Молекулярно-генетичний аналіз нейродегенеративних мутацій Drosophila melanogaster, локалізованих в Х-хромосомі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа «Науковий центр радіаційної медицини АМН України»

УДК 575.24: 577.7: 591.481.1

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Молекулярно-генетичний аналіз нейродегенеративних мутацій Drosophila melanogaster, локалізованих в Х-хромосомі

03.00.15 - генетика

Матійців Наталія Петрівна

Київ 2009

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Важливим є дослідження процесів нейродегенерації, їх молекулярної та генетичної природи. Зниження надійності механізмів регуляції метаболічних процесів і адаптивних можливостей організму під час старіння створюють умови для розвитку вікових патологій, таких як хвороба Альцгеймера, Паркінсона, Гентінгтона, аміотрофічного бокового склерозу, атаксійні синдроми, пріонові захворювання та ін, які призводять до фізичних, розумових розладів та смерті. Оскільки в основі зазначених патологічних станів лежать нейродегенеративні процеси, важливим є вивчення їхньої молекулярної та генетичної природи. Досягнуто значного прогресу у виявленні, як генетичних факторів, так і факторів зовнішнього середовища, що задіяні в етіології нейродегенеративних патологій (Becker et al., 1991; Collinge et al., 2005; Kanazawa, 2001). Але незважаючи на це, досі невідомі молекулярно-генетичні механізми розвитку цих захворювань.

Праці останнього десятиліття доводять, що модельний об'єкт Drosophila melanogaster успішно може використовуватись для дослідження таких актуальних питань, як молекулярні основи нейродегенерації, генетичні аспекти вікових змін, формування та функціонування структур центральної нервової системи (Mutsuddi et al., 1999; Wittmann et al., 2001; Kretzschmar, 2005). Вибір та успішність використання дрозофіли у вирішенні таких проблем пояснюється рядом переваг цього безхребетного організму (Greenspan, 2000): короткий життєвий цикл, добре відомі анатомічні характеристики та особливості розвитку, а також секвенований геном. Дрозофіла була одним з перших об'єктів дослідження, до якого застосували індукований мутагенез, накопичені експериментальні дані полегшують проведення спрямованої індукції мутацій зараз. Наразі описано близько двадцяти нейродегенеративних мутантів D.melanogaster (Kretzschmar, 2005), характеристика яких виявила участь у розвитку дегенеративних змін багатьох клітинних процесів. Деякі з описаних генів вказаних мутантів дрозофіли є ортологами генів захворювань людини, а патологічні зміни в структурі мозку за морфологічними, біохімічними та функціональними характеристиками подібні до таких у хворих людей. Так, у мутанта дрозофіли eggroll спостерігаються щільні багатошарові утворення в мозку, які нагадують структури, що формуються при хворобах ліпідного накопичення, таких, як хвороба Тея-Сакса (Min et al., 1997); для мутантів sws характерне надлишкове обгортання нейронів клітинами глії, що призводить до нейродегенерації, подібно до випадку деяких спадкових нейропатій людини (Mьhlig-Versen et al., 2005).

Нещодавні дослідження (Annika et al., 2004; Cha et al., 2005; Chen et al., 2007) особливо успішними були в розкритті етіології хвороби Паркінсона. Описано більше шести генів, які зумовлюють сімейні форми захворювання, та основною патологічною зміною в мозку названо відмирання дофамінергічних нейронів в чорній субстанції та смугастому тілі середнього мозку (стріатуму). Функції нейротрансмітера дофаміна є еволюційно консервативними у нервовій системі багатьох видів, зокрема, у дрозофіли та ссавців (Whitworth et al., 2006). Це підтверджує, що дрозофіла є також вдалою моделлю для вивчення стану дофамінергічної системи в процесі нейродегенерації.

Таким чином, пошук та характеристика нових нейродегенеративних мутантів, разом із пошуком гомологічних генів у інших видів, морфологічних та функціональних змін мозку хребетних та безхребетних сприятимуть значному поступу у розумінні молекулярних основ нейродегенеративних захворювань людини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Дисертаційна робота Матійців Н.П. виконана в рамках наукових досліджень, які проводилися на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка згідно тематик Міністерства освіти і науки України та ДКНТ України: «Молекулярно-генетичні механізми нейро- та міопатій при впливі ряду лікарських препаратів та генотоксикологічна оцінка дії екстремальних факторів довкілля на мінливість геномів» (№ державної реєстрації 0106U005908). Дослідження були підтримані індивідуальними міжнародними грантами WUBMRC та INTAS для молодих науковців «D. melanogaster як модель нейродегенеративних розладів».

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було провести генетичний аналіз індукованих етилметансульфонатом нейродегенеративних мутацій, встановити їх молекулярну природу та дослідити функціональний характер морфологічних змін у мозку мутантів D.melanogaster.

Для вирішення цієї проблеми нами були поставлені наступні завдання:

1. Шляхом індукованого мутагенезу отримати мутантів із структурними змінами у тканині мозку.

2. Провести комплементаційний аналіз одержаних мутацій та здійснити їхнє картування на Х-хромосомі.

3. Проаналізувати показники тривалості життя та динаміку появи нейродегенеративних змін у мутантів.

4. Встановити гени кандидати відповідних нейродегенеративних мутацій, провести їхнє клонування та секвенування.

5. Дослідити функціональний характер морфологічних змін у мозку нейродегенеративних мутантів D.melanogaster.

Об'єкт дослідження. Індукція мутацій; нейродегенеративні зміни у мозку; тривалість життя у індукованих мутантів; гени та їх продукти, що зумовлюють формування нейродегенерації.

