелевого чохла, тобто впливає на функцію екскреторної системи.

Було виявлено, що індуковане фтористим натрієм інгібування росту коренів супроводжувалося посиленням екскреції білка як для коренів з ВІР, так і з НІР, причому для ВІР екскреторна активність залишалася нижчою порівняно з НІР і в цьому випадку (табл. 3).

Вміст високомолекулярного білку в складі кореневих екзометаболітів коренів з НІР збільшувався лише при внесенні 20 мМ фтористого натрію, а для коренів з ВІР - в усьому діапазоні досліджуваних концентрацій.

Таблиця 3

Вміст загального і високомолекулярного білку (мкг/корінь) в кореневих екзометаболітах 1-денних проростків пшениці в контролі і після внесення фтористого натрію в різних концентраціях

Концентрація NaF, мМ	Корені з НІР	Корені з ВІР
	загальний білок, мкг/корінь	високомол. білок, мкг/корінь	загальний білок, мкг/корінь	високомол. білок, мкг/корінь
0	3,50±0,34	0,86±0,07	1,57±0,38	0,14±0,05
1	5,50±0,72	1,14±0,23	1,90±0,45	0,20±0,02
5	6,40±0,24	1,20±0,34	2,01±0,21	0,46±0,07*
10	3,76±0,45	0,94±0,10	1,61±0,56	0,44±0,09*
20	12,10±1,98**	3,74±0,67**	2,77±0,44**	1,78±0,35**

Примітки: * - Р<0,05 порівняно з контролем; ** - Р<0,05 порівняно з 1,5 та 10 мМ фториду натрію

Було виявлено, що внесення фтористого натрію в середовище культивування коренів як з НІР, так і з ВІР не супроводжувалося зміною вмісту вуглеводних компонентів, незалежно від дози фториду натрію.

Таким чином, збільшення швидкості екскреції білків в присутності фтористого натрію в концентрації 20 мМ було зумовлене не руйнуванням клітин кореня, а, ймовірно, індукцією специфічного механізму їх транспорту в середовище.

Можлива роль межових клітин кореня в екскреції кореневих екзометаболітів. Відомо, що функціональна активність межових клітин може розрізнятися залежно від факторів зовнішнього середовища і функціонального стану кореня. Збільшення чи зменшення кількості речовин, що екскретуються, в наших експериментах могло бути викликане як збільшенням кількості межових клітин в апексі кореня, так і посиленням їх екскреторної функції. Для вирішення даного завдання ми розраховували питому екскреторну активність МК як кількість білків та вуглеводів в культуральному середовищі на 100 МК для коренів з ВІР та НІР.

Виявилося, що в апексі коренів з ВІР і НІР кількість МК була однаковою і складала 30-40 клітин на корінь, а вміст білків і вуглеводів в середовищі культивування коренів з НІР був в кілька разів більшим, ніж в середовищі культивування коренів з ВІР (рис. 5).

Питома активність екскреції загального білка межовими клітинами коренів з НІР при такому розрахунку була в 2 рази більшою порівняно з коренями з ВІР і складала 10,4 мкг/100 МК і 4,4 мкг/100 МК відповідно. Питома активність екскреції вуглеводів МК коренів з НІР перевищувала таку у коренів з ВІР в 1,3 раза і складала 40,76 мкг/100 МК і 31,26 мкг/100 МК відповідно. Таким чином, питома екскреторна активність МК апексу проростків з ВІР була нижчою, ніж у МК апексу проростків з НІР.

Відомо, що межові клітини є перешкодою на шляху проникнення в корінь важких металів та фітотоксикантів (Miysaka S.C. et al., 2001). Було виявлено, що внесення в середовище культивування фітотоксиканту і в той же час «стимулятора» кореневої екскреції NaF в концентрації від 1 до 20 мМ супроводжувалося збільшенням кількості МК, що виявлялися in situ, як для коренів з ВІР, так і для коренів з НІР, в 2 рази порівняно з контролем.

При активному методі виділення МК від коренів спостерігався дещо інший характер зміни кількості МК в гелевому чохлі, ніж при морфологічному методі: кількість МК зростала більш ніж в 2 рази при концентрації NaF 1-10 мМ і в 4 рази при концентрації NaF 20 мМ як для коренів з ВІР, так і з НІР (табл. 4).



