Генетичні процеси в природних популяціях Drosophila melanogaster України

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа

«Науковий центр радіаційної медицини Академії медичних наук України»

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.15 - генетика

Генетичні процеси в природних популяціях Drosophila melanogaster України

Проценко Олександра Володимирівна

Київ - 2009

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Drosophila melanogaster - модельний організм, біологія якого на сьогодні є добре вивченою, що робить його чудовим обєктом для популяційно-генетичних та екологічних досліджень.

Моніторинг популяцій забезпечує вивчення динаміки їхньої генетичної структури та інших генетичних процесів, які відбуваються в природі. На території бувшого Радянського Союзу дослідження природних популяцій дрозофілід започатковані ще Московською та Ленінградською генетичними школами (С.С. Четвериков, М.П. Дубінін, Г.Г. Тіняков, С.М. Гершензон, Р.Л. Берг та інші) (Захаров, 2001). На території України такі дослідження були розпочаті в 1931 році і з певними перервами тривали до 1991 року, в результаті чого для окремих популяцій були описані закономірності мутаційних процесів протягом низки поколінь (Захаров, 2001). Зокрема, було зафіксовано хвилеподібний характер природного мутагенезу (Гершензон, 1996). З'ясування закономірностей природних мутаційних процесів, а також встановлення причин, які викликають мутаційні хвилі, потребує подальшого моніторингу.

Крім того, на мутаційні процеси в природних популяціях впливають фактори зовнішнього середовища, які постійно змінюються, інколи дуже суттєво (аварія на ЧАЕС). На сьогодні залишається відкритим питання про наслідки подібних подій для генофонду популяцій. Таким чином, дослідження генетичних процесів в природних популяціях Drosophila melanogaster України є важливими не тільки для розуміння фундаментальних механізмів генетичних процесів у природі, а й як елемент загального моніторингу стану зовнішнього середовища.

Щодо генетичних процесів, які призводять до виникнення генетичного поліморфізму, слід особливо відзначити два аспекти. По-перше, добре відомо, що у виду Drosophila melanogaster 80% спонтанних мутацій обумовлено активністю мобільних елементів (МЕ). В той же час, на сьогодні недостатньо дослідженими залишаються питання виникнення та розповсюдження МЕ в природних популяціях (Deceliere, 2005, Фурман, 1996). По-друге, особливий інтерес набула останнім часом проблема сумісної еволюції організму хазяїна та внутрішньоклітинних симбіонтів (паразитів), здатних впливати на генетичні процеси, зокрема, у Drosophila melanogaster (Горячева, 2004).

Представлена робота присвяченна вивченню зазначених питань: дослідженню генетичної мінливості, рівня присутності мобільних елементів та інфікованості ендосімбіонтами у природних популяціях Drosophila melanogaster України, а також впливу на генетичні процеси факторів зовнішнього середовища.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідної теми „Генетичний моніторинг: розробка підходів до оцінки впливу факторів зовнішнього середовища на геном” (№ держреєстрації 0106U005750, 2006-2010), яка входить до комплексної наукової програми „Здоров'я людини”.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було охарактеризувати мутаційні та рекомбінаційні процеси в природних популяціях Drosophila melanogaster України.

1. Встановити наявність видимих та зчеплених зі статтю мутацій в десяти природних популяціях D. melanogaster.

2. Проаналізувати вихід та спектр видимих мутацій в п'яти поколіннях лабораторного (інбредного) розведення ліній, отриманих зі всіх досліджуваних природних популяцій.

3. Встановити частоту рекомбінації між локусами white та cut в Х-хромосомі в особин з природних популяцій D. melanogaster.

4. Діагностувати інфікованість ендосимбіонтом Wolbachia sp. особин з природних популяцій D. melanogaster України.

5. Встановити наявність мобільного Р-елементу в геномах D. melanogaster з природних популяцій України, а також визначити цитотип представників цих популяцій.

Об'єктом дослідження є природні популяції Drosophila melanogaster України. Предмет дослідження - мутаційні та рекомбінаційні процеси в цих популяціях та вплив на такі процеси факторів зовнішнього та внутрішнього середовища.

