Регенерація рослин в культурі пиляків м'якої пшениці, шляхи її підвищення

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ І.І. МЕЧНИКОВА

УДК 633. 111: 57. 085.2(043.3)

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РЕГЕНЕРАЦІЯ РОСЛИН В КУЛЬТУРІ ПИЛЯКІВ М'ЯКОЇ ПШЕНИЦІ, ШЛЯХИ ЇЇ ПІДВИЩЕННЯ

Лобанова Катерина Іванівна

Одеса - 2009



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Південному біотехнологічному центрі в рослинництві Української академії аграрних наук

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Ігнатова Світлана Олександрівна Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН, завідувач лабораторії культури тканин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Дубровна Оксана Василівна Інститут фізіології рослин та генетики НАН, старший науковий співробітник відділу генетичних основ гетерозису;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Єгорова Наталія Олексіївна Інститут ефіроолійних та лікарських рослин УААН завідувач лабораторії біотехнології

Захист дисертації відбудеться „ 20 „ березня 2009 р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 41.051.06 Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65058, м. Одеса, пров. Шампанський, 2 (Біологічний факультет), ауд. 27.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: м. Одеса, вул. Преображенська, 24.

Автореферат розісланий „ 19 „ лютого 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, професор Т.О. Філіпова



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розробка біотехнологічних методів з метою використовування їх у теоретичних і прикладних дослідженнях у напрямку створення нового вихідного матеріалу і прискорення окремих етапів селекції головних хлібних злаків у теперішній час набуває особливого значення. Для м'якої пшениці привертають увагу гаплоїдні технології in vitrо, що забезпечують одержання лінійного матеріалу з різного типу гібридів перших поколінь. У зв'язку з цим дослідження, спрямовані на удосконалення окремих етапів гаплоїдії є актуальними. У світовій літературі широко представлені дані у галузі гаплоїдних технологій, що базуються на різних прийомах in vitrо (Knush, Virmani, 1982; Hu, 1987; Mujeev-Kazi, Riera-Lizarazu, 1995).

Для злакових культур, і зокрема м'якої пшениці, біотехнологія одержання гомозиготного матеріалу з мікроспор є найбільш розповсюдженою. Культура пиляків пшениці привертає увагу дослідників простотою виконання і дозволяє одержати протягом одного покоління генетично однорідний і стабільний селекційний матеріал, відкриває можливість отримання широкого спектру константних рекомбінантів із гібридів перших поколінь (Лукьянюк, 1985; Махновська и др., 1997). Такий шлях селекції, з використанням культури пиляків in vitrо, приводить до значного зменшення обсягу популяцій та скороченню площ посівних ділянок цього злаку. Гаплоїди представляють інтерес ще й тому, що на гаплоїдному рівні у рослин легше виявити рецесивні гени. В культурі пиляків і мікроспор серед регенерантів також можливе одержання анеуплоїдів, поліплоїдів, міксоплоїдів, що служать важливим матеріалом для різних генетичних досліджень (Тоцький, 2002; Тырнов, 2005).

Проте, у теперішній час, за потенційно високої ефективності цієї біотехнологічної системи андрогенезу in vitrо, у порівнянні з традиційними методами селекції, які використовуються для одержання лінійного матеріалу пшениці, результативність методу культури пиляків поки що недостатня. Висока генотипоспецифічність м'якої пшениці за чутливістю до андрогенезу in vitrо обумовлює низький вихід подвоєних гаплоїдів, особливо, у роботі з озимими формами. Виходячи з цього, вдосконалення окремих етапів цієї перспективної біотехнології, що ведуть до регенерації рослин, представляє науковий і практичний інтерес. При цьому, особливу значущість набуває виявлення чинників, що лімітують формування зелених регенерантів і пошук шляхів підвищення рівня регенерації зелених рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН у рамках НТП ”Сільськогосподарська біотехнологія 2006-2010 р.”, (номер державної реєстрації 0106U002674), що затверджена загальним наказом Міністерства аграрної політики України та Української академії аграрних наук від 28 лютого 2006 року № 19. Дослідження здійснювались за напрямком підпрограми «Розробити біотехнологію створення лінійного матеріалу із гібридів пшениці шляхом культури ізольованих мікроспор» (02.03).

Мета дослідження - виявити закономірності процесу регенерації рослин та рівень її проявлення в культурі пиляків генотипів м'якої пшениці під впливом різних чинників, розробити методичні заходи щодо підвищення її ефективності. регенерація пшениця генотип рослина

Для досягнення поставленої мети були поставлені наступні завдання:

Визначити діапазон варіювання рівня регенерації зелених рослин у наборі різних за походженням генотипів м'якої пшениці в культурі пиляків.

Вивчити основні закономірності проходження процесу регенерації: зв'язок між кількістю новоутворень та регенерацією рослин, оцінити вплив типу новоутворень і швидкості їх формування на регенерацію.

Визначити рівень регенерації зелених рослин в культурі пиляків генотипів озимої м'якої пшениці, що відрізняються за показником «тривалість періоду сходи - колосіння».

Виявити особливості реалізації регенераційного потенціалу в культурі пиляків залежно від кліматичних умов вирощування та строку посіву донорного матеріалу в польових умовах.

Дослідити вплив різних варіантів попередньої обробки донорного матеріалу на ефективність регенерації рослин в культурі пиляків м'якої пшениці.

Визначити вплив складу живильних середовищ та умов культивування новоутворень на регенерацію рослин в культурі пиляків м'якої пшениці.

Виділити основні фактори, що підвищують регенерацію рослин у різних за чутливістю до андрогенезу генотипів м'якої пшениці та запропонувати шляхи вдосконалення етапу регенерації в культурі пиляків.

Об'єкт дослідження: морфогенез мікроспор та шляхи регенерації рослин в культурі пиляків м'якої пшениці в умовах in vitro.

Предмет дослідження: регенерація рослин та її ефективність в культурі пиляків in vitro генотипів м'якої пшениці під впливом різних чинників.

Методи дослідження: метод культивування ізольованих пиляків пшениці, світлова мікроскопія, цитологічні та гістологічні методи дослідження, мікрофотографія, методи статистичної обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень вперше в Україні на озимій м'якій пшениці виявлено закономірності процесу регенерації рослин та показано залежність ефективності регенерації від різних чинників в культурі пиляків. Встановлено, що регенерацію зелених рослин у чутливих до андрогенезу генотипів можна підвищити на етапі попередньої обробки зрізаних пагонів донорного матеріалу у розчині абсцизової кислоти на фоні низьких позитивних температур. На основі цього розроблено і запатентовано спосіб підвищення регенераційного потенціалу в культурі пиляків озимої м'якої пшениці. Також підвищення результативності гаплопродукційного процесу можливо на етапі регенерації шляхом модифікації фітогормонального складу живильного середовища. Вперше встановлено, що для ефективної гаплопродукції озимої м'якої пшениці необхідним є використання донорного матеріалу із нетривалим періодом «сходи - вакуолізована мікроспора». На основі цього запатентовано спосіб прогнозування рівня регенерації рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці. Вперше визначено вплив кліматичних умов вирощування та строку посіву донорних рослин у польових умовах на регенерацію зелених рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці.