Предмет дослідження. Мутації, що спричиняють нейродегенеративні зміни у мозку D.melanogaster та їхнє картування; функціональні та морфологічні зміни, що супроводжують нейродегенерацію.

Методи дослідження. Генетичні (індукований мутагенез, гібридологічний аналіз), гістологічні (виготовлення та фарбування гістологічних зрізів тканини головного мозку, імунологічна детекція), генно-інженерні (виділення сумарної РНК, синтез кДНК, полімеразна ланцюгова реакція, гель-електрофорез ДНК, генетична трансформація клітин Escherichia coli), метод побудови кривих виживання, методи математичного аналізу отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Створено колекцію Х-зчеплених мутантів D.melanogaster із нейродегенеративними змінами мозку. Показано, що ступінь зниження життєздатності, вік появи нейродегенерації та її характер є відмінним у особин різних ліній та визначається генетично. Картування мутацій на Х-хромосомі та аналіз бази даних FlyBase підтвердило унікальність деяких ліній колекції. Одержано чотири лінії, що несуть мутацію в гені sws. Ідентифіковано раніше невідому алельну форму гена sws, яка характеризується домінантним проявом по відношенню до інших відомих мутацій в гені, однак рецесивною щодо гену дикого типу. Вперше показано, що мутації гена sws здатні спричиняти віковозалежну дегенерацію дофамінергічних нейронів мозку.

Практичне значення одержаних результатів. Робота, головно, присвячена вивченню та вирішенню фундаментальних проблем нейродегенерації, її генетичної, функціональної та морфологічної складових. Ген sws D.melanogaster є відомим ортологом генів хребетних, зокрема НІЕ людини, що задіяні у формуванні нейропатій, природа яких ще не цілком зрозуміла (Mьhlig-Versen et al., 2005). Тому виявлення нової мутантної форми гена sws, яка, імовірно, зумовлює дефект у регуляторній ділянці білкового продукту, відкриває нові перспективи у дослідженні генетичних та молекулярних механізмів розвитку нейродегенерації клітин тканини мозку.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно підготовлено огляд літератури та виконано весь обсяг експериментальних досліджень. Розробка програми вирішення завдань, аналіз та інтерпретація результатів проведені спільно з науковим керівником к.б.н., доцентом Максимів Д.В., а також із професором К. Самаковлісом (Christos Samakovlis) та доцентом Р. Кантерою (Rafael Cantera) під час стажування в Стокгольмському університеті (Швеція). Дисертантом самостійно виконано підготовку та подання матеріалів до друку у фахових наукових журналах та написано текст дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати дисертаційної роботи доповідались на наукових конференціях (2003 - 2008 рр.) та звітних наукових конференціях викладачів та співробітників біологічного факультету (2003 - 2007 рр.), наукових семінарах кафедри генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка та відділу біології розвитку Стокгольмського університету (2005, 2006, 2007 р.р). Матеріали роботи були представлені на конференціях молодих вчених з молекулярної біології і генетики (Київ, 2003, 2007), І Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Всеросійській конференції молодих вчених “Физиология и медицина” (Санкт-Петербург, 2005), 46-й науковій конференції з досліджень на дрозофілі (Сан Дієго, 2005), ІІ та ІІІ конференції молодих науковців «Розмаїття живого. Екологія. Еволюція. Адаптація» (Одеса, 2005, 2007), ІІ , ІІІ та IV міжнародних наукових конференціях студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2006, 2007, 2008), І Міжнародній конференції «Дрозофіла в експериментальній генетиці та біології» (Харків, 2008).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 7 статей (з них 6 у фахових виданнях ВАКу) та 11 тез доповідей у матеріалах з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень та їхнього обговорення, висновків, списку використаних джерел (150 найменувань). Роботу викладено на 135 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 28 рисунками і 9 таблицями.

Основний зміст

Матеріали та методи досліджень. Матеріалом для проведення мутагенезу служила лінія дикого типу Oregon R з ізогенізованими хромосомами. Для індукції мутагенезу методом личинкового згодовування використовували хімічний мутаген етилметансульфонат (ЕМС) у різних концентраціях (2,5мМ, 25мМ, 50 мМ, 75 мМ, 100 мМ, 125 мМ і 250 мМ), розведений в 1% розчині глюкози, контролем слугував 1% розчин глюкози (Ashburner., 1989).

Для обліку видимих Х-зчеплених мутацій використовували самок тестерної лінії із зчепленими Х-хромосомами C(1)DX, y f. Визначення рецисивного та домінантного характеру мутацій здійснювали шляхом схрещування мутантних особин з особинами лінії дикого типу. Комплементаційний аналіз було проведено, схрещуючи мутантні лінії між собою. Для цитологічного картування використовували делеційні лінії, отримані з Bloomington Drosophila Stock Center (США): 949 Df(1)C128/FM6; 948 Df(1)ct-J4,In(1)dl-49; f(1)/C(1)DX,y(1)w(1)f(1)Dp(1;3)sn(13a1); 950 Df(1)RA1/FM7c1; 998 Df(1) RK2 /FM7a; 1329 Df(1)BA1, w(*) / FM7a; Dp(1;2)E1, y(+) / +.

