Похідні протромбіну та їх роль у функціонуванні коагуляційної ланки системи гемостазу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка

УДК 577.151.042.5: 612.115

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Похідні протромбіну та їх роль у функціонуванні коагуляційної ланки системи гемостазу

03.00.04 - біохімія

Корольова Дар'я Сергіївна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка та Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник:доктор біологічних наук Платонова Тетяна Миколаївна, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу структури та функції білка.

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, провідний науковий співробітник відділу хімії білків та пептидів;

доктор біологічних наук Гриненко Тетяна Вікторівна, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу хімії і біохімії ферментів.

Захист відбудеться « 25 » січня 2010 р. о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано “ 17 ” грудня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

протромбін фібриновий згусток антикоагулянт

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гемостаз є сукупністю процесів, що забезпечують підтримання крові у рідкому стані та зупинку кровотечі. При пошкодженні судини на поверхні активованого ендотелію та тромбоцитів ініціюється каскад зсідання крові, в результаті чого утворюється тромбін. Тромбін є багатофункціональним ферментом, що виконує в системі гемостазу як прокоагулянтні функції (перетворює фібриноген на фібрин; активує фактори V, VIII, ХІ, ХІІІ зсідання крові; забезпечує активацію та агрегацію тромбоцитів) так і антикоагулянтні функції (активує протеїн С) [Зубаиров Д.М., 2000].

Тромбін циркулює в кровотоці у вигляді проферменту - протромбіну, що складається з N-кінцевого Гла-домену, двох кринглів та С-кінцевого каталітичного домену. Перетворення протромбіну в тромбін проходить на фосфоліпідній мембрані за участі факторів Xа та Vа зсідання крові, іонів кальцію. Домінуючий шлях утворення тромбіну протікає через стадію мезотромбіну. Молекула мезотромбіну містить активний центр, який формується внаслідок розщеплення пептидного зв'язку (Arg320-Ile321) в каталітичному домені протромбіну. Зокрема відомо, що мезотромбін активує протеїн С [Cфtй H.C.F., 1997]. Водночас, в мезотромбіні зберігається доменна будова протромбіну і тому він може зв'язуватись з фосфоліпідною мембраною клітин. З огляду на це, видається доцільним з'ясувати чи має мезотромбін, як і тромбін, прокоагулянтну активність і зокрема, дослідити його роль у первинному гемостазі.

Тромбін гідролізує протромбін в положенні Arg155-Ser156, що приводить до відщеплення Гла-домену та першого кринглу і утворення претромбіну 1. В молекулі претромбіну 1 каталітичний домен залишається інтактним, тому активний центр не формується. Відсутність N-кінцевої ділянки протромбіну в молекулі претромбіну 1 сприяє формуванню в молекулі претромбіну 1 екзосайту І, який забезпечує взаємодію з рецепторами тромбоцитів і такими білками як фібриноген, фактори V, VIII, ХІ зсідання крові, протеїн С тощо [Anderson P.J., 2003].

Як претромбін 1, так і мезотромбін локалізуються в місці активації системи зсідання крові і можуть брати участь в регуляції функціонування ланок системи гемостазу. В літературі практично немає даних щодо ролі похідних протромбіну в гемостазі взагалі і в первинному гемостазі зокрема. Тому, на нашу думку, актуальним є дослідження ролі мезотромбіну та претромбіну 1 в формуванні тромбоцитарного та фібринового тромбу.

При порушенні балансу про- та антикоагулянтної ланок системи гемостазу в кровотоці може з'являтись претромбін 1, а при порушенні карбоксилювання вітамін К-залежних білків - PIVKA-протромбін (protein induced by vitamin K absence - протеїн, що утворюється в результаті відсутності вітаміну К). Тому виявлення цих функціонально неактивних форм протромбіну в плазмі крові може надати інформацію для діагностування тромбофілії та контролю антикоагулянтної терапії.

Нефізіологічний активатор протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) екамулін здатен гідролізувати зв'язок Arg320-Ile321 протромбіну з утворенням мезотромбіну. Тому він є придатним інструментом для отримання препарату мезотромбіну та дослідження функцій проміжних продуктів активації протромбіну in vitro. Оскільки екамулін здатен активувати функціонально неактивні форми протромбіну, то він є придатним для розробки лабораторних діагностичних тестів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану НДР науково-дослідної лабораторії «Фізико-хімічної біології» біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної теми «Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції і профілактики» (№ д/р 0106U005750) і відділу структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ в рамках наукової тематики «Структурно-функціональний аналіз білків за норми та деяких патологій» (№ д/р 0107V007187), «Вивчення механізмів регуляції та взаємодії компонентів системи зсідання крові та фібринолізу з судинно-тромбоцитарною ланкою системи гемостазу» (№ д/р 0104U003276) та гранту НАН України для молодих учених «Вплив ендогенних та екзогенних факторів на тромбоцити» (№ д/р 0107V007197).

Мета і завдання дослідження. Визначити роль похідних протромбіну в формуванні фібринового і тромбоцитарного тромбу та розробити метод їх виявлення в плазмі крові.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1) Оптимізувати метод препаративного виділення та очистки активатора протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) екамуліну та охарактеризувати його;

2) Вивчити кінетику активації протромбіну екамуліном та розробити метод отримання мезотромбіну;

3) Визначити роль мезотромбіну та претромбіну 1 в формуванні фібринового згустку;

4) Дослідити вплив мезотромбіну та претромбіну 1 на тромбоцитарну ланку гемостазу;

5) Розробити тест лабораторної діагностики для виявлення функціонально неактивних форм протромбіну в плазмі крові, встановити його ефективність для виявлення активації системи зсідання крові та моніторингу лікування антикоагулянтами непрямої дії.