Таблиця 4

Кількість МК на 1 корінь, що виявлялися при препаративному видаленні гелевого чохлу у проростків з ВІР і НІР після доби росту в присутності NaF в різних концентраціях

Концентрація NaF, мМ	Кількість МК /1 корінь
	корені з НІР	корені з ВІР
0	63±28	83±16
1	172±32*	199±30*
5	108±32*	127±19*
10	123±27*	150±23*
20	292±80**	352±71**

Примітки: * - Р<0,05 порівняно з контролем; ** - Р<0,05 порівняно з 10 мМ фториду натрію

Таким чином, інтенсивність збільшення кількості МК в присутності фториду натрію у випадку коренів з ВІР і НІР не корелювала з інтенсивністю інгібування росту коренів. Це дозволяє припустити, що кількість МК в ризосфері не лімітується інтенсивністю метаболічних процесів в корені, а залежить від екзогенних факторів (токсиканти, температура тощо).

Якщо екскреторна активність кореня забезпечується переважно МК, то можна очікувати, що зі збільшенням концентрації фтористого натрію в середовищі, яке призводило до стрибкоподібного збільшення МК в ризосфері, повинно спостерігатися збільшення питомої екскреторної активності МК, принаймні, для білків.

Виявилося, що внесення NaF в концентрації 1, 5, 10 мМ супроводжувалося зменшенням питомої екскреторної активності МК коренів як з ВІР, так і з НІР, причому це зменшення порівняно з контролем було однаковим в обох варіантах. Внесення 20 мМ фтористого натрію в культуральне середовище супроводжувалося збільшенням питомої активності екскреції загального і високомолекулярного білка, але лише тільки для коренів з НІР. Питома екскреторна активність вуглеводів МК була нижчою порівняно з контролем в усьому досліджуваному діапазоні концентрацій фтористого натрію як для коренів з НІР, так і з ВІР.

Таким чином, посилення екскреторної активності коренів при внесенні в середовище культивування фтористого натрію зумовлене не збільшенням функціональної активності МК коренів, а ймовірно, пов'язане і з посиленням екскреторної активності інших типів клітин кореня.

Одержані нами результати можуть бути пояснені на основі гіпотези функціональної системи «корінь-мікрооточення».

Ця функціональна система формується впродовж першої доби росту кореня. До цієї системи входять різноманітні типи клітин кореня і компоненти мікрооточення кореня (межові клітини, білкові, вуглеводні, ліпідні компоненти тощо). Функціонування системи «корінь-мікрооточення» забезпечує регуляцію інтенсивності росту кореня, його захист від різних факторів зовнішнього середовища та «взаємодію» кореневої системи з трофічними факторами середовища. В особливостях формування мікрооточення кореня головну роль відіграють клітини кореня, адже мікрооточення є похідним від фізіологічного стану кореня (рис. 6).

Однак, після формування певного базового рівня в кількісному та якісному складі мікрооточення, воно здійснює вплив не тільки на регуляцію власного складу (авторегуляція), але, ймовірно, і на фізіологічні процеси в самому корені.

Властивості кореневих екзометаболітів. Дослідження поліфункціональності дії кореневих екзометаболітів становить практичний інтерес для розвитку кореневих технологій з метою одержання біологічно активних речовин різної дії. З метою пошуку сфери можливого використання одержаних в результаті ризосферних біотехнологій кореневих екзометаболітів оцінювали біологічну активність кореневих екзометаболітів проростків пшениці, що екскретуються на початкових етапах росту (1-3 доба росту проростків). Досліджували вплив кореневих екзометаболітів проростків пшениці на культури мікроводоростей Dunaliella viridis, Spіrulina platensis, Chlorella vulgaris. Виявилося, що кореневі екзометаболіти за концентрації в культурі від 1 до 15% виявляли інгібуючий вплив на ріст культури Dunaliella viridis. Крім того, виявилося, що в інтервалі досліджуваних концентрацій кореневі екзометаболіти проростків пшениці не впливали на накопичення біомаси мікроводоростей Spіrulina platensis і Chlorella vulgaris, тобто спостерігалася видова специфічність їхньої дії.

