Особливості субклітинної локалізації протеїнкіназ S6K1 та S6K2 у тиреоцитах щурів в умовах культури клітин in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.25 + 591.87 + 611.44

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості субклітинної локалізації протеїнкіназ S6K1 та S6K2 у тиреоцитах щурів в умовах культури клітин in vitro

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

ХОРУЖЕНКО Антоніна Іванівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі сигнальних систем клітини систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Філоненко Валерій Вікторович Інституту молекулярної біології та генетики НАН України завідувач відділу сигнальних систем клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Островська Галина Віталіївна Київський національний університет імені Тараса Шевченка професор кафедри цитології та гістології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Лукаш Любов Леонідівна Інститут молекулярної біології та генетики НАН України завідувач відділу генетики людини

Захист дисертації відбудеться «07» жовтня 2009 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка МОН України за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Автореферат розіслано 31 серпня 2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Внутрішньоклітинна передача сигналу у фолікулярному епітелії щитовидної залози опосередковується різними сигнальними шляхами, основним з яких є фосфатидилінозитол-3'кіназний (РІ3К) сигнальний каскад, оскільки саме він залучений до регуляції функції щитовидної залози гіпофізарним тиреотропним гормоном (ТТГ) та інсуліном (Suh et al., 2003). Зміна активації та субклітинної локалізації ланок цього сигнального каскаду була виявлена при різноманітних патологіях щитовидної залози, пов'язаних як із дисфункціями, так і з виникненням неоплазій (Vasko et al., 2004). Окрім цілої низки порушень та новоутворень, викликаних викидами радіоактивного йоду після аварії на Чорнобильській АЕС, необхідно зазначити, що на території України розташовані ендемічні зони, збіднені йодом, що також призводить до тиреоїдної патології (Олійник В.А., 2001). Порушення функції щитовидної залози може зумовлювати як гіпо- так і гіпертиреоз. Крім того, збереження функціональної активності тиреоцитів має вирішальне значення при застосуванні радіойод діагностики та радіойод терапії у хворих на карциному щитовидної залози. Тому вивчення тонких субклітинних механізмів, які контролюють рівень функціональної активності тиреоцитів, залишається нагальним.

Важливою ланкою РІ3К сигнального ланцюга є протеїнкіназа рибосомного білка S6 - S6K (Jastrzebski et al., 2007). S6К належить до AGC родини серинових/треонінових протеїнкіназ. Існують дві форми S6 кінази - S6К1 та S6К2 кожна з яких має ядерну (S6К1 І та S6К2 І) та цитоплазматичну (S6К1 ІІ та S6К2 ІІ) форми. Було показано, що активація S6К регулюється шляхом фосфорилювання/дефосфорилювання у відповідь на різні позаклітинні стимули. Роль S6K у процесах диференціювання вивчалась раніше на нервових клітинах, нейтрофілах та інших типах клітин. Так, було виявлено, що пригнічення S6K гальмує диференціювання нервових клітин (McNeill et al., 2008).

Аналіз експресії S6K проводили на нормальній тканині, клітинних лініях та пухлинах щитовидної залози людини. Була відзначена надекспресія цих кіназ у папілярних карциномах щитовидної залози порівняно з нормальною тканиною (Lyzogubov et al., 2003). Проте участь S6K у підтриманні диференціювання тиреоцитів не досліджувалась.

Найбільш застосовуваним методом дослідження тиреоцитів in vitro є метод культури клітин. При вивченні сигнальних систем клітини у контрольованих умовах цей підхід має важливі методологічні і біоетичні переваги над методами дослідження in vivo та дає змогу значно зменшити кількість використаних лабораторних тварин (Freshney , 1994). Проте культивування клітин має ряд суттєвих обмежень. У першу чергу це стосується методу моношарових культур. За умов моношару клітини втрачають первинну тканинну організацію, що викликає порушення міжклітинних контактів, зміни у позаклітинному мікрооточенні, деполяризацію клітин та інше. Одним з важливих наслідків культивування у моношарі може стати зниження функціональної активності клітин (Lee et al., 2007). При вивченні процесів проліферації, апоптозу, міграції як таких метод моношарових культур дає відповіді на численні питання. З іншого боку, вивчення фізіологічних процесів на клітинному рівні потребує використання функціонально активних клітин, рівень диференціювання яких максимально наближений до умов in vivo. Слід зазначити, що використання методу органних культур забезпечує збереження гістологічної структури зразка протягом певного терміну. Проте, недостатнє над-ходження поживних речовин та кисню до клітин, віддалених від поверхні шматочка тканини, досить швидко викликає некроз і унеможливлює тривале культивування. Інший підхід передбачає виділення із тканини і подальше культивування так званих структурно-функціональних одиниць. Серед них можна відзначити ацинуси молочної залози, шматочки мікросудин, фолікули щитовидної залози тощо (Pearson et al., 2007). Таке культивування потребує створення тривимірових умов. Наразі розроблені численні моделі культивування, що забезпечують збереження або утворення структур, подібних до таких у живому організмі (Rejniak et al., 2008). Дані сучасної літератури свідчать про бурхливий розвиток методичних підходів для отримання тривимірових культур (Rauch et al., 2008).

У представленій роботі розроблена методика культивування клітин щитовидної залози із збереженням фолікулярної організації та функціональної активності клітин, яка дозволяє проводити на цих культурах подальший гістологічний та імуногістохімічний аналіз.

Беручи до уваги той факт, що S6K залучена до численних процесів, що забезпечують життєдіяльність клітини, актуальним було дослідження вмісту S6K у тиреоцитах різного ступеня диференціювання. Отримані нами результати дають підставу розглядати субклітинну локалізацію S6K, як додатковий показник функціональної активності клітин щитовидної залози.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (зав. відділом проф., д.б.н. В.В. Філоненко) та виконувалась в рамках бюджетної теми № 2.2.4.10 - “Дослідження структурно-функціональної організації PI3-кіназного сигнального шляху та пухлино-асоційованих антигенів” (номер державної реєстрації - 0105U005342, 2006-2010 рр.). Частково дослідження проводились в Інституті ендокринології та обміну речовин АМН України за темою “Епідеміологічне та клініко-морфологічне дослідження раку щитовидної залози та інших форм тиреоїдної патології у дітей та підлітків України, що зазнали радіаційного впливу внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС” (номер держреєстрації 0196U018213, 1996-1999 р.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було розробити модель культивування тиреоцитів, при якій зберігається фолікулярна організація цих клітин, та дослідити на ній зв'язок між активацією процесів проліферації, міграції, рівнем функціональної активності фолікулярного епітелію щитовидної залози та субклітин-ною локалізацією S6K1 та S6K2. Відповідно до мети були поставлені такі завдання:

1. Відпрацювати умови отримання суспензії неушкоджених фолікулів щитовидної залози людини та щурів.