Об'єкт дослідження. Функціональне навантаження мезотромбіну та претромбіну 1 в формуванні фібринового згустку і функціонуванні тромбоцитарної ланки гемостазу та виявлення функціонально неактивних форм протромбіну в плазмі крові за тромбофілії та антикоагулянтної терапії.

Предмет дослідження. Похідні протромбіну (мезотромбін, претромбін 1, PIVKA-протромбін) та активатор протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis).

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети було використано біохімічні методи (хроматографія для виділення та очистки білкових препаратів; диск-електрофорез у поліакриламідному гелі з наступною денситометрією для характеристики білкових препаратів та вивчення кінетики ферментативних реакцій, спектрофотометрія для визначення концентрації розчинних білків, реєстрації процесу відщеплення п-нітроаналіну від хромогенних субстратів, перетворення фібриногену на фібрин, характеристики процесу агрегації тромбоцитів), цитологічні методи дослідження (протокова цитометрія для характеристики стану тромбоцитів) та клініко-біологічні методики для характеристики стану системи гемостазу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що мезотромбін ефективно активує тромбоцити в популяції частково активованих тромбоцитів, тобто здатен залучати нові інтактні тромбоцити до процесу тромбоутворення.

Вперше продемонстровано, що мезотромбін підсилює колаген-, АDР- та адреналін-індуковану агрегацію тромбоцитів, хоча сам є слабким, порівняно з тромбіном, індуктором агрегації тромбоцитів.

Вперше показано здатність претромбіну 1 дозозалежно пригнічувати колаген-, АDР- та адреналін-індуковану агрегацію тромбоцитів, що, ймовірно, пов'язано з його зв'язуванням із глікопротеїном Іb на поверхні тромбоцитів.

В роботі отримало подальший розвиток дослідження ролі мезотромбіну в формуванні фібринового згустку. Показано, що мезотромбін здатен викликати згортання фібриногену і, вперше, продемонстровано, що мезотромбін активує фактор ХІІІ зсідання крові.

Практичне значення одержаних результатів. Удосконалено метод очистки активатора протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis). Розроблено метод отримання проміжного продукту активації протромбіну - мезотромбіну, придатного для використання в модельних системах.

Удосконалено метод виявлення функціонально неактивних форм протромбіну (ФНФП) в плазмі крові на основі екамуліну. Показано, що завдяки використанню хромогенного субстрату результати даного тесту залишаються об'єктивними за умов гепаринотерапії та при накопиченні інгібіторів зсідання крові.

Показано, що накопичення ФНФП в плазмі крові за системного червоного вовчака може використовуватись як маркер тромбофілії. Показано, що визначення рівня ФНФП в плазмі крові дозволяє проводити підбір дози антикоагулянтів непрямої дії та контролювати антикоагулянтну терапію шляхом виявлення PIVKA-протромбіну в плазмі крові.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено аналіз літературних даних за темою дисертації, сплановано та проведено основний обсяг експериментальних досліджень, отримано основні білкові препарати використані в роботі, проведено статистичний аналіз та інтерпретацію отриманих результатів.

Постановка задач дослідження, обговорення, узагальнення результатів та формулювання висновків проводилось спільно з науковим керівником д.б.н. Т.М. Платоновою.

Препарати фібриногену та анцистрону були надані співробітниками відділу структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ Т.М. Чернишенко та В.О. Чернишенком.

Дослідження стану системи гемостазу при системному червоному вовчаку проводилось спільно з Українським державним НДІ реабілітації інвалідів МОЗ України, м. Вінниця. Плазма крові хворих на серцево-судинні захворювання, яким проводилась терапія антикоагулянтами непрямої дії, була люб'язно надана лабораторією біохімії та бактеріології Національного Інституту хірургії та трансплантології імені академіка О.О. Шалімова АМН України. Матеріал брали за персональної проінформованої згоди в рамках лікувально-діагностичних процедур.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представленні на вітчизняних та міжнародних конференціях: конференція-конкурс робіт молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології», (Київ, 2006 р. та 2008 р.); ІХ Український біохімічний з'їзд, (Харків, 2006 р.); ІІІ та V Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології», (Львів, 2007 р. та 2009 р.); «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки», (Минск, 2007 р.); Bridges in Life Sciences Second Annual Review of the Regional Cooperation for Health, Science and Technology Consortium, (Zagreb, 2008 р.)

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових праць з яких: 3 - статті у фахових періодичних виданнях, затверджених переліком ВАК України, 7 - тези у матеріалах міжнародних та всеукраїнських конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає опис матеріалів і методів дослідження і викладення результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що містить 181 джерело. Дисертація викладена на 126 сторінках друкованого тексту, містить 4 таблиці, 43 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури розглянуто особливості функціонування системи гемостазу та взаємозв'язок між різними її ланками. Наведено відомості про структуру тромбіну та протромбіну, про шляхи активації протромбіну до тромбіну за фізіологічних умов та активаторами протромбіну з отрути змій. Особливу увагу приділено функціям тромбіну та шляхам регуляції його активності. Охарактеризовано напрямки дослідження продуктів розщеплення протромбіну.

Аналіз літературних даних дозволив визначити напрямки та основні завдання дисертаційної роботи.

Матеріали і методи досліджень

Протромбін отримували з цитратної плазми крові людини сорбуванням на ВаSО₄ та виділяли шляхом іонообмінної хроматографії з подальшою очисткою гель-фільтрацією. Претромбін 1 отримували шляхом обмеженого протеолізу протромбіну тромбіном з подальшою очисткою претромбіну 1 іонообмінною хроматографією.