Методи дослідження: В роботі були використані класичні методи гібридологічного аналізу (комплементаціний та рекомбінаційний тести, метод близькородинних схрещувань, дисгенні схрещування); для врахування зчеплених зі статтю летальних мутацій була використана лінія C(1)DX, самки якої несуть фізично зчеплені Х-хромосоми. Дослідження фенотипового прояву мутацій та редукції гонад проводили за допомогою світлової мікроскопії. Стандартні молекулярно-біологічні методи включали: виділення ДНК, гель-електрофорез ДНК, ПЛР, гібридизацію in situ. Статистичний аналіз проводили загальноприйнятими методами (метод ч², F-критерій для якісних ознак) (Лакин, 1990).

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше проведено моніторингове дослідження десяти природних популяцій Drosophila melanogaster України за наступними показниками: частота видимих та зчеплених зі статтю летальних мутацій, частота рекомбінаційних подій між генами w і ct, вихід видимих мутацій в п'яти поколіннях лабораторноо розведення, зараженість ендосимбіонтами та наявність Р-елементу.

Вперше показано наявність Р-елементу в геномах особин з усіх природних популяцій Drosophila melanogaster України, а також зараженість дрозофіл ендосимбіотичною бактерією Wolbachia sp.

Продемонстровано, що максимальний вихід видимих мутацій є характерним для популяцій D. melanogaster з Чорнобильського регіону.

Показано, що жодна з досліджуваних природних популяцій D. melanogaster не знаходиться в стані мутаційного спалаху.

Практичне значення отриманих результатів. У процесі роботи отримані нові лінії D. melanogaster, які походять з природних популяцій цього виду (лінії дикого типу, лінії, які несуть певні мутації). Отримані результати та деякі висновки можуть бути використані при розробці стратегій та постановці експериментів з дослідження популяцій комах. Матеріали дисертації використовуються при викладанні спецкурсів "Генетичний аналіз", "Генетика дрозофіли" на кафедрі загальної та молекулярної генетики Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літератури за темою роботи, експериментальна частина, статистична обробка даних виконані автором самостійно. Визначення конкретних завдань дослідження, обговорення та інтерпретація результатів здійснювались разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на наукових конференціях: 19 th European Drosophila research Conference (Eger, 2005); V Всеукраїнська наукова конференція студентів та аспірантів «Біологічні дослідження молодих вчених в Україні» (Київ, 2005); Міжнародна конференція «Генетика в России и мире», присвячена 40-річюю Інституту загальної генетики ім. М.І. Вавилова РАН (Москва, 2006); ІІ Міжнародна конференція студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2006); European radiation research (Kyiv, 2006); Фактори експериментальної еволюції організмів (Алушта, 2006); VIII З'їзд товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова (Алушта, 2007); International Conference on Low Dose Radiation on Human Health and Environment (Budapest, Hungary, 2007); ІV Міжнародна конференція студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2008).

Публікації. Матеріал, представлений в дисертаційній роботі, опублікований в 14 наукових роботах, з них 7 - статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 7 - тези доповідей, представлених на наукових конфренціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 116 сторінках комп'ютерного тексту, включає наступні розділи: вступ, огляд літературних даних, матеріали та методи дослідження, результати дослідження, обговорення результатів, висновки. Список літератури нараховує 169 джерел, з них 62 кирилицею, 107 латиницею. Текст дисертації містить 25 таблиць та 10 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

мутація стать популяція drosophila

Матеріали та методи досліджень. Матеріалом для дослідження слугували випадкові вибірки з природних популяцій плодової мушки Drosophila melanogaster (Diptera, Drosophilidae). Відлов мух проводився на території восьми різних міст України, а саме в Києві (фруктовий сад на околиці міста), Одесі (фруктовий сад на околиці міста), Лубнах (фруктовий завод), Пирятині (фруктовий завод), Умані (фруктовий завод) і Чорнобилі (фрукові сади) в 2005, 2006 та 2007 роках (серпень-вересень), Варві (фруктовий завод) в 2006 та 2007 роках та Магарачі (місто Ялта) в 2007 році. В Чорнобилі відлов проводили в трьох різних місцях: селище Поліське, місто Чорнобиль та біля водойми-охолоджувача ЧАЕС (надалі - водойма-охолоджувач).