Практичне значення одержаних результатів. Проведено методичні розробки та запропоновано умови ефективної регенерації зелених рослин в культурі пиляків м'якої пшениці в умовах in vitro. Отримано патент на корисну модель „Спосіб підвищення регенераційного потенціалу в культурі пиляків озимої м'якої пшениці”. Запропоновано використовувати показник „тривалість періоду сходи - вакуолізована мікроспора” для прогнозування ступеня чутливості до гаплопродукції генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків. Отримано патенти на корисну модель „Спосіб прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці на основі цитологічного моніторингу першого етапу культури пиляків in vitro” і „Спосіб прогнозування рівня регенерації рослин у культурі пиляків пшениці”. В результаті дослідницької роботи одержано 153 лінії подвоєних гаплоїдів із гібридів м'якої пшениці, які передано в лабораторію селекції інтенсивних сортів пшениці та у відділ генетики Селекційно-генетичного інституту - національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН (СГІ - НЦНС) для подальших досліджень.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем проведено аналіз літературних даних за темою дисертаційної роботи, польові та лабораторні експерименти, статистичну обробку одержаних даних. Разом з керівником д.б.н. С. О. Ігнатовою сформульовано мету, завдання досліджень і проведено планування експериментів, аналіз, інтерпретацію одержаних результатів, підготовлено публікації до друку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2006), ІІ Міжнародній школі молодих вчених “Эмбриология, Генетика, Биотехнология” (Уфа, 2007), II з'їзді Українського Товариства клітинної біології (Київ, 2007), III Міжнародній конференції “Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution”, (Odessa 2007), VIII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова “Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології” (Алушта, 2007), IX Міжнародній конференції “Биология клеток растений in vitro и биотехнология” (Звенигород, 2008), IV Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів”, (Алушта, 2008), V Міжнародній конференції “Геном рослин”, (Одеса, 2008).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 13 наукових праць, що відображають основний зміст дисертації: чотири статті, дві з них - у виданнях, затверджених ВАК України в якості спеціалізованих для галузі біологічних наук, три патенти, 6 публікацій - у вигляді тез та матеріалів конференцій.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 151 сторінці комп'ютерного тексту. Складається зі вступу, трьох розділів (огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, одного розділу власних досліджень, аналізу результатів), висновків, практичних рекомендацій, додатків, списку використаних джерел, що включає 221 найменування, у тому числі 122 - на іноземних мовах. Дисертація містить 19 таблиць, 33 рисунка.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РЕАЛІЗАЦІЯ МОРФОГЕНЕТИЧНОГО ПОТЕНЦІАЛУ МІКРОСПОР

В КУЛЬТУРІ ПИЛЯКІВ М'ЯКОЇ ПШЕНИЦІ В УМОВАХ IN VITRO

В огляді літературних джерел надано відомості про явище андрогенезу in vitro, представлено сучасний стан біотехнологічних досліджень у напрямку гаплоїдії пшениці. Показана важливість використання культури пиляків у різних галузях теоретичних досліджень і на практиці. Проаналізовано ефективність основних етапів процесу гаплопродукції м'якої пшениці та вплив різних чинників на результативність даної біотехнології, наголошено на необхідності подальших детальних досліджень таких чинників та їх зв'язку з ефективністю проходження процесу регенерації рослин, як визначального показника результативності культури пиляків. На основі критичного аналізу літературних джерел обґрунтовано вибір теми дисертаційної роботи та основні напрями досліджень.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У якості донорного матеріалу для культури пиляків використовували:

сорти озимої м'якої пшениці - Capelle, Mara, Ciano, Mercia, Фантазія одеська, Чайка, Альбатрос одеський, Брігантіна, Одеська 51, Одеська 3, Одеська червоноколоса, Безоста 1, Avalon, Скороспілка, Одеська напівкарликова, Степняк, Ніконія, Кооператорка, Миронівська 808; лінія озимої м'якої пшениці, отримана з подвоєних гаплоїдів Лютесценс 155;

канадські сорти ярої м'якої пшениці - Superb, Elsa, Domаin.

Гібридні форми озимої м'якої пшениці: Чайка Ч T. tauschii,

Миронівська 808 Ч T. tauschii, [Alsen Ч 2(74-91)] Ч Альбатрос одеський, № 612, № 613, № 615, № 736, № 778, № 720;

віддалені гібриди: Вікторія одеська Ч Agropyron,

Одеська напівкарликова Ч Agropyron, Миронівська 808 Ч Agropyron, люб'язно надані відділом генетики СГІ - НЦНС.

Гібриди озимого типу розвитку, що відрізняються за тривалістю періоду «сходи - колосіння»: [Зірка Ч Зразкова] Ч Леля, [Зірка Ч Зразкова] Ч Ніконія,

[Зірка Ч Зразкова] Ч Куяльник, [Зірка Ч Зразкова] Ч Кірія, Багіра Ч Леля,

Багіра Ч Бунчук, [Повага Ч Подяка] Ч Ніконія, [Багряна Ч Ніконія] Ч Ніконія, [Зірка Ч Лан 25] Ч Кірія, [Зірка Ч Савана] Ч Багряна, Зірка Ч Вдала,

[Зірка Ч Дріада 1] Ч Багряна, [Зірка Ч Лан 25] Ч Ніконія, Зірка Ч Ліона,

озимо-ярі гібриди: Кобира Ч № 76 (ярий), Кобира Ч № 47 (ярий),

Кобира Ч № 38 (ярий) , Кобира Ч № 41 (ярий); люб'язно надані лабораторією селекції інтенсивних сортів пшениці СГІ - НЦНС.

Моносомні лінії по 5А, 5В, 5D хромосомах сортів Безоста 1 і Миронівська 808, люб'язно надані К. Панковою (Research Institute of Crop Production, Czech Republic).

Донорні рослини вирощували у камері штучного клімату та польових умовах. Умови вирощування рослин у камері штучного клімату: нічна температура 16 °С, денна 20 - 22 °С; інтенсивність освітлення - 10 тис. люкс; 16-ти годинний фотоперіод. У польових умовах рослини вирощували протягом літніх сезонів 2005-2008 рр. Метеорологічні дані за роками вирощування надані агрометеостанцією СГІ - НЦНС. З метою визначення оптимального строку посіву озимої м'якої пшениці насіння сіяли у два строки - оптимальний 4 жовтня 2007 року та пізній 14 листопада 2007 року, як це прийнято за проведенням польових робіт з озимою м'якою пшеницею у СГІ - НЦНС.