Активатор протромбіну екамулін отримували з кристалічної отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) методом іонообмінної хроматографії з подальшою гель-фільтрацією. Процес активації протромбіну екамуліном вивчали електрофоретично та з використанням хромогенного субстрату S2238 (D-Phe-Pip-Arg-pNA•2 HCl). Розщеплення хромогенних субстратів фіксували за вивільненням п-нітроаніліну, який визначали спектрофотометрично, вимірюючи оптичне поглинання в області 405 - 492 нм.

Для отримання препарату мезотромбіну проводили іммобілізацію екамуліну на BrCN-Sepharose.

Згортання фібриногену вивчали турбідиметричним методом. Процес активації фактору ХІІІа зсідання крові мезотромбіном характеризували за рівнем ковалентної прошивки фібрину.

Збагачену тромбоцитами плазму крові (ЗТПК) отримували шляхом центрифугування цитратної крові при 160 g протягом 20 хв і температурі 20°С. Відмиті тромбоцити отримували гель-фільтрацією зі ЗТПК.

Процес агрегації тромбоцитів вивчали в ЗТПК людини (200-300 тис. тромбоцитів/мкл) в перші три години після забору крові на фотооптичному агрегометрі “SOLAR AP2110”. Агрегацію тромбоцитів ініціювали внесенням одного з індукторів агрегації тромбоцитів: ADP (у кінцевій концентрації 1-1,25 мкМ), колаген (0,2 мкг/мл) та адреналін (60-80 нг/мл). Процес агрегації реєстрували протягом 10 хв.

Процес активації тромбоцитів вивчали на відмитих тромбоцитах людини методом цитометрії на протоковому цитофлуориметрі COULTER EPICS XL Flow Cytometer. В ході експерименту реєстрували два типи світлорозсіювання: пряме, що характеризує розмір клітин, та бічне, яке характеризує щільність цитоплазми клітини, тобто гранулярність тромбоцитів.

Результати досліджень та їх обговорення

Виділення та характеристика екамуліну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis). Оптимізовано метод препаративного виділення активатора протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis), що полягає в отриманні екамуліну на Q-Sepharose з подальшою очисткою на Superdex G-75.

Для характеристики та стандартизації препарату екамуліну використовували хромогенний субстрат S2302. Зокрема, було визначено кінетичні параметри процесу гідролізу хромогенного субстрату S2302 екамуліном: Кm=78,8 мкМ; Vmax=0,43 нмоль/хв. Було показано, що екамулін не розщеплює фібриноген та тромбін-специфічний хромогенний субстрат S2238, тому даний фермент можна використовувати в тестах лабораторної діагностики для визначення рівня протромбіну.

Екамулін розщеплює протромбін в положенні Arg320-Ile321 з утворенням мезотромбіну. Встановлено кінетичні параметри процесу гідролізу протромбіну екамуліном (Кm=3,4 мкМ; Vmax=0,23 нмоль/хв) та визначено, що рН-оптимум Vmax та Km цього процесу знаходяться в фізіологічних межах (7,35 та 7,05 відповідно). Крім того, показано, що екамулін активує функціонально неактивну форму протромбіну (ФНФП) - претромбін 1 (Кm=3,5 мкМ; Vmax=0,05 нмоль/хв). Знайдено, що максимальна швидкість процесу розщеплення протромбіну та претромбіну 1 екамуліном досягається вже при концентрації CaCl₂ 0,2 мМ.

Проведений аналіз властивостей екамуліну дозволяє віднести його до групи В активаторів протромбіну з отрути змій (кальцій-залежних металопротеїназ).

Отримання мезотромбіну. Для отримання очищеного мезотромбіну, придатного для використання в модельних системах in vitro, ми застосовували екамулін, оскільки він розщеплює протромбін з утворенням мезотромбіну. Щоб уникнути додаткового етапу очистки мезотромбіну, було використано імобілізований на BrCN-сефарозі препарат екамуліну.

Отримана екамулін-сефароза виявляла здатність до розщеплення протромбіну (рис. 1). Для попередження автолізу мезотромбіну до тромбіну ми використали зворотний інгібітор тромбіну бензамідин у концентрації 0,05мМ.

Отриманий препарат мезотромбіну був стабільним і зберігався в присутності бензамідину за температури -20°С. Препарат мезотромбіну очищали від бензамідину (ex temporo) гель-фільтрацією при температурі 4°С.

Характеристика продуктів розщеплення протромбіну. Основними прокоагулянтними функціями тромбіну, які забезпечуються його ферментативною активністю, є обмежений протеоліз фібриногену з утворенням фібрину, активація фактору ХІІІ зсідання крові, активація тромбоцитів та стимуляція їх агрегації.

Ферментативна активність продуктів розщеплення протромбіну. Серед продуктів розщеплення протромбіну, крім тромбіну, ферментативною активністю володіє проміжний продукт активації протромбіну - мезотромбін. Зокрема, нами показано, що саме мезотромбін, але не претромбін 1, здатен розщеплювати низькомолекулярний тромбін-специфічний субстрат S2238 (рис. 2). Розпізнавання низькомолекулярних субстратів визначається зв'язуванням субстрату лише в активному центрі і, оскільки тромбін та мезотромбін однаково розщеплюють хромогенний субстрат, можна говорити про формування в молекулі мезотромбіну повноцінного, порівняно з тромбіновим, активного центру.

Специфічне зв'язування високомолекулярних білкових субстратів, зокрема фібриногену, є більш складним і визначається взаємодією субстрату з декількома ліганд-зв'язувальними ділянками на поверхні молекули тромбіну (аполярною ділянкою «щілини» активного центру, екзосайтами І та ІІ). В молекулі мезотромбіну екзосайти, ймовірно, не сформовані. Тому взаємодія фібриногену з мезотромбіном є менш афінною, порівняно з тромбіном. Це виявляється в подовженні lag-фази процесу згортання фібриногену за дії мезотромбіну, порівняно з процесом згортання фібриногену за дії тромбіну (рис. 3). Претромбін 1 не розщеплює фібриноген, оскільки в його молекулі активний центр відсутній.