В роботі були використані лінії Drosophila melanogaster з колекції кафедри загальної та молекулярної генетики Київського національного університету імені Тараса Шевченка, а також з колекцій інституту цитології та генетики СО РАН (м. Новосибірськ, Росія) та колекційного центру Bloomingston (США): Canton-Special - інбредна лінія дикого типу; Harwich - лінія дикого типу, що несе в геномі більше 50 копій мобільного Р-елементу; Compound (1) Double X (С(1)DX) - лінія із фізично зчепленими Х хромосомами; w сt - лінія, яка несе мутації white (1 - 1.5) - білі очі - та сut (1 - 20.0) - обрізане крило з нерівним краєм; е - мутантна лінія ebony (3-70.7) - чорний колір тіла; abn abd - лінія, яка несе мутацію abnormal abdomen (1-4.5) - порушення в формуванні кутикуляного шару сегментів черевця; v - мутантна лінія vermilion (1-33.0) - яскраво червоні очі; c - мутантна лінія cinnabar (2-57.5) - кіноварні очі; b - мутантна лінія brown (2-104.5) - коричневі очі; ri - мутантна лінія radius incompletus (3-47,0) - розрив на субкостальній жилці крила (L2).

Весь зібраний матеріал був проаналізований на наявність видимих фенотипових змін. Після чого з кожної популяції було відібрано по 30 самок; від них було отримано 30 ізосамкових ліній, які протягом п'яти поколінь інбредного розмноження досліджувались щодо наявності в них видимих мутацій. При виявленні особин з фенотиповими порушеннями ці особини вилучались з лінії та досліджувались в окремих схрещуваннях з метою встановлення, чи спадкуються видимі фенотипові порушення. У випадку, коли порушення успадковувались, для встановлення приналежності цих порушень до відомих локусів проводили комплементаційні тести.

Для оцінки спонтанного рівня летальних зчеплених зі статтю мутацій самців з природних популяцій схрещували з віргінними самками лінії С(1)DX зі зчепленими Х-хромосомами. Рівень летальних зчеплених зі статтю мутацій оцінювали по відхиленню у співвідношенні самців до самок у першому поколінні в порівнянні з контролем. В якості контролю використовували самців лабораторної лінії Canton S, яких також схрещували з самками лінії С(1)DX.

Для визначення частоти рекомбінації Х-хромосом між генами white (w, 1-1,5) і cut (ct, 1-20) отримували самок, один з хромосомних наборів яких походить від самців з природних популяцій D. melanogaster. Таких самців схрещували з віргінними самками лінії w ct, а нащадків першого покоління - між собою. Частоту кросинговеру оцінювали, аналізуючи частоту фенотипових класів у другому поколінні.

Щоб визначити цитотип досліджуваних популяцій, віргінних самок з природних популяцій схрещували з самцями лінії Harwich, яка містить в своєму геномі повнорозмірні копії Р-елементу, після чого оцінювали частоту редукції гонад у самок першого покоління. Оцінку рівня редукції гонад (%GD) проводили також у особин, зібраних у природі. Для цього гонади ізолювали і оцінювали ступінь їхнього розвитку візуально, враховуючи одно- і двосторонню редукцію яєчників і сім'яників.

В усіх зібраних популяціях визначали співвідношення статей. Також кількість самок і самців визначалась протягом п'яти поколінь лабораторного розведення. Для уточнення того, чи є відхилення в співвідношенні самки/самці від очікуваного 1:1 наслідком бактеріального зараження, частина мух була відсаджена на середовище з тетрацикліном (0,25 мг/мл), після чого в першому та другому поколінні також оцінювали співвідношення статей.

З мух досліджених популяцій виділяли ДНК, використовуючи QIAamp DNA Micro Kit (“Qiagen”, США). Для лослдження брали по 20 особин взятих з природи. Отримані препарати ДНК використовували як матрицю для ПЛР, яку проводили за схемою: 3 хвилини за температури 94°С; 30 циклів ампліфікації (30 с за 94°С, 45 с за 55°С, 60 с за 72°С); 7 хвилин за 72°С. У випадку негативного результату дослід повторювали тричі. З метою визначення наявності Р-елемента за допомогою ПЛР ампліфікували фрагмент Р-елемента довжиною 437 п.о., використовуючи праймери 5'- ACGTTTGCTTGTTGAGAGGA-3', 5'- AACAGGACCTAACGCACAGT-3'). З метою визначення наявності Wolbachia sp. використовували праймери, специфічні до високо консервативного району гену рРНК 16s Wolbachia довжиною 438 п. о. (5'-CATACCTATTCGAAGGGATAG, 5'-AGCTTCGAGTGAAACCAATTC).

Про водили сиквенс отриманих за допомогою ПЛР фрагментів гену рРНК 16s Wolbachia. Для визначення приналежності отриманих в результаті сиквенсу послідовностей даному виду чи штаму бактерії оцінювали ступінь гомології із послідовностями з GeneBank (DQ412083), використовуючи програмне забезпечення BLAST. Достатнім вважали рівень гомології якнайменше 98%.