2. Отримати моношарові культури, багатоклітинні сфероїди та агрегати фолікулів щитовидної залози та перевірити їх на відсутність контамінації клітинами строми.

3. Проаналізувати рівень функціональної активності тиреоцитів у вказаних трьох типах культур за вмістом тиреоглобуліну.

4. Дослідити субклітинну локалізацію S6K у тканині щитовидної залози щурів та у фолікулах, що розпластуються у моношарі, на різних термінах культивування .

5. Проаналізувати вміст S6K методом Вестерн-блот аналізу у тиреоцитах, отриманих із суспензії щойно ізольованих із щитовидної залози фолікулів та культивованих за умов моношару. Методом подвійної імунохімічної реакції дослідити вміст S6K у проліферуючих тиреоцитах.

6. Дослідити субклітинну локалізацію S6K у мігруючих тиреоцитах, культивованих на пористих мембранах.

7. Методом подвійної імунохімічної реакції дослідити локалізацію S6K у тиреоцитах агрегатів фолікулів, позитивних та негативних на тиреоглобулін.

Об'єктом дослідження була внутрішньоклітинна передача сигналу у клітинах фолікулярного епітелію щитовидної залози, а предметом - особливості субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 у тиреоцитах з різним ступенем функціональної активності в умовах дво- та тривимірових культур.

Методи дослідження: отримання первинних культур клітин, дво- та тривимірове культивування, одержання цитологічних та гістологічних препаратів, імуноцитохімічний та імуногістохімічний аналіз, імунофлюоресцентний метод, отримання лізатів клітин та Вестерн-блот аналіз, дослідження міграції клітин за допомогою пористих полікарбонатних фільтрів, статистичний аналіз. Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримано культури флотуючих агрегатів фолікулів щитовидної залози людини та щурів, придатні як для біохімічного аналізу, так і для проведення гістологічного та імуногістохімічного дослідження. Вперше досліджено субклітинну локалізацію S6K1 та S6K2 у тиреоцитах з різним ступенем функціональної активності. Виявлено закономірність у зміні внутрішньоклітинної локалізації S6K1 та S6K2, а саме появі позитвної реакції у ядрах тиреоцитів поряд з цитоплазмою, у ході штучно викликаного дедиференціювання тиреоцитів in vitro. Вперше відзначено зростання вмісту S6K1 та S6K2 у проліферуючих тиреоцитах. Вперше було показано, що активація процесу міграції тиреоцитів не супроводжується внутрішньоклітинною релокалізацією досліджуваних кіназ. Вперше встановлено зв'язок між субклітинною локалізацією S6K1 та S6K2 та рівнем функціональної активності клітин щитовидної залози, культивованих у вигляді моношару та фолікулярних структур в умовах дво- та тривимірових культур.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена модель культивування фолікулів щитовидної залози за відсутності адгезії клітин на шарі агарози може бути використаною для дослідження впливу різноманітних чинників, у тому числі фармакологічних препаратів, на функціональний стан тиреоцитів в умовах культури з подальшим гістологічним та імуногістохімічним аналізом.

Поєднання методів визначення міграції клітин та імуноцитохімії дає можливість вивчати роль та внутрішньоклітинну локалізацію білків, поява яких викликана проявом локомоторних властивостей клітин. Отримані нами результати дають підставу розглядати субклітинну локалізацію кіназ рибосомного білка S6 як додатковий показник рівня функціональної активності фолікулярних клітин щитовидної залози. Використання цього показника може бути у подальшому використано при розробці препаратів, які модулюють функцію клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози людини. Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи виконано за безпосередньої участі здобувача. Розробка методу культивування фолікулів щитовидної залози та суспензії тиреоцитів людини в умовах моношарової культури та на шарі агарози, імуноцитохімічний та імуногістохімічний аналіз культивованих клітин, аналіз субклітинної локалізації S6К у мігруючих тиреоцитах, подвійне імуноцитохімічне визначення S6К у проліферуючих тиреоцитах та статистичний аналіз отриманих результатів виконано безпосередньо пошукачем. Отримання первинних культур тиреоцитів щура, приготування гістологічних препаратів, отримання лізатів тиреоцитів та клітин лінії MCF-7, Вестерн-блот аналіз, подвійне імунохімічне визначення вмісту тиреоглобуліну та S6К1/2 проводили у співробітництві з м.н.с. Чередник О.В.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були апробовані на семінарах відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і представлені на конференції молодих учених України (ІЕПОР НАНУ, Київ 2000), IV з'їзді ендокринологів України (Київ 2001), XXVII з'їзді Європейської асоціації тиреоїдологів (Варшава 2001), V з'їзді Європейської спілки біологів (ELSO) (Дрезден 2005), XX Пущинській школі-конференції молодих учених (Пущино 2006), конференції молодих учених, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ 2007), VI з'їзді ELSO (Дрезден 2007), VIІ з'їзді ELSO (Ніца 2008). Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у провідних фахових виданнях та тези 8 доповідей на наукових конференціях. Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 135 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 36 рисунків. Список використаної літератури охоплює 205 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. Для отримання первинних культур клітин щитовидної залози використовували післяопераційний матеріал (тканину вузлового зобу та нормальну тканину) та щитовидні залози щурів лінії Вістар. Пацієнти були проінформовані та дали згоду на використання хірургічного матеріалу для наукових досліджень. Для виділення фолікулів тканину подрібнювали та піддавали ензиматичній дисоціації сумішшю ферментів колагенази/диспази протягом 1,5-2 год. Після обережного піпетування суспензію фолікулів фільтрували послідовно через нейлонові фільтри з діаметром пор 180 та 40 мкм з метою позбавитись сполучнотканинних фрагментів та поодиноких клітин не епітеліального походження. Для отримання моношарових культур суспензію фолікулів вміщували на адгезивний субстрат. Для отримання сфероїдних культур тиреоцити із моношару трипсинізували і у вигляді суспензії переносили у чашки Петрі, попередньо вкриті шаром агарози, на якому клітини формували сфероїди. Частину вихідної суспензії фолікулів вносили відразу на шар агарози, де вони формували агрегати фолікулів.