Процес гідролізу фібриногену реєстрували за зміною оптичного поглинання інкубаційного середовища.

В даній модельній системі та надалі автокаталітичне перетворення мезотромбіну в тромбін контролювалось електрофоретично та шляхом контролю фібриногенолітичної активності преінкубованого мезотромбіну в кальційвмісному середовищі за відповідної температури.

Тромбін забезпечує утворення фібринового згустку не лише згортаючи фібриноген, але й активуючи фактор ХІІІ зсідання крові, який каталізує міжмолекулярну прошивку фібринових фібрил. Нами було показано, що мезотромбін здатен активувати фактор ХІІІ зсідання крові (рис. 4), однак є слабкішим активатором фактору ХІІІ зсідання крові порівняно з тромбіном. Активацію фактору ХІІІ зсідання крові реєстрували за ступенем прошивки молекул фібрину.

Слід зазначити, що в процесі активації фактору ХІІІ тромбіном фібрин виступає як кофактор. Отже, відсутність сформованих екзосайтів в молекулі мезотромбіну і, відповідно, його низькоафінна взаємодія з фібрино(гено)м визначає низьку ферментативну активність мезотромбіну по відношенню до фактору ХІІІ зсідання крові.

Відомо [Han J.H., 1997], що мезотромбін не інгібується основним фізіологічним інгібітором тромбіну антитромбіном ІІІ. Тому, ймовірно, що за умов потужного інгібування тромбіну (наприклад, при гепаринотерапії) роль мезотромбіну в формуванні фібринового згустку стає суттєвою.

Роль продуктів розщеплення протромбіну у функціонуванні тромбоцитарної ланки гемостазу. Тромбін - це найбільш потужний фізіологічний активатор тромбоцитів, який вже на перших етапах активації системи зсідання крові в концентрації 0,5-1 нМ викликає зміну форми тромбоцитів, їх адгезію, агрегацію та дегрануляцію. Вплив тромбіну на тромбоцити опосередкований рецепторами родини ПАР (1, 3 та 4 типів) та глікопротеїном Іb (GPІb).

Методом протокової цитометрії нами було проаналізовано зміну розміру та щільності цитоплазми відмитих тромбоцитів людини за дії продуктів розщеплення протромбіну. Зміну розміру, а відтак і форми тромбоцитів, фіксували за зміною прямого світлорозсіювання, а зміну щільності цитоплазми, яка визначається гранулярністю тромбоцитів, фіксували за зміною бічного світлорозсіювання. Оскільки в процесі активації тромбоцитів відбувається поступова зміна їх форми з дископодібної до сферичної з утворенням псевдоподій, а також вивільнення вмісту цитоплазматичних гранул, такі параметри як розмір та гранулярність тромбоцитів добре характеризують їх функціональний стан.

Було показано, що мезотромбін та претромбін 1 не викликають зміни розміру та форми відмитих тромбоцитів людини (рис. 5). Таким чином, хоча мезотромбін і має сформований активний центр та здатен зв'язуватись з фосфоліпідними мембранами, він не викликає активацію тромбоцитів. Ми припускаємо що, це пов'язано з конкуренцією тромбоцитарних мембран з ПАР-1 за зв'язування з мезотромбіном.

Поряд з цим, коли в популяції відмитих тромбоцитів в значній кількості (30-50%) є попередньо активовані тромбоцити, то нативні тромбоцити цієї популяції стають чутливими до впливу мезотромбіну. Нами було показано, що в такій модельній системі відмиті тромбоцити людини змінюють розмір та гранулярність за присутності мезотромбіну (рис. 6), однак чутливість до дії тромбіну у таких тромбоцитів все ж залишається вищою. Претромбін 1 не активує тромбоцити за таких умов. Слід зазначити, що частково активовані тромбоцити присутні в місці активації системи зсідання крові - в місці пошкодження судини - і взаємодіють з активованим ендотелієм. Крім того, сенсибілізованими є «молоді» тромбоцити.

В іншій модельній системі на ЗТПК людини, де містяться всі компоненти плазми крові, нами було показано, що мезотромбін обумовлює незначну, порівняно з тромбін-індукованою, агрегацію тромбоцитів. Претромбін 1 агрегацію тромбоцитів не викликає. Процес агрегації тромбоцитів під впливом мезотромбіну є концентраційно залежним (рис. 7).

Тромбін викликає швидку активацію та дегрануляцію тромбоцитів, що призводить до необоротної агрегації (рис. 8). Однак мезотромбін, навіть при високій концентрації (0,29 мкМ), викликає оборотну агрегацію тромбоцитів (І хвиля агрегації), в результаті якої з тромбоцитарних гранул вивільняються індуктори агрегації тромбоцитів, що забезпечує подальшу необоротну агрегацію тромбоцитів (ІІ хвиля) (рис. 8).

На ЗТПК людини нами показано, що мезотромбін та претромбін 1 модулюють колаген-, ADP- та адреналін-індуковану агрегацію тромбоцитів.

Колаген-індукована агрегація тромбоцитів в дослідженнях in vitro, насамперед, дає змогу оцінити процес вивільнення вмісту тромбоцитарних гранул, оскільки цей тип агрегації є вторинним і відображає другу фазу агрегації - фазу секреції. Для неї характерна lag-фаза, що відповідає процесу активації фосфоліпази С. Дослідження ADP- та адреналін-індукованої агрегації тромбоцитів характеризує первинну та вторинну агрегацію тромбоцитів.