Для порівняння розподілу вибіркових дат з теоретично очікуваним розподілом використовували критерій Пірсона (ч²). Вірогідність розходження між вибірковими відсотками в досліді та контролі оцінювали за допомогою критерію Фішера (F) для якісних ознак (Лакин, 1990).

Видимі фенотипові зміни в природних популяціях Drosophila melanogaster. За результатами аналізу видимих фенотипових змін встановлено, що в популяції D. melanogaster міста Києва одна з 346 відловлених в 2005 році мух мала вирізку на крилі. В 2006 у трьох особин з 1001 були зафіксовані фенотипові порушення: одна особина мала вирізку на крилі, дві - порушення склеротизації черевця, жодне з порушень не спадкувалось. В 2007 році також була знайдена одна особина з вирізкою на крилі, порушення не успадковувалось в наступних поколіннях (табл. 1).

В уманській популяції в 2005, 2006 роках фенотипових порушень у імаго зафіксовано не було. В 2007 році з 3035 відібраних особин 9 мали фенотипові відхилення, а саме порушення в розвитку черевця, з них у 8 ці порушення спадкувались. Шляхом комплементаційного тесту було встановлено, що мутація належить локусу abnormal abdomen (табл. 1).

В популяції міста Одеса в 2005 - 2006 роках фенотипових порушень у імаго зафіксовано не було. В 2007 році з 2165 мух було зафіксовано 2 особини, які мали фенотипові зміни в будові черевця, в потомстві однієї з них вони успадковувались. Спадкова зміна виявилась алельною гену abnormal abdomen (табл. 1).

В популяції міста Пирятин в 2005 році лише дві мухи мали вирізки на крилах, які не спадкувались. В популяції D. melanogaster міста Пирятин в 2006 - 2007 роках фенотипових порушень у імаго зафіксовано не було (табл. 1).

В природних популяціях мух з міст Чорнобиль (всі три популяції), Лубни, Варва, Магарач протягом всіх трьох років моніторингу не було зафіксовано фенотипових порушень у імаго (табл. 3.2).

Таблиця 1. Частота фенотипових порушень в природних популяціях Drosophila melanogaster в різні роки досліджень (%)

Таким чином, враховуючи розміри вибірок, ми можемо стверджувати, що частота зустрічності фенотипових порушень у D. melanogaster за три роки досліджень в більшості популяцій була нижче 0,01 %, а у деяких 0,001%. Такі показники свідчать про те, що в період дослідження жодна з вивчених природних популяцій не знаходилась в стані «мутаційного спалаху».

Аналіз видимих фенотипових змін Drosophila melanogaster при лабораторному розведенні. При розведенні популяцій в культурі спостерігається підвищення виходу видимих мутацій в поколіннях. В лабораторних умовах популяції підтримувались у вигляді ізосамкових ліній, що забезпечує перехід рецесивних алелів в гомозиготний стан. Слід відмітити, що динаміка цього процесу була різною як для різних популяцій, так і в різні роки досліджень.

Максимальні частоти виходу видимих мутацій в гомозиготний стан демонструють певну залежність від несприятливих умов середовища. Так, протягом трьох років досліджень для більшості природних популяцій частота виходу видимих мутацій не перевищувала 2%.

Але для популяцій, які були зібрані на територіях з підвищеним рівнем радіаційного забруднення, цей показник двічі сягав суттєво вищих значень: 9% для мух з водойми-охолоджувача (2005 рік) та 6,4% - з Поліського (2006 рік).

Таблиця 2. Спектр мутацій, які зустрічаються в природних популяціях Drosophila melanogaster України

сі спадкові фенотипові зміни, які було виявлено при лабораторному розведенні, можна розбити на такі групи: зміни кольору очей, зміни кольору тіла, порушення склеротизації черевця, «пухирі на крилах», зміни жилкування, зменшення кількості фасеток очей. Також було зафіксовано низку фенотипових порушень, які не спадкувались, а саме: відсутність або вкорочення одного крила, деформація тораксу, вирізки на крилах.

Для встановлення генетичної приналежності знайдених мутацій кожного типу були проведені комплементаційні тести. В результаті були ідентифіковані мутації radius incompletus, abnormal abdomen, ebony.

Отже, спектр видимих мутацій був подібним для більшості досліджених природних популяцій (табл. 2).