Для морфологічного дослідження моношарових культур застосовували метод забарвлення за Май-Грюнвальдом-Гімза із попередньою фіксацією клітин метанолом. Дослідження тканини щитовидної залози та тривимірових культур проводили за класичною гістологічною методикою із використанням забарвлення гематоксилін-еозином та заключенням у канадський бальзам.

Подальший аналіз культур проводили за допомогою імуноцитохімічного та імуногістохімічного методів. Для цього використовували первинні моноклональні антитіла до S6К1/2 форм кінази рибосомного білка S6К, тиреоглобуліну, комплексу кератинів (Pan cytoceratin). Візуалізацію непрямої імунопероксидазної реакції проводили за допомогою 1 мМ розчину 3,3'-діамінобензидину тетрахлориду у PBS, до якого додавали 0,02% H₂O_2. При проведенні подвійної імунохімічної/ імунофлюоресцентної реакції на першому етапі шляхом імунопероксидазного методу визначали вміст у тиреоцитах тиреоглобуліну, антигену проліферуючих клітин Кі-67 та мітогенактивованих протеїнкіназ. Після чого відразу наносили антитіла до S6К1/2, які виявляли за допомогою вторинних антитіл мічених FITC.

Прояв локомоторних властивостей клітин досліджували шляхом стимуляції спрямованої міграції. Для цього використовували трансвели, у верхню камеру яких вносили суспензію фолікулів у культуральному середовищі з додаванням 1 % альбуміну сироватки людини, а у нижню камеру вносили поживне середивище із 20 % сироватки ембріонів великої рогатої худоби. Субклітинну локалізацію досліджуваних кіназ у мігруючих клітинах проводили за допомогою імуноцитохімічної реакції.

Експресію S6К1/2 кіназ у тиреоцитах на рівні білка досліджували за допомогою Вестерн-блот аналізу. Для цього отримували лізати тиреоцитів щойно виділених із щитовидної залози та на 10 добу культивування. Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд. Зразки піддавали електрофорезу у денатуруючих умовах у 10 % поліакриламідному гелі, після чого білки переносили на PVDF мембрану. Імуноблот-аналіз S6K1 та S6K2 проводили за допомогою поліклональних антитіл кроля до С-кінцевих фрагментів відповідних кіназ з вихідною концентрацією 0,25 мг/мл у розведенні 1 : 500 на фосфатно-сольовому буфері (PBS, рН 7,4) з 0,1 % Tween-20. Як вторинні антитіла використовували IgG кози, кон'юговані з пероксидазою хрону. Імунореактивні білки виявляли в системі за підвищеною хемілюмінесценцією (ECL).

Кожен експеримент повторювали не менш, ніж 3 рази. Кількісні дані аналізували за непараметричним критерієм Ван дер Вардена. Величини виражали як середні, p < 0,05 вважали статистично вірогідним (Урбах, 1964). Аналіз кореляції між якісними показниками проводили за допомогою тетрахоричного показника зв'язку (Минцер, 1991). Для цього клітини підраховували у 10 випадково обраних полях зору для кожної форми досліджуваної кінази. Результати досліджень та обговорення. Одержання суспензії ізольованих фолікулів щитовидної залози для ініціації культур тиреоцитів людини із нормальної тканини та тканини вузлового зоба.

Враховуючи, що анатомічною та функціональною одиницею щитовидної залози є фолікул, в основу отримання первинних культур тиреоцитів було покладено одержання суспензії неушкоджених фолікулів. Культури тиреоцитів людини отримували як із матеріалу вузлового зобу, так і з нормальної тканини. Кількість фолікулів, ізольованих із тканини вузлового зобу була вірогідно вищою, ніж із нормальної тканини (1275 проти 9425 на 0,3 г тканини щитовидної залози, відповідно для нормальної тканини та вузлового зобу, p < 0,01, n=12). Це корелювало із кількістю ізольованих фолікулів, отриманих із нормальної тканини та вузлового зобу, які протягом доби прикріплялися до ростової поверхні (222 проти 1212 фолікулів на чашку відповідно з нормальної тканини та вузлового зобу, p < 0,01, n=12). Відсоток адгезованих фолікулів коливався від 54 до 83 %. Щоб підвищити ефективність виділення матеріалу, у першу чергу із нормальної тканини щитовидної залози, у окремих експериментах до суміші колагеназадиспаза додавали панкреатичну еластазу або тестикулярну гіалуронідазу. Однак інкубація шматочків щитовидної залози із вказаними ензимами не підвищувала вірогідно кількість фолікулів, виділених із нормальної тканини (p > 0,05, n=12), і навіть призводила до зниження (проте статистично не вірогідного) виходу неушкоджених фолікулів при ензиматичній деградації тканини вузлового зобу. Так, кількість фолікулів, ізольованих за допомогою суміші гіалуронідаза/колагенназа/диспаза, становила 863 та 5687 відповідно з 0,3 г нормальної тканини та вузлового зобу; кількість фолікулів, ізольованих за допомогою суміші еластаза/колагеназа/диспаза, становила відповідно 1825 та 2701 з 0,3 г нормальної тканини та вузлового зобу. Тому у подальшому як стандартну суміш для ензиматичної дезагрегації тканини щитовидної залози застосовували суміш колагенази/диспази. Отриману суспензію фолікулів використовували для ініціації первинних культур тиреоцитів.