Виявлена щодо мікроводоростей токсична дія кореневих екзометаболітів пшениці дозволила припустити наявність у них антибактеріальних властивостей. Антибактеріальні властивості кореневих екзометаболітів 1-3-денних проростків оцінювали за допомогою методу паперових дисків, а в як тест-організми використовували Staphylococcus aureus і Streptococcus pyogenes.

Виявили, що водний розчин кореневих екзометаболітів виявляв виражені антибактеріальні властивості щодо досліджуваних тест-організмів (табл. 5). Найбільшу антибактеріальну дію виявляли екзометаболіти 1-денних проростків, на 2 і 3 добу росту вона знижувалась незначно щодо дослідних тест-організмів.

Таблиця 5

Зони затримки росту мікроорганізмів (мм) Staphylococcus aureus і Streptococcus pyogenes при оцінюванні антибактеріальних властивостей кореневих екзометаболітів 1-, 2- і 3-денних проростків пшениці методом паперових дисків

Тест-організм	Варіанти експери-менту	Зона затримки росту зразків (мм) при внесенні кореневих екзометаболітів
		1 доба росту	2 доба росту	3 доба росту
Staphylococcus aureus	контроль	суцільний ріст культури
	дослід	23±2	20±3	19±2
Streptococcus pyogenes	контроль	суцільний ріст культури
	дослід	35±2	30±4	28±2



Виявлені в дослідженні антибактеріальні властивості водних розчинів кореневих екзометаболітів стосовно Staphylococcus aureus і Streptococcus pyogenes порівнювані з властивостями антибіотиків, що використовуються в медичній практиці, зокрема, для лікування захворювань, викликаних даними патогенами.

Антиоксидантні властивості кореневих екзометаболітів проростків пшениці оцінювали, визначаючи загальну антиоксидантну активність та активність перехоплення гідроксильних радикалів в модельних системах. Загальна антиоксидантна активність виявлялася в складі кореневих екзометаболітів вже на першу добу росту, не змінювалася на другу та незначно збільшувалася на третю добу росту. Однак, ефективність інгібуючої ПОЛ дії кореневих екзометаболітів була нижчою, ніж ефективність природного антиоксиданту б-токоферолу. Здатність кореневих екзометаболітів проростків пшениці перехоплювати ОН-радикали збільшувалася з першої по третю добу росту та була порівняною з антирадикальною дією гасника ОН-радикалів етанолу.

Таким чином, створення ефективної кореневої технології з метою одержання кореневих екзометаболітів та подальшого їх використання як антиоксидантів та антибактеріальних речовин є досить перспективним, оскільки дозволяє без додаткових витрат одержувати впродовж всього періоду вегетації рослини продукти природного процесу екскреції, що мають ті ж самі властивості, що й синтетичні антиоксиданти.

ВИСНОВКИ

1. Мікрооточення коренів проростків пшениці формувалося впродовж перших 24 годин росту кореня. Основним компонентом кореневих екзометаболітів пшениці на першу добу росту були вуглеводи (62%). Також до складу мікрооточення кореня входили амінокислоти, низько- та високомолекулярні білки. Білок в складі кореневих екзометаболітів виявлявся після 12 годин росту, його вміст складав 1,32±0,04 мкг/корінь та залишався незмінним впродовж наступних 12 годин росту кореня. Крім того, в складі кореневих екзометаболітів виявлялася протеазна активність, яка забезпечувала деградацію білків в середовищі.

2. Екскреторна система кореня пшениці функціонує за принципом авторегуляції, тобто екскретовані в середовище екзометаболіти є регуляторами подальшого процесу екскреції. Показано, що при різних системах збору екзометаболітів (накопичувальній та проточній), а також при різній щільності пророщування (при різній швидкості накопичення екзометаболітів в середовищі) якісний та кількісний склад екзометаболітів 1-3 денних проростків пшениці розрізнявся: при проточній системі збору кількість екскретованих за 3 доби росту проростків екзометаболітів була на 25% більше, ніж при накопичувальній системі, а максимальна інтенсивність екскреції спостерігалася при щільності пророщування 1 проросток/см².

3. Встановлено зворотну кореляцію між інтенсивністю росту кореня та інтенсивністю екскреції екзометаболітів. Корені проростків пшениці з природною низькою інтенсивністю росту характеризувалися більш високою екскреторною активністю, ніж корені з високою природною інтенсивністю росту.