Для дослідження впливу мезотромбіну на індуковану агрегацію тромбоцитів ми використали мезотромбін у такій концентрації, яка не викликала агрегації тромбоцитів - 90 нМ. Нами було показано, що мезотромбін підсилює індуковану агрегацію тромбоцитів у такий спосіб (рис. 9):

- скорочує lag-фазу колаген-індукованої агрегації тромбоцитів в 3,4 рази, не впливаючи на ступінь агрегації тромбоцитів;

- посилює ступінь першої хвилі ADP-індукованої агрегації тромбоцитів в 1,5 раза, не впливаючи на швидкість ADP-індукованої агрегації, тобто швидкість утворення тромбоцитарних агрегатів;

- посилює першу хвилю адреналін-індукованої агрегації тромбоцитів в 1,8 раза та збільшує її швидкість в 2,1 раза, сприяючи чіткому відособленню першої хвилі агрегації та не впливаючи на ступінь другої хвилі агрегації.

Мезотромбін посилює первинний вплив адреналіну подібно до тромбіну, який синергічно збільшує ефективність дії адреналіну як при активації тромбоцитів, так і в інших процесах судинного гемостазу.

В той самий час претромбін 1 дозозалежно пригнічує індуковану агрегацію тромбоцитів (рис. 10).

Претромбін 1 подовжує lag-фазу колаген-індукованої агрегації тромбоцитів (рис. 10, А), а час та швидкість колаген-індукованої агрегації тромбоцитів за дії претромбіну 1 залишаються практичноно не змінними. Оскільки початкове зв'язування колагену з тромбоцитами забезпечується глікопротеїдним комплексом GPIb-V-IX, а GPIb-опосередкований механізм активації тромбоцитів тромбіном передбачає можливість зв'язування ферментативно неактивного тромбіну з рецептором, ми припускаємо, що претромбін 1 пригнічуює колаген-індуковану агрегацію тромбоцитів, конкуруючи з колагеном за GPIb на поверхні цих клітин.

Крім того, претромбін 1 знижує швидкість ADP-індукованої агрегації тромбоцитів, сприяє вичленовуванню першої хвилі ADP-індукованої агрегації та зменшенню швидкості агрегації (рис. 10, Б). Тобто претромбін 1 сповільнює утворення агрегатів тромбоцитів на першій стадії ADP-індукованої агрегації.

На ЗТПК нами було показано, що претромбін 1 ефективно пригнічує адреналін-індуковану агрегацію тромбоцитів, зменшуючи першу та другу хвилі агрегації чи повністю нівелюючи адреналіновий сигнал (рис. 10, В).

Слід зазначити, що інгібування аденілатциклази, опосередковане як пурино- так і адрено-рецепторами, пригнічується факторами, які активують cGМP-залежну протеїнкіназу (протеїнкіназу G). При зв'язуванні з тромбіном GPIb опосередковує активацію кальцій-фосфоінозитольного каскаду, який може приводити до активації гуанілатциклази, а відтак, до появи cGМP. Тому в основі інгібуючого ефекту претромбіну 1 на адреналін- та ADP-індуковану агрегацію тромбоцитів може лежати активація протеїнкінази G.

На основі отриманих нами даних можна запропонувати схему впливу мезотромбіну та претромбіну 1 на активацію та агрегацію тромбоцитів, яка представленна на рис. 11. Отже дія мезотромбіну та претромбіну 1 на тромбоцити є різноспрямованою: мезотромбін сприяє залученню «нових» тромбоцитів до процесу тромбоутворення; претромбін 1 пригнічує хвилю зсідання, інгібуючи вторинну агрегацію тромбоцитів (рис. 11).

Претромбін 1 з'являється в кровотоці за умов активації системи зсідання крові, оскільки його утворення є одним із механізмів негативної зворотної регуляції цієї системи, який забезпечує переривання каскаду зсідання. З огляду на отримані дані, можна говорити про здійснення претромбіном 1 негативної зворотної регуляції не лише в плазменному, але й в тромбоцитарному гемостазі (рис. 11).

Метод виявлення функціонально неактивних форм протромбіну (ФНФП) в плазмі крові. Для розробки методу виявлення ФНФП нами було створено модельні системи in vitro з використанням очищених препаратів протромбіну, претромбіну 1, плазми крові донорів, плазми крові, збідненої на вітамін К-залежні фактори зсідання крові та активаторів протромбіну - екамуліну та тромбопластину. Було показано, що екамулін активує в плазмі крові донорів не лише протромбін, а й ФНФП (претромбін 1) з утворенням функціонально активного продукту, що може фіксуватись в тестах лабораторної діагностики за розщепленням хромогенного субстрату S2238 або згортанням фібриногену (рис. 12, 13). Натомість тромбопластин активує лише функціонально активний протромбін. Тому оцінка результатів тромбопластинового та екамулінового тестів дає змогу виявляти ФНФП.

Крім того було показано, що використання хромогенного субстрату S2238 дає змогу визначати рівень протромбіну в цих тестах як за умов гепаринотерапії низькомолекулярними та нефракціонованими гепаринами, так і за умов накопичення інгібіторів системи зсідання крові.

Результати протромбінового та екамулінового тестів було запропоновано виражати у вигляді протромбінового (ПВ) та екамулінового (ЕВ) відношень:

ПВ = (А_д/А_п)^МІЧ(1),

ЕВ = А_д/А_п(2),

де:А_п - амідолітична активність тромбіну плазми крові пацієнта за дії тромбопластину (1) та екамуліну (2);

А_д - амідолітична активність тромбіну плазми крові донора за дії тромбопластину (1) та екамуліну (2);

МІЧ - Міжнародний Індекс Чутливості препарату тромбопластину.

Виявлення активації системи зсідання крові з використанням екамуліну. Описаний вище спосіб виявлення ФНФП було використано для виявлення тромбофілії за системного червоного вовчака (СЧВ). Для виявлення ФНФП в плазмі крові розраховували співвідношення між ЕВ та ПВ. Якщо отримане числове значення дорівнює 1,2 або вище, - це свідчить про накопичення ФНФП в плазмі крові.