Культивування тиреоцитів у дво- та тривимірових умовах. Отримання культур тиреоцитів у дво- та тривимірових умовах проводили за загальною, наведеною нижче схемою. Тканину щитовидної залози подрібнювали та піддавали ензиматичній дезінтеграції у суміші колагеназа/диспаза. Суспензію вивільнених фолікулів піддавали подвійній фільтрації крізь нейлонові фільтри. Розмір пор фільтрів обирали виходячи з даних вимірювання діаметра фолікулів на гістологічних зрізах. Отримані нами розміри фолікулів (40-180 мкм) збігалися з даними літератури (Бомаш., 1981). Відповідно до схеми, одну частину суспензії фолікулів вносили у чашки Петрі на адгезивний субстрат. На наступну добу спостерігали прикріплення та розпластування тиреоцитів. За вказаних умов тиреоцити швидко втрачали фолікулярну структуру. Через 6-8 діб культивування вони досягали моношару із кінцевою щільністю 56 х 10³ клітин/см². Після цього клітини відкріплювали від субстрату за допомогою 0,25 % розчину трипсину. Частину суспензії знову переносили у чашки Петрі на адгезивний субстрат для формування моношару, а іншу частину вносили у чашки, попередньо вкриті 1,8 % агарозою. Шар агарози запобігав адгезії клітин до субстрату, внаслідок чого вони починали утворювати міжклітинні комплекси, так звані сфероїди. Слід зазначити, що культивовані тиреоцити у складі сфероїдів не мали фолікулярної організації. Таким чином, перенесення суспензії тиреоцитів в умови тривимірової культури не призводило до відновлення фолікулярної організації цих клітин. Термін культивування обирали відносно нетривалим, щоб уникнути утворення некротичної зони у центрі сфероїда. Після 10-12 діб їхній розмір культивування сягав 400 мкм.

Як зображено на схемі, частину вихідної суспензії фолікулів вміщували на чашки Петрі, попередньо вкриті агарозою для запобігання прикріплення фолікулів до ростової поверхні. Це призводило до формування флотуючих агрегатів фолікулів. Головною морфологічною ознакою цього типу первинних культур, одержаних із тканини щитовидної залози, була наявність фолікулоподібної організації клітин, на відміну від культури багатоклітинних сфероїдів, отриманих із суспензії клітин, що наближає агрегати фолікулів до структури щитовидної залози і дозволяє віднести їх до типу гістіотипових культур.

Слід зазначити, що фолікулоподібна організація тиреоцитів зберігалася навіть після 12 - 18 діб культивування. Розміри флотуючих агрегатів фолікулів варіювали у тих же межах, що і для багатоклітинних сфероїдів, і сягали 400 мкм. Отже, із суспензії ізольованих фолікулів тканини щитовидної залози були отримані моношарові, сфероїдні культури та культури флотуючих агрегатів фолікулів, із яких лише останній тип культур за морфологічними ознаками характеризувався збереженням фолікулярної організації клітин.

Підтвердження епітеліального походження культивованих клітин у моношарових, сфероїдних та культурах агрегатів фолікулів. Щоб підтвердити відсутність контамінації отриманих культур клітинами строми, в усіх типах культур було проведено перевірку епітеліального походження клітин шляхом виявлення епітеліальних антигенів, а саме цитокератинів (Pan cytokeratin) за допомогою імунохімічного аналізу.

Практично усі клітини у трьох типах культур демонстрували позитивну реакцію на епітеліальні антигени. Отже, можна зробити висновок, що розроблений нами метод отримання культур клітин щитовидної залози забезпечує відсутність неепітеліальних клітин у цих культурах.

Визначення функціональної активності тиреоцитів, культивованих у вигляді моношару, сфероїдів та агрегатів фолікулів. Маркерним показником функціональної активності тиреоцитів був тиреоглобулін, який визначали імунохімічно. Це широко застосовуваний показник при аналізі стану тиреоцитів in vivo та in vitro (Eom et al., 2008). Було показано, що у моношаровій культурі тиреоцитів (як нормальної тканини так і вузлового зобу) на 9 добу культивування лише окремі клітини демонстрували позитивну реакцію на тиреоглобулін. На зрізі багатоклітинного сфероїда також спостерігалися лише поодинокі клітини, позитивні на тиреоглобулін. На відміну від моношарової культури та багатоклітинних сфероїдів тиреоцити у складі агрегатів фолікулів демонстрували яскраву позитивну реакцію на наявність тиреоглобуліну.

Наші результати повністю узгоджуються із положенням про зв'язок між функціональною активністю тиреоцитів та просторовою організацією цих клітин (Westermark et al.,1990). Ці дані корелюють з дослідженнями, проведеними на суспензійній культурі фолікулів, щодо зв'язку між функцією та фолікулярною структурою тиреоцитів (Gдrtner et al., 1992).

Визначення субклітинної локалізації S6K у тканині щитовидної залози щура. Імуногістохімічний аналіз виявив переважно цитоплазматичну локалізацію обох форм кінази. Раніше на клітинах щитовидної залози людини було показано, що на відміну від злоякісних клітин, тиреоцити нормальної тканини демонстрували слабку реакцію на S6K1 та S6K2 (Lyzogubov et al., 2003). Слід відзначити, що тиреоцити щура також демонстрували помірну реакцію на вказані кінази.

Визначення вмісту тиреоглобуліну у тиреоцитах щурів, культивованих в умовах моношару. На попередньому етапі роботи було показано, що при культивуванні фолікулів у моношарі, тиреоцити поступово зазнають дедиференціації. Таким чином, штучно були створені умови дедиференціювання тиреоцитів, що включали вміщення клітин в умови двовимірової моношарової культури за відсутності тиреотропного гормону у поживному середовищі. При цьому рівень функціональної активності тиреоцитів контролювали за вмістом тиреоглобуліну. Тестування вмісту тиреоглобуліну проводили на 3-тю, 6-ту та 10-ту добу культивування та співставляли його з тканиною щитовидної залози.

За допомогою імунохімічного аналізу було показано, що протягом культивування вміст тиреоглобуліну значно знижувався. Відсоток тиреоглобулін-позитивних клітин знижувався від 99,7 % на 3-тю добу культивування до 35,75 % на 10-ту. Отже, на моделі культивованих тиреоцитів щурів було продемонстровано у динаміці, що втрата фолікулярної організації супроводжується суттєвим зниженням вмісту тиреоглобуліну, який є маркерним показником функціональної активності фолікулярних клітин щитовидної залози.