4. При проведенні пілотних експериментів з одержання кореневих екзометаболітів в гідропонній культурі проростків пшениці закономірності з кількості і співвідношення компонентів в кореневих екзометаболітах, виявлені в лабораторних експериментах, зберігалися і при збільшенні обсягів культивування: за 3 доби росту проростків при проточному режимі збору з 1 кг пшениці можна одержати кореневі екзометаболіти, що містять 1,052±0,012 г білка і 2,126±0,016 г глюкози.

5. Етиловий спирт в концентрації 1% викликав інгібування проростання насіння пшениці та інгібування росту коренів проростків, більш виражене для проростків з початковою високою інтенсивністю росту. Інгібування росту коренів супроводжувалося посиленням екскреції як вуглеводів, так і білків для проростків з низькою інтенсивністю росту, і посиленням екскреції тільки вуглеводів для проростків з високою інтенсивністю росту.

6. Внесення фтористого натрію в середовище культивування викликало дозозалежне інгібування росту коренів проростків з початковою низькою та високою інтенсивністю росту, яке супроводжувалося посиленням екскреції білка Екскреція вуглеводів залишалася на рівні контролю незалежно від концентрації фториду натрію в середовищі.

7. Відділення межових клітин з поверхні кореневого апексу починалося вже в перші 24 години росту кореня. Морфологічним методом виявлялося 30-40 межових клітин/корінь, а препаративним - 80-90 межових клітин/корінь. Кількість межових клітин не розрізнялася для коренів з початковою низькою та високою інтенсивністю росту.

8. Внесення фтористого натрію супроводжувалося збільшенням кількості межових клітин в апексі коренів. Кількість межових клітин, що виявлялися морфометричним методом, збільшувалася в 2 рази при внесенні фториду натрію в концентрації від 1 до 20 мМ. Кількість межових клітин, оцінювана препаративним методом, зростала в 2 рази в присутності від 1 до 10 мМ фториду натрію і в 4 рази при концентрації 20 мМ фториду натрію в середовищі порівняно з контролем. Характер зміни кількості межових клітин був однаковим як для коренів з низькою, так і для коренів з високою інтенсивністю росту.

9. В присутності фториду натрію змінювалися інтегральні характеристики апікального гелевого чохла коренів проростків: його в'язкість збільшувалася в 3 рази при концентрації NaF в середовищі від 1 до 5 мМ і в 5 разів при 10-20 мМ порівняно з контролем. Вміст фторид-іону в коренях проростків залишався однаковим (перевищуючи контрольне значення в 8 разів) при концентрації NaF в середовищі від 1 до 10 мМ та збільшувався в 40 разів порівняно з контролем при 20 мМ.

10. Кореневі екзометаболіти проростків проявляли альгіцидні властивості щодо мікроводорості Dunaliella viridis в присутності їх в середовищі культивування мікроводорості від 5 до 15% і не впливали на ріст Spіrulina platensis і Chlorella vulgaris. Кореневі екзометаболіти 1-3-денних проростків пшениці виявляли антибактеріальні властивості щодо патогенних мікроорганізмів Staphylococcus aureus і Streptococcus pyogenes, викликаючи затримку росту даних мікроорганізмів в культурі. Кореневі екзометаболіти проростків пшениці виявляли загальну антиоксидантну активність і антирадикальну активність.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кузнецова Ю.А. Влияние плотности культивирования проростков пшеницы на состав их корневых экзометаболитов / Ю.А. Кузнецова // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2004. - Т. 1, № 1. - С. 315-320.

2. Кузнецова Ю.А. Влияние этилового спирта на интенсивность роста и экскреторную активность корней проростков пшеницы (Triticum aestivum) / Ю.А. Кузнецова, В.И. Приходько // Биологический вестник. - 2006. - Т. 10, № 1. - С. 112-115. (Кузнецова Ю.О. виконала 70% роботи, одержала експериментальні дані з вмісту вуглеводів та білків, проаналізувала одержані дані, зробила статистичні розрахунки, підготувала статтю до друку)

3. Божков А.И. Взаимосвязь интенсивности роста корней проростков пшеницы (Triticum aestivum) с их экскреторной активностью и количеством пограничных клеток / А.И. Божков, Ю.А. Кузнецова, Н.Г. Мензянова // Физиология растений. - 2007. - Т. 54, № 1. - С. 97-103. (Кузнецова Ю.О. виконала 50% роботи, одержала експериментальні дані з довжини коренів, вмісту білків, кількості межових клітин, проаналізувала одержані дані, зробила статистичні розрахунки, підготувала статтю до друку).