Виготовлення гістологічних парафінових зрізів мозку мух проводили згідно Хайзенберга та Боля (Heisenberg et al., 1979). Ядерне і дифузне фарбування гістологічних зрізів здійснювали відповідно методиці (Heisenberg et al., 1979). Препарати аналізували на мікроскопі Laboval-3 Carl Zеiss Jena при збільшенні 15х40. Тканину мозку для імунохімічної детекції in situ препарували методом whole-mount або виготовляли заморожені зрізи (Nassel et al., 1992). У роботі використали моноклональні первинні антитіла anti-TH і 22С10 та вторинні антитіла Су2 Alexa 488. Аналіз препаратів проводили на лазерному конфокальному мікроскопі Carl Zeiss Axiovert 100M при збільшенні 15х40, та з використанням комп'ютерної програми Carl Zeiss LSM Image. На основі аналізу кривих виживання визначали показники середньої та максимальної тривалості життя (Ashburner., 1989).

Шляхом зворотньої транскрипції з сумарної РНК здійснювали синтез кДНК, яка слугувала матрицею для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Ausubel., 1990). Продукти ПЛР лігували у вектор pGEM-T-easy та клонували у клітинах E. coli DH5б. Селекцію клонів проводили на середовищі з X-gal, IPTG та ампіціліном. Білі колонії перевіряли на наявність вставки аналітичною рестрикцією з використанням Sac I i Sac II. Електрофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію та ферментативну обробку фрагментів ДНК виконували за (Sambrook et al., 2001).

Результати та обговорення. Одержання Х-зчепленних нейродегенеративних мутантів D. melanogaster та їхня характеристика. Вивчення нейродегенеративних хвороб людини ускладнюється тим, що зразки тканин на різних стадіях, особливо на початку перебігу хвороби, отримати важко, ще складніше дослідити молекулярно-генетичну природу цих змін. Еволюційно високо організована нервова система, короткий період генерації, можливість протягом нетривалого часу провести пошук нових мутацій, наявність багатьох генів ортологів людини доводять доцільність пошуку та вивчення генетично зумовленої дегенерації мозку у D. melanogaster. Для отримання нових мутацій, які б приводили до появи змін у тканині мозку, ми використали хімічний мутаген ЕМС у різних концентраціях та одержано 31 мутанта із змінами у тканині мозку. Було виявлено, що дві лінії несуть домінантні мутації (лінії 67-2 та 71-21), а у всіх інших ліній нейродегенерація зумовлена рецесивними мутаціями. За результатами комплементаційного аналізу мутантів зі змінами у структурі головного мозку було розділено на 4 комплементаційні групи. При цьому фенотип тканини мозку особин першої та другої груп комплементації мали sws - подібний фенотип. Певну особливість у комплементаційних схрещуваннях проявила лінія 76-15, яку ми не віднесли до жодної з чотирьох комплементаційних груп.

Роботами багатьох дослідників (Nunomura et al., 2007; Troulinaki et al., 2005) показано, що функціонування нервової системи відіграє ключову роль у регуляції процесів старіння, тривалість життя більшості нейронів відповідає тривалості життя організму, а зміни в нервовій системі призводять до порушень у гомеостазі цілісного організму. За даними дослідження середньої тривалості життя були побудовані криві виживання мутантних особин і лінії дикого типу Oregon. Порівняльний аналіз кривих виживання контрольної лінії Oregon і особин з мозковими змінами показав, що мутанти характеризуються зменшеною тривалістю життя. Криві виживання мутантів різних комплементаційних груп мали подібний профіль і характеризувались відсутністю плато або так званого періоду активної життєздатності. Тривалість життя особин всіх мутантних культур була на 15-40% менше, ніж у дикого типу.

У особин більшості ліній дегенеративні зміни проявлялись вже на 1-5 день після вильоту імаго (рання дегенерація) і далі швидко прогресували, тоді як інші лінії (72-2, 71-21) характеризувались нейродегенерації з пізнім початком. Момент масового відмирання особин більшості досліджуваних ліній починався вже після 5 дня життя та співпадав з початком утворення дегенеративних змін в мозку. На парафінових зрізах тканини мозку особин різних мутантних ліній ми виявили відмінний фенотип, що свідчило про різну природу одержаних мутацій.

Картування Х-зчеплених мутацій, що зумовлюють нейродегенерацію мозку D. melanogaster. Локалізацію мутацій здійснювали за допомогою тестерних делеційних ліній, у яких точно встановлені розмір та ділянка делеції (Rigamonti et al., 2000). Було обрано 4 делеційні лінії - 949, 998, 1329 та 950, які були використані авторами (Buchanan et al., 1993; Kretzschmar et al., 1997; Min et al., 1997) для картування раніше описаних нейродегенеративних мутацій D. melanogaster, таких як sws, drop-dead, spongecake та eggroll, з метою виявлення алельних варіантів цих генів серед досліджуваних нами мутантів (табл. 1).

Мутації 60-15 та 60-16, які належать до другої групи комплементації, локалізовано в районі делецій, які несла лінія 998, а саме 12D2 або 13A2 - 5 Х-хромосоми. Серед генів вказаних цитологічних районів наш інтерес для подальших досліджень представляють три гени - drop-dead, ether a go-go та bendless. Мутацію 65-10 картовано в районі 1А1 Х-хромосоми, який відповідає делеції тестерної лінії 1329 та має розмір 175 т.п.н. Описана Бензером та Міном (Min et al., 1997) мутація spongecake захоплює цю ділянку. Було виявлено, що гетерозиготні особини від схрещування чотирьох ліній зі структурними змінами тканини мозку, а саме 2-14, 61-7, 72-7 та 76-15 з тестерною лінією 949 проявляли мутантний фенотип, як і лінія sws.