В якості стандартної методики культивування пиляків пшениці використовували наступну схему. Відбір донорних рослин пшениці для наступного введення в культуру in vitro проводили, коли більша частина мікроспор у пиляках знаходилась на фазі вакуолізації. Фазу розвитку мікроспор у пиляках визначали цитологічним методом на тимчасових мікропрепаратах, забарвлених оцтокарміном (Паушева, 1988) під мікроскопом Opton. Попередню холодову обробку зрізаних пагонів з колоссям проводили (в контрольному варіанті) у воді за температури 2 - 4 °С у темряві протягом 3 діб. Колосся поверхнево стерилізували насиченим розчином гіпохлориту кальцію за прийнятою методикою (Лукьянюк, Ігнатова, 1980). Ізольовані пиляки висаджували на індукційне живильне середовище 190-2 (Wang, Hu, 1984) у модифікації - з додаванням 1,5 мг/л 2,4-Д, 90 г/л сахарози, 400 мг/л проліну, 400 мг/л глутаміну, 0,5 мг/л кінетіну (Жосонар, 2005). Висаджені пиляки культивували перші 3 доби у темряві за температури 30 °С, далі - 24 °С до появи новоутворень. Сформовані макроструктури для проходження темнової фази культивування переносили на живильне середовище MS у модифікації (Жосонар, 2005): 30 г/л сахарози, 0,5 мг/л кінетіну, 200 мг/л проліну, 200 мг/л глутаміну. Новоутворення культивували у темряві 3 - 4 тижня до появи на їх поверхні центрів регенерації, і далі такі макроструктури культивували за умов 16-годинного фотоперіоду, інтенсивності освітлення - 10 тис. люкс, температурі 24 °С до формування рослин. Зелені рослини пересаджували на безгормональне живильне середовище MS та яровизували (за температури 2 - 4 °С, 16-ти годинному фотоперіоді, інтенсивності освітлення 3 - 3,5 тис. люкс).

Тестування перших етапів морфогенезу мікроспор у пиляках проводили за методикою, описаною у наступних роботах: Ігнатова С.А. і ін., 2001; Шестопал О.Л., Ігнатова С.О., 2006. Кількість морфогенних мікроспор підраховували на 5, 10, 15 та 20 добу культивування. Морфогенними вважали мікроспори, що зберігали життєздатність (на 5 добу культивування) та інтенсивно забарвлювались 4 % розчином оцтокарміну, на 10 - 20 добу культивування формували багатоядерні та багатоклітинні структури. Морфогенними вважали пиляки, на поверхні яких було сформовано новоутворення. Фіксацію та приготування постійних препаратів сформованих новоутворень проводили за загальноприйнятою методикою (Паушева, 1988), зрізи новоутворень одержано на ротаційному мікротомі Historange microtome - 2218, фірми LKB (Швеція).

В експерименті з дослідження впливу швидкості формування ново-утворень на ефективність регенерації рослин сформовані на поверхні пиляків ембріоїди, діаметром 0,5 мм3, було розділено на три групи. До I групи віднесено ембріоїди, що сформувались за 35 діб культивування (від дати висадження пиляків на індукційне живильне середовище), до II групи - новоутворення сформовані за 40 діб культивування, і до III групи - за 45 діб культивування. Через 5, 10, 15 діб культивування вимірювали діаметр та розраховували об'єм ембріоїдів за формулою кулі.

Відсоток морфогенних пиляків, новоутворень і регенерації рослин для кожного генотипу розраховували від кількості висаджених пиляків.

Статистичну обробку отриманих даних проводили за методами статистичних досліджень і дисперсійного аналізу (Доспехов, 1965; Рокицкий, 1973; Атраментова, 2007).

ЕФЕКТИВНІСТЬ РЕГЕНЕРАЦІЇ РОСЛИН В КУЛЬТУРІ ПИЛЯКІВ

У РІЗНИХ ГЕНОТИПІВ М'ЯКОЇ ПШЕНИЦІ, РОЗРОБКА

СПОСОБІВ ЇЇ ПІДВИЩЕННЯ

Найбільш важливим чинником, що обмежує застосування сучасних біотехнологій, заснованих на культивуванні генеративних органів in vitro, у селекційно-генетичних роботах є низькій рівень регенерації рослин. Практична значимість використання культури пиляків in vitro для м'якої пшениці визначається можливістю швидкого отримання фертильних гомозиготних рослин із сортових та гібридних популяцій у достатній кількості. Проте низька ефективність даного методу на теперішній час потребує проведення досліджень у напрямі вдосконалення окремих етапів гаплопродукційного процесу в культурі пиляків м'якої пшениці.

Рівень реалізації регенераційного потенціалу мікроспор в культурі пиляків різних генотипів м'якої пшениці. В результаті проведених досліджень показано, що рівень регенерації варіює залежно від генотипу донорного матеріалу і виражається у різному виході рослин-регенерантів з новоутворень в процесі культивування пиляків пшениці. Так, у досліджених 50 генотипів озимої м'якої пшениці показник відсотка регенерації зелених рослин різко відрізнявся і становив у сортів від 0 до 15,8 %, у гібридів від 0 до 76,2 %. Найбільш високий рівень регенерації було зафіксовано в культурі ізольованих пиляків озимо-ярих гібридів - максимальними показниками гаплопродукції відрізнявся гібрид Кобира Ч № 76 (ярий), рівень регенерації в якого складав 76,2 %. Серед сортів високими показниками характеризувались Capelle, Mara, Ciano. Всі досліджені генотипи були розподілені на 4 групи в залежності від ступеня їх чутливості до андрогенезу in vitro: I - нечутливі генотипи, у яких регенерації зелених рослин не було, II - низькочутливі, у яких відсоток регенерації зелених рослин був у межах від 0 до 1 (у сортів) та від 0 до 1,5 (у гібридів), III - середньочутливі, з регенерацією від 1 до 4 % (у сортів) і від 1,5 до 5 % (у гібридів), IV - високочутливі, відсоток регенерації зелених рослин яких, складав більше 5 % (рис. 1, 2).