Рекомбінаційні події в гетерозиготних самок, одна з Х-хромосом яких походить від самців з природних популяцій. Результати дослідження частоти кросинговеру на ділянці між генами w і ct відображені в таблиці 3.

Таблиця 3. Частота рекомбінації на ділянці між генами white і cut в досліджуваних природних популяціях України (2005 - 2007 рік)

Нульова гіпотеза про рівність часток у генеральних сукупностях відхиляється при F ? 3,8 (р=0,05).

Було показано статистично достовірне зниження частоти рекомбінації протягом всіх трьох років моніторингу в популяціях D. melanogaster Поліське, Київ, Пирятин та Лубни. В популяції Чорнобиль зниження частоти кросинговеру було зафіксоване в 2006 та 2007 роках, а в популяції Одеса - в 2005 та 2006 роках. В популяції Умань зниження частоти кросинговеру було зафіксоване лише в 2007 році, а в популяції Варва - лише в 2006. В популяціях Водойма-охолоджувач та Магарач жодного разу за весь період моніторингу не було зафіксовано відхилення частоти кросинговеру від контрольних показників. Слід зазначити, що жодного разу не було зафіксовано статистично достовірного збільшення частоти рекомбінаційних подій на ділянці між генами w і ct в порівнянні з контролем, навіть у нащадків популяцій, які мешкають на радіоактивно забруднених територіях.

Летальні зчеплені зі статтю мутації в природних популяціях Drosophila melanogaster України. В результаті аналізу першого покоління від схрещування самок лінії C(1)DX з самцями із природних популяцій було виявлено, що тільки в популяціях міст Лубни, Пирятин (2005 - 2006 роки) та Варва (2006 рік) рівень зчеплених зі статтю летальних мутацій статистично достовірно перевищував контрольний. Для всіх інших популяцій та років цей показник не перевищував контрольного рівня.

Цікаво, що вказане підвищення рівня летальних мутацій зафіксоване в радіаційно чистих регіонах, тоді як в природних популяціях з радіаційно забруднених територій (водойма-охолоджувач, Поліське, Чорнобиль) рівень зчеплених зі статтю летальних мутацій протягом всіх трьох років досліджень знаходився в межах контрольного.

Інфікованість Wolbachia природних популяцій Drosophila melanogaster України. Вибірки з усіх досліджуваних природних популяцій України були протестовані на наявність Wolbachia sp.

Методом ПЛР встановлено наявність рДНК 16s Wolbachia у ДНК мух всіх досліджених природних популяцій 2005 - 2007 років збору, за винятком мух з популяцій Водойма-охолоджувач (2006 рік) та Чорнобиль (2007 рік).

З метою остаточного ідентифікування ампліфікованих фрагментів рДНК 16s було проведено секвенування цих фрагментів, отриманих з ДНК мух усіх досліджуваних популяцій. На рис. 3 наведено у якості прикладу порівняння послідовності рДНК 16s Wolbachia з препаратів ДНК однієї з досліджуваних популяцій (Київ) та відповідної послідовності з GeneBank (вид Wolbachia sp. код: DQ412083). Всі одержані послідовності є ідентичними між собою та співпадають із послідовністю рДНК Wolbachia sp. із GeneBank.

Співвідношення статей в природних популяціях Drosophila melanogaster. З відкритям ендосимбіотичних бактерій було встановлено, що деякі з них, в тому числі і Wolbachia, здатні впливати на процес становлення статі у комах загалом та у дрозофіли зокрема (Fry, 2004). Тому весь зібраний матеріал був проаналізований щодо співвідношення статей в природних популяціях D. melanogaster.

Протягом трьох років досліджень в природних популяціях були зареєстровані як випадки очікуваного “нормального“ співвідношення статей 1:1, так і відхилення в той чи інший бік. При цьому для кожної популяції окремо цей показник не був сталим протягом трьох років наших досліджень. Лише в популяції м. Лубни протягом трьох років спостерігалось переважання кількості самців над кількістю самок. У популяціях Пирятин, Варва, Водойма-охолоджувач, Умань або кількість самців була більшою за кількість самок, або їх кількості були однакові в різні роки. В популяції Поліське, навпаки, було або більше самок, або співвідношення статей складало 1:1. В популяції Одеса було більше самок у 2007 році, а в інші два роки, - навпаки, більше самців. В популяціях Київ та Чорнобиль співвідношення статей також варіювало від року в рік (табл. 4).