нейродегенеративний мутація drosophila melanogaster

Таблиця 1. Результати схрещувань нейродегенеративних мутантів D. melanogaster з делеційними лініями

N - нормальний фенотип; М - мутантний фенотип

Для підтвердження результатів делеційного аналізу та виявлення, в якій з досліджуваних ділянок (7D1 чи 7D5) хромосоми слід картувати мутації, ми провели схрещування з лінією 948, яка несла дуплікацію 7D1 району Х-хромосоми на третій хромосомі.

Таблиця 2. Результати генетичного аналізу нейродегенеративних ліній, які, імовірно, несуть мутацію в гені sws

Також нами був проведений тест на комплементацію між мутантом swsolfE та лініями 2-14, 61-7, 72-7 та 76-15, у яких мутації локалізовані в ділянці 7D1 Х-хромосоми (табл. 2).

На основі даного аналізу можна припустити, що лінії 2-14, 61-7, 72-7 та 76-15 несуть мутацію в гені sws. При чому, лінії 72-7 та swsolfE представлені однією алельною формою гена, а алельна форма гена, яку несе мутант 76-15, є домінантною по відношенню до інших мутантних алелей, але не до алелю дикого типу.

Молекулярна ідентифікація мутацій у гені sws нейродегенеративних мутантів D. melanogaster. Серед низки відомих алельних форм гена sws добре вивченими з морфологічної та молекулярно-генетичної точки зору є тільки три (Kretzschmar et al., 2005; FlyBase). Для мутанта swsolfE характерні аналогічні іншим алельним формам морфологічні ознаки, однак не відомо якою мутацією зумовлений даний алель і який білковий продукт утворюється в результаті цієї мутації. Великий транскрипт гена має розмір 5,4 т.п.н., відкрита рамка зчитування (ORF) якого складає 4274 п.н. Клонування цього транскрипта гена (SWS-A) з використанням зворотної транскриптази (RT-PCR) та його наступне секвенування, можливо, дозволить ідентифікувати нові алелі гена sws у ліній 2-14, 61-7, 72-7 та 76-15. Було створено 8 пар праймерів до послідовності ORF SWS-A таким чином, щоб закінчення попереднього та початок наступного фрагменту частково перекривались. Матеріалом для виділення тотальної РНК служили голови 20-ти денних особин ліній swsolfE, 2-14, 61-7, 72-7, 76-15 та лінії дикого типу OregonR. Першу нитку кДНК, синтезовану на основі сумарної РНК, використовували як матрицю для ПЛР. Було ампліфіковано по 8 фрагментів гена sws кожної з досліджуваних нейродегенеративних ліній та лінії дикого типу. Це дозволяло стверджувати, що жодна з мутацій не зумовлена делецією в гені sws.

Було здійснено порівняльний аналіз нуклеотидної послідовності кДНК гена sws дикого типу, що є в базі даних Gene Bank (національний центр біотехнологічної інформації, США), лінії дикого типу Oregon та мутантних ліній з допомогою комп'ютерної програми DNA Star. Всі представлені варіанти нуклеотидного складу відповідають послідовності амінокислот, що характерна для білка SWS дикого типу. Окрім поліморфних змін нуклеотидів, які не впливали на амінокислотний склад продукта гена sws, у секвенованій послідовності кДНК лінії 76-15 було знайдено мутацію, яка спричиняла заміну амінокислоти у послідовності білка. Так, у положенні 4233 відкритої рамки зчитування гуанін, якій присутній у послідовності дикого типу та послідовностях всіх інших досліджуваних ліній, замінений на цитозин. Ця заміна спричиняє заміну глутамінової кислоти на аспарагінову кислоту у положенні 1411 ймовірної послідовності білка SWS-А лінії 76-15.

Співставляючи аналіз нуклеотидних послідовностей гена sws досліджуваних ліній та результати описаного вище картування і комплементаційного аналізу, можна припустити, що особини ліній swsolfE, 72-7 та 2-14 несуть мутацію, яка зумовлює дисфункцію лише малого транскрипту гена sws SWS-B. У той же час мутант 61-7, для якого виявлені неоднозначні показники генетичного аналізу (табл. 2), швидше за все, не несе мутацію в гені sws. Мутація 61-7 або міститься у районі Х-хромосоми близькому до 07D01, або в гені, якому властива певна взаємодія із геном sws.

Використовуючи програмне забезпечення SMART (Letunic et al., 2006) та Pfam (Finn et al., 2003) ми здійснили порівняльний аналіз імовірних функціональних доменів білка SWS та деяких його ортологів. Всі зазначені ортологи містили домен із фосфоліпазною активністю розміром близько 166 амінокислотних залишків, функція якого полягала у підтриманні метаболізму ліпідів, в тому числі, гідролізі мембранних ліпідів (Mignery et al., 1988). Всім ортологам sws, крім естеразо-подібного білка C. elegans, характерна наявність трьох структурних доменів, кожен з яких мав розмір близько 120 амінокислот та за структурою був подібний до цНМФ-залежних протеінкіназ. Відомо (Yau., 1994), що такі протеінкінази здійснюють функціональний вплив на іонні канали шляхом їх фосфорилювання. Описані (Koudinova et al., 2000) алельні мутації гена sws зумовлювали амінокислотні заміни саме у цих консервативних доменах.

Ідентифікована нами мутація у лінії 76-15 не зачіпає жодного з цНМФ-залежних або фосфоліпазного доменів. Глутамінова кислота у положенні 1411 входить до складу С-кінцевого домену, функція якого досі не з'ясована. Видова унікальність властива С-кінцевим ділянкам всіх представлених білків, які мають високу гомологію із SWS. Ми припускаємо, що дефект даного домену не призводив до безпосередньої втрати ензиматичної активності білка, а, ймовірно, став причиною порушення взаємодії SWS-А із білками-партнерами, це, в свою чергу, є причиною його незадовільної функціональної активності.