Визначення субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 у тиреоцитах із розпластуваних фолікулів щура. На моделі моношарових культур тиреоцитів, які отримували після розпластування фолікулів на адгезивному субстраті, було досліджено внутрішньоклітинну локалізацію S6K1 та S6K2.

Отримані нами результати свідчать, що у ході культивування відбувається процес внутрішньо-клітинного перерозподілу вказаних форм S6K. На 3-тю добу культивування, подібно до вихідної тканини щитовидної залози, має місце переважно цитоплазматична локалізація досліджуваних кіназ. У вказаний термін прикріплені фолікули є частково розпластаними. Пізніше, на 6-ту та 10-ту добу культивування, практично в усіх клітинах обидві форми S6K визначались як у цитоплазмі, так і у ядрах клітин. Cпочатку такі ядра спостерігались по краю розпластуваного фолікула, а згодом з'являлись у всіх тиреоцитах колонії клітин. Це викликало припущення проможливий зв'язок між виявленим внутрішньоклітинним перерозподілом кіназ та процесами міграції та проліферації тиреоцитів Слід відзначити, що культивування тиреоцитів, одержаних із суспензії фолікулів, в умовах моношару супроводжується активацією процесів міграції, проліферації та зміною тканинної структурної організації і функціональної активності. Отже, метою подальшої роботи було з'ясувати, який саме із перерахованих чинників може відігравати ключову роль у внутрішньоклітинному перерозподілі S6K1 та S6K2.

Визначення вмісту S6K1/2 у проліферуючих тиреоцитах щура. З даних літератури відомо, що S6K бере участь у контролі над проліферацією клітин (Boyer et al., 2008). Тому, з'ясовували наявність зв'язку між субклітинною релокалізацією S6K1 та S6K2 та процесом проліферації. Для цього популяцію культивованих тиреоцитів досліджували на вміст антигену проліферуючих клітин Кі-67. Було показано, що на 3-тю добу культивування проліферуючі клітини були практично відсутні і з'являлиль лише на 4-5 добу культивування. Проте, поява проліферуючих Кі-67 позитивних клітин не обмежувалась краєм колонії. Тому, не можна було зробити однозначний висновок про кореляцію між субклітинним перерозподілом S6K1/2 та локалізацією проліферуючих клітин у розпластуваному фолікулі.

З іншого боку, з метою визначення вмісту S6K1 та S6K2 у проліферуючих тиреоцитах було проведене подвійне імунохімічне визначення наявності досліджуваних форм кінази та антигену Кі-67. На 6-ту та 10-ту добу кількість Кі-67 позитивних клітин суттєво зростала. Саме у цих тиреоцитах, як свідчить подвійний імунохімічний/імунофлюоресцентний аналіз на наявність Кі-67 та S6K1/2, відзначалась посилена реакція на S6K1 та S6K2.

Проведений кореляційний аналіз із застосуванням тетрахоричного показника зв'язку показав наявність кореляції між присутністю Кі-67 антигену та посиленою реакцією на S6K1 (p < 0,01, n=586) та S6K2 (p < 0,01, n=353). Наші дані співпадають з результатами дослідження, у якому на культурі клітин кишечника за допомогою імуноцитохімічного аналізу також було виявлено надекспресію S6К1 у проліферуючих клітинах (Rhoads et al., 2006). Визначення вмісту S6K1/2 методом Вестерн-блот аналізу у тиреоцитах щурів в умовах моношарової культури. Застосування Вестерн-блот аналізу дозволило виявити зростання вмісту S6K1/2 при культивуванні фолікулярного епітелію щитовидної залози у моношарі. Для цього порівнювали експресію S6K1/2 на рівні білка у тиреоцитах ізольованих фолікулів щитовидної залози щурів (без культивування, день 0) та у клітинах, культивованих за умов моношару протягом 10 діб. Позитивним контролем для Вестерн-блот аналізу були лізати клітин лінії MCF-7, що походять із карциноми молочної залози та характеризуються підвищеною експресією S6K1/2. Було виявлено, що культивування тиреоцитів у моношарі супроводжується підвищенням вмісту S6K1/2 у порівнянні з клітинами фолікулярного епітелію вихідної тканини щитовидної залози.

Визначення внутрішньоклітинного розподілу S6K1/2 у мігруючих тиреоцитах щура. Оскільки було показано відсутність прямого зв'язку між субклітинною релокалізацією S6K1/2 та проліферацією тиреоцитів, було доцільним дослідити можливий вплив процесу міграції на локалізацію досліджуваних кіназ. Наразі у літературі наводиться ряд свідчень про залучення PI3K сигнального шляху та зокрема S6K до міграції клітин (Berven et al., 2004). Нами були створені умови для спрямованої міграції тиреоцитів у культурі. Для цього використовували трансвели. Після закінчення інкубації клітини із верхньої поверхні фільтра видаляли і імуноцитохімічно визначали субклітинну локалізацію S6K1/2 у клітинах, що промігрували на нижню поверхню фільтра. У контрольних зразках середовище у верхньому та нижньому компартментах трансвелу містило однакову концентрацію сироватки, що практично виключало процес міграції у цих умовах. Для цих трансвелів визначали внутрішньоклітинну локалізацію S6K1/2 у тиреоцитах на верхній поверхні мембрани.

Зазвичай такі тести проводять для визначення локомоторних властивостей злоякісних клітин, при цьому використовуються трансформовані клітини перманентних ліній або первинні культури клітин, одержані із карцином (Vuillermoz et al., 2004). Наші дослідження показали, що цей метод оцінки міграції можна успішно застосовувати також для нормальних клітин первинних культур, одержаних із щитовидної залози.

Отримані нами результати свідчать про те, що у всіх тиреоцитах, які промігрували крізь фільтр, досліджувані форми S6K1/2 були локалізовані у цитоплазмі. За цих умов проведення експерименту, релокалізація вказаних кіназ, яка призводить до появи S6K1/2 позитивних ядер тиреоцитів, не відзначалась. Отже, прямого зв'язку між міграцією клітин щитовидної залози у культурі та зміною внутрішньоклітинної локалізації S6K1/2 не спостерігали.