Рис. 1. Регенерація зелених рослин у сортів озимої м'якої пшениці:

- I і II група генотипів, - III група генотипів, - IV група генотипів

Рис. 2. Регенерація зелених рослин у гібридів озимої м'якої пшениці:

- I і II група генотипів, - III група генотипів, - IV група генотипів

За літературними даними відомо, що у м'якої пшениці проходження процесу андрогенезу in vitro знаходиться під контролем мультигенної системи, встановлено роль окремих хромосом у даному процесі (Szacaks, 1988; Henry, 1993; Torp, 1998, 2001). Так, індукція морфогенезу, за результатами різних авторів, контролюється генами, розташованими на 5А (Henry, 1993) , 7А і 1В хромосомах (Szacaks, 1988), а регенерація рослин - на 2А, 2В, 3А, 5В (Torp, 1998, 2001), 2D хромосомах (Szacaks, 1988; Жосонар, 2005; Sarrafi, 2006). Таким чином, ефективність гаплопродукції в культурі пиляків пшениці визначається генотипом донорних рослин, що сьогодні вже не викликає сумнівів, але залишається дискусійним питання щодо ролі окремих хромосом, генів або генетичних систем у регенерації рослин. Тому важливим питанням було визначення генетичного контролю етапів гаплопродукції в культурі пиляків озимої м'якої пшениці. За результатами проведених нами досліджень гаплопродукційної здатності сортів Безоста 1 і Миронівська 808 та моносомних ліній отриманих на їх основі (Research Institute of Crop Production, Czech Republic), встановлено, що відсутність 5В і 5D хромосом у чутливого до андрогенезу сорту Безоста 1 негативно впливає на ембріоїдогенез у культурі пиляків. Сорт Миронівська 808 та моносомні лінії, отримані на його основі характеризувались низькими показниками гаплопродукції, частота формування новоутворень та регенерації рослин у яких, наближувались до нуля. Відзначено сильний вплив генофону нечутливого сорту Миронівська 808 на всі етапи культури пиляків у моносомних ліній.

Морфогенез мікроспор в культурі пиляків м'якої пшениці, шляхи реалізації регенераційного потенціалу у різних за чутливістю до андрогенезу in vitro генотипів. З метою вивчення морфогенезу мікроспор в процесі їх розвитку за спорофітною програмою у контрастних за чутливістю до андрогенезу генотипів пшениці проведено аналіз тестування індукційної фази гаплопродукційного процесу в культурі пиляків. Показано, що за кількістю морфогенних мікроспор, які інтенсивно ділились на перших етапах морфогенезу високочутливі та нечутливі генотипи озимої м'якої пшениці суттєво відрізнялись. За цим показником можливо одержати орієнтовний висновок щодо прогнозованого рівня подальшої регенерації у досліджених генотипів.

Вивчено етап індукції новоутворень у 20 сортів та 30 гібридних форм озимої м'якої пшениці з різною чутливістю до андрогенезу у культурі пиляків. Встановлено позитивний кореляційний зв'язок між індукцією новоутворень та регенерацією з них зелених рослин - для сортів озимої м'якої пшениці він складав 0,77 і для гібридів 0,98. Виявлено наявність генотипів з високим рівнем індукції новоутворень і низькими показниками регенерації зелених рослин, що обумовлено низькою регенераційною здатністю сформованих по типу неморфогенного калусу новоутворень та високою часткою ризогенезу. Новоутворення, сформовані на поверхні пиляків в умовах in vitro, були представлені 3 типами: I - ембріоїди, II - ембріонально-клітинні комплекси, III - калуси (морфогенні та неморфогенні). Показано прямий зв'язок між типом сформованих новоутворень (ЕКК - ембріонально-клітинні комплекси) і регенерацією рослин (r= 0,68), та швидкістю їх формування і регенерацією рослин у досліджених генотипів озимої м'якої пшениці.

Регенерація в культурі пиляків озимої м'якої пшениці у генотипів з різною тривалістю періоду «сходи - колосіння». У дослідженнях з визначення рівня регенерації зелених рослин in vitro у генотипів озимої м'якої пшениці, контрастних за ознакою «тривалість періоду сходи - колосіння» (С-К), як додатковий критерій, було використано показник тривалості періоду «сходи - вакуолізована мікроспора»(С-ВМК). З огляду на той факт, що на фазі ВМК відбувається введення пиляків у культуру in vitro і подальший розвиток мікроспор за спорофітним шляхом розвитку, використання даного показника для оцінки гаплопродукційної здатності різних генотипів пшениці, на нашу думку, є більш коректним. Таким чином, було запропоновано використовувати показник тривалості періоду «сходи - вакуолізована мікроспора» у якості критерію для добору з різних популяцій найбільш чутливих до андрогенезу генотипів м'якої пшениці. Встановлено негативний кореляційний зв'язок між регенерацією зелених рослин і тривалістю періоду «сходи - вакуолізована мікроспора», що становив для досліджених сортів - 0,7, для гібридів - 0,6 (табл. 1). Цей факт дає підставу вважати, що тривалість періоду «сходи - вакуолізована мікроспора» є важливим показником для оцінки ефективності регенерації у культурі пиляків м'якої пшениці.

Таблиця 1 - Регенерація рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці у генотипів, що відрізняються тривалістю періоду «сходи - колосіння» та «сходи - вакуолізована мікроспора»

Генотип	Тривалість періоду, діб	Кількість	Регенерація рослин, % від кількості висаджених пиляків
	С-ВМК	С- К	пиляків, шт.	ново-утворень, %	зелених	загальна
Гібриди
[Зірка Ч Зразкова] Ч Леля	209	211	578	10,6 ± 1,3	7,1 ± 1,1	7,8 ± 1,1
[Зірка Ч Зразкова] Ч Ніконія	210	213	607	8,7 ± 1,2	4,6 ± 0,9	4,8 ± 0,8
[Зірка Ч Зразкова] Ч Куяльник	213	215	526	1,9 ± 1,0 *	0	0
[Зірка Ч Зразкова] Ч Кірія	213	216	436	0	0	0
Багіра Ч Леля	204	207	181	7,7 ± 2,0	3,3 ± 1,3	4,4 ± 1,5
Багіра Ч Бунчук	214	216	435	0	0	0
Сорти
Лютесценс 155	177	182	346	10,12 ± 1,62	2,89 ± 0,9	3,47 ± 0,98
Фантазія одеська	180	186	488	6,56 ± 1,12	2,05 ± 0,64	2,25 ± 0,67
Одеська червоноколоса	181	187	397	5,04 ± 1,21*	0,50 ± 0,35*	1,01 ± 0,5
Чайка	186	192	350	4,86 ± 1,15*	0,29 ± 0,29*	0,57 ± 0,4*
Mercia	188	193	505	0,79 ± 0,39*	0	0

Примітка: * - різниця достовірна за Р ? 0,05

С - К - тривалість періоду від сходів до колосіння

С - ВМК - тривалість періоду від сходів до фази вакуолізованих мікроспор

Запропоновано використовувати показник тривалості періоду „сходи - вакуолізована мікроспора” в якості допоміжного критерію добору найбільш чутливих до андрогенезу в культурі пиляків генотипів озимої м'якої пшениці.