Вивчення нейропатію індукуючої естерази (НІЕ) людини триває більше 20 років, проте його біологічна роль досі не до кінця з'ясована.

Важливий внесок у розуміння функції цього білка людини зробили дослідження ортологів хребетних та дрозофіли. Описана нами алельна форма гена sws, властива лінії 76-15, має особливу цінність саме з точки зору виявлення білків партнерів або білків-посередників, які задіяні у підтриманні нормального функціонування нейронів та гліальних клітин мозку. Це дозволить зробити крок у напрямку до з'ясування більш повного переліку механізмів, задіяних у розвитку нейродегенерації клітин мозку. Недивлячись на те, що імовірні білки-посередники можуть характеризуватись високою видоспецифічністю, процеси, у яких вони беруть участь, можуть бути універсальними та високо консервативними.

Морфологічнна та функціональна характеристика змін у мозку нейродегенеративних мутантів групи sws. З літератури (Mattson., 2000; Weishaupt et al., 2003; Kretzschmar., 2005) відомо, що нейродегенеративні процеси у дрозофіли супроводжуються як апоптичними, так і некротичними змінами в мозку. Апоптозу підлягають окремі нейрони, аналогічно до нейродегенеративних процесів у людини, і характеризуються вибірковою втратою нейронів у певних анатомічних структурах мозку, що зумовлює специфічність клінічних проявів кожного захворювання. Для виявлення таких клітин існують методи фарбування фіксованої тканини специфічними барвниками, які базуються на різній спорідненості барвників до різних структурних компонентів клітин фіксованих тканин, що дозволяє оцінити функціональний стан клітини на час фіксації (Хэм и др., 1983). Встановлено (Glynn., 2007), що втрата НІЕ фосфоліпазної активності у хребетних порушує гомеостаз ліпідів ендоплазматичного ретикулюму (ЕР), що зумовлює загальну дисфункцію ЕР. Ці структури в еукаріотичних клітинах є стартовою точкою всього секреторного транспорту, тому і мембранний транспорт аксонів, і взаємодія між аксонами та гліальними клітинами порушуються у разі патологічного стану ЕР. Оскільки одержано докази (Mьhlig-Versen et al., 2005), що основною функцією білка SWS є здійснення фосфоліпазної активності та доведено його зв'язок із ЕР, доцільно було дослідити стан аксонів у мутантів sws.

Нами були використані моноклональні антитіла 22С10, що є специфічним маркером Futcsh білка. Цей білок локалізований у мікротрубочках і необхідний для організації цитоскелету в процесі формування аксонів та синаптогенезу (Bettencourt et al., 2005). Морфологія нейронів визначається цитоскелетом, що забезпечує відмінність у структурі аксонів та дендритів. Багато нейродегенеративних захворювань характеризуються змінами специфічних компонентів цитоскелету (McMurray., 2000), тому його структура є передумовою для функціонування і збереження нейронів. У тканині мозку особин дикого типу спостерігали однорідний, рівномірний розподіл маркера, що свідчило про нормальну структуру аксонів та їх впорядковане розташування. Як для молодих, так і для старих особин ліній 2-14 та swsolfE не було виявлено жодних суттєвих відмінностей у морфології аксонів в порівнянні з диким типом. Тоді як, і 3-денні, і 21-денні мухи лінії 76-15 продемонстрували специфічний патологічний фенотип для даного імунологічного маркера.

Однак, етіологія аномалії аксонів лінії 76-15 безпосередньо не пов'язана з патологічною формою Futcsh білка. Більш імовірно аномальна структура цитоскелету аксонів є наслідком системного порушення, яке було спричинене дизфункцією білка SWS. Саме втрата естеразної активності відомими ортологами SWS хребетних зумовлює дегенерацію аксонів.

Ми здійснили якісний і кількісний аналіз дофамінергічних нейронів у мозку нейродегенеративних мутантів D. melanogaster. Антитіла anti-TH, які специфічні до тирозингідроксилази, ми використовували як маркер для візуалізації дофамінергічних клітин в мозку дрозофіли (Whitworth et al., 2006). Ми оцінювали кількість нейронів у семи основних групах: PAL (protocerebral anterior lateral) складається з п'яти клітин; PPM1 (protocerebral posterior medial) складає один нейрон; PPM2 - 8; PPM3 - 6; VUM (ventral unpaired medial) налічує 3 клітини; до складу PPL1 (protocerebral posterior lateral) входить 14 нейронів; до PPL2 - 6.

Чутливість дофамінових (ДФ) нейронів пояснюється особливостями метаболізму дофаміну та його везикулярного транспорту (Friggi-Grelin et al., 2003; Sang et al., 2007). Дофамін за своєю природою нестабільний і може окиснюватись із утворенням H2O2. ДФ синтезується в цитозолі і транспортується у синаптичні везикули, де його руйнування обмежується низьким pH і відсутністю оксидаз (Cooper., 2006). Пригнічення везикулярного транспорту має найбільш виражений вплив саме на ДФ нейрони, оскільки нейротрансмітери, які продукуються іншими нейронами, мають значно меншу цитотоксичність.

Ми здійснили детекцію антитілами anti-TH тканини мозку молодих мух всіх досліджуваних ліній. Не було виявлено суттєвих змін кількості клітин в жодній з груп нейронів у мозку триденних особин лінії дикого типу та мутантних ліній. Аналогічна детекція ДФ нейронів була виконана на тканинах мозку старих, 23 денних, особин. Кількість нейронів мутантних особин у кластерах PAL, PPL2, VUM, PPM1/2, PPM3 суттєво не відрізнялась від показників лінії дикого типу. Інтерес представляють дані одержані для групи нейронів PPL1.