4. Божков А.И. Интенсивность экскреции и состав выделений проростков пшеницы при накопительном и проточном сборе экзометаболитов / А.И. Божков, Ю.А. Кузнецова, Н.Г. Мензянова // Биологический вестник. - 2007. - Т. 11, № 2. - С. 14-19. (Кузнецова Ю.О. виконала 50% роботи, одержала експериментальні дані з складу екзометаболітів у разі проточного та накопичувального збору, проаналізувала одержані дані, зробила статистичні розрахунки, підготувала статтю до друку).

5. Кузнецова Ю.А. Влияние плотности культивирования проростков пшеницы на качественный и количественный состав корневых экзометаболитов / Ю.А. Кузнецова // 9-ая Междунар. Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология - наука ХХІ века», 18-22 апреля 2005 г. : тезисы докл. - Пущино, 2005. - С. 273.

6. Кузнецова Ю.А. Влияние корневых экзометаболитов проростков пшеницы на динамику роста культуры Dunaliella viridis / Ю.А. Кузнецова // III международная конференция “Актуальные проблемы современной альгологии”, 20-23 апреля, 2005 г. : тез. докл. - Харьков, 2005. - С. 79.

7. Кузнецова Ю.О. Вплив фтористого натрію на популяцію межових клітин кореневого апексу паростків пшениці в гідропонній культурі / Ю.О. Кузнецова // ІІ Міжнародна конференція студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології”, 21-24 березня 2006 р. : збірка тез. - Львів, 2006. - С. 284.

8. Кузнецова Ю.А. Влияние этилового спирта на активность корневой экскреции проростков пшеницы, развивающихся из семян разного срока хранения / Ю.А. Кузнецова, В.И. Приходько // VII международный симпозиум «Биологические механизмы старения», 24-27 мая 2006 г. : материалы. - Харьков, 2006. - С. 77. (Кузнецова Ю.О. виконала 70% роботи, одержала експериментальні дані з впливу етилового спирта на вміст вуглеводів та білків в екзометаболітах, підготувала тези до друку).

9. Божков А.И. Влияние фторида натрия на метаболизм растущего корня пшеницы / А.И. Божков, Ю.А. Кузнецова // ІХ Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовтня 2006 р. : збірка тез. - Харків, 2006. - С. 166-167. (Кузнецова Ю.О. виконала 50% роботи, одержала експериментальні дані з впливу фтористого натрію на ріст проростків, проаналізувала одержані дані)

10. Кузнецова Ю.А. Антибактериальная и антоксидантная активность корневых экзометаболитов пшеницы / Ю.А. Кузнецова, Ю.В. Никитченко // ІХ Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовтня 2006 р. : збірка тез. - Харків, 2006. - С. 199. (Кузнецова Ю.О. виконала 70% роботи, одержала експериментальні дані з антибактеріальної і антирадикальної активності екзометаболітів, підготувала тези до друку)

11. Кузнецова Ю.О. Взаємозв'язок екскреторної активності коренів паростків пшениці з кількістю межових клітин в апексі коренів / Ю.О. Кузнецова, Н.Г. Мензянова // 2-ий з'їзд Українського товариства клітинної біології, 23-26 жовтня 2007 р. : збірка тез. - Київ, 2007. - С. 249. (Кузнецова Ю.О. виконала 70% роботи, одержала експериментальні дані з кількості межових клітин в апексі коренів, зробила статистичні розрахунки, підготувала тези до друку)