Таблиця 4. Співвідношення статей в природних популяціях Drosophila melanogaster України

Нульова гіпотеза про рівність часток самок і самців в популяціях відхиляється при ч2 ? 3,84 (р=0,01)

Таким чином, показник співвідношення статей в вибірках досліджених природних популяцій D. melanogaster є дуже мінливим, і в силу цього ніяких закономірностей виявити не вдалось.

Співвідношення статей у п'яти поколіннях лабораторного розведення нащадків природних популяцій Drosophila melanogaster України. Аналіз співвідношення статей у п'яти поколіннях лабораторного розведення був проведений для кожної із досліджених природних популяцій D. melanogaster.

В результаті було показано, що при переході до лабораторного розведення серед нащадків природних популяцій або спостерігається співвідношення 1:1, або кількість самок переважає над кількістю самців. Чіткої закономірності в таких коливаннях встановлено не було. Однак, важливо підкреслити, що при лабораторному розведенні жодного разу не було зафіксовано випадку, коли самців було статистично достовірно більше, ніж самок (табл. 5).

Таблиця 5 Частка самок в п'яти поколіннях лабораторного розведення мух з природних популяцій (середні значення за три роки)

Нульова гіпотеза про рівність часток самок і самців в популяціях відхиляється при ч2 ? 3,84 (р=0,01), m=±0,02

Відомо, що на співвідношення статей можуть впливати різні чинники як внутрішньої (різноманітні мутації, співвідношення хромосом), так і зовнішньої природи (температура, інфекційні чинники). Для встановлення імовірного впливу бактерій на співвідношення статей у досліджених популяціях було застосовано традиційний метод тетрациклінового лікування (Bourtzis 1996). Вибірки з природних популяцій були перенесені на середовище з тетрацикліном. В цьому досліді для мух усіх популяцій протягом двох поколінь лабораторного розведення спостерігалось чітке співвідношення статей 1:1. Крім того, в препаратах ДНК усіх особин, які пройшли тетрациклінове лікування, не було зафіксовано 16s рДНК Wolbachia.

Отже, можна припустити, що відхилення в співвідношеннях статей від 1:1 мають саме бактеріальну природу.

Поширення мобільного Р-елементу в природних популяціях Drosophila melanogaster України. Для вивчення поширення мобільного Р-елементу в природних популяціях D. melanogaster України ДНК, виділену з 10 особин кожної з досліджуваних популяцій, перевіряли на наявність Р-елементу за допомогою ПЛР. Цей аналіз показав, що в ампліфікатах, отриманих з ДНК мух усіх популяцій, на відміну від контрольної лабораторної лінії дикого типу Cаnton S, є присутнім продукт очікуваного розміру. Отже, ми можемо стверджувати, що в геномах мух усіх природних популяцій наявний принаймні фрагмент Р-елементу, який відповідає певній ділянці транспозази. Цей фрагмент (437 п.о.) є значно меншим за розмір всього Р-елементу (2907 п.о.). Тому ми не можемо говорити про наявність в досліджених популяціях повнорозмірного Р-елементу.

Всі досліджені популяції були протестовані щодо їхньої належності до Р- чи М-цитипів в рамках Р-М системи гібридного дисгенезу. В результаті дисгених схрещувань ліній D. melanogaster, отриманих з природних популяцій (материнські особини), з лінією Harwich (батьківські особини) були отримані результати, представлені у табл. 6.

Таблиця 6. Частота редукції гонад в F1 дисгених схрещувань ліній Drosophila melanogaster, отриманих з природних популяцій України, та лінією Harwich

Добре відомо, що при схрещуванні самок, які мають М-цитотип, з самцями з Р-цитотипом спостерігається явище редукції гонад у самок, і цей показник сягає 80-100%. В реципрокних схрещуваннях явище редукції гонад не спостерігається (Kocur,1986). До ліній з Р-цитотипом прийнято відносити такі, в яких при дисгенних схрещуваннях з особинами з Р-цитотипом (батьківські особини) редукція гонад не спостерігається, а до Q-ліній - ті, в яких цей показник становить менше 10% (Simmons, 1986).