Дослідження субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 у тиреоцитах флотуючих агрегатів фолікулів. На наступному етапі роботи були проведені дослідження локалізації S6K1/2 у тиреоцитах, культивованих у складі фолікулярних структур. Як і у випадку моношарових культур, визначення локалізації S6K1/2 проводили на 3-тю, 6-ту та 10-ту добу культивування. Імуногістохімічний аналіз виявив переважно цитоплазматичну локалізацію S6K1/2 у тиреоцитах. Така локалізація вказаних кіназ співпадає із їхнім розподілом у нормальній тканині. Як було описано вище, за таких умов культивування має місце збереження функціональної активності тиреоцитів. Методом подвійної імуногістохімічної реакції на клітинах агрегатів фолікулів було проведено дослідження можливого зв'язку між рівнем функціональної активності тиреоцитів та субклітинною локалізацією S6K1/2.

Аналіз отриманих результатів показав, що після тривалого культивування (10 діб) тиреоглобулін містили лише клітини, які входили до складу фолікулоподібних структур. Крім того, ділянки агрегатів, які втратили фолікулярну організацію, не містили тиреоглобуліну. Таке пряме співставлення у межах агрегату вказує на те, що збереженням або втратою фолікулярної організації тиреоцитів.

Таким чином, на культурах сфероїдів та агрегатів фолікулів було показано, що при культивуванні у тривимірових умовах та втраті фолікулярної організації, рівень функціональної активності тиреоцитів різко знижується, результатом чого є відсутність у клітинах тиреоглобуліну. З метою визначення субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 у різних ділянках агрегатів, що містять або не містять тиреоглобулін, була проведена подвійна імуногістохімічна реакція на S6K. Після 10 діб культивування, у популяції клітин, що не зберегли фолікулярної організації і, відповідно, не містили тиреоглобуліну, мала місце позитивна реакція на S6К1/2 у ядрах тиреоцитів, як і при тривалому культивуванні тиреоцитів в умовах моношарових культур. Був проведений кореляційний аналіз із застосуванням тетрахоричного показника зв'язку. Він виявив наявність зв'язку між втратою тиреоцитами тиреоглобуліну та появою реакції на S6K1 (p < 0,01, n=1459) та S6K2 (p < 0,01, n=771) у ядрах. Крім того, у тиреоглобулін негативних клітинах відзначалась яскравіша реакція на S6К1/2, ніж у тих, що містили тиреоглобулін. Отримані дані свідчать, що кінази рибосомного білка S6 - S6K1 та S6K2 залучені до процесу контролю над диференціюванням тиреоцитів. У літературі наводиться ряд даних про залучення РІ3К сигнального шляху і, зокрема S6K, до процесу хондрогенезу, дозрівання еритробластів та ін. (Hamamura et al., 2008; Starkman et al., 2005). Проте, наразі немає однозначного визначення вказаного сигнального ланцюга як позитивного чи негативного регулятора диференціювання.

Отже, одержані результати підтверджують дані, отримані на моношарових культурах тиреоцитів, а саме, що у клітинах, які втратили первинну гістологічну структуру, відзначається поява S6K1/2 позитивних ядер. Натомість, у клітинах, що містять тиреоглобулін, внутрішньоклітинна локалізація S6K1/2 є переважно цитоплазматичною і співпадає з такою у нормальній тканині щитовидної залози. Дані, отримані нами на дво- та тривимірових моделях культури клітин, підтверджують залучення кінази рибосомного білка S6 до механізму контролю рівня диференціювання тиреоцитів. Ці результати можуть бути корисними при розробці препаратів, що модулюють функцію щитовидної залози при патологічних станах. Крім того, отримані результати вказують на можливість застосування створеної моделі для детального дослідження молекулярних механізмів S6K1/2 опосередкованого сигналінгу, у тому числі і за рахунок змін субклітинної локалізації кіназ за умов найбільш наближених до існуючих in vitro.

фолікула щитовидний субклітинний локалізація

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вперше розроблено модель тривимірового культивування тиреоцитів людини та щура у вигляді флотуючих агрегатів фолікулів, що зберігають свою структурну організацію. Встановлено зв'язок між субклітинною локалізацією S6K1/2 кіназ рибосомного білка S6K та рівнем функціональної активності культивованих тиреоцитів.

1. Вперше розроблено умови та отримано первинні культури флотуючих агрегатів фолікулів щитовидної залози людини та щурів.

2. Проведено порівняльний аналіз рівня збереження функціональної активності клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози у трьох типах культур (моношаровій, сфероїдній та у флотуючих агрегатах фолікулів) за вмістом тиреоглобуліну, найвищий рівень якого виявлено у тиреоцитах агрегатів фолікулів, що характеризувалися збереженням фолікулоподібної організації протягом тривалого терміну культивування.

3. У тканині щитовидної залози щура шляхом непрямої імунопероксидазної реакції виявлено переважно цитоплазматичну локалізацію S6K1 та S6K2 кіназ рибосомного білка S6.

4. Встановлено, що втрата фолікулярної організації тиреоцитів в умовах моношарової культури та у частині клітин флотуючих агрегатів фолікулів супроводжується субклітинною релокалізацією S6K1/2, що виражається у появі досліджуваних кіназ у ядрах клітин.

5. Продемонстровано підвищення вмісту S6K1/2 у проліферуючих тиреоцитах за умов моношарової культури та у тиреоцитах, що втратили фолікулярну організацію у тривиміровій культурі.

6. Встановлено, що активація спрямованої міграції культивованих тиреоцитів не супроводжується внутрішньоклітинною релокалізацією S6K1/2.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Khoruzhenko A.I. New approaches for thyrocyte cultivation in vitro with retention of their follicular organization / A.I. Khoruzhenko // Exp. Oncol. - 2002. - Vol. 24, P. 99-104.

2. Khoruzhenko A.I. Subcellular localization of S6K1 and S6K2 forms of ribosomal protein S6K kinase in primary monolayer culture of rat thyrocytes / A.I. Khoruzhenko, O.V. Cherednyk, V.V. Filonenko // Біополімери та клітина. - 2008. Т. 24, № 1. - С. 35-40. Особистий внесок здобувача - отримання первинних культур, імунохімічний аналіз.