У особин ліній 2-14, 72-7 та swsolfE було зафіксовано статистично достовірне зменшення кількості нейронів у вказаному кластері. Так, у 21-денних мух лінії 2-14 налічувалось від 7 до 9 клітин PPL1, що вказує на зменшення кількості нейронів у цій групі на 33% (***Р<0.0001). Аналогічний результат виявлено для мозку особин линії 72-7. Старі особини swsolfE також характеризувались значною дегенерацією клітин в кластері PPL1. Замість 11 - 13 клітин вказаної групи, які ми реєстрували у мозку в нормі, кількість нейронів PPL1 у мозку носіїв мутації swsolfE не перевищувала 8 - 10. Тобто, спостерігалася редукція до 26% (***Р<0.0001) дофамінергічних нейронів кластеру PPL1.

Така характеристика стану ДФ нейронів ліній 2-14, 72-7 та swsolfE свідчить про подібні механізми, що лежать в основі формування патології. Це співпадає із висновком, про спільну генетичну природу порушення в гені sws особин зазначених лінії. Імовірно, вони мають дефект лише малого продукту SWS-В, тоді як великий SWS-А має нормальну структуру та функціонування. Можна припустити, що саме нормальна функціональна активність малого продукту гена sws визначальна для збереження ДФ нейронів у мозку дрозофіли.

Висновки

В результаті виконаної роботи отримано колекцію індукованих етилметансульфонатом мутантів D. melanogaster із дегенеративними змінами в тканині мозку. Проведено картування мутацій та встановлено гени кандидати для подальшого вивчення. Клоновано та секвеновано кДНК гена sws у низки ліній, виявлено новий алель даного гена (76-15), встановлено функціональні та морфологічні прояви мутацій у цьому гені - порушення будови цитоскелету аксонів, специфічна дегенерація дофамінових нейронів у мозку.

1. Серед одержаних мутантів виявлено 2 з домінантним проявом; мутантів з рецесивним проявом розділено на чотири групи комплементації.

2. Показано, що дегенеративні зміни розпочинались як у молодих, 1-5-ти денних мутантних ліній (2-14, 5-5, 67-2, 72-7, 77-12, 73-8, 28-11, 77-4, 61-7, 76-7, 76-15), так і 10-15-ти денних імаго (72-2, 71-21); нейродегенеративний фенотип особин різних ліній мав відмінний характер.

3. Побудовано криві виживання мутантних ліній і встановлено взаємозалежність між часом виникнення дегенерації мозку і тривалістю життя особин. Максимальна тривалість життя особин мутантних культур була на 15-40% менша, ніж у дикого типу Oregon R.

4. На основі результатів делеційного картування встановлено, що: мутації 60-15 та 60-16 локалізовані в 12D2 або 13А2-5 цитологічних районах Х-хромосоми, де містяться гени кандидати bendles та ether a go-gо; мутацію 65-10 картовано в ділянці 1А1 Х-хромосоми, яка є місцем локалізації нейродегенеративного мутанта spongecake; мутації 2-14, 61-7, 72-7 та 76-15 локалізовано у 7D1 районі Х-хромосоми, який є місцем картування гена sws.

5. Великий транскрипт SWS-A гена sws D. melanogaster у ліній 2-14, 61-7, 72-7 та swsolfE відповідає такому у особин дикого типу. У лінії 76-15 виявлено новий алель гена sws , який зумовлює амінокислотну заміну у С-кінцевому домені білка SWS-A.

6. Виявлено, що механізми дегенерації в мозку особин лінії 76-15 пов'язані зі змінами в структурі цитоскелету аксонів. Патологія аксонів є специфічною при дисфункції білка SWS-A.

7. Встановлено віковозалежну дегенерацію дофамінергічних нейронів групи PPL1 у старих особин мутантних ліній 2-14, 72-7 та swsolfE.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Максимів Д.В. Вплив нейропротекторів арісепту, церебролізину і карнозину на тривалість життя та динаміку появи змін у мозку нейродегенеративних мутантів Drosophila melanogaster / Д.В. Максимів, Н.П. Матійців, М.В. Кучеренко, В.В. Радиш, Я.І. Черник, Г.Р. Щербата, Є.Р. Гасуль, О.М. Макаренко // Архів психіатрії. - 2003. - Т. 9, №4. - С.71-76.

Здобувач виконала 30% експериментальних досліджень (аналіз гістологічних препаратів окремих ліній), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні статті.

2. Щepбaтa Г.P. Химически индуцированный мутагенез у Drosophila melanogaster с целью получения мутантов с изменениями в структуре мозга / Г.P. Щepбaтa, Н.П. Матийцив, Я.И. Чepник, Д.B. Maкcимив // Генетика. - 2004. - Т.40, № 9. - С. 1280-1285.

Здобувач виконала 50% експериментальних досліджень (одержала частину ліній та охарактеризувала фенотип тканини мозку на парафінових зрізах), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

3. Щepбaтa Г.P. Генетический анализ нейродегенеративных мутантов Drosophila melanogaster по Х-хромосоме, индуцированных этилметансульфонатом и нитрозоэтилмочевиной / Г.P. Щepбaтa, Н.П. Матийцив, Я.И. Чepник, А.С. Яценко, В.В. Радыш, М.М. Кучеренко, Д.B. Maкcимив // Генетика. - 2004. - Т. 40, № 9. - С.1286 - 1292.