Вплив умов вирощування та строку посіву донорного матеріалу на реалізацію регенераційного потенціалу в культурі пиляків озимої м'якої пшениці. Сприятливі кліматичні умови вирощування рослин in vivo забезпечують оптимальний фізіологічний стан донорних рослин, що в свою чергу визначає результативність методу культури пиляків пшениці в умовах in vitro. Відсоток новоутворень, сформованих за культивування пиляків в культурі in vitro у досліджених генотипів, варіював у різні роки вирощування. Проте, рівень регенерації у досліджених генотипів виявився стабільним за різних років вирощування. Виявлено достовірний негативний вплив пізнього строку посіву насіння озимої м'якої пшениці на індукцію новоутворень і регенерацію рослин у культурі пиляків. Цей факт дає можливість зазначити, що для досягнення високого виходу рослин-регенерантів у культурі пиляків озимої м'якої пшениці є необхідним дотримання оптимальних строків посіву донорного матеріалу в польових умовах, які прийняті у даному конкретному регіоні вирощування.

Попередня обробка донорного матеріалу м'якої пшениці як спосіб підвищення регенерації рослин в культурі пиляків. Попередня холодова обробка донорного матеріалу. На досліджених сортах м'якої пшениці підтверджено необхідність використання попередніх холодових обробок зрізаних пагонів з колоссям на стадії вакуолізованих мікроспор в пиляках донорних рослин озимої м'якої пшениці для ефективного проходження всіх етапів процесу гаплопродукції.

Регенерація рослин за використання попередньої обробки зрізаних пагонів пшениці розчином АБК на фоні низької температури. Особливий інтерес у цьому напрямку досліджень представляє абсцизова кислота, оскільки встановлено, що вона є одним з фітогормонів-регуляторів, що беруть участь у процесах морфогенезу ячменя і пшениці в культурі in vitro (Анапіяєв, 1997; Bishimbayeva, 2000; Wang, 2000; Шаяхметов, 2001; Зайнутдінова, 2003; Катасонова, 2006). За отриманими даними виявлено, що регенерацію зелених рослин у чутливих до андрогенезу генотипів пшениці можна підвищити на етапі попередньої обробки зрізаних пагонів донорного матеріалу у розчині абсцизової кислоти на фоні низьких позитивних температур (2-4 °С, у темряві на протязі 3 діб). Так, для генотипів озимої пшениці, вирощеної у камері штучного клімату, підвищення регенерації досягається попередньою обробкою 0,1 мг/л АБК, для ярих генотипів - 0,5 мг/л, і для озимої пшениці, вирощеної в польових умовах - 0,5 мг/л (рис. 3, 4).

Рис. 3. Частота новоутворень за попередньої обробки пагонів донорних рослин АБК в культурі пиляків м'якої пшениці, вирощеної у камері штучного клімату

Рис. 4. Регенерація рослин за попередньої обробки пагонів донорних рослин АБК в культурі пиляків м'якої пшениці, вирощеної в камері штучного клімату

У більшості генотипів озимої м'якої пшениці у запропонованих нами умовах попередньої обробки показник регенерації рослин збільшився за рахунок підвищення індукції новоутворень (табл. 2). Найбільш чутливими до дії АБК були пиляки, мікроспори в яких, знаходились на ранній вакуолізованій фазі розвитку.

Таблиця 2 - Ефективність гаплопродукції при попередній обробці АБК зрізаних пагонів озимої м'якої пшениці (польові умови 2006 р.)

Генотип	Концентрація АБК, мг/л	Кількість пиляків, шт.	Кількість новоутворень, %	Частота регенерації рослин, % від кількості висаджених пиляків
				зелених	загальна
Чайка Ч T. tauschii	контроль	481	8,3 ± 1,3	4,2 ± 0,9	5,6 ± 1,1
	0,1	399	27,8 ± 1,8	5,0 ± 1,1	8,8 ± 1,4
	0,5	713	27,9 ± 1,6**	6,3 ± 0,9	8,8 ± 1,1*
Фантазія одеська	контроль	488	6,6 ± 1,1	2,1 ± 0,6	2,3 ± 0,7
	0,1	462	7,8 ± 1,3	1,3 ± 0,5	2,4 ± 0,7
	0,5	153	15,0 ± 2,9**	4,6 ± 1,7	6,5 ± 1,9**
Одеська червоноколоса	контроль	397	5,0 ± 1,2	0,5 ± 0,4	1,0 ± 0,5
	0,1	407	8,6 ± 1,4	1,7 ± 0,6	2,7 ± 0,8
	0,5	434	3,0 ± 0,8	0,7 ± 0,4	1,2 ± 0,5
Ніконія	контроль	92	1,1 ± 1,1	0	0
	0,1	102	4,1 ± 1,5	0	0
	0,5	172	13,7 ± 3,4**	0	0
Лютесценс 155	контроль	346	10,1 ± 1,6*	2,9 ± 0,9	3,5 ± 0,9
	0,1	427	8,7 ± 1,4	0,7 ± 0,4	1,4 ± 0,6
	0,5	500	6,4 ± 1,1	1,8 ± 0,6	2,6 ± 0,7

Примітка: достовірно за: * Р<0,05; ** Р<0,01

Аналіз отриманих даних за 2006 - 2008 роки дозволив розділити досліджені генотипи на дві групи за реакцією на попередню обробку АБК: I група генотипів з позитивною реакцією (гібридні форми Чайка Ч T. tauschii, (Alsen Ч 2(74-91)) Ч Альбатрос одеський, сорти Фантазія одеська, Одеська червоноколоса, Ніконія, Mercia) і II група генотипів з нейтральною або негативною реакцією на попередню обробку АБК (Лютесценс 155, Чайка). Таким чином, вплив АБК на етапі попередньої обробки є генотипоспе-цифічним. Реакція генотипів на екзогенну АБК, можливо, обумовлена різним рівнем ендогенного змісту даного фітогормону в донорному матеріалі. У нечутливих генотипів індукувати морфогенез в умовах in vitro використаними попередніми обробками не вдалось.

Оптимізація умов культивування новоутворень і живильних середовищ з метою підвищення ефективності регенерації рослин озимої м'якої пшениці в культурі пиляків. Відомо, що новоутворення, отримані за культивування пиляків пшениці в умовах in vitro, характеризуються різною регенераційною здатністю і не від кожного можна отримати зелені рослини-регенеранти. Так, за літературними і нашими дослідженнями показано, що при вивчені великої групи сортів та гібридних форм озимої м'якої пшениці виділяються генотипи з високим рівнем індукції новоутворень і низькою регенерацією рослин (Redha, 2000), що пов'язано із низькою регенераційною здатністю сформованих новоутворень у запропонованих умовах культивування. Тому актуальним напрямком досліджень був пошук оптимальних умов культивування in vitro сформованих новоутворень для реалізації їх максимального регенераційного потенціалу. В результаті чого виявлено позитивний вплив додавання у живильне середовище для регенерації абсцизової кислоти (0,25 мг/л) на вихід зелених рослин з ембріоїдів. Додання у живильне середовище MS для регенерації гіберелової кислоти (0,5 мг/л), яблучної кислоти (25 мг/л) і розчинного крохмалю (1 мг/л), при температурі культивування 9 - 12 °С, та 16-ти годинному фотоперіоді збільшувало вихід зелених рослин-регенерантів із морфогенних калусів, які культивувались впродовж 2-3 пасажів (рис. 5).