3. Хоруженко А.І. Субклітинна локалізація S6K1 і S6K2 форм кінази рибосомного білка S6 у тиреоцитах щурів за умов дво- та тривимірної культури / А.І. Хоруженко, О.В. Чередник, В.В. Філоненко // Біополімери та клітина. - 2008. Т. 24, № 6. - С. 470-475. Особистий внесок здобувача - отримання первинних культур, подвійний імунопероксидазний/імуноферментний аналіз.

4. Хоруженко А.І. Визначення тиреоглобуліну для оцінки функціональної активності у моношарових та флотуючих культурах клітин щитоподібної залози людини. - 2001. - Т. 6 додаток. - С. 321.

5. Khoruzhenko A.I. Human thyrocyte culture derived from isolated follicles / A.I. Khoruzhenko // The 27^th Annual Meeting of European Thyroid Association, (Warsaw, 25-29 August 2001) Journal of endocrinological Investigation. - 2001. - Vol. 24, Suppl to No. 6. - P. 24.

6. Khoruzhenko A. Loss of thyrocyte follicular organization in vitro is accompanied by subcellular redistribution of ribosomal protein S6 kinases S6K1 and S6K2 / A. Khoruzhenko, V. Filonenko // V annual meeting of ELSO, 3-6 September 2005, Dresden, Germany.

7. Хоруженко А.И. Потеря тиреоцитами фолликулярной организации in vitro сопровождается внутриклеточным перераспределением киназ рибосомального белка S6: S6K1 и S6K2 / А.И. Хоруженко, О.В. Чередник, В.В. Филоненко // 10-я Пущинская школа-конференция молодых учёных “Биология - наука XXI века”, Пущино, 17-21 апреля 2006 г. Особистий внесок здобувача - - отримання первинних культур, оцінка субклітинної локалізації, аналіз зображень.

8. Khoruzhenko A.I. Subcellular localization of S6K1 and S6K2 isoforms of ribosomal protein S6 kinase in rat thyroid tissue, primary thyrocyte monolayer culture and aggregates of undamaged follicles / A. Khoruzhenko, O. Cherednyk, V. Filonenko // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120^th anniversary of M.I. Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine. Особистий внесок здобувача - отримання дво- та тривимірових культур тиреоцитів, імунохімічний аналіз.

9. Khoruzhenko A. Immunocytochemical determination of subcellular localization of S6K1 and S6K2 forms of ribosomal protein S6 kinase in initial tissue and two- and three-dimensional cultures of rat thyrocytes / A. Khoruzhenko, O. Cherednyk, V. Filonenko // VI annual meeting of ELSO, 1-4 September 2007, Dresden, Germany. Особистий внесок здобувача - отримання дво- та тривимірових культур тиреоцитів.

10. Khoruzhenko A. Thyroid cell dedifferentiation in vitro is accompanied by subcellular redistribution of ribosomal protein S6 kinase / A. Khoruzhenko, O. Cherednyk, V. Filonenko // VII annual meeting of ELSO, 30 August - 2 September 2008, Nice, France. Особистий внесок здобувача - аналіз субклітинної локалізації S6K1/2.

11. Cherednyk O. Expression of ribosomal protein S6 kinases S6K1 and S6K2 in proliferating rat thyroid and MCF-7 cells / O. Cherednyk, V. Kukharchuk, A. Khoruzhenko // VII annual meeting of ELSO, 30 August - 2 September 2008, Nice, France. Особистий внесок здобувача - аналіз субклітинної локалізації S6K1/2.

АНОТАЦІЇ

Хоруженко А.І. Особливості субклітинної локалізації протеїнкіназ S6K1 та S6K2 у тиреоцитах щурів в умовах культури клітин in vitro. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Метою даної роботи було дослідити субклітинну локалізацію S6K1 та S6K2 у тиреоцитах за різних умов культивування та визначити можливий зв'язок процесів проліферації, міграції та зміни функціональної активності клітин із релокалізацією вказаних форм S6K. Для цього розроблено умови для отримання дво- та тривимірових культур без збереження (моношарові та сфероїдні культури) та із збереженням фолікулярної організації (агрегати фолікулів) тиреоцитів. Визначення вмісту тиреоглобуліну виявило різке зниження функціональної активності тиреоцитів людини та щурів в моношарових та сфероїдних культурах порівняно із агрегатами фолікулів. На моделі моношарової культури тиреоцитів виявлено внутрішньоклітинну релокалізацію S6K1/2, важливої ланки РІ3К сигнального шляху, що опосередковує регуляторний вплив ТТГ на клітини щитовидної залози. На відміну від нормальної тканини, в умовах моношару поряд з цитоплазматичною виявлено ядерну локалізацію S6K1/2, що спостерігається у процесі культивування і супроводжується зниженням вмісту тиреоглобуліну, який відображує функціо-нальний стан тиреоцитів. Кореляції між появою S6K1/2-позитивних ядер тиреоцитів та локалізацією проліферуючих клітин не виявлено. З іншого боку, відзначено підвищення вмісту S6K1/2 у Кі-67 позитивних клітинах. Не виявлено зв'язку між процесом міграції тиреоцитів та зміною субклітинної локалізації S6K1/2. Проте виявлено кореляцію між вмістом тиреоглобуліну у тиреоцитах агрегатів фолікулів та цитоплазматичною локалізацією S6K1/2. Таким чином, показана наявність зв'язку між субклітинною локалізацією S6K1/2 та рівнем функціональної активності тиреоцитів, культивованих в умовах дво- та тривимірової культури.

Ключові слова: S6K1, S6K2, тиреоцити, рівень диференціювання.