Здобувач виконала 50% експериментальних досліджень (провела комплементаційний аналіз, побудову кривих виживання та визначила динаміку появи змін у частини ліній), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

4. Матійців Н. Генетичне картування Х-зчепленних нейродегенеративних мутацій у Drosophila melanogaster / Н. Матійців // Вісник львівського університету. Серія биологічна. - 2005. - Т. 39. - С.54 - 59.

Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила статтю.

5. Матійців Н. Генетичний аналіз нейродегенеративних Х-зчеплених мутантів Drosophila melanogaster групи sws / Н. Маційців, Д. Максимів // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. праць. - К.: Логос, 2007. - Т. 1. - С. 276 - 280.

Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила статтю.

6. Матійців Н.П. Роль оксидативного стресу в дегенерації дофамінових нейронів у мутантів Drosophila melanogaster / Н.П. Матійців, І.І. Могиляк, Н.І. Груник, Я.І. Черник, Д.В. Максимів // «Дрозофіла в експериментальній генетиці та біології» : Зб. наук. праць. - Харків, 2008. - С. 128 - 131.

Здобувач виконала 60% експериментальних досліджень (провела дослідження стану дофамінових нейронів), брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.

7. Матийцив Н.П. Генетический анализ нейродегенеративных мутантов Drosophila melanogaster по 3-й хромосоме, индуцированных этилметансульфонатом / Н.П. Матийцив, И.Б. Магоривска, О.В. Щербакова, Я.И. Черник, Д.В. Максимив // Генетика. - 2009. - Т. 45, № 2. - С.196 - 202.

Здобувач виконала 70% експериментальних досліджень (провела комплементаційний аналіз, картування в повному обсязі, побудову кривих виживання та визначила динаміку появи змін у частини ліній), написала та оформила статтю.

8. Matiytsiv N.P. Neuroprotector effect of Cerebrolysine on Drosophila melanogaster neurodegeneration / N.P. Matiytsiv, T.V. Bakhmat, O.V. Leskiv, V.V. Radysh, G.R. Shcherbata // Conference for Young Scientists, Ph.D. Students and Students on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine. Kyiv, September 25-27 2003. - Kyiv, 2003. - P. 101.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

9. Matiytsiv N. Neurodegenerative mutations of Drosophila melanogaster: molecular genetic analysis / N. Matiytsiv, O. Shcherbakova, M. Kucherenko, V. Radysh, D. Maksimiv, Ya. Chernik // First Ukrainian Congress for Cell Biology. Lviv, April 25-28 2004. - Lviv, 2004 - P. 303.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

10. Матийцив Н.П. Генетически обусловленная нейродегенерация у Drosophila melanogaster / Н.П. Матийцив // VIII Российская биомедицинская конференция для молодых учёных. С-Петербург, Россия 14-16 апреля 2005г. С-П, 2005 - С. 74.

Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила тези доповіді.

11. Matiytsiv N. Genetic control of Drosophila melanogaster neurogenerative mutants induced by ethylmethansulphonate / N. Matiytsiv // 46 th Drosophila Research Conference. San Diego, USA, 30 March - 3 April 2005. - P. 354.

Здобувач виконала експериментальну роботу у повному обсязі, написала та оформила.

12. Матійців Н. Х-зчеплена нейродегенерація у Drosophila melanogaster / Н. Матійців, О. Виноградська // Біорізноманіття. Екологія. Еволюція. Адаптація.: конференція студентів, аспірантів та молодих науковців присвячена 140-річчю Одеського національного університету. Одеса, 28 березня - 1 квітня 2005р. - Одеса, 2005. - С. 86.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

13. Матійців Н. Молекулярно-генетичний аналіз нейродегенеративних мутантів дрозофіли із sws - подібним фенотипом / Н. Матійців, О. Виноградська // “Молодь і поступ біології”: I Міжнародна конференція студентів та аспірантів. Львів, 11-14 квітня 2005 р. - Львів, 2005. - С.129.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

14. Виноградська О. Характеристика дофамінергічних нейронів у мозку нейродегенеративних мутантів Drosophila melanogaster / О. Виноградська, Н. Матійців // “Молодь і поступ біології”: IІ Міжнародна конференція студентів та аспірантів. Львів, 21-24 березня 2006р. - Львів, 2006.- С. 137.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

15. Магорівська І. Генетичне картування нейродегенеративних мутацій в третій хромосомі Drosophila melanogaster / І. Магорівська, Н. Матійців, Д. Максимів // “Молодь і поступ біології”: III Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів. Львів, 23-27 квітня 2007р. - Львів, 2007.- С. 163.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

16. Магорівська І. Mapping of the third chromosome mutations causing neuronal pathologies in Drosophila melanogaster brain / І. Магорівська, Н. Матійців, Д. Максимів // III міжнародна конференція молодих вчених „Розмаїття живого. Екологія. Еволюція. Адаптація”, присвячена 100-річчю з дня народження видатного українського ліхенолога М.Ф. Макаревич. Одеса, 15 - 18 травня 2007р. - Одеса, 2007. - С. 206.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

17. Matiytsiv N. Neurodegeneretion in the brain of Drosophila melanogaster mutants / N. Matiytsiv, Ya. Chernyk, I. Mahorivska, D.Maksymiv // Conference for yang scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics Dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov. Kiiv, 20-26 September 2007р. Київ, 2007. - С. 29.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

18. Матійців Н.П. Нова алельна форма гена swiss cheese Drosophila melanogaster / Н.П. Матійців, Д.В. Максимів // “Молодь і поступ біології”: IV Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів. Львів, 7-10 квітня 2008р. - Львів, 2008.- С. 138.

Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі даних, написанні тез доповіді.

Анотація

Матійців Н.П. Молекулярно-генетичний аналіз нейродегенеративних мутацій Drosophila melanogaster, локалізованих в Х-хромосомі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Державна установа «Науковий центр радіаційної медицини АМН України», Київ.

У дисертаційній роботі проведено молекулярно-генетичний аналіз індукованих етилметансульфонатом нейродегенеративних мутацій D. melanogaster, вивчено функціональні та морфологічні зміни у тканині мозку мутантів. У мутантних ліній спостерігалось швидке відмирання особин і зменшені параметри середньої та максимальної тривалості життя. Нейродегенерація таканини мозку мала прогресуючий із віком характер. Комплементаційний аналіз дозволив розділити мутантів та чотири групи комплементації. Завдяки делеційному картуванню деякі мутації було картовано та встановлено гени кандидати для подальшого вивчення у певних ліній. Детальному генетичному аналізу, як класичному так і молекулярному, було піддано лінії картовані в районі 7D1 Х-хромосоми. Цей район відповідав локалізації нейродегенеративної мутації swiss cheese. Було клоновано та секвеновано кДНК великого транскрипту гена (SWS-A) ліній swsolfE, 2-14, 61-7, 72-7, 76-15 та лінії дикого типу Oregon R. Виявлено, що мутант 76-15 є носієм нової алельної форми гена sws, яка представлена точковою мутацією, що спричиняє амінокислотну заміну в С-кінцевому домені білка SWS-A.

Функціональні зміни у мутанта 76-15 пов'язані із патологією цитоскелету аксонів мозку. Саме патологія аксонів є специфічним фенотипом при втраті естеразної активності білком SWS-A. У особин swsolfE, 2-14, 72-7 виявлено віковозалежну дегенерацію дофамінових нейронів групи PPL1.

Ключові слова: D.melanogaster, нейродегенерація мозку, swiss cheese.

Аннотация

Матийцив Н.П. Молекулярно-генетический анализ нейродегенеративных мутаций Drosophila melanogaster, локализованных в Х-хромосоме. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Государственная организация «Научный центр радиационной медицины АМН Украины», Киев.

В диссертации проведено молекулярно-генетический анализ индуцированных этилметансульфонатом нейродегенеративных мутаций D.melanogaster, изучено функциональные и морфологические изменения в ткани мозга мутантов. У мутантных линий наблюдалось раннее отмирание особей и уменьшение параметров средней и максимальной продолжительности жизни. Нейродегенерация ткани мозга имела прогрессирующий с возрастом характер. Комплементационный анализ позволил разделить мутантов на четыре группы комплементации. Благодаря делеционному картированию некоторые мутации локализовали и установили гены кандидаты для дальнейшего изучения у определенных линий.

Детальному генетическому анализу, как классическому, так и молекулярному, было подвергнуто линии картированные в районе 7D1 Х-хромосомы. Этот район соответствует локализации нейродегенеративной мутации swiss cheese. Проведено клонирование и секвенирование кДНК большого продукта гена (SWS-A) у линий swsolfE, 2-14, 61-7, 72-7, 76-15 и линии дикого типа Oregon R. Установлено, что мутант 76-15 является носителем новой аллельной формы гена sws, которая представлено точковой мутацией, обуславливающей аминокислотную замену в С-концевом домене белка SWS-A.

Функциональные изменения у мутанта 76-15 связаны с патологией цитоскелета аксонов мозга. Именно патология аксонов является специфическим фенотипом при потере эстеразной активности белком SWS-A. У особей swsolfE, 2-14, 72-7 найдено возрастзависимую дегенерацию дофаминовых нейронов группы PPL1.

Ключевые слова: D.melanogaster, нейродегенерация мозга, swiss cheese.

Summary

Natalia Matiytsiv. Molecular-Genetic Analysis of Drosophila melanogaster Neurodegenerative Mutations Localized in X Chromosome. - Manuscript. Dissertation for Candidate of Biological Sciences scientific degree in speciality 03.00.15 - Genetics. - State Institution «Scientific Center for Radiation Medicine AMS Ukraine», Kiev.

Molecular-genetic analysis of ethylmethanesulphonate-induced D.melanogaster neurodegenerative mutations was done and both functional and morphological changes in mutant brain tissue were studied in this dissertation work. Early death and lowered average and maximum lifespan parameters were observed in mutant lines. Brain tissue degeneration progressed with age. Complementation analysis helped divide mutants into four complementation groups. With deletion mapping, some mutations were mapped and candidate genes were specified for further study in certain lines.

Lines mapped in X chromosome 7D1 region were subject of detailed genetic analysis, both classical and molecular. This region corresponded to the swiss cheese neurodegenerative mutation. (SWS-A) gene large transcript cDNA of swsolfE, 2-14, 61-7, 72-7, 76-15 lines and Oregon R wild type line was cloned and sequenced. It was found out that 76-15 mutant carries a new sws gene allele form represented by point mutation that causes amino acid substitution in the C-end domain of SWS-A protein.

Functional changes in 76-15 mutant are connected with brain axons cytoskeleton pathology. Axon pathology is specific phenotype under SWS-A protein esterase activity loss. In swsolfE, 2-14, 72-7 flies age-dependent degeneration of dophamine neurons of PPL1 group was observed.

Keywords: D.melanogaster, brain neurodegeneration, swiss cheese.

Размещено на Allbest.ru