Рис. 5. Морфогенез новоутворень на модифікованих живильних середовищах MS та за різних умов культивування:

1 - середовище MS безгормональне, 25 °С, світло,2 - середовище MS + ГК 0,5 мг/л, яблочна кислота 25 мг/л, розчинний крохмаль 1 мг/л, 9-12 °С, світло, 3 - середовище MS + ГК 0,5 мг/л, яблочна кислота 25 мг/л, розчинний крохмаль 1 мг/л, 9-12 °С, темрява * - достовірно за Р < 0,05

Проаналізувавши отримані результати можна запропонувати вдосконалення окремих етапів біотехнології одержання рослин-регенерантів в культурі пиляків м'якої пшениці у вигляді наступної схеми (рис. 6).



Рис. 6. Схема вдосконалення етапів біотехнології одержання рослин-регенерантів в культурі пиляків м'якої пшениці



ВИСНОВКИ

В результаті проведених досліджень виявлено закономірності процесу регенерації рослин в культурі пиляків м'якої пшениці, які полягають у визначальній ролі генотипу рослин донорів, попередніх обробок, кількості та структури новоутворень, складу живильних середовищ та концентрації в них фітогормонів, температурних та світлових умов проходження процесу регенерації. На основі виявлених закономірностей процесів індукції новоутворень та їх регенерації запропоновано умови попередніх обробок донорних рослин пшениці, модифіковано живильні середовища та умови культивування новоутворень, що дозволило удосконалити технологію одержання подвоєних гаплоїдів.

Виявлено високу генотипоспецифічність серед 50 зразків м'якої пшениці за показником рівня регенерації рослин, який коливався в межах у сортів 0 - 15,8 %, у гібридів 0 - 76,2 %. За рівнем регенерації зелених рослин у культурі пиляків досліджені генотипи представлено 4 групами. Відсутність 5В і 5D хромосом у генотипів моносомних ліній сорту Безоста 1 негативно впливає на ембріоїдогенез у культурі пиляків.

Новоутворення, отримані в результаті спорофітних поділів мікроспор, представлено ембріоїдами, ембріонально-клітинними комплексами, калусами (морфогенними та неморфогенними). Встановлено високу позитивну кореляцію між регенерацією зелених рослин та індукцією новоутворень (для сортів озимої м'якої пшениці r = 0,77, для гібридів r = 0,9), а також між типом сформованих новоутворень (ЕКК r = 0,68) і регенерацією, та швидкістю їх формування і регенерацією рослин.

Встановлено негативний кореляційний зв'язок між регенерацією зелених рослин в культурі пиляків in vitro та тривалістю періоду «сходи -вакуолізована мікроспора» для сортів (r = - 0,7) і для гібридів (r = - 0,6) озимої м'якої пшениці. Показник «тривалість періоду сходи - вакуолізована мікроспора» запропоновано використовувати для попереднього прогнозування рівня регенерації генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків.

У генотипів озимої м'якої пшениці за різних років вирощування виявлено стабільність за показником рівня регенерації в культурі пиляків, за наявності варіювання відсотка новоутворень у досліджених генотипів у різні роки вирощування. Для досягнення високого виходу рослин-регенерантів в культурі пиляків озимої м'якої пшениці необхідне дотримання оптимальних строків посіву донорного матеріалу в польових умовах, які прийняті у регіоні вирощування.

Виявлено позитивний вплив попередньої обробки зрізаних пагонів донорних рослин м'якої пшениці у водному розчині АБК у темряві, 2-4 °С, 3 доби на ефективність етапів гаплопродукції. Для генотипів озимої пшениці, вирощеної в камері штучного клімату, підвищення регенерації досягнуто попередньою обробкою зрізаних пагонів 0,1 мг/л АБК, для ярих генотипів - 0,5 мг/л, і для озимої пшениці, вирощеної в польових умовах - 0,5 мг/л.

Рівень регенерації зелених рослин у чутливих до андрогенезу in vitro генотипів озимої м'якої пшениці за використання попередньої обробки АБК (0,5 мг/л) підвищується від 1,5 до 2 разів, залежно від генотипу, внаслідок збільшення кількості морфогенних новоутворень. У нечутливих генотипів використання попередніх обробок виявилось неефективним.

Формування зелених рослин з ембріоїдів достовірно збільшувалося від 3 до 5 разів за додання у живильне середовище MS для регенерації 0,25 мг/л АБК. За культивування морфогенних калусів на живильному середовищі MS, доповненому гібереловою кислотою (0,5 мг/л), яблучною кислотою (25 мг/л) та розчинним крохмалем (1 мг/л), за температури культивування 9-12 °С та 16-ти годинного фотоперіоду регенерація зелених рослин зросла в 3-5 разів, а регенерація альбіносних рослин зменшилась в 2,5 рази.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Для підвищення рівня регенерації зелених рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці пропонуються застосування наступних прийомів на різних етапах процесу гаплопродукції: оптимальний строк посіву в польових умовах озимих форм, попередня обробка зрізаних пагонів донорних рослин у розчині АБК (0,1 - 0,5 мг/л) на фоні низьких позитивних температур (2-4 °С) та культивування сформованих ембріоїдів на живильному середовищі MS із доданням 0,25 мг/л АБК. Для морфогенних калусів - додання до живильного середовища MS гіберелової (0,5 мг/л) та яблучної кислот (25 мг/л) і крохмалю (1 мг/л), за температури культивування 9-12 °С и 16-ти годинного фотоперіоду.

Рекомендується використовувати в якості донорних рослин форми із нетривалим періодом «сходи - вакуолізована мікроспора» для добору найбільш чутливих до андрогенезу генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків.

Пропонується в селекції пшениці використовувати лінії з високим рівнем регенерації зелених рослин в якості генетичних джерел високої здатності до андрогенезу in vitro.



СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лобанова К. І. Шляхи реалізації регенераційного потенціалу в культурі пиляків у різних генотипів озимої м'якої пшениці / К. І. Лобанова, М. В. Жосонар, С. О. Ігнатова // Вісник українського товариства генетиків та селекціонерів. - 2006. - Т. 4, № 1. - С.52 - 57.