Хоруженко А.И. Особенности субклеточной локализации протеинкиназ S6K1 и S6K2 в тиреоцитах крыс в условиях культуры клеток in vitro. Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - Киевский национальный університет шимени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Целью данной работы было исследовать субклеточную локализацию S6K1 и S6K2 в тиреоцитах при разных условиях культивирования и определить возможную связь процессов пролиферации, миграции и изменения функциональной активности клеток с релокализацией указанных форм S6K. Для этого разработаны условия для получения двух- и трехмерных культур без сохранения (монослойные и сфероидные культуры) и с сохранением фолликулярной организации (агрегаты фолликулов) тиреоцитов. Определение содержания тиреоглобулина обнаружило резкое снижение функциональной активности тиреоцитов человека и крысы в монослойных и сфероидных культурах в сравнении с агрегатами фолликулов. На модели монослойной культуры тиреоцитов обнаружена внутриклеточная релокализация S6K1/2, важного звена РI3К сигнального пути, который опосредует регуляторное влияние ТТГ на клетки щитовидной железы. В отличие от нормальной ткани, в условиях монослоя наряду с цитоплазматической обнаружена ядерная локализация S6K1/2, которая наблюдается в процессе культивирования и сопровождается снижением содержания тиреоглобулина, отражающего функциональное состояние тиреоцитов. Корреляция между появлением S6K1/2-позитивних ядер тиреоцитов и локализацией пролиферирующих клеток не выявлена. С другой стороны, отмечено увеличение содержания S6K1/2 в Кі-67 положительных клетках. Не обнаружена связь между процессом миграции тиреоцитов и изменением субклеточной локализации S6K1/2. Однако была выявлена корреляция между содержанием тиреоглобулина в тиреоцитах агрегатов фолликулов и цитоплазматической локализацией S6K1/2. Таким образом, показано наличие связи между субклеточной локализацией S6K1/2 и уровнем функциональной активности тиреоцитов, культивируемых в условиях двух- и трёхмерной культуры.

Ключевые слова: S6K1, S6K2, тиреоциты, уровень дифференцировки.

Khoruzhenko A.I. Features of subcellular localization of proteinkinases S6K1 and S6K2 in rat thyrocytes in cell culture conditions in vitro. - Manuscript.

Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.11 - cytology, cell biology, histology. - National Taras Shevchenko University of Kyiv, Kyiv, 2009.

The function of thyroid is closely related to its follicular structure. Loss of this specific organization in primary culture leads to dedifferentiation of thyrocytes. Earlier it was shown that TSH and insulin serve as the main regulators of thyroid function and control the target cells in vitro through PI3K signalling pathway. The kinase of ribosomal protein S6 is an important member of this pathway involved in control of protein synthesis and G1/S transition of the cell cycle. The ribosomal protein S6 kinase belongs to the AGS family of Ser/Thr protein kinases. There are two forms of S6 kinase S6K1 and S6K2, each of which has cytoplasmic and nuclear variants derived from alternative splicing at N-terminus. Depending on physiological status of tissue, S6K could be found either in the cytoplasm and/or in the nucleus. The biological implication of such subcellular redistribution remains unclear. The purpose of this work was to define possible connection between the processes of proliferation, migration, decrease of functional activity of thyrocytes and subcellular relocalization of the indicated forms of S6K.

Suspension of undamaged follicles was obtained after enzyme dissoсiation of thyroid tissue and double filtration through nylon mesh with pore diameter 40 and 180 m. Three types of thyrocyte culture were obtained from the suspension of isolated follicles: monolayer and spheroid cultures, which lost follicle organization, and floating aggregates of follicles, which retain a follicle-like structure. Immunochemical detection did not revealed nonepithelial cells in mentioned cultures. Subsequent determination of thyroglobulin content had shown that the major part of the cells from monolayer and spheroid culture were negative for thyroglobulin, whereas all the thyrocytes in floating aggregates of follicles contain thyroglobulin, which is a marker of their functional activity. So, follicle-like organization of cultured thyrocytes is necessary for retention of their functional activity.

It was shown, that follicles, isolated from human and rat thyroid tissue and placed onto adhesive substrate, lost their initial organization during several days, that was accompanied by gradual decrease of thyroglobulin content. Such a model of thyrocyte activity decreasing was used to study the subcellular redistribution of S6K. In normal thyroid tissue S6K1/2 were observed predominantly in the cytoplasm of the cells. Thyroid follicles were placed at low density into Petri dishes, and cultivated in RPMI 1640 medium with 15 % FCS. At the 3^rd, 6^th and 10. So, the direct relation between proliferation and subcellular distribution of S6K1 and S6K2 was not observed.

To study possible effect of migration on subcellular localization of S6K1 and S6K2, cultured thyrocytes were stimulated to penetrate a porouse membrane of Transwell. The suspension of isolated follicles was placed into upper chamber of Transwell in culture medium supplemented with 1 % human serum albumin. Growth medium with 20 % FCS were placed into lower chamber. Application of indirect immunoperoxidase reaction allow to reveal that S6K1 and S6K2 were localized in the cytoplasm of thyrocytes. Thus, there is no direct link between migration and subcellular redistribution of S6K1/2.

Since, in course of follicle spreading the change of subcellular distribution of S6K1 and S6K2 took place, it was necessary to detect the content of these kinases in thyrocytes in 3 D culture with retention of follicle structure. The aggregates of isolated follicles were applied for the study. In course of tissue dissociation with collagenase and dispase, part of follicles were destroyed. Such follicles form an area of solid structure. So, follicular and solid areas were observed in floating aggregates of follicles obtained from rat thyroids. Immunohistochemical analisis revealed that thyrocytes from follicle-like structures contain thyroglobulin, whereas the thyrocytes from solid areas did not contain thyroglobulin. It confirm the supposition that 3D culture conditions as themselves do not provide the retention of thyrocyte functional activity. Namely, presence of follicle organization is necessary to retain high level of thyrocyte differentiation. To detect subcellular redistribution of S6K1 and S6K2, the double immunoperoxidase/immunofluorescent reaction was applied. It was revealed that in thyroglobulin-positive cells S6K1/2 localized in cytoplasm, like normal thyroid tissue. On other hand, in thyroglobulin-negative cells S6K1/2 were obserwed in nuclei as well. It correlates with our results obtained in thyrocyte monolayer culture.

Thus, the change of subcellular localization of S6K1/2 in cultured thyrocytes is directly related to change of level of functional activity, unlike the processes of proliferation and migration of these cells.

Key words: S6K1, S6K2, thyrocytes, level of differentiation.

Размещено на Allbest.ru