АНОТАЦІЇ

Кузнецова Ю.О. Одержання, характеристика та біологічна активність кореневих екзометаболітів проростків пшениці. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню закономірностей процесу кореневої екскреції, складу кореневих екзометаболітів та їх властивостей на прикладі модельного об'єкту проростків пшениці Triticum aestivum в гідропонній культурі. Встановлено, що до складу кореневих екзометаболітів проростків пшениці входять вуглеводи, амінокислоти, білки. Мікрооточення кореня формується вже в перші 24 години росту коренів. Показано, що система екскреції кореня функціонує за принципом авторегуляції, тобто екскретовані в середовище екзометаболіти самі стають регуляторами подальшого процесу екскреції. Встановлений зворотній зв'язок між інтенсивністю росту коренів та їх екскреторною активністю. Показано, що відділення межових клітин з поверхні кореневого апексу починається вже в перші 24 години росту кореня. Після першої доби росту кількість клітин, що виявляються морфометричним методом, складає 30-40 клітин/корінь, а кількість клітин, що виявляються препаративним методом, - 80-90 клітин/корінь. Внесення фтористого натрію до середовища пророщення супроводжується посиленням екскреції білків та збільшенням кількості межових клітин в апексі коренів. Показана антибактеріальна та антиоксидантна дія кореневих екзометаболітів.

Ключові слова: Triticum aestivum, кореневі екзометаболіти, білки, вуглеводи, межові клітини, антиоксидантна активність, антибактеріальна активність.



Кузнецова Ю.А. Получение, характеристика и биологическая активность корневых экзометаболитов проростков пшеницы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2008.

Диссертация посвящена изучению закономерностей процесса корневой экскреции, состава корневых экзометаболитов и их свойств на примере модельного объекта проростков пшеницы Triticum aestivum в гидропонной культуре. Установлено, что основным компонентом корневых экзометаболитов проростков пшеницы являются углеводы. В состав экзометаболитов входят также аминокислоты, высоко и низкомолекулярные белки. Белок в составе корневых экзометаболитов появляется после первых 12 часов роста, его содержание составляет 1,32±0,04 мкг/корень и остается постоянным в течение следующих 12 часов роста корня. Показано, что экскреторная система корня функционирует по принципу авторегуляции, то есть экскретированные в среду экзометаболиты сами становятся регуляторами дальнейшего процесса экскреции. Обнаружено, что при различных системах сбора экзометаболитов (накопительном и проточном), а также при различной плотности проращивания качественный и количественный состав экзометаболитов 1-3-дневных проростков различается. Установлена обратная связь между интенсивностью роста корней проростков и интенсивностью процесса корневой экскреции. Внесение этилового спирта в концентрации 1% в среду культивирования проростков вызывает ингибирование прорастания зерен пшеницы и ингибирование роста корней проростков, более выраженное для проростков с высокой начальной интенсивностью роста. Ингибирование роста корней сопровождается усилением экскреции как углеводов, так и белков для проростков с низкой интенсивностью роста, и усилением экскреции только углеводов для проростков с высокой интенсивностью роста. Внесение фтористого натрия в среду культивирования проростков вызывает дозозависимое ингибирование роста корней проростков с начальной низкой интенсивностью роста, которое сопровождается усилением экскреции белка. Показано, что отделение пограничных клеток с поверхности корневого апекса начинается уже в первые 24 часа роста корня. Морфологическим методом выявляется 30-40 пограничных клеток/корень, а препаративным - 80-90 пограничных клеток/корень. Количество пограничных клеток не различается для корней с начальной низкой и высокой интенсивностью роста. Внесение фтористого натрия сопровождается увеличением количества пограничных клеток в апексе корней. В присутствии фторида натрия изменяются интегральные характеристики апикального гелевого чехла корней проростков: его вязкость возрастала в 3 раза при концентрации NaF в среде от 1 до 5 мМ и в 5 раз при 10-20 мМ. Содержание фторид-иона в корнях проростков оставалось постоянным (превышая контрольное значение в 8 раз) при концентрации NaF в среде от 1 до 10 мМ и возрастало в 5 раз при 20 мМ. Обнаружено, что корневые экзометаболиты проростков проявляют альгицидные свойства по отношению к микроводоросли Dunaliella viridis, а также проявляют антибактериальные свойства по отношению к патогенным микроорганизмам Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes, вызывая задержку роста данных микроорганизмов в культуре. Корневые экзометаболиты проростков пшеницы проявляли общую антиоксидантную активность и антирадикальную активность. Таким образом, создание эффективной корневой технологии с целью получения корневых экзометаболитов и дальнейшего их использования в качестве антиоксидантов и антибактериальных веществ представляется весьма перспективным, т.к. позволяет без дополнительных затрат получать в течение всего периода вегетации растения продукты естественного процесса экскреции, обладающие теми же свойствами, что синтетические антиоксиданты.

...