При аналізі стану системи гемостазу хворих на СЧВ (n=196), нами виявлено, що у 36% всіх хворих накопичуються ФНФП. Присутність ФНФП корелює зі зниженням активності протеїну С (компоненту антикоагулянтної ланки гемостазу) та наявністю маркерів активації системи зсідання крові (накопиченням розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК), високим вмістом фібриногену (понад 3,5 г/л), скороченням часу зсідання плазми крові в тесті «Активований частково тромбопластиновий час» (менше 43 с)).

Аналіз стану системи гемостазу хворих на СЧВ показав, що у хворих із індексом ушкоджень вище середнього зростають частота виявлення ФНФП та середній рівень ФНФП в плазмі крові. Крім того, виявилось, що між рівнем ФНФП в плазмі крові хворих на СЧВ і активністю захворювання та індексом ушкоджень є позитивна кореляція (r=0,22 та 0,21 відповідно при р?0,05, n=191). В той же час загальноприйнятий маркер активації системи зсідання крові РФМК корелював лише з індексом ушкоджень (r=0,20 при р?0,05, n=191).

Виявлення PIVKA-протромбіну для моніторингу лікування антикоагулянтами непрямої дії. До ФНФП, поряд з претромбіном 1, належить PIVKA-протромбін, який з'являється внаслідок порушення пост-трансляційного карбоксилювання Гла-доменів протромбіну, зокрема внаслідок лікування антикоагулянтами непрямої дії (АНД), які широко використовуються в клінічній практиці для профілактики тромбозів. Гла-домен PIVKA-протромбіну, на відміну від нормального протромбіну, є некарбоксильованим, тому PIVKA-протромбін не здатен зв'язуватись з мембранами та, відповідно, не активується протромбіназним комплексом.

Загальний рівень протромбіну в плазмі крові здорової людини може коливатись в межах 90 - 110% відносно норми (пул плазми крові донорів). Тому при контролі ефективності лікування АНД рівень PIVKA-протромбіну, який з'являється в результаті лікування пацієнта, слід визначати виходячи з загального рівня протромбіну, наявного у даного пацієнта, а не середнього нормального рівня протромбіну.

Ми проаналізували систему гемостазу хворих з серцево-судинними захворюваннями (n=26), яким проводили профілактику тромбоутворення препаратами АНД. На рис. 14 представлено дані протромбінового та екамулінового відношень плазми крові цих хворих.

Для хворих 1-11 (рис. 14, А) характерне зниження ПВ на 30-50% порівняно з нормою, однак відносно загального рівня протромбіну в плазмі крові цих хворих накопичення PIVKA-протромбіну значно відрізняється: у хворих 1-4 рівень PIVKA-протромбіну складає 17-37%, а у хворих 5-11 - 45-70%. Таким чином, прокоагулянтний потенціал хворих 1-4 в результаті терапії АНД знижений недостатньо. Для зменшення ризику тромбоутворення цим пацієнтам слід підвищити дозу АНД під суворим лабораторним контролем. Рівень PIVKA-протромбіну у хворих 5-11 свідчить про ефективну антикоагулянтну терапію АНД.

У хворих 12-15 (рис. 14 Б) ФНФП не виявлено (ПВ = ЕВ), що свідчить про толерантність організму до препаратів АНД. Таким пацієнтам слід або підвищувати дозу АНД, суворо контролюючи появу PIVKA-протромбіну, або замінити АНД іншими антикоагулянтами.

В ряді випадків (рис. 14, В) ми спостерігали значне зниження ПВ, що було пов'язано як з підвищеною чутливістю організму до АНД (хворі 15-18), так і з вихідно низьким рівнем протромбіну в плазмі крові пацієнта (хворі 19-22). Для пацієнтів 15-18 незначне зниження дози АНД обумовить ефективну та безпечну антикоагулянтну терапію, тоді як, пацієнтам 19-22 слід припинити терапію АНД внаслідок високого ризику кровотеч і провести додаткове дослідження стану системи гемостазу для виявлення причин зниження загального рівня протромбіну.

Інформативність описаного підходу була також підтверджена порівняльним аналізом вмісту PIVKA-протромбіну під час лікування АНД та після зниження дози препаратів. Отже, використання екамулінового тесту дозволяє визначати ефективну дозу АНД, враховуючи індивідуальні особливості організму хворого, а також контролювати накопичення PIVKA-протромбіну впродовж всього курсу лікування.

Таким чином, вивчення властивостей похідних протромбіну необхідне не лише для розуміння шляхів регуляції системи гемостазу, зокрема її коагуляційної ланки, але і для розробки методів діагностики стану цієї системи.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у з'ясуванні функціональної ролі похідних протромбіну в процесі формування тромбоцитарного та фібринового тромбу та розроблено спосіб виявлення похідних протромбіну в плазмі крові.

2. Оптимізовано препаративний метод виділення та очистки активатора протромбіну з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) - екамуліну. Встановлено його належність до класу В активаторів протромбіну з отрути змій (Са²⁺-залежних металопротеїназ). Вивчено кінетику активації протромбіну та претромбіну 1 екамуліном (Кm=3,4 та 3,5 мкМ; Vmax=0,23 та 0,05 нмоль/хв відповідно).

3. Запропоновано метод отримання мезотромбіну, який полягає в активації протромбіну іммобілізованим екамуліном за присутності бензамідину.

4. Вперше показано, що мезотромбін активує фактор ХІІІ зсідання крові. Підтверджено, що ефективність згортання мезотромбіном фібриногену менша порівнянно з тромбіном, тоді як претромбін 1 на формування фібринового згустку не впливає.