2. Дисертантом сплановано основні напрямки досліджень, проведено відбір матеріалу і культивування пиляків в умовах in vitro, обробку експериментального матеріалу, написано текст статті, разом із співавторами - проведено аналіз результатів, формулювання основних положень і висновків.

3. Лобанова К. І. Абсцизова кислота як екзогенний фактор підвищення регенераційного потенціалу в культурі пиляків м'якої пшениці / К. І. Лобанова, О. Л. Шестопал, С. О. Ігнатова // Вісник Харківського Національного Аграрного Університету. - 2007. - Вип. 1 (10). - С.102 - 110.

4. Особисто дисертантом сплановані дослідження, проведено відбір донорного матеріалу, введення ізольованих пиляків у культури in vitro, в процесі культивування пиляків на живильних середовищах отримано новоутворення та рослини-регенеранти, разом із співавторами проведено аналіз результатів, формулювання основних положень і висновків, написання та підготовка статті до друку.

5. Ігнатова С. О. Фактори, що впливають на реалізацію регенераційного потенціалу мікроспор в культурі пиляків м'якої пшениці / С. О. Ігнатова, К. І. Лобанова // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології. - 2007. - Т. 2. - С. 492-496.

6. Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з культурою пиляків, статистичну обробку одержаних даних, аналіз результатів, формулювання основних положень, разом із співавтором - формулювання висновків та підготовка публікації до друку.

7. Лобанова Е. И. Регенерация в культуре пыльников озимой мягкой пшеницы у генотипов с разной продолжительностью периода “всходы-колошение” / Е. И. Лобанова, С. А. Игнатова, О. Л. Шестопал, Т. П. Нарган // Фактори експериментальної еволюції організмів. - 2008. - Т. 5. - С. 291 - 297.

8. Особисто дисертантом введено в культуру in vitro пиляки донорних рослин, вивчено особливості проходження процесу андрогенезу досліджених генотипів, проведено статистичну обробку даних, написано текст статті, разом із співавторами проаналізовано результати дослідження та зроблено основні висновки.

9. Пат. 21988 України МПК (2006) А01Н1/06 Спосіб підвищення регенераційного потенціалу в культурі пиляків озимої м'якої пшениці / Ігнатова С. О., Лобанова К. І., Шестопал О. Л.; заявник і патентовласник Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН. - № u 200611658; заявка 6.11.06 ; опубл. 10.04.07, Бюл. № 4.

10. Особисто дисертантом складено загальну схему досліджень, проведено експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, отримано рослини подвоєних гаплоїдів, разом із співавторами проаналізовано результати дослідження та зроблено висновки та рекомендації, що слугували основою отримання патенту.

11. Пат. 33983 України МПК (2006) А01Н1/06 Спосіб прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці на основі цитологічного моніторингу першого етапу культури пиляків in vitro / Ігнатова С. О., Шестопал О. Л., Лобанова К. І., Жосонар М. В. ; заявник і патентовласник Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН. - № u 200801382; заявка 4.02.08 ; опубл. 25.07.08, Бюл. № 14.

12. Дисертант брав участь у проведені експериментів, разом із співавторами здійснено аналіз одержаних результатів, сформовано висновки і методичні рекомендації, підготовлено публікацію до друку.

13. Пат. 36253 України МПК (2006) А01Н1/06 Спосіб прогнозування рівня регенерації рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці / Ігнатова С. О., Лобанова К. І., Шестопал О. Л.,; заявник і патентовласник Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН. - № u 200803034; заявка 11.03.08; опубл. 27.10.2008, Бюл. № 20.

14. Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з культурою пиляків, статистичну обробку одержаних даних, аналіз результатів, формулювання основних положень, разом із співавторами - формулювання висновків та підготовка публікації до друку.

15. Жосонар М. В. Типи макроструктур та їх регенераційна здатність у культурі пиляків м'якої пшениці / М. В. Жосонар, К. І. Лобанова, С. О. Ігнатова // Молодь та поступ біології : ІІ міжнародна наукова конф. студентів та аспірантів, 21-24 березня 2006 г. : зб. тез. - Львів, 2006 - С. 337 - 338.

16. Дисертант брав участь у проведенні досліджень основних етапів культури пиляків і обробці експериментального фактичного матеріалу та його аналізі.

17. Lobanova E. Plant regeneration ability of varieties and hybrid populations in anther culture of common wheat (Triticum aestivum L.) / E. Lobanova, S. Ignatova // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution : III Intеrnational Young Scientists conference, 15-18 May 2007. : abstracts - Odessa, 2007. - P. 205.

18. Дисертантом проведено планування досліджень, одержано базу експериментальних даних, разом із співавтором сформовано висновки, оформлено та підготовлено до друку тези.

19. Лобанова К. І. Вплив абсцизової та гібереллової кислот на регенерацію в культурі пиляків м'якої пшениці / Лобанова К. І. , Шестопал О. Л. // II з'їзд Українського товариства клітинної біології, 23-26 жовтня 2007 г. : зб. тез. - К., 2007 - С. 251.

20. Дисертантом складено загальну схему досліджень, проведено експерименти, методом культури пиляків пшениці отримано подвоєні гаплоїди, разом із співавторами - підготовлено публікацію до друку.

21. Лобанова Е. И. Влияние абсцизовой кислоты на регенерацию в культуре пыльников озимой мягкой пшеницы / Е. И. Лобанова, С. А. Игнатова // Эмбриология, Генетика, Биотехнология : ІІ международная школа молодых ученых, 3-7 декабря 2007 г. : тезисы докл. - Уфа, 2007. - С. 82 - 83.

22. Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з культивування пиляків пшениці на живильних середовищах, модифіковано і проведено попередню обробку донорного матеріалу, отримано рослини-регенеранти, зроблено статистичну обробку матеріалу, разом із співавтором - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовлено публікацію до друку.

23. Игнатова С. А. Возможность прогнозирования гаплопродукционной способности озимой мягкой пшеницы / С. А. Игнатова, О. Л. Шестопал, Е. И. Лобанова // Биотехнология клеток растений in vitro и биотехнология : IX междунар. конф., 8-12 сентября 2008 г. : тезисы докл. - Звенигород, 2008. - С. 144.

24. Особистий внесок дисертанта - введення в культуру in vitro пиляків донорних рослин, вивчення процесу гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці, участь в обробці та аналізі отриманих результатів, написання тез.

25. Лобанова Е. И. Регенерация зелёных растений в культуре пыльников озимой мягкой пшеницы, генотипические различия ее проявления / Е. И. Лобанова, С. А. Игнатова, Е. Панкова // Геном рослин : V міжнар. конф. 13-16 жовтня 2008 г. : тези доп. - Одеса, 2008. - С. 195 - 198.