За результатами дисгенних схрещувань всі досліджені нами лінії можна віднести до М-цитотипу (табл. 6). В той же час, результати ПЛР-аналізу (рис. 5) свідчать про наявність принаймні фрагментів Р-елементу в геномі особин з усіх досліджених нами природних популяцій. Подібна ситуація, коли лінія несе неповнорозмірні копії Р-елементу, які однак не є активними і не здатні переміщуватись, а отже викликати явище гібридного дисгенезу, описана також іншими авторами (Kidwell M. G. 1987). Такі лінії прийнято відносити до М'-цитотипу. Отже, можна зробити висновок про те, що всі досліджені природні популяції D. melanogaster відносяться саме до М'-цитотипу, тобто поводять себе в дисгених схрещуваннях як М-лінії, хоча і несуть в своїх геномах неповнорозмірні копії Р-елементу. З метою додаткового контролю ми провели реципрокні схрещування, для яких були взяті самки з лабораторної лінії Harwich, а самці з досліджуваних природних популяцій. В жодному з цих схрещувань частота редукції гонад не перевищувала 1%: отже, лінія Harwich дійсно несе повнорозмірні копії Р-елементу, активністю яких і обумовлюється редукція гонад, що спостерігається у прямих схрещуваннях.

Оскільки в природі існує певна ймовірність випадковї активації мобільних елементів, що може привести до гібридного дисгенезу, ми оцінили рівень редукції гонад у представників усіх досліджених природних популяцій. Протягом трьох років моніторингу були отримані наступні результати (табл. 7): найвищий показник редукції гонад був зафіксований в 2005 році в популяції Чорнобиль і становив 23%, також високий рівень редукції гонад спостерігався в популяціях Умань (14%, 2006 рік) та Водойма-охолоджувач (11%, 2005 рік). Водночас, у деяких популяціях в окремі роки досліджень особин з редукованими яєчниками або сім'яниками не було відмічено взагалі.

Таблиця 7. Частота особин з редукованими яєчниками/сім'яниками в природних популяціях D. melanogaster

Отже, у зазначених трьох популяціях з високим рівнем редукції гонад імовірно відбуваються або дисгенні схрещування, або ж працюють невідомі фактори, що впливають на фертильність самок. Проте, загалом представлені в табл. 7 результати опосередковано вказують на низький рівень активності мобільних елементів в природних популяціях D. melanogaster України.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі викладені теоретичні узагальнення результатів, отриманих під час вирішення наукової задачі по відновленню моніторингу генетичних процесів в природних популяціях Drosophila melanogaster України. В моніторинг, окрім частоти видимих та зчеплених зі статтю летальних мутацій і виходу рецесивних мутацій в процесі лабораторного розведення, додано такі показники як активність мобільних генетичних елементів, частота рекомбінаційних подій та фенотипові ефекти ендосимбіонтів. Окрему увагу приділено порівнянню отриманих результатів з дослідженнями 30-х - 70-х років минулого століття.

1. Частота видимих та зчеплених зі статтю летальних мутацій у десяти природних популяціях Drosophila melanogaster України протягом 2005-2007 років коливалась в межах від 0,1% до 0,86%, що значно нижче частот, зафіксованих у 30-х та 70-х роках минулого століття.

2. В трьох популяціях Чорнобильського регіону спостерігається найвищій, в порівнянні з іншими сімома популяціями, рівень виходу видимих мутацій в низці поколінь. Підвищення частоти летальних мутацій в цьому регіоні не зафіксовано.

3. У популяціях Одеси, Києва, Поліського, Чорнобиля, Лубен, Пирятина зафіксовано зниження частоти рекомбінації між локусами white і cut (на 1 - 9 сМ). В інших досліджених природних популяціях (Умань, Варва, Магарач, чорнобильська водойма-охолоджувач) такі ефекти не спостерігались.

4. Встановлено наявність рДНК Wolbachia sp. в препаратах ДНК дрозофіл всіх досліджених популяцій. Продемонстровано, що бактеріальне зараження природних популяцій приводить до відхилень у співвідношенні між самками та самцями в п'яти поколіннях інбредного розведення нащадків досліджених природних популяцій в бік підвищення кількості самок.