5. Вперше показано, що мезотромбін сприяє залученню нових тромбоцитів до процесу тромбоутворення в популяції частково активованих відмитих тромбоцитів людини та в збагаченій тромбоцитами плазмі крові людини. Встановлено, що, мезотромбін стимулює, а претромбін 1 пригнічує колаген-, АDP- та адреналін-індуковану агрегацію тромбоцитів.

6. Розроблено діагностичний тест на основі екамуліну для визначення загального рівня протромбіну та його функціонально неактивних форм в плазмі крові. Запропонований тест є придатним за умов гепаринотерапії та при накопиченні інгібіторів зсідання в плазмі крові. Встановлено, що виявлення претромбіну 1 є маркером тромбофілії за системного червоного вовчака.

7. Встановлено, що запропонований діагностичний тест дозволяє підібрати індивідуальну дозу антикоагулянтів непрямої дії для кожного окремого пацієнта та контролювати ефективність терапії, що проводиться.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корольова Д. С. Використання екамуліну - активатора протромбіну із отрути ефи багатолускової в клінічній лабораторній діагностиці / Д. С. Корольова, Р. П. Виноградова, Т. М. Чернишенко, Т. М. Платонова, Г. Л. Волков // Лабораторна діагностика. - 2006. - Т. 37, № 3. - С. 18-22. (Особистий внесок здобувача - розробка модельних систем для створення тесту лабораторної діагностики з використанням екамуліну).

2. Корольова Д. С. Вплив гепарину на показники тестів протромбінового та екамулінового часу / Д. С. Корольова, В. О. Чернишенко, Т. М. Платонова // Лабораторна діагностика. - 2006. - Т. 38, № 4. - С. 22-26. (Особистий внесок здобувача - розробка модельних систем для визначення чутливості тестів екамуліновий та протромбіновий час до гепаринів).

3. Корольова Д. С. Тромбопластин та його використання у клінічній лабораторній діагностиці / Д. С. Корольова, В. О. Чернишенко, Т. М. Платонова // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2007. - Т. 4, № 40. - С. 65-71. (Особистий внесок здобувача - аналіз стану системи гемостазу за гострого інфаркту міокарду).

4. Корольова Д. С. Дослідження впливу гепарину на процес активації протромбіну екзогенними активаторами / Д. С. Корольова // Укр. біохім. журнал. - 2006. - Т. 78, № 6. - С. 139.

5. Корольова Д. С. Використання екзогенних активаторів протромбіну у тест-системах лабораторної діагностики / Д. С. Корольова // ІХ Український біохімічний з'їзд: 24-27 жовтня, 2006 р.: Збірник тез, том 2. - Х., 2006. - С. 199.

6. Корольова Д. С. Процес активації протромбіну людини активатором із отрути ефи багатолускової / Д. С. Корольова // Молодь та поступ біології: ІІІ Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів, 23-27 квітня 2007 р.: збірник тез. - Л., 2007. - С. 66-67.

7. Королева Д. С. Активация протромбина активатором из яда эфы многочешуйчатой / Д. С. Королева, Т. Н. Платонова // Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки: Международная конференция, 25-26 октября 2007 г.: тезисы докладов. - Минск, 2007. - С. 15-16.

8. Корольова Д. С. Вплив антитіл, що накопичуються за розвитку системного червоного вовчаку, на процес активації та агрегації тромбоцитів / Д. С. Корольова // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, № 4. - С. 162.

9. Korolova D. Echis multisquamatis venom enzymes acting on haemostasis / Volodymyr Chernyshenko, Dar'ya Korolova // Bridges in Life Sciences: Second Annual Review of the Regional Cooperation for Health, Science and Technology Consortium, 4 october, 2008: theses of report. - Zagreb, 2008. - Р. 37.

10. Корольова Д. С. Роль продуктів розщеплення протромбіну в функціонуванні тромбоцитарного гемостазу / Д. С. Корольова, Т. М. Платонова // Молодь та поступ біології: V Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів, 12-15 травня 2009 р.: збірник тез. - Л., 2009. - С. 43-44.

АНОТАЦІЯ

Корольова Д.С. Похідні протромбіну та їх роль у функціонуванні коагуляційної ланки гемостазу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Досліджено роль похідних протромбіну (мезотромбіну та претромбіну 1) в процесах формування фібринового та тромбоцитарного тромбів.

Розроблено метод отримання мезотромбіну, придатного для використання в модельних системах in vitro.

Показано, що мезотромбін сприяє формуванню фібринової сітки, згортаючи фібриноген та активуючи фактор ХІІІ зсідання крові. Методом протокової цитометрії показано, що в популяції механічно стимульованих до активації тромбоцитів мезотромбін, але не претромбін 1, виявляє себе як потужний активатор тромбоцитів. З'ясовано, що ці похідні протромбіну модулюють АDР-, колаген- та адреналін-індуковану агрегацію тромбоцитів. Мезотромбін скорочує lag-фазу колаген-індукованої агрегації тромбоцитів та збільшує ступінь ADP- та адреналін-індукованої агрегації тромбоцитів. Претромбін 1 пригнічує індуковану агрегацію тромбоцитів і не впливає на процес їх дегрануляції.

Розроблено діагностичний тест на основі екамуліну (активатора протромбіну з отрути Echis multisquamatis) для визначення загального рівня протромбіну та його функціонально неактивних форм (претромбіну 1 та PIVKA-протромбіну) в плазмі крові. Показано, що виявлення претромбіну 1 є маркером тромбофілії за системного червоного вовчаку. Запропонований діагностичний тест дозволяє підібрати індивідуальну дозу антикоагулянтів непрямої дії для кожного окремого пацієнта та контролювати ефективність терапії, що проводиться.

Отже, дослідження похідних протромбіну надає інформацію для з'ясування шляхів регуляції системи гемостазу і для розробки методів діагностики стану цієї системи.