26. Дисертантом проведено планування досліджень, вивчено рівень регенерації в культурі пиляків досліджених генотипів, одержано базу експериментальних даних та проведено їх статистичну обробку, разом із співавторами сформовані висновки, оформлено тези до друку.



АНОТАЦІЯ

Лобанова К. І. Регенерація рослин в культурі пиляків м'якої пшениці, шляхи її підвищення. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса, 2009.

Дисертація присвячена вивченню закономірностей процесу регенерації рослин в культурі пиляків генотипів м'якої пшениці під впливом різних чинників з метою розробки методичних прийомів підвищення її ефективності. Виявлено високу генотипоспецифічність серед 50 зразків м'якої пшениці за показником рівня регенерації рослин. Діапазон варіювання рівня регенерації зелених рослин у досліджених генотипів складав у сортів 0 - 15,8 %, у гібридів 0 - 76,2 %. Регенерацію зелених рослин у чутливих генотипів можна підвищити на етапі попередньої обробки зрізаних пагонів донорного матеріалу у водному розчині абсцизової кислоти (0,1 - 0,5 мг/л) на фоні низьких позитивних температур. Також підвищення результативності гаплопродукції можливо на етапі регенерації шляхом модифікації фітогормонального складу живильного середовища. Встановлено високу позитивну кореляцію між індукцією новоутворень та регенерацією з них зелених рослин, для сортів озимої м'якої пшениці r = 0,77, для гібридів r = 0,98; а також між регенерацією рослин і типом сформованих новоутворень (ЕКК r = 0,68). Встановлено кореляційний зв'язок між регенерацією зелених рослин в культурі пиляків in vitro та тривалістю періоду «сходи - вакуолізована мікроспора» для сортів (r = - 0,7) і для гібридів (r = - 0,6) озимої м'якої пшениці. Визначено вплив кліматичних умов виро-щування та строку посіву донорних рослин у польових умовах на регенерацію зелених рослин в культурі пиляків озимої м'якої пшениці.

Ключові слова: культура пиляків пшениці, умови in vitro, морфогенез мікроспор, новоутворення, регенерація рослин.

АННОТАЦИЯ

Лобанова Е. И. Регенерация растений в культуре пыльников мягкой пшеницы, пути её повышения - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой ступени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20. - биотехнология. Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова, Одесса, 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению закономерностей и особенностей процесса регенерации растений в культуре пыльников генотипов мягкой пшеницы под влиянием различных факторов с целью разработки методических приемов повышения её эффективности.

Выявлена высокая генотипоспецифичность среди 50 образцов мягкой пшеницы по показателю уровня регенерации растений. Диапазон варьирования уровня регенерации зелёных растений у исследованных генотипов мягкой пшеницы составил у сортов 0 - 15,8 %, у гибридов 0 - 76,2 %. По уровню регенерации зелёных растений в культуре пыльников исследованные генотипы представлены 4 группами. Отсутствие 5В и 5D хромосом у генотипов моносомных линий сорта Безостая 1 оказывало отрицательное влияние на эмбриоидогенез в культуре пыльников. Установлена корреляционная связь между индукцией новообразований и регенерацией из них зелёных растений, для сортов озимой мягкой пшеницы r = 0,77, для гибридов r = 0,98; а также между типом сформированных новообразований, скоростью их формирования и регенерацией растений в культуре пыльников. Установлена отрицательная корреляционная связь между регенерацией зелёных растений в культуре пыльников in vitro озимой мягкой пшеницы и продолжительностью периода «всходы - вакуолизи-рованная микроспора» - для сортов (r = - 0,7) и для гибридов (r = - 0,6). Показатель «продолжительности периода всходы - вакуо-лизированная микроспора» предложено использовать для прогнозирования уровня регенерации генотипов озимой мягкой пшеницы в культуре пыльников. Исследовано влияние климатических условий выращивания и сроков посева донорных растений в полевых условиях на регенерацию зелёных растений в культуре пыльников озимой мягкой пшеницы. Выявлено, что регенерацию зелёных растений у отзывчивых генотипов можно повысить на этапе предобработки срезанных побегов донорного материала в растворе абсцизовой кислоты на фоне низких положительных температур: в темноте, 2-4 °С, 3 суток, для генотипов озимой пшеницы, выращенной в камере искусственного климата 0,1 мг/л АБК, для яровых генотипов 0,5 мг/л, и для озимой пшеницы, выращенной в полевых условиях - 0,5 мг/л. Также повышение результатив-ности гаплопродукционного процесса возможно на этапе регенерации путем модификации фитогормонального состава питательной среды. Формирование зелёных растений из эмбриоидов достоверно увеличивалось в 3 - 5 раз при добавлении в питательную MS среду для регенерации 0,25 мг/л АБК. Питательная среде MS, дополненная гибберелловой кислотой (0,5 мг/л), яблочной кислотой (25 мг/л) и крахмалом (1 мг/л), при температуре культивирования 9 - 12 °С и 16-ти часовом фото-периоде способствовала увеличению количества зелёных растений-регенерантов из длительно культивируемых морфогенных каллусов. В результате проведенной модификации регенерация зелёных растений возросла в 3 - 5 раз, а регенерация альбиносных растений уменьшилась в 2,5 раза

Ключевые слова: культура пыльников пшеницы, условия in vitro, морфогенез микроспор, новообразования, регенерация растений.



SUMMARY

Lobanova К. I. Regeneration of the plants in anther culture of the common wheat, ways to inctease of its efficiency. - Manuscript.

Thesis for a Ph.D. degree for the speciality 03.00.20. - biotechnology. Оdessa National University by І.І. Мechnikov, Odessa, 2009.

The thesis was devoted to studying of laws and features of regeneration process of plants in anther culture genotypes of common wheat under the influence of different factors for the purpose of working out of methodical receptions of increase of its efficiency.

High genotypespecific among 50 forms of common wheat on the of level of plants regeneration was revealed. The range of the variation of level of green plants regeneration at the investigated genotypes of common wheat, was at varietes 0 - 15,8 %, at hybrids 0 - 76,2 % was revealed. Regeneration of green plants at sensitive genotypes can be raised at a stage of pretreatment the cut off shoots of donor material in the solution of abscisic acid (0,1 - 0,5 mg/l) against low positive temperatures. Also productivity increase haploproduction process probably at the stage of regeneration by updating of phytohormonal structure of a nutrient medium. High positive correlation between an induction of newformations and regeneration from them green plants, for varyites of winter common wheat r = 0,77, for hybrids r = 0,98; and also between type of the generated newformations, speed of the formation and regeneration of plants in anther culture was established. Correlation between regeneration of green plants in anther culture in vitro and duration of the period «shoots - vacuolated microspore» for varyetes (r = - 0,7) and for hybrids (r = - 0,6) winter common wheat was established.

...