5. Встановлено наявність фрагментів Р-елементу у геномах особин з усіх досліджених популяцій. Визначено, що всі досліджені лінії, які походять з природних популяцій Drosophila melanogaster України, належать до М'-цитотипу.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИССЕРТАЦІЇ

1. Проценко О.В. Мутаційні процеси в природних популяціях Drosophila melanogaster України // О.В. Проценко, І.А. Козерецька / Збірник наукових праць. Фактори експериментальної еволюції організмів. - Київ. -2006. - Т.3. - С.49-53. (дисертантом особисто була зібрана частина матеріалу; проведено аналіз матеріалу на наявність видимих мутацій, аналіз результатів)

2. Проценко А.В. Соотношение полов в природных популяциях Drosophila melanogaster Украины. / А.В. Проценко, О.В. Жук, И.А. Козерецкая // Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів- 2006. - Т.4. - №.2. - С. 193-200. (дисертантом особисто була зібрана частина матеріалу; проведено аналіз матеріалу на співвідношення статей, проведений статистичний аналіз результатів)

3. Козерецька І. А. Генетичний моніторинг природних популяцій Drosophila melanogaster України з різних, за радіаційним забрудненням, територій / І. А. Козерецька, О. В. Проценко, Г.П. Міліневський // Бюлетень екологічного стану зони відчуження та зони безумовного відселення - 2006. - Т.29. №1. - С. 57-60. (дисертантом встановлено частоту летальних зчеплених зі статтю та видимих мутацій в досліджуваних популяціях)

4. Проценко А.В. Природные популяции Drosophila melanogaster Украины. Мониторинг мутационных процессов / А.В. Проценко, И.А. Козерецкая // Збірник наукових праць. - Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології. -Київ.- Логос.- 2007. - Т.1. - С.288-292. (дисертантом особисто була зібрана частина матеріалу; частоту летальних зчеплених зі статтю та видимих мутацій, частоту редукції гонад, проведений статистичний аналіз результатів)

5. Мутационные процессы в природных популяциях Drosophila melanogaster и Hirundo rustica с радиационно - загрязнених территорий / И.А. Козерецкая, А.В. Проценко, Е.С. Афанасьєва [и др.] // Цитология и генетика 2008 №4 С. 63-68. (дисертантом надана генетична характеристика мутаційних процесів в природних популяціях Drosophila melanogaster з радіаційно забруднених регіонів)

6. Распространение Р-элемента в природных популяциях Drosophila melanogaster Украины / А.В. Проценко, Д.А. Козерецька, О.В. Жук [и др.] // Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів - 2007. - Т.5.№.1-2. - С.62-68. (дисертантом проведений аналіз природних популяцій на наявність редукованих гонад, встановлена частота кросинговеру в Х хромосомі самців з природних популяцій на ділянці між генами w i ct)

7. Козерецька І.А. Рекомбінаційні події у нащадків представників природних популяцій Drosophila melanogaster України / І.А. Козерецька, О.В. Проценко, С.В. Демидов // Збірник наукових праць Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - Київ - Луганськ. - 2009. - Вип. 3(90). - С. 35-43. (дисертантом надана генетична характеристика рекомбінаційних процесів в природних популяціях Drosophila melanogaster)

8. Проценко А.В. Wolbachia и соотношение полов в природных популяциях Drosophila melanogaster Украины / А.В. Проценко // « Генетика в России и мире»: Международная конференция, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН / 28 июня - 2 июля, 2006, Москва. С. 81.

9. Проценко О.В. Генетичні процеси в природних популяціях Drosophila melanogaster України / О.В. Проценко // Збірник тез ІІ Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології” / 21 - 24 березня, 2006, Львів. С. 35.

10. Проценко О.В. Генетичні процеси в природних популяціях Drosophila melanogaster України / О.В. Проценко // Збірник тез IV Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології” / 7-10 квітня, 2008, Львів. С.145.

11. Protsenko A.V. Genetic monitoring in natural populations of Drosophila melanogaster from differently radioactively contaminated Ukranian territories / A.V. Protsenko, D.I. Kozeretska, // International Conferens on Low Dose Radiation on Human Health and Enviroment / October 17 - 20, 2007, Budapesht, Hungary. Р. 118.

12. Protsenko O.V. Genetic processes in Drosophila melanogaster population from Uman city / O.V. Protsenko, D.I. Kozeretska, S.V. Mezhzherin // 19th European Drosophila Research Conference / August 31 - September 3, 2005, Eger, Hungary. Р. 256.

13. Protsenko O.V. Mutation processes in natural populations of Drosophila melanogaster in Ukraine / O.V. Protsenko, I.A. Kozeretskaya // European radiation research / August 22 - 25, 2006, Kyiv. Р. 76.

14. Проценко О.В. Генетичні процеси в популяції Drosophila melanogaster міста Умань / О.В. Проценко, С.В. Демидов // V Всеукраїнська наукова конференція студентів та аспірантів «Біологічні дослідження молодих вчених в Україні» / 15 - 16 вересня, 2005, Київ. С. 77-78.

Размещено на Allbest.ru