Ключові слова: протромбін, мезотромбін, претромбін 1, тромбоцит, екамулін, тромбофілія, PIVKA, антикоагулянти непрямої дії.

АННОТАЦИЯ

Королева Д.С. Производные протромбина и их роль в функционировании коагуляционного звена гемостаза. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена проблеме регуляции системы гемостаза, в частности ее коагуляционного звена. В работе исследована роль таких производных протромбина как мезотромбин и претромбин 1 в формировании фибринового и тромбоцитарного тромбов.

На первом этапе работы разработан метод получения препарата мезотромбина для использования в модельных системах in vitro. Метод основан на использовании бензамидина (ингибитора автолиза мезотромбина) и активатора протромбина из яда эфы многочешуйчатой (Echis multisquamatis) экамулина.

В модельных системах с использованием очищенных белков показано, что мезотромбин сворачивает фибриноген и активирует фактор ХІІІ свертывания крови, способствуя, таким образом, формированию трехмерной фибриновой сети. Поскольку мезотромбин не ингибируется основным физиологическим ингибитором тромбина - комплексом антитромбин ІІІ-гепарин - в условиях гепаринотерапии роль мезотромбина в формировании фибринового сгустка, вероятно, является существенной. Претромбин 1 не принимает участия в свертывании фибриногена.

Методом проточной цитометрии показано, что в популяции частично активированных тромбоцитов мезотромбин, но не претромбин 1, проявляет себя в качестве мощного активатора тромбоцитов. Однако, мезотромбин и претромбин 1 не способны активировать интактные отмытые тромбоциты.

На другой модельной системе с использованием обогащенной тромбоцитами плазмы крови показано, что мезотромбин дозозависимо вызывает обратимую агрегацию тромбоцитов, однако он значительно менее эффективный индуктор агрегации по сравнению с тромбином. Претромбин 1 агрегации тромбоцитов не вызывает. В тоже время эти производные протромбина модулируют индуцированную агрегацию тромбоцитов и их влияние разнонаправлено. Мезотромбин (в концентрации, которая не вызывает агрегации тромбоцитов) стимулирует индуцированную агрегацию тромбоцитов, сокращая lag-период коллаген-, увеличивая степень ADP-, а также степень и скорость адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Претромбин 1, напротив, дозозависимо угнетает индуцированную агрегацию тромбоцитов, удлиняя lag-период коллаген-индуцированной, снижая степень первой волны ADP- и адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов или даже полностью нивелируя действие адреналина. Таким образом, мезотромбин вовлекает «новые» тромбоциты в процесс тромбообразования. Претромбин 1, который образовывается в результате регуляции каскада свертывания по механизму негативной обратной связи, угнетает не только плазменный, но и клеточный гемостаз.

В работе разработан метод выявления функционально неактивных форм протромбина (ФНФП) (претромбина 1 и PIVKA-протромбина) в плазме крови. В основе метода - определение общего уровня протромбина по результатам экамулинового теста и уровня функционально активного протромбина по результатам тромбопластинового теста. Показано, что выявление ФНФП в плазме крови является информативным маркером тромбофилии при системной красной волчанке, наряду с появлением маркеров активации системы свертывания крови (накоплением растворимых фибрин-мономерных комплексов, сокращением времени свертывания плазмы крови в тесте «Активированное частично тромбопластиновое время», возрастанием уровня фибриногена, падением активности протеина С) и коррелирует с активностью заболевания и индексом повреждений. Показано, что определение в плазме крови уровня PIVKA-протромбина обеспечивает подбор эффективной дозы антикоагулянтов непрямого действия и контроль эффективности антикоагулянтной терапии.

Таким образом, изучение свойств производных протромбина необходимо как для понимания путей регуляции функционирования системы гемостаза, в частности ее коагуляционного звена, так и для разработки методов диагностики состояния этой системы.

Ключевые слова: протромбин, мезотромбин, претромбин 1, тромбоцит, экамулин, тромбофилия, PIVKA, антикоагулянты непрямого действия.

ANNOTATION

Korolova D.S. Prothrombin derivatives and their role in coagulant haemostasis functioning. - A manuscript.

Dissertation for the candidate biological sciences degree in speciality 03.00.04 - biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2009.

Role of prothrombin derivatives (meizothrombin and prethrombin 1) in the fibrin and platelet clot formation process has been studied.

Method of meizothrombin production that is suitable for use in model systems in vitro was developed.

Meizothrombin is shown to promote fibrin network by fibrinogen coagulation and clotting factor XIII activation. It is shown by flow cytometry that meizothrombin but not prethrombin 1 is strong platelet activator in population of platelets mechanically stimulated for activation. These prothrombin derivatives are found to modulate АDР-, collagen- and adrenalin-induced platelet aggregation. Meizothrombin reduces lag-phase of collagen-induced platelet aggregation and increases rate of АDР- and adrenalin-induced platelet aggregation. Prethrombin 1 reduces induced platelet aggregation and doesn't influence on their degranulation process.

Diagnostic test based on ecamulin (prothrombin activator from Echis multisquamatis venom) for detection of total prothrombin level and its functionally inactive forms (prethrombin 1 and PIVKA-prothrombin) in blood plasma is worked out. It is shown that prethrombin 1 detection could be thrombophilia a marker during systemic lupus erythematosus. Proposed diagnostic test permits to select individual dosage of oral anticoagulants for each certain patient and control efficiency of provided treatment.

Thus, investigation of prothrombin derivatives gives information for clearing up pathway of hemostasis system regulation and for developing of this system state diagnostics methods.

Key words: prothrombin, meizothrombin, prethrombin 1, platelet, ecamulin, thrombophilia, PIVKA, oral anticoagulants.

Размещено на Allbest